Artykuł metodologiczny

Zastosowanie jednowarstwowego grafenu w siatkach mikroskopii krioelektronowej do określania struktury w wysokiej rozdzielczości

DOI:

10.3791/66023

⸱

10 listopada 2023

 ,  , 
1Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, 2Program in Computational and Systems Biology, Massachusetts Institute of Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zastosowanie warstw nośnych do siatek kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryoEM) może zwiększyć gęstość cząstek, ograniczyć interakcje z interfejsem powietrze-woda, zredukować ruch wywołany wiązką i poprawić rozkład orientacji cząstek. W artykule opisano solidny protokół powlekania siatek krioEM monowarstwą grafenu w celu lepszego przygotowania próbek kriogenicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryoEM), oczyszczone makrocząsteczki są nakładane na siatkę z dziurawą folią węglową; cząsteczki są następnie osuszane w celu usunięcia nadmiaru płynu i szybko zamrażane w warstwie lodu szklistego o grubości około 20-100 nm, zawieszonej w otworach foliowych o szerokości około 1 μm. Otrzymaną próbkę obrazuje się za pomocą kriogenicznej transmisyjnej mikroskopii elektronowej, a po przetworzeniu obrazu za pomocą odpowiedniego oprogramowania można określić struktury o rozdzielczości zbliżonej do atomowej. Pomimo powszechnego zastosowania cryoEM, przygotowanie próbek pozostaje poważnym wąskim gardłem w przepływach pracy cryoEM, a użytkownicy często napotykają wyzwania związane ze słabym zachowaniem próbek w zawieszonym lodzie szklistym. Ostatnio opracowano metody modyfikacji siatek krioEM za pomocą pojedynczej ciągłej warstwy grafenu, która działa jak powierzchnia nośna, która często zwiększa gęstość cząstek w obrazowanym obszarze i może zmniejszać interakcje między cząstkami a granicą faz powietrze-woda. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe protokoły dotyczące stosowania grafenu w siatkach krioelektromagnetycznych oraz szybkiej oceny względnej hydrofilowości powstałych siatek. Dodatkowo opisujemy metodę opartą na elektromagnetycznym w celu potwierdzenia obecności grafenu poprzez wizualizację jego charakterystycznego wzoru dyfrakcyjnego. Na koniec demonstrujemy użyteczność tych nośników grafenowych, szybko rekonstruując mapę gęstości kompleksu Cas9 o rozdzielczości 2,7 A przy użyciu czystej próbki o stosunkowo niskim stężeniu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kriogeniczna mikroskopia elektronowa pojedynczej cząstki (cryoEM) stała się powszechnie stosowaną metodą wizualizacji makrocząsteczek biologicznych1. Napędzany postępami w bezpośredniej detekcji elektronów2,3,4, akwizycja danych5 i algorytmy przetwarzania obrazu6,7,8,9,10, cryoEM jest teraz w stanie wytwarzać struktury 3D o rozdzielczości zbliżonej do atomowej szybko rosnącej liczby makrocząsteczek11. Co więcej, wykorzystując jednocząsteczkowy charakter tego podejścia, użytkownicy mogą określić wiele struktur na podstawie jednej próbki12,13,14,15, podkreślając obietnicę wykorzystania wygenerowanych danych do zrozumienia heterogenicznych zespołów strukturalnych16,17. Pomimo tego postępu nadal występują wąskie gardła w przygotowywaniu siatek do próbek kriogenicznych.

Do charakterystyki strukturalnej za pomocą cryoEM, próbki biologiczne powinny być dobrze zdyspergowane w roztworze wodnym, a następnie muszą zostać błyskawicznie zamrożone w procesie zwanym witryfikacją18,19. Celem jest wychwycenie cząstek w jednolicie cienkiej warstwie zeszklonego lodu zawieszonej w regularnie rozmieszczonych otworach, które zwykle są wycinane w warstwie amorficznego węgla. Ta wzorzysta amorficzna folia węglowa jest podtrzymywana przez siatkę TEM z siatką z miedzianych lub złotych prętów nośnych. W standardowych przepływach pracy siatki są przekształcane w hydrofilowe metody za pomocą obróbki plazmowej jarzeniowej przed nałożeniem próbki. Nadmiar cieczy osusza się bibułą filtracyjną, dzięki czemu roztwór białka tworzy cienką warstwę cieczy w poprzek otworów, którą można łatwo zeszklone podczas zamrażania wgłębnego. Typowe wyzwania obejmują lokalizację cząstek na granicy faz powietrze-woda (AWI) i późniejszą denaturację20,21,22 lub przyjęcie preferowanych orientacji23,24,25, przyleganie cząstek do folii węglowej, a nie migrowanie do otworów, oraz grupowanie i agregacja cząstek w holes26. Kolejnym problemem jest niejednolita grubość lodu; Gruby lód może powodować wyższy poziom szumu tła na mikrofotografiach ze względu na zwiększone rozpraszanie elektronów, podczas gdy ekstremalnie cienki lód może wykluczać większe cząstki27.

Aby sprostać tym wyzwaniom, do powlekania powierzchni siatki użyto różnych cienkich folii podporowych, pozwalając cząsteczkom spoczywać na tych podporach i, idealnie, unikając interakcji z interfejsem powietrze-woda. Podpory grafenowe okazały się bardzo obiecujące, częściowo ze względu na ich wysoką wytrzymałość mechaniczną w połączeniu z minimalnym przekrojem rozpraszania, co zmniejsza sygnał tła dodawany przez warstwę nośną28. Oprócz minimalnego wpływu na szum tła, grafen wykazuje również niezwykłą przewodność elektryczną i cieplną29. Wykazano, że siatki pokryte grafenem i tlenkiem grafenu zapewniają wyższą gęstość cząstek, bardziej równomierny rozkład cząstek30 i zredukowaną lokalizację do klasy AWI22. Ponadto grafen zapewnia powierzchnię nośną, którą można dalej modyfikować w celu: 1) dostrojenia właściwości fizykochemicznych powierzchni siatki poprzez funkcjonalizację31,32,33; lub 2) para czynników łączących, które ułatwiają oczyszczanie powinowactwa białek będących przedmiotem zainteresowania34,35,36.

W tym artykule zmodyfikowaliśmy istniejącą procedurę powlekania siatek cryoEM pojedynczą jednolitą warstwą grafenu30. Modyfikacje mają na celu zminimalizowanie obsługi sieci w całym protokole, w celu zwiększenia wydajności i odtwarzalności. Dodatkowo omawiamy nasze podejście do oceny skuteczności różnych zabiegów UV/ozonu w renderowaniu siatek hydrofilowych przed zanurzeniem. Ten etap przygotowania próbki cryoEM przy użyciu siatek pokrytych grafenem ma kluczowe znaczenie i stwierdziliśmy, że nasza prosta metoda ilościowego określania względnej hydrofilowości powstałych siatek jest przydatna. Korzystając z tego protokołu, demonstrujemy użyteczność stosowania siatek pokrytych grafenem do określania struktury poprzez generowanie rekonstrukcji 3D w wysokiej rozdzielczości katalitycznie nieaktywnego S. pyogenes Cas9 w kompleksie z przewodnikiem RNA i docelowym DNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie grafenu CVD

  1. Przygotuj roztwór do wytrawiania grafenu, jak opisano poniżej.
    1. Rozpuścić 4,6 g nadsiarczanu amonu (APS) w 20 ml wody molekularnej w zlewce o pojemności 50 ml na 1 M roztwór i przykryć folią aluminiową. Poczekaj, aż APS całkowicie się rozpuści, przechodząc do kroku 1.2.
  2. Przygotować przekrój grafenu CVD do powlekania metakrylanem metylu (MMA). Ostrożnie wytnij kwadratowy przekrój grafenu CVD. Przenieść kwadrat na szkiełko nakrywkowe (50 mm x 24 mm) na czystej szalce Petriego i przykryć podczas transportu do powlekarki.
    UWAGA: Kwadrat o wymiarach 18 mm x 18 mm powinien dać 25-36 siatek pokrytych grafenem.

2. Powlekanie grafenu CVD MMA

  1. Ustaw wirowanie powlekarki na 60 s z dużą prędkością wirowania przy 2,500 obr./min. Ostrożnie umieść grafen CVD na uchwycie o odpowiednim rozmiarze.
    UWAGA: Idealnie, grafen CVD będzie wystawał 1-2 mm poza krawędź wybranego uchwytu, aby zapobiec zasysaniu MMA do systemu próżniowego.
  2. Naciśnij przycisk Take/Absorb, aby włączyć pompę próżniową i przymocować grafen CVD do uchwytu. Nałóż MMA na środek kwadratu grafenowego CVD, zamknij pokrywę i natychmiast naciśnij przycisk Start/Stop. Dla kwadratu grafenu CVD o wymiarach 18 mm x 18 mm wystarczy 40 μl MMA.
  3. Po zatrzymaniu wirowania odłącz pompę próżniową i ostrożnie wyjmij pęsetą grafen CVD pokryty MMA. Odwróć grafen CVD tak, aby strona pokryta MMA była skierowana w dół i umieść go z powrotem na szklanym szkiełku nakrywkowym.

3. Wytrawianie plazmowe tylnej strony grafenu

  1. Przenieś grafen CVD na szkiełku nakrywkowym do wyładowania jarzeniowego i wyładowania jarzeniowe przez 30 s przy 25 mA za pomocą pęsety z płaską końcówką.
  2. Z powrotem grafen CVD znajdujący się na szkiełku nakrywkowym należy umieścić na szalce Petriego i przykryć podczas transportu do obszaru trawienia miedzi. Powłoka MMA ochroni wierzchnią warstwę grafenu przed wytrawianiem plazmowym.

4. Cięcie kwadratów grafenowych CVD pokrytych siatką MMA

  1. Użyj dwóch par pęset, aby podeprzeć kwadrat grafenowy CVD. Zwróć uwagę na orientację kwadratu grafenowego CVD, trzymaj MMA stroną do góry, gdy jest przymocowany do pęsety (KRYTYCZNE).
  2. Pokrój grafen CVD na kwadraty o wymiarach około 3 mm x 3 mm. Na tym etapie użyj dwóch zestawów kleszczy o odwrotnym działaniu, aby przytrzymać kwadrat grafenowy CVD prawą stroną do góry i zakotwiczyć go na miejscu, a także przytrzymać krawędź kwadratu o wymiarach 3 mm x 3 mm po odcięciu go od reszty kwadratu.

5. Rozpuszczanie podłoża miedzianego z grafenu CVD pokrytego MMA

  1. Ostrożnie unieruchamiać każdy kwadrat o wymiarach 3 mm x 3 mm w roztworze APS. Zetknij się z powierzchnią roztworu APS przed zwolnieniem każdego kwadratu. Przechylić zlewkę tak, aby każdy kwadrat można było umieścić w roztworze pod płytkim kątem; Gwarantuje to, że kwadrat nie zapadnie się.
  2. Przykryć zlewkę folią aluminiową i inkubować przez noc w temperaturze 25 °C.

6. Usuwanie filmów MMA/grafenowych z APS

  1. Użyć szkiełka nakrywkowego o wymiarach 12 mm x 50 mm i wyjąć kwadraty MMA/grafenu z APS, delikatnie zanurzając szkiełko nakrywkowe pionowo w APS, a następnie przesuwając szkiełko nakrywkowe na boki tak, aby przylegało do pływającego kwadratu MMA/grafenu.
  2. Ostrożnie zdejmij szkiełko nakrywkowe i upewnij się, że kwadrat całkowicie przylega do boku szkiełka nakrywkowego po wyjęciu.
  3. Przenieś kwadraty MMA/grafenu do czystej zlewki o pojemności 50 ml wypełnionej wodą molekularną na 20 minut. Delikatnie zanurz szkiełko nakrywkowe z kwadratem MMA/grafenu przymocowanym pionowo do wody i upewnij się, że kwadrat odsuwa się od szkiełka nakrywkowego po interakcji z powierzchnią wody. Powtórz te czynności dla wszystkich kwadratów MMA/grafenu.

7. Przyleganie grafenu do siatek

  1. Używając pęsety o negatywnym działaniu, delikatnie zanurz siatkę pionowo w wodzie, stroną z włókna węglowego skierowaną w pływający kwadrat MMA/grafenu. Po zetknięciu się z kwadratem ostrożnie zdejmij siatkę i upewnij się, że kwadrat całkowicie przylega do węglowej strony siatki po wyjęciu. Zminimalizuj ruch boczny siatki po zanurzeniu w wodzie, aby zapobiec uszkodzeniu kwadratów siatki (KRYTYCZNE).
  2. Umieść siatki na czystym szkiełku nakrywkowym MMA/grafenem do góry i wysusz na powietrzu przez 1 do 2 minut. Przenieś siatki pokryte grafenem/MMA na gorącą płytę ustawioną na 130 °C za pomocą pęsety z płaską końcówką.
  3. Przykryj wierzchem szklanej szalki Petriego i inkubuj przez 20 minut. Zdejmij z ognia i schłodzić do temperatury pokojowej przez 1 do 2 minut.
    UWAGA: Zachowaj ostrożność, ponieważ górna część szalki Petriego będzie bardzo gorąca.

8. Rozpuszczanie MMA za pomocą acetonu

  1. Przenieść całe szkiełko nakrywkowe na szalkę Petriego wypełnioną 15 ml acetonu. Inkubować przez 30 minut.
  2. Za pomocą pipety serologicznej z czystego szkła przenieść aceton, w którym inkubowano siatki, do pojemnika na odpady. Ostrożnie dodać 15 ml świeżego acetonu do szalki Petriego za pomocą pipety serologicznej z czystego szkła. Inkubować przez 30 minut.
  3. Powtórz te kroki prania, aby uzyskać łącznie 3 prania acetonem.

9. Usuwanie resztek acetonu za pomocą izopropanolu

  1. Po 3 płukaniach acetonem usuń aceton i zastąp go 15 ml izopropanolu za pomocą pipety serologicznej z czystego szkła. Inkubować przez 20 minut.
  2. Powtórz 3 razy, w sumie 4 płukania izopropanolem. Ostrożnie usuń kratki z izopropanolu i wysusz na czystym szkiełku nakrywkowym na czystym szkiełku nakrywkowym za pomocą pęsety.
    UWAGA: Resztki izopropanolu mogą utrudniać uwalnianie siatek z pęsety. Nawiązanie kontaktu między siatką a czystym szkiełkiem nakrywkowym przed zwolnieniem siatki z pęsety może złagodzić ten problem.
  3. Odparować resztki substancji organicznych, przenosząc szkiełko nakrywkowe z kratkami pokrytymi grafenem na płytę grzejną ustawioną na 100 °C na 10 minut. Schłodzić do temperatury pokojowej i przechowywać w próżni do czasu użycia.

10. Obróbka UV/ozonem siatek pokrytych grafenem

  1. Za pomocą pęsety o odwróconym działaniu delikatnie umieść siatki w czystym obszarze oświetlenia środka czyszczącego UV/ozon, stroną pokrytą grafenem skierowaną do góry.
  2. Zamknij obszar oświetlenia i włącz maszynę. Przekręć pokrętło czasu na wyznaczony czas zabiegu, aby rozpocząć oczyszczanie siatek promieniowaniem UV/ozonem.
    UWAGA: Czas trwania leczenia jest parametrem regulowanym, a nadmierne leczenie może spowodować uszkodzenie siatki. Han et al.30 zaleca 10-minutową kurację promieniowaniem UV/ozonem, a także stwierdziliśmy, że 10-minutowa kuracja jest wystarczająca. Zobacz krok 12, aby uzyskać wskazówki dotyczące dostrajania tego czasu leczenia.
  3. Przejdź bezpośrednio do zanurzania próbki cryoEM na poddanych działaniu substancji siatce, wykonując kroki zanurzania zgodnie z opisem w Koh et al.37.
    UWAGA: Węglowodory atmosferyczne mogą gromadzić się na powierzchni siatki po obróbce UV/ozonem i zwiększać hydrofobowość powierzchni grafenu38,39. Aby tego uniknąć, należy natychmiast zanurzyć kratki zabezpieczone promieniowaniem UV/ozonem. Korzystne może być traktowanie siatek promieniowaniem UV/ozonem w partiach, na przykład traktowanie promieniowaniem UV/ozonem sześciu siatek i natychmiastowe zanurzanie tych sześciu siatek, a następnie traktowanie UV/ozonem drugiej partii kratek, a następnie zanurzanie drugiej partii.

11. Przechwytywanie obrazu dyfrakcyjnego

  1. Upewnij się, że mikroskop jest dobrze dostrojony z ustalonym równoległym oświetleniem i ustaw końcowe rozmycie na -0.2 μm.
  2. Włóż ekran fluorescencyjny, a wiązka całkowicie się zatrzyma. Wejdź w tryb dyfrakcji, aby wyraźnie uwidocznić punkty dyfrakcyjne.
  3. Uzyskaj obraz za pomocą kamery CCD i oceń go za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.
    UWAGA: Najłatwiejszymi do zaobserwowania i zidentyfikowania punktami dyfrakcyjnymi generowanymi przez monowarstwę grafenu jest 6 plamek odpowiadających częstotliwości przestrzennej 2,13 A. Użyj narzędzia pomiarowego, aby oszacować odległość od środka wiązki dyfrakcyjnej do jednego z tych punktów dyfrakcyjnych w jednostkach odwrotności. W szczególności 2.13 Å figure-protocol-1 0.47 Å-1.

12. Ocena hydrofilowości sieci

  1. Przygotuj konfigurację do obrazowania. Zlokalizuj stojak na telefon, powierzchnię obrazowania na stole, telefon z aparatem, szklane szkiełko nakrywkowe i folię parafinową. Obrazy pokazane tutaj zostały uzyskane przy użyciu stojaka na telefon i powierzchni obrazowania na stole, które zostały wydrukowane w 3D przy użyciu dostarczonych plików .stl, co skutkuje łatwiejszymi do odtworzenia i wymiernymi pomiarami kąta zwilżania (rysunek uzupełniający 1A).
  2. Połóż szklane szkiełko nakrywkowe na płaskiej powierzchni, a następnie wytnij kwadrat folii parafinowej o wymiarach 1 cm na 1 cm i umieść ją na szklanym szkiełku nakrywkowym. Umieść telefon na podstawce pod telefon, ustawiając telefon tak, aby aparat znajdował się w płaszczyźnie ze szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Zabezpiecz telefon w tej pozycji za pomocą gumek (Rysunek uzupełniający 1B). Zrób przykładowe zdjęcie, aby sprawdzić, czy aparat jest wyrównany z powierzchnią obrazowania.
  3. Bezpośrednio po obróbce UV/ozonem siatek pokrytych grafenem, umieść pojedynczą siatkę na kwadracie folii parafinowej na szklanym szkiełku nakrywkowym. Upewnij się, że strona grafenowa jest skierowana do góry. Dodaj kroplę wody o pojemności 2 μl na środek powierzchni siatki za pomocą pipety i natychmiast zrób zdjęcie.
    UWAGA: Powtórz ten krok po: i) żądanych odstępach czasu między zabiegami UV/ozonu, aby określić wystarczającą długość zabiegu; lub ii) pożądane przedziały czasowe po poddaniu działaniu promieniowania UV/ozonu w celu zmierzenia, jak długo po zabiegu powierzchnia siatki zachowuje swój hydrofilowy charakter.
  4. Oblicz kąty zwilżania na podstawie zdjęć, importując je do ImageJ43 i korzystając z wtyczki kąta zwilżania.

13. Analiza pojedynczych cząstek w złożonym zestawie danych dCas9

UWAGA: Wszystkie procesy przetwarzania obrazów opisane w tym protokole zostały wykonane przy użyciu cryoSPARC w wersji 4.2.1.

  1. Wstępne przetwarzanie filmów przy użyciu zadań Patch Motion Correction i Patch CTF Estimation. Pobieranie cząstek należy wykonywać za pomocą zadania Blob picker przy użyciu sferycznej kropelki o średnicy od 115 A do 135 A.
  2. Wyodrębnij cząstki za pomocą zadania Wyodrębnij z mikrofotografii, używając znormalizowanego współczynnika korelacji (NCC) i progów mocy, co daje około 200-300 cząstek na mikrofotografię. Należy pamiętać, że odpowiednie progi i wynikająca z nich liczba cząstek mogą się różnić, a użytkownicy powinni sprawdzić jakość pobrania na różnych mikrofotografiach, aby określić odpowiednie warunki.
  3. Wykonuj wieloklasowe rekonstrukcje początkowe za pomocą zadania rekonstrukcji Ab-initio, co wymaga trzech klas. Dwie z trzech klas będą prawdopodobnie zawierać cząstki inne niż Cas9, w tym zanieczyszczenia powierzchniowe. Wybierz klasę podobną do dCas9 do dalszego przetwarzania.
    UWAGA: W celu dalszego udoskonalenia stosu cząstek można zastosować dodatkowe rundy wieloklasowej rekonstrukcji ab-initio lub uszlachetniania heterogenicznego.
  4. Wykonaj zagęszczenie 3D za pomocą zadania Niejednolite zagęszczenie, wybierając parametry domyślne. Oszacuj rozdzielczość rekonstrukcji za pomocą zadań Validation (FSC) i ThreeDFSC, wykorzystując mapy i maskę z końcowego udoskonalenia 3D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomyślne wyprodukowanie siatek krioelektromagnetycznych pokrytych grafenem przy użyciu sprzętu (Rysunek 1) i protokołu (Rysunek 2) tutaj zaowocuje monowarstwą grafenu pokrywającą otwory folii, co można potwierdzić za pomocą charakterystycznego wzoru dyfrakcyjnego. Aby pobudzić adsorpcję białek na powierzchni grafenu, można zastosować obróbkę UV/ozonem w celu nadania powierzchni hydrofilowości poprzez zainstalowanie grup funkcyjnych zawierających tlen. Jednak zan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przygotowanie próbek CryoEM wiąże się z wieloma wyzwaniami technicznymi, przy czym większość procesów roboczych wymaga od badaczy ręcznego manipulowania delikatnymi siatkami z najwyższą ostrożnością, aby uniknąć ich uszkodzenia. Ponadto podatność każdej próbki na witryfikację jest nieprzewidywalna; Cząstki często oddziałują z powierzchnią międzyfazową powietrze-woda lub ze stałą folią nośną pokrywającą siatki, co może prowadzić do tego, że cząstki przyjmują preferowaną orientację lub nie dostają się do otworów obrazowych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbki zostały przygotowane i zobrazowane w CryoEM Facility w MIT.nano na mikroskopach pozyskanych dzięki Fundacji Arnolda i Mabel Beckmanów. Urządzenia do obrazowania kąta zwilżania zostały wydrukowane w MIT Metropolis Maker Space. Dziękujemy laboratoriom Nieng Yan i Yimo Han oraz pracownikom MIT.nano za ich wsparcie podczas wdrażania tej metody. W szczególności dziękujemy dr Guanhui Gao i dr Sarah Sterling za ich wnikliwe dyskusje i opinie. Praca ta była wspierana przez granty NIH R01-GM144542, 5T32-GM007287 i granty NSF-CAREER 2046778. Badania w laboratorium Davisa są wspierane przez Fundację Alfreda P. Sloana, Fundusz Jamesa H. Ferry'ego, MIT J-Clinic i Rodzinę Whiteheadów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zlewka 250 ml (3x)Fisher02-555-25B
Zlewka 50 ml (2x)Corning1000-50
AcetonFisherA949-4
Folia aluminiowaFisher15-078-292
Nadsiarczan amonuFisher(I17874
Szkiełka nakrywkowe 50 mm x 24 mmMattek PCS-1.5-5024
CVD grafenGraphene SupermarketCVD-Cu-2x2
easiGlow wyładowczyTed-Pella91000S
EthanolMillipore-Sigma1.11727
Pęseta z płaską końcówką Fisher50-239-60
Nóż do szkłaGrainger21UE26
Szklana płytka Petriego i pokrywa VWR75845-544
Szklana pipeta serologicznaFisher13-676-34D
Walizka do przechowywania siatkiEMS71146-02
Płyta grzejnaFisher07-770-108
IsopropanolSigmaW292907
KimwipeFisher06-666
Nożyczki laboratoryjne Fisher13-806-2
Metakrylan metylu EL-6 KayakuMMA M310006 0500L1GL
Woda klasy molekularnejCorning46-000-CM
Pęseta o negatywnym działaniu (2x)Pipeta Fisher50-242-78
P20Pipeta Rainin17014392
P200Rainin17008652 
ParafilmFisher13-374-12
Końcówki do pipetRainin30389291
Siatki Quantifoil z dziurawym węglem Powlekarka EMSQ2100CR1
Spin SetCasKW-4Az uchwytem SCA-19-23
Termometr StraightedgeULINEH-6560
 Grainger3LRD1
Środek czyszczący UV/Ozone BioForceSKU: PC440
Eksykator próżniowyThomas Scientific1159X11
Papier WhatmanVWR28297-216

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chua, E. Y. D., et al. cheaper: Recent advances in cryo-electron microscopy. Annu Rev Biochem. 91, 1-32 (2022).
  2. Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, 00461(2013).
  3. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  4. Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
  5. Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Sci. 30 (1), 136-150 (2021).
  6. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).
  7. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  8. Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
  9. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383(2018).
  10. Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. High resolution single particle refinement in EMAN2.1. Methods. 100, 25-34 (2016).
  11. Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
  12. Kinman, L. F., Powell, B., Zhong, E., Berger, B., Davis, J. H. Uncovering structural ensembles from single particle cryo-EM data using cryoDRGN. Nat Protoc. 18 (2), 319-339 (2022).
  13. Zhong, E. D., Bepler, T., Berger, B., Davis, J. H. CryoDRGN: reconstruction of heterogeneous cryo-EM structures using neural networks. Nat Methods. 18 (2), 176-185 (2021).
  14. Chen, M., Ludtke, S. J. Deep learning-based mixed-dimensional Gaussian mixture model for characterizing variability in cryo-EM. Nat Methods. 18 (8), 930-936 (2021).
  15. Punjani, A., Fleet, D. J. 3D variability analysis: Resolving continuous flexibility and discrete heterogeneity from single particle cryo-EM. J Struct Biol. 213 (2), 107702(2021).
  16. Dashti, A., et al. Retrieving functional pathways of biomolecules from single-particle snapshots. Nat Commun. 11 (1), 4734(2020).
  17. Sun, J., Kinman, L. F., Jahagirdar, D., Ortega, J., Davis, J. H. KsgA facilitates ribosomal small subunit maturation by proofreading a key structural lesion. Nat Struct Mol Biol. , (2023).
  18. Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10 (1-2), 55-61 (1982).
  19. Dubochet, J. Cryo-EM--the first thirty years. J Microsc. 245 (3), 221-224 (2012).
  20. Glaeser, R. M., et al. Factors that influence the formation and stability of thin, cryo-EM specimens. Biophys J. 110 (4), 749-755 (2016).
  21. Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-Em grids. Curr Opin Colloid Interface Sci. 34, 1-8 (2018).
  22. D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747(2019).
  23. Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting. Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
  24. Chen, J., Noble, A. J., Kang, J. Y., Darst, S. A. Eliminating effects of particle adsorption to the air/water interface in single-particle cryo-electron microscopy: Bacterial RNA polymerase and CHAPSO. J Struct Biol X. 1, 100005(2019).
  25. Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nat Methods. 15 (10), 793-795 (2018).
  26. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 560-571 (2018).
  27. Neselu, K., et al. Measuring the effects of ice thickness on resolution in single particle cryo-EM. J Struct Biol X. 7, 100085(2023).
  28. Pantelic, R. S., et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. J Struct Biol. 174 (1), 234-238 (2011).
  29. Geim, A. K., Novoselov, K. S. The rise of graphene. Nat Mater. 6 (3), 183-191 (2007).
  30. Han, Y., et al. High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (2), 1009-1014 (2020).
  31. Fujita, J., et al. Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis. Sci Rep. 13 (1), 2279(2023).
  32. Lu, Y., et al. Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM. Nat Commun. 13 (1), 6718(2022).
  33. Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  34. Liu, N., et al. Bioactive functionalized monolayer graphene for high-resolution cryo-electron microscopy. J Am Chem Soc. 141 (9), 4016-4025 (2019).
  35. Benjamin, C. J., et al. Selective capture of histidine-tagged proteins from cell lysates using TEM grids modified with NTA-graphene oxide. Sci Rep. 6, 32500(2016).
  36. Wang, F., et al. General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24269-24273 (2020).
  37. Koh, A., et al. Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope. J Vis Exp. (181), (2022).
  38. Schweizer, P., et al. Mechanical cleaning of graphene using in situ electron microscopy. Nat Commun. 11 (1), 1743(2020).
  39. Li, Z., et al. Effect of airborne contaminants on the wettability of supported graphene and graphite. Nat Mater. 12 (10), 925-931 (2013).
  40. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  41. Zhu, X., et al. Cryo-EM structures reveal coordinated domain motions that govern DNA cleavage by Cas9. Nat Struct Mol Biol. 26 (8), 679-685 (2019).
  42. Croll, T. I. ISOLDE: a physically realistic environment for model building into low-resolution electron-density maps. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 519-530 (2018).
  43. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  44. Prydatko, A. V., Belyaeva, L. A., Jiang, L., Lima, L. M. C., Schneider, G. F. Contact angle measurement of free-standing square-millimeter single-layer graphene. Nat Commun. 9 (1), 4185(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Siatki powlekane grafenemprzygotowanie pr bek do krio EMl d witryfikowanytransmisyjna mikroskopia elektronowahydrofilowo siatekobraz dyfrakcyjnykompleks Cas9

Powiązane artykuły