Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zastosowanie jednowarstwowego grafenu w siatkach mikroskopii krioelektronowej do określania struktury w wysokiej rozdzielczości

45.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66023

⸱

10 listopada 2023

 ,  , 
1Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, 2Program in Computational and Systems Biology, Massachusetts Institute of Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Zastosowanie warstw nośnych do siatek kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryoEM) może zwiększyć gęstość cząstek, ograniczyć interakcje z interfejsem powietrze-woda, zredukować ruch wywołany wiązką i poprawić rozkład orientacji cząstek. W artykule opisano solidny protokół powlekania siatek krioEM monowarstwą grafenu w celu lepszego przygotowania próbek kriogenicznych.

Streszczenie

W kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryoEM), oczyszczone makrocząsteczki są nakładane na siatkę z dziurawą folią węglową; cząsteczki są następnie osuszane w celu usunięcia nadmiaru płynu i szybko zamrażane w warstwie lodu szklistego o grubości około 20-100 nm, zawieszonej w otworach foliowych o szerokości około 1 μm. Otrzymaną próbkę obrazuje się za pomocą kriogenicznej transmisyjnej mikroskopii elektronowej, a po przetworzeniu obrazu za pomocą odpowiedniego oprogramowania można określić struktury o rozdzielczości zbliżonej do atomowej. Pomimo powszechnego zastosowania cryoEM, przygotowanie próbek pozostaje poważnym wąskim gardłem w przepływach pracy cryoEM, a użytkownicy często napotykają wyzwania związane ze słabym zachowaniem próbek w zawieszonym lodzie szklistym. Ostatnio opracowano metody modyfikacji siatek krioEM za pomocą pojedynczej ciągłej warstwy grafenu, która działa jak powierzchnia nośna, która często zwiększa gęstość cząstek w obrazowanym obszarze i może zmniejszać interakcje między cząstkami a granicą faz powietrze-woda. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe protokoły dotyczące stosowania grafenu w siatkach krioelektromagnetycznych oraz szybkiej oceny względnej hydrofilowości powstałych siatek. Dodatkowo opisujemy metodę opartą na elektromagnetycznym w celu potwierdzenia obecności grafenu poprzez wizualizację jego charakterystycznego wzoru dyfrakcyjnego. Na koniec demonstrujemy użyteczność tych nośników grafenowych, szybko rekonstruując mapę gęstości kompleksu Cas9 o rozdzielczości 2,7 A przy użyciu czystej próbki o stosunkowo niskim stężeniu.

Wprowadzenie

Kriogeniczna mikroskopia elektronowa pojedynczej cząstki (cryoEM) stała się powszechnie stosowaną metodą wizualizacji makrocząsteczek biologicznych1. Napędzany postępami w bezpośredniej detekcji elektronów2,3,4, akwizycja danych5 i algorytmy przetwarzania obrazu6,7,8,9,10, cryoEM jest teraz w stanie wytwarzać struktury 3D o rozdzielczości zbliżonej do atomowej szybko rosnącej liczby makrocząsteczek11. Co więcej, wykorzystując jednocząsteczkowy charakter tego podejścia, użytkownicy mogą określić wiele struktur na podstawie jednej próbki12,13,14,15, podkreślając obietnicę wykorzystania wygenerowanych danych do zrozumienia heterogenicznych zespołów strukturalnych16,17. Pomimo tego postępu nadal występują wąskie gardła w przygotowywaniu siatek do próbek kriogenicznych.

Do charakterystyki strukturalnej za pomocą cryoEM, próbki biologiczne powinny być dobrze zdyspergowane w roztworze wodnym, a następnie muszą zostać błyskawicznie zamrożone w procesie zwanym witryfikacją18,19. Celem jest wychwycenie cząstek w jednolicie cienkiej warstwie zeszklonego lodu zawieszonej w regularnie rozmieszczonych otworach, które zwykle są wycinane w warstwie amorficznego węgla. Ta wzorzysta amorficzna folia węglowa jest podtrzymywana przez siatkę TEM z siatką z miedzianych lub złotych prętów nośnych. W standardowych przepływach pracy siatki są przekształcane w hydrofilowe metody za pomocą obróbki plazmowej jarzeniowej przed nałożeniem próbki. Nadmiar cieczy osusza się bibułą filtracyjną, dzięki czemu roztwór białka tworzy cienką warstwę cieczy w poprzek otworów, którą można łatwo zeszklone podczas zamrażania wgłębnego. Typowe wyzwania obejmują lokalizację cząstek na granicy faz powietrze-woda (AWI) i późniejszą denaturację20,21,22 lub przyjęcie preferowanych orientacji23,24,25, przyleganie cząstek do folii węglowej, a nie migrowanie do otworów, oraz grupowanie i agregacja cząstek w holes26. Kolejnym problemem jest niejednolita grubość lodu; Gruby lód może powodować wyższy poziom szumu tła na mikrofotografiach ze względu na zwiększone rozpraszanie elektronów, podczas gdy ekstremalnie cienki lód może wykluczać większe cząstki27.

Aby sprostać tym wyzwaniom, do powlekania powierzchni siatki użyto różnych cienkich folii podporowych, pozwalając cząsteczkom spoczywać na tych podporach i, idealnie, unikając interakcji z interfejsem powietrze-woda. Podpory grafenowe okazały się bardzo obiecujące, częściowo ze względu na ich wysoką wytrzymałość mechaniczną w połączeniu z minimalnym przekrojem rozpraszania, co zmniejsza sygnał tła dodawany przez warstwę nośną28. Oprócz minimalnego wpływu na szum tła, grafen wykazuje również niezwykłą przewodność elektryczną i cieplną29. Wykazano, że siatki pokryte grafenem i tlenkiem grafenu zapewniają wyższą gęstość cząstek, bardziej równomierny rozkład cząstek30 i zredukowaną lokalizację do klasy AWI22. Ponadto grafen zapewnia powierzchnię nośną, którą można dalej modyfikować w celu: 1) dostrojenia właściwości fizykochemicznych powierzchni siatki poprzez funkcjonalizację31,32,33; lub 2) para czynników łączących, które ułatwiają oczyszczanie powinowactwa białek będących przedmiotem zainteresowania34,35,36.

W tym artykule zmodyfikowaliśmy istniejącą procedurę powlekania siatek cryoEM pojedynczą jednolitą warstwą grafenu30. Modyfikacje mają na celu zminimalizowanie obsługi sieci w całym protokole, w celu zwiększenia wydajności i odtwarzalności. Dodatkowo omawiamy nasze podejście do oceny skuteczności różnych zabiegów UV/ozonu w renderowaniu siatek hydrofilowych przed zanurzeniem. Ten etap przygotowania próbki cryoEM przy użyciu siatek pokrytych grafenem ma kluczowe znaczenie i stwierdziliśmy, że nasza prosta metoda ilościowego określania względnej hydrofilowości powstałych siatek jest przydatna. Korzystając z tego protokołu, demonstrujemy użyteczność stosowania siatek pokrytych grafenem do określania struktury poprzez generowanie rekonstrukcji 3D w wysokiej rozdzielczości katalitycznie nieaktywnego S. pyogenes Cas9 w kompleksie z przewodnikiem RNA i docelowym DNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie grafenu CVD

  1. Przygotować roztwór do trawienia grafenu zgodnie z opisem poniżej.
    1. Rozpuścić 4,6 g nadsiarczanu amonu (APS) w 20 mL wody klasy molekularnej w zlewce o pojemności 50 mL, aby uzyskać roztwór 1 M, a następnie przykryć folią aluminiową. Pozostawić APS do całkowitego rozpuszczenia, przechodząc do kroku 1.2.
  2. Przygotować fragment grafenu CVD do powlekania polimetakrylanem metylu (MMA). Ostrożnie wyciąć kwadratowy fragment grafenu CVD. Przenieść kwadrat na szkiełko nakrywkowe (50 mm x 24 mm) w czystej szalce Petriego i pozostawić go przykrytego podczas transportu do powlekarki wirówkowej.
    ​UWAGA: Kwadrat o wymiarach 18 mm x 18 mm powinien pozwolić na uzyskanie 25-36 siatek powlekanych grafenem.

2. Pokrywanie grafenu CVD warstwą MMA

  1. Ustaw parametry spin coatera na 60 s szybkiego wirowania przy 2 500 rpm. Ostrożnie umieść grafen CVD na odpowiednio dobranym uchwycie.
    ​UWAGA: Idealnie grafen CVD powinien wystawać 1-2 mm poza krawędź wybranego uchwytu, aby zapobiec zassaniu MMA do układu próżniowego.
  2. Naciśnij przycisk Take/Absorb, aby uruchomić pompę próżniową i przymocować grafen CVD do uchwytu. Nanieś MMA na środek kwadratu z grafenu CVD, zamknij pokrywę i natychmiast naciśnij przycisk Start/Stop. Dla kwadratu grafenu CVD o wymiarach 18 mm x 18 mm wystarczająca jest ilość 40 µL MMA.
  3. Po zatrzymaniu wirowania wyłącz pompę próżniową i ostrożnie pobierz pęsetą pokryty MMA grafen CVD. Odwróć grafen CVD tak, aby strona pokryta MMA była skierowana w dół, i połóż go z powrotem na szklanej lamellce.

3. Trawienie plazmowe tylnej strony grafenu

  1. Przenieść graffen CVD na szkiełku podstawnym do urządzenia do wyładowań żarowych i poddać działaniu wyładowania żarowego przez 30 s przy natężeniu 25 mA, używając pęsety z płaskimi końcami.
  2. Przenieść graffen CVD na szkiełku podstawnym z powrotem do szalki Petriego i przykryć go podczas transportu do miejsca trawienia miedzi. Powłoka MMA zabezpieczy górną warstwę grafenu przed trawieniem plazmowym.

4. Wycinanie kwadratów grafenu CVD powleczonego MMA o rozmiarach siatki

  1. Użyj dwóch par pęset do podtrzymania kwadratu grafenu CVD. Zwróć uwagę na orientację kwadratu grafenu CVD; podczas trzymania pęsetami strona z MMA musi być skierowana do góry (KRYTYCZNE).
  2. Wytnij grafen CVD w kwadraty o wymiarach około 3 mm x 3 mm. W tym kroku użyj  dwóch zestawów pęset z blokadą (tzw. reverse-action forceps) , aby trzymać kwadrat grafenu CVD stroną prawą do góry i unieruchomić go w pozycji, a także aby przytrzymać krawędź kwadratu 3 mm x 3 mm po odcięciu go od reszty materiału.

5. Rozpuszczanie podłoża miedzianego z grafenu CVD pokrytego PMMA

  1. Każdy kwadrat o wymiarach 3 mm x 3 mm należy ostrożnie umieścić na powierzchni roztworu APS. Przed zwolnieniem każdego kwadratu należy upewnić się, że styka się on z powierzchnią roztworu APS. Zlewnik należy przechylić tak, aby każdy kwadrat mógł zostać umieszczony w roztworze pod niewielkim kątem; zapobiega to zatonięciu kwadratu.
  2. Zlewnik należy przykryć folią aluminiową i inkubować przez noc w temperaturze 25 °C.

6. Usuwanie błon MMA/grafenowych z podłoży APS

  1. Należy użyć szklanego szkiełka podstawowego o wymiarach 12 mm x 50 mm i wyłowić kwadraty z MMA/grafenu z roztworu APS, delikatnie zanurzając szkiełko pionowo w APS, a następnie przesuwając je bocznie tak, aby dotknęło pływającego kwadratu z MMA/grafenu.
  2. Należy ostrożnie wyjąć szkiełko, upewniając się, że kwadrat całkowicie przylega do jego boku podczas wyciągania.
  3. Przenieść kwadraty z MMA/grafenu do czystego zlewki o pojemności 50 mL wypełnionej wodą klasy molekularnej na 20 min. Delikatnie zanurzyć szkiełko z przytwierdzonym kwadratem z MMA/grafenu pionowo w wodzie, upewniając się, że kwadrat oddziela się od szkiełka w momencie kontaktu z powierzchnią wody. Powtórzyć czynność dla wszystkich kwadratów z MMA/grafenu.

7. Mocowanie grafenu do siatek

  1. Używając pincety o działaniu negatywnym, ostrożnie zanurz siatkę pionowo w wodzie stroną węglową w stronę pływającego kwadratu MMA/grafenu. Po zetknięciu z kwadratem ostrożnie wyjmij siatkę, upewniając się, że kwadrat całkowicie przylega do węglowej strony siatki po jej wyjęciu. Aby zapobiec uszkodzeniu pól siatki, zminimalizuj ruchy boczne siatki podczas zanurzenia w wodzie (KRYTYCZNE).
  2. Umieść siatki stroną z MMA/grafenem do góry na czystym szkiełku nakrywkowym i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 1 do 2 min. Przenieś szkiełko nakrywkowe z siatkami powleczonymi grafenem/MMA na płytkę grzejną ustawioną na 130 °C, używając pincety z płaskimi końcówkami.
  3. Przykryj górną częścią szklanej szalki Petriego i inkubuj przez 20 min. Zdejmij z podgrzewacza i studź do temperatury pokojowej przez 1 do 2 min.
    ​OSTRZEŻENIE: Zachowaj ostrożność, ponieważ górna część szalki Petriego będzie bardzo gorąca.

8. Rozpuszczanie MMA w acetonie

  1. Przenieś całą lamellkę do szalki Petriego wypełnionej 15 mL acetonu. Inkubuj przez 30 min.
  2. Za pomocą czystej szklanej pipety serologicznej przenieś aceton, w którym inkubowano siatki, do pojemnika na odpady. Ostrożnie dodaj 15 mL świeżego acetonu do szalki Petriego, używając czystej szklanej pipety serologicznej. Inkubuj przez 30 min.
  3. Powtórz te etapy płukania, aby łącznie przeprowadzić 3 płukania acetonem.

9. Usuwanie pozostałości acetonu za pomocą izopropanolu

  1. Po trzykrotnym płukaniu acetonem usunąć aceton i zastąpić go 15 mL izopropanolu, używając czystej szklanej pipety serologicznej. Inkubować przez 20 min.
  2. Powtórzyć czynność 3 razy, aby łącznie przeprowadzić 4 płukania izopropanolem. Ostrożnie wyjąć siatki z izopropanolu i wysuszyć je na powietrzu na czystym szkiełku nakrywkowym za pomocą pęsety.
    UWAGA: Pozostałości izopropanolu mogą utrudniać zwolnienie siatek z pęsety. Problem ten można rozwiązać, doprowadzając do kontaktu siatki z czystym szkiełkiem nakrywkowym przed puszczeniem siatki z pęsety.
  3. Odparować resztki substancji organicznych, przenosząc szkiełko nakrywkowe z pokrytymi grafenem siatkami na płytkę grzejną ustawioną na 100 °C na 10 min. Schłodzić do temperatury pokojowej i przechowywać w próżni do momentu użycia.

10. Opracowanie siatek pokrytych grafenem za pomocą promieniowania UV/ozonu

  1. Używając pęsety z odwróconym chwytem, delikatnie umieść siatki w czystym obszarze naświetlania w czyszczarce UV/ozonowej, stroną pokrytą grafenem do góry.
  2. Zasuń osłonę obszaru naświetlania i włącz urządzenie. Ustaw pokrętło czasu na wyznaczony czas obróbki, aby rozpocząć traktowanie siatek UV/ozonem..
    UWAGA: Czas obróbki jest parametrem regulowanym, a zbyt długa ekspozycja może uszkodzić siatkę. Han et al.30 zalecają 10 min obróbki UV/ozonowej; ustaliliśmy, że czas 10 min jest również wystarczający. Patrz krok 12 w celu uzyskania wskazówek dotyczących dostrajania czasu tej obróbki.
  3. Przejdź bezpośrednio do mrożenia próbki cryoEM na potraktowanych siatkach, postępując zgodnie z etapami mrożenia opisanymi przez Koh et al.37.
    UWAGA: Węglowodory atmosferyczne mogą gromadzić się na powierzchni siatki po obróbce UV/ozonowej i zwiększać hydrofobowość powierzchni grafenowej38,39. Aby tego uniknąć, mroź siatki potraktowane UV/ozonem niezwłocznie. Wskazane może być traktowanie siatek UV/ozonem w partiach, na przykład obróbka sześciu siatek i natychmiastowe ich mrożenie, a następnie obróbka drugiej partii siatek i mrożenie tej drugiej partii.

11. Rejestracja obrazu dyfrakcyjnego

  1. Upewnij się, że mikroskop jest odpowiednio nastrojony, ustalono równoległe oświetlenie, a końcowy defokus ustawiono na -0.2 µm.
  2. W pełni wsuń ekran fluorescencyjny oraz przesłonę wiązki (beam stop). Przejdź do trybu dyfrakcyjnego, aby wyraźnie zwizualizować punkty dyfrakcyjne.
  3. Nabyj obraz za pomocą kamery CCD i oceń go przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu.
    UWAGA: Najłatwiejszymi do zaobserwowania i zidentyfikowania punktami dyfrakcyjnymi generowanymi przez monowarstwę grafenu są 6 punktów odpowiadających częstotliwości przestrzennej 2.13 Å. Użyj narzędzia pomiarowego, aby oszacować odległość od centrum dyfrakcyjnej wiązki do jednego z tych punktów w jednostkach odwrotnych. W szczególności 2.13 Å figure-protocol-1 0.47 Å-1.

12. Ocena hydrofilowości siatki

  1. Przygotować zestaw do obrazowania. Przygotować statyw na telefon, blat do obrazowania, telefon z aparatem, szkiełko podstawowe oraz folię parafinową. Zdjęcia przedstawione w niniejszej publikacji uzyskano przy użyciu statywu na telefon oraz blatu do obrazowania wydrukowanych w technologii 3D z dostarczonych plików .stl, co pozwoliło na łatwiejszą reprodukcję i kwantyfikację pomiarów kąta zwilżania (Supplementary Figure 1A).
  2. Położyć szkiełko podstawowe na płaskiej powierzchni, następnie wyciąć kwadrat z folii parafinowej o wymiarach 1 cm na 1 cm i umieścić go na szkiełku podstawowym. Umieścić telefon na statywie, ustawiając go tak, aby aparat znajdował się w jednej płaszczyźnie ze szkiełkiem podstawowym. Przymocować telefon w tej pozycji za pomocą gumek recepturek (Supplementary Figure 1B). Wykonać zdjęcie próbne, aby zweryfikować, czy aparat jest wyrównany z powierzchnią obrazowania.
  3. Bezpośrednio po obróbce siatek pokrytych grafenem w atmosferze UV/ozon, umieścić jedną siatkę na kwadracie folii parafinowej na szkiełku podstawowym. Upewnić się, że strona z grafenem jest skierowana do góry. Za pomocą pipety nanieść kroplę wody o objętości 2 µL na środek powierzchni siatki i natychmiast wykonać zdjęcie.
    UWAGA: Powtórzyć ten krok po: i) wybranych odstępach czasu obróbki UV/ozon, aby określić wystarczający czas trwania procesu; lub ii) wybranych odstępach czasu po obróbce UV/ozon, aby zmierzyć, jak długo po obróbce powierzchnia siatki zachowuje swój charakter hydrofilowy.
  4. Obliczyć kąty zwilżania na podstawie zdjęć, importując je do programu ImageJ43 i korzystając z wtyczki do pomiaru kąta zwilżania.

13. Analiza pojedynczych cząsteczek zbioru danych kompleksu dCas9

UWAGA: Cały proces przetwarzania obrazów opisany w niniejszym protokole został przeprowadzony przy użyciu oprogramowania cryoSPARC w wersji 4.2.1.

  1. Przeprowadź wstępne przetwarzanie filmów za pomocą zadań Patch Motion Correction oraz Patch CTF Estimation. Wykonaj wybieranie cząstek (particle picking) przy użyciu zadania Blob picker, stosując sferyczny blob o średnicy od 115 Å do 135 Å.
  2. Wyodrębnij cząstki za pomocą zadania Extract from micrographs, stosując znormalizowany współczynnik korelacji (NCC) oraz progi mocy, aby uzyskać około 200-300 cząstek na jedną mikrografię. Należy pamiętać, że odpowiednie progi i wynikowa liczba cząstek mogą się różnić, dlatego użytkownicy powinni ocenić jakość wyboru na serii mikrografii w celu zidentyfikowania optymalnych warunków.
  3. Wykonaj wieloklasowe rekonstrukcje początkowe za pomocą zadania Ab-initio reconstruction, określając trzy klasy. Dwie z trzech klas prawdopodobnie będą zawierać cząstki inne niż Cas9, w tym zanieczyszczenia powierzchniowe. Wybierz klasę przypominającą dCas9 do dalszego przetwarzania.
    UWAGA: Można zastosować dodatkowe rundy wieloklasowej rekonstrukcji Ab-initio lub rafinacji heterogenicznej (Heterogeneous refinement), aby dodatkowo udoskonalić zestaw cząstek.
  4. Przeprowadź rafinację 3D za pomocą zadania Non-uniform Refinement, wybierając parametry domyślne. Oszacuj rozdzielczość rekonstrukcji za pomocą zadań Validation (FSC) oraz ThreeDFSC, wykorzystując mapy i maskę z końcowej rafinacji 3D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pomyślne wykonanie siatek do krio-EM powlekanych grafenem przy użyciu sprzętu (Rycina 1) i protokołu (Rycina 2) opisanych w niniejszym opracowaniu pozwoli na uzyskanie monowarstwy grafenu pokrywającej otwory w folii, co można potwierdzić na podstawie charakterystycznego obrazu dyfrakcyjnego. Aby zwiększyć adsorpcję białek na powierzchni grafenu, można zastosować traktowanie UV/ozonem, co uczyni powierzchnię hydrofilową poprzez wprowadzenie grup funkcyjnych zawie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przygotowanie próbek CryoEM wiąże się z wieloma wyzwaniami technicznymi, przy czym większość procesów roboczych wymaga od badaczy ręcznego manipulowania delikatnymi siatkami z najwyższą ostrożnością, aby uniknąć ich uszkodzenia. Ponadto podatność każdej próbki na witryfikację jest nieprzewidywalna; Cząstki często oddziałują z powierzchnią międzyfazową powietrze-woda lub ze stałą folią nośną pokrywającą siatki, co może prowadzić do tego, że cząstki przyjmują preferowaną orientację lub nie dostają się do otworów obrazowych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Podziękowania

Próbki zostały przygotowane i zobrazowane w CryoEM Facility w MIT.nano na mikroskopach pozyskanych dzięki Fundacji Arnolda i Mabel Beckmanów. Urządzenia do obrazowania kąta zwilżania zostały wydrukowane w MIT Metropolis Maker Space. Dziękujemy laboratoriom Nieng Yan i Yimo Han oraz pracownikom MIT.nano za ich wsparcie podczas wdrażania tej metody. W szczególności dziękujemy dr Guanhui Gao i dr Sarah Sterling za ich wnikliwe dyskusje i opinie. Praca ta była wspierana przez granty NIH R01-GM144542, 5T32-GM007287 i granty NSF-CAREER 2046778. Badania w laboratorium Davisa są wspierane przez Fundację Alfreda P. Sloana, Fundusz Jamesa H. Ferry'ego, MIT J-Clinic i Rodzinę Whiteheadów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zlewka 250 ml (3x)Fisher02-555-25B
Zlewka 50 ml (2x)Corning1000-50
AcetonFisherA949-4
Folia aluminiowaFisher15-078-292
Nadsiarczan amonuFisher(I17874
Szkiełka nakrywkowe 50 mm x 24 mmMattek PCS-1.5-5024
CVD grafenGraphene SupermarketCVD-Cu-2x2
easiGlow wyładowczyTed-Pella91000S
EthanolMillipore-Sigma1.11727
Pęseta z płaską końcówką Fisher50-239-60
Nóż do szkłaGrainger21UE26
Szklana płytka Petriego i pokrywa VWR75845-544
Szklana pipeta serologicznaFisher13-676-34D
Walizka do przechowywania siatkiEMS71146-02
Płyta grzejnaFisher07-770-108
IsopropanolSigmaW292907
KimwipeFisher06-666
Nożyczki laboratoryjne Fisher13-806-2
Metakrylan metylu EL-6 KayakuMMA M310006 0500L1GL
Woda klasy molekularnejCorning46-000-CM
Pęseta o negatywnym działaniu (2x)Pipeta Fisher50-242-78
P20Pipeta Rainin17014392
P200Rainin17008652 
ParafilmFisher13-374-12
Końcówki do pipetRainin30389291
Siatki Quantifoil z dziurawym węglem Powlekarka EMSQ2100CR1
Spin SetCasKW-4Az uchwytem SCA-19-23
Termometr StraightedgeULINEH-6560
 Grainger3LRD1
Środek czyszczący UV/Ozone BioForceSKU: PC440
Eksykator próżniowyThomas Scientific1159X11
Papier WhatmanVWR28297-216

Bibliografia

  1. Chua, E. Y. D., et al. cheaper: Recent advances in cryo-electron microscopy. Annu Rev Biochem. 91, 1-32 (2022).
  2. Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, 00461(2013).
  3. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  4. Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
  5. Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Sci. 30 (1), 136-150 (2021).
  6. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).
  7. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  8. Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
  9. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383(2018).
  10. Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. High resolution single particle refinement in EMAN2.1. Methods. 100, 25-34 (2016).
  11. Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
  12. Kinman, L. F., Powell, B., Zhong, E., Berger, B., Davis, J. H. Uncovering structural ensembles from single particle cryo-EM data using cryoDRGN. Nat Protoc. 18 (2), 319-339 (2022).
  13. Zhong, E. D., Bepler, T., Berger, B., Davis, J. H. CryoDRGN: reconstruction of heterogeneous cryo-EM structures using neural networks. Nat Methods. 18 (2), 176-185 (2021).
  14. Chen, M., Ludtke, S. J. Deep learning-based mixed-dimensional Gaussian mixture model for characterizing variability in cryo-EM. Nat Methods. 18 (8), 930-936 (2021).
  15. Punjani, A., Fleet, D. J. 3D variability analysis: Resolving continuous flexibility and discrete heterogeneity from single particle cryo-EM. J Struct Biol. 213 (2), 107702(2021).
  16. Dashti, A., et al. Retrieving functional pathways of biomolecules from single-particle snapshots. Nat Commun. 11 (1), 4734(2020).
  17. Sun, J., Kinman, L. F., Jahagirdar, D., Ortega, J., Davis, J. H. KsgA facilitates ribosomal small subunit maturation by proofreading a key structural lesion. Nat Struct Mol Biol. , (2023).
  18. Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10 (1-2), 55-61 (1982).
  19. Dubochet, J. Cryo-EM--the first thirty years. J Microsc. 245 (3), 221-224 (2012).
  20. Glaeser, R. M., et al. Factors that influence the formation and stability of thin, cryo-EM specimens. Biophys J. 110 (4), 749-755 (2016).
  21. Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-Em grids. Curr Opin Colloid Interface Sci. 34, 1-8 (2018).
  22. D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747(2019).
  23. Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting. Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
  24. Chen, J., Noble, A. J., Kang, J. Y., Darst, S. A. Eliminating effects of particle adsorption to the air/water interface in single-particle cryo-electron microscopy: Bacterial RNA polymerase and CHAPSO. J Struct Biol X. 1, 100005(2019).
  25. Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nat Methods. 15 (10), 793-795 (2018).
  26. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 560-571 (2018).
  27. Neselu, K., et al. Measuring the effects of ice thickness on resolution in single particle cryo-EM. J Struct Biol X. 7, 100085(2023).
  28. Pantelic, R. S., et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. J Struct Biol. 174 (1), 234-238 (2011).
  29. Geim, A. K., Novoselov, K. S. The rise of graphene. Nat Mater. 6 (3), 183-191 (2007).
  30. Han, Y., et al. High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (2), 1009-1014 (2020).
  31. Fujita, J., et al. Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis. Sci Rep. 13 (1), 2279(2023).
  32. Lu, Y., et al. Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM. Nat Commun. 13 (1), 6718(2022).
  33. Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  34. Liu, N., et al. Bioactive functionalized monolayer graphene for high-resolution cryo-electron microscopy. J Am Chem Soc. 141 (9), 4016-4025 (2019).
  35. Benjamin, C. J., et al. Selective capture of histidine-tagged proteins from cell lysates using TEM grids modified with NTA-graphene oxide. Sci Rep. 6, 32500(2016).
  36. Wang, F., et al. General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24269-24273 (2020).
  37. Koh, A., et al. Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope. J Vis Exp. (181), (2022).
  38. Schweizer, P., et al. Mechanical cleaning of graphene using in situ electron microscopy. Nat Commun. 11 (1), 1743(2020).
  39. Li, Z., et al. Effect of airborne contaminants on the wettability of supported graphene and graphite. Nat Mater. 12 (10), 925-931 (2013).
  40. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  41. Zhu, X., et al. Cryo-EM structures reveal coordinated domain motions that govern DNA cleavage by Cas9. Nat Struct Mol Biol. 26 (8), 679-685 (2019).
  42. Croll, T. I. ISOLDE: a physically realistic environment for model building into low-resolution electron-density maps. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 519-530 (2018).
  43. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  44. Prydatko, A. V., Belyaeva, L. A., Jiang, L., Lima, L. M. C., Schneider, G. F. Contact angle measurement of free-standing square-millimeter single-layer graphene. Nat Commun. 9 (1), 4185(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Siatki powlekane grafenemprzygotowanie próbek do krio-EMlód witryfikowanytransmisyjna mikroskopia elektronowahydrofilowość siatekobraz dyfrakcyjnykompleks Cas9
Zastosowanie jednowarstwowego grafenu w siatkach mikroskopii krioelektronowej do określania struktury w wysokiej rozdzielczości
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.