Zastosowanie warstw nośnych do siatek kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryoEM) może zwiększyć gęstość cząstek, ograniczyć interakcje z interfejsem powietrze-woda, zredukować ruch wywołany wiązką i poprawić rozkład orientacji cząstek. W artykule opisano solidny protokół powlekania siatek krioEM monowarstwą grafenu w celu lepszego przygotowania próbek kriogenicznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zastosowanie jednowarstwowego grafenu w siatkach mikroskopii krioelektronowej do określania struktury w wysokiej rozdzielczości
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryoEM), oczyszczone makrocząsteczki są nakładane na siatkę z dziurawą folią węglową; cząsteczki są następnie osuszane w celu usunięcia nadmiaru płynu i szybko zamrażane w warstwie lodu szklistego o grubości około 20-100 nm, zawieszonej w otworach foliowych o szerokości około 1 μm. Otrzymaną próbkę obrazuje się za pomocą kriogenicznej transmisyjnej mikroskopii elektronowej, a po przetworzeniu obrazu za pomocą odpowiedniego oprogramowania można określić struktury o rozdzielczości zbliżonej do atomowej. Pomimo powszechnego zastosowania cryoEM, przygotowanie próbek pozostaje poważnym wąskim gardłem w przepływach pracy cryoEM, a użytkownicy często napotykają wyzwania związane ze słabym zachowaniem próbek w zawieszonym lodzie szklistym. Ostatnio opracowano metody modyfikacji siatek krioEM za pomocą pojedynczej ciągłej warstwy grafenu, która działa jak powierzchnia nośna, która często zwiększa gęstość cząstek w obrazowanym obszarze i może zmniejszać interakcje między cząstkami a granicą faz powietrze-woda. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe protokoły dotyczące stosowania grafenu w siatkach krioelektromagnetycznych oraz szybkiej oceny względnej hydrofilowości powstałych siatek. Dodatkowo opisujemy metodę opartą na elektromagnetycznym w celu potwierdzenia obecności grafenu poprzez wizualizację jego charakterystycznego wzoru dyfrakcyjnego. Na koniec demonstrujemy użyteczność tych nośników grafenowych, szybko rekonstruując mapę gęstości kompleksu Cas9 o rozdzielczości 2,7 A przy użyciu czystej próbki o stosunkowo niskim stężeniu.
Wprowadzenie
Kriogeniczna mikroskopia elektronowa pojedynczej cząstki (cryoEM) stała się powszechnie stosowaną metodą wizualizacji makrocząsteczek biologicznych1. Napędzany postępami w bezpośredniej detekcji elektronów2,3,4, akwizycja danych5 i algorytmy przetwarzania obrazu6,7,8,9,10, cryoEM jest teraz w stanie wytwarzać struktury 3D o rozdzielczości zbliżonej do atomowej szybko ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie grafenu CVD
- Przygotować roztwór do trawienia grafenu zgodnie z opisem poniżej.
- Rozpuścić 4,6 g nadsiarczanu amonu (APS) w 20 mL wody klasy molekularnej w zlewce o pojemności 50 mL, aby uzyskać roztwór 1 M, a następnie przykryć folią aluminiową. Pozostawić APS do całkowitego rozpuszczenia, przechodząc do kroku 1.2.
- Przygotować fragment grafenu CVD do powlekania polimetakrylanem metylu (MMA). Ostrożnie wyciąć kwadratowy fragment grafenu CVD. Przenieść kwadrat na szkiełko nakrywkowe (50 mm x 24 mm) w czystej szalce Petriego i pozostawić go przykrytego podczas transportu do powlekarki w....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Pomyślne wykonanie siatek do krio-EM powlekanych grafenem przy użyciu sprzętu (Rycina 1) i protokołu (Rycina 2) opisanych w niniejszym opracowaniu pozwoli na uzyskanie monowarstwy grafenu pokrywającej otwory w folii, co można potwierdzić na podstawie charakterystycznego obrazu dyfrakcyjnego. Aby zwiększyć adsorpcję białek na powierzchni grafenu, można zastosować traktowanie UV/ozonem, co uczyni powierzchnię hydrofilową poprzez wprowadzenie grup funkcyjnych zawie.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przygotowanie próbek CryoEM wiąże się z wieloma wyzwaniami technicznymi, przy czym większość procesów roboczych wymaga od badaczy ręcznego manipulowania delikatnymi siatkami z najwyższą ostrożnością, aby uniknąć ich uszkodzenia. Ponadto podatność każdej próbki na witryfikację jest nieprzewidywalna; Cząstki często oddziałują z powierzchnią międzyfazową powietrze-woda lub ze stałą folią nośną pokrywającą siatki, co może prowadzić do tego, że cząstki przyjmują preferowaną orientację lub nie dostają się do otworów obrazowych.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.
Podziękowania
Próbki zostały przygotowane i zobrazowane w CryoEM Facility w MIT.nano na mikroskopach pozyskanych dzięki Fundacji Arnolda i Mabel Beckmanów. Urządzenia do obrazowania kąta zwilżania zostały wydrukowane w MIT Metropolis Maker Space. Dziękujemy laboratoriom Nieng Yan i Yimo Han oraz pracownikom MIT.nano za ich wsparcie podczas wdrażania tej metody. W szczególności dziękujemy dr Guanhui Gao i dr Sarah Sterling za ich wnikliwe dyskusje i opinie. Praca ta była wspierana przez granty NIH R01-GM144542, 5T32-GM007287 i granty NSF-CAREER 2046778. Badania w laboratorium Davisa są wspierane przez Fundację Alfreda P. Sloana, Fundusz Jamesa H. Ferry'ego, MIT J-Clinic i Rodzinę Wh....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zlewka 250 ml (3x) | Fisher | 02-555-25B | |
| Zlewka 50 ml (2x) | Corning | 1000-50 | |
| Aceton | Fisher | A949-4 | |
| Folia aluminiowa | Fisher | 15-078-292 | |
| Nadsiarczan amonu | Fisher | (I17874 | |
| Szkiełka nakrywkowe 50 mm x 24 mm | Mattek PCS-1.5-5024 | ||
| CVD grafen | Graphene Supermarket | CVD-Cu-2x2 | |
| easiGlow wyładowczy | Ted-Pella | 91000S | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | 1.11727 | |
| Pęseta z płaską końcówką | Fisher | 50-239-60 | |
| Nóż do szkła | Grainger | 21UE26 | |
| Szklana płytka Petriego i pokrywa | VWR | 75845-544 | |
| Szklana pipeta serologiczna | Fisher | 13-676-34D | |
| Walizka do przechowywania siatki | EMS | 71146-02 | |
| Płyta grzejna | Fisher | 07-770-108 | |
| Isopropanol | Sigma | W292907 | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
| Nożyczki laboratoryjne | Fisher | 13-806-2 | |
| Metakrylan metylu EL-6 | Kayaku | MMA M310006 0500L1GL | |
| Woda klasy molekularnej | Corning | 46-000-CM | |
| Pęseta o negatywnym działaniu (2x) | Pipeta Fisher | 50-242-78 | |
| P20 | Pipeta Rainin | 17014392 | |
| P200 | Rainin | 17008652 | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
| Końcówki do pipet | Rainin | 30389291 | |
| Siatki Quantifoil z dziurawym węglem | Powlekarka EMS | Q2100CR1 | |
| Spin | SetCas | KW-4A | z uchwytem SCA-19-23 |
| Termometr Straightedge | ULINE | H-6560 | |
| Grainger | 3LRD1 | ||
| Środek czyszczący UV/Ozone | BioForce | SKU: PC440 | |
| Eksykator próżniowy | Thomas Scientific | 1159X11 | |
| Papier Whatman | VWR | 28297-216 |
Bibliografia
- Chua, E. Y. D., et al. cheaper: Recent advances in cryo-electron microscopy. Annu Rev Biochem. 91, 1-32 (2022).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
