Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Opracowanie mysiego modelu ortodontycznego szczęki

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66033

⸱

27 października 2023

 ,  , 
1State Key Laboratory of Oral Diseases and National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2Department of Endodontics, West China Stomatology Hospital, Sichuan University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj demonstrujemy krok po kroku łatwy do opanowania, ortodontyczny protokół ruchu zębów operowany na mysim modelu szczęki. Dzięki wyraźnemu wyjaśnieniu każdego kroku i wizualnej demonstracji, naukowcy mogą opanować ten model i zastosować go do swoich potrzeb eksperymentalnych za pomocą kilku modyfikacji.

Streszczenie

Ze względu na brak powtarzalnych protokołów do tworzenia mysiego modelu ortodontycznego szczęki, przedstawiamy niezawodny i powtarzalny protokół, aby dostarczyć badaczom realnego narzędzia do analizy mechanicznej przebudowy kości związanej z obciążeniem. W tym opracowaniu przedstawiono szczegółowy schemat blokowy wraz z różnymi rodzajami schematów ideowych, zdjęciami operacyjnymi i filmami. Przeprowadziliśmy ten protokół na 11 dorosłych myszach C57 / B6J typu szerokokątnego i zebraliśmy próbki w 3, 8 i 14 dniu po operacji. Mikrotomografia komputerowa i dane histopatologiczne dowiodły skuteczności ruchów zębów w połączeniu z przebudową kości przy użyciu tego protokołu. Ponadto, zgodnie z wynikami mikrotomografii komputerowej w dniach 3, 8 i 14, podzieliliśmy modelowanie kości na trzy etapy: etap przygotowania, etap resorpcji kości i etap tworzenia kości. Oczekuje się, że etapy te pomogą badaczom zajmującym się różnymi etapami w rozsądnym ustaleniu czasu pobierania próbek. Protokół ten może wyposażyć naukowców w narzędzie do przeprowadzania analizy regeneracyjnej przebudowy kości.

Wprowadzenie

Kość jest wysoce aktywną zrekonstruowaną tkanką, która dostosowuje swój rozmiar, kształt i właściwości przez cały okres życia osobnika1,2. Oprócz hormonów, starzenia się, odżywiania i innych czynników biologicznych lub biochemicznych3, idea, że obciążenie mechaniczne jest najważniejszym czynnikiem decydującym, zyskała ogólną akceptację4,5. W pewnych okolicznościach, przy nieprawidłowym obciążeniu mechanicznym, brak równowagi między resorpcją kości a tworzeniem kości może prowadzić do nieprawidłowej przebudowy kości i zaburzeń kostnych. Choroby kości, takie jak nieużywanie, osteoporoza i utrata masy kostnej podczas długotrwałego leżenia w łóżku lub w obecności mikrograwitacji podczas lotu kosmicznego, mają ścisły związek z nieprawidłowym obciążeniem mechanicznym6,7,8.

Obciążenie mechaniczne było również używane do leczenia chorób związanych z kośćmi, takich jak leczenie rozproszenia uwagi i leczenie ortodontyczne. Leczenie rozproszenia uwagi było stosowane w chorobach rozwojowych, takich jak kraniosynostoza i hipoplazja żuchwy9,10, podczas gdy leczenie ortodontyczne było szeroko stosowane w celu skorygowania nieprawidłowej pozycji zębów i wszelkich wad zgryzu11. Istotą leczenia ortodontycznego jest również zarządzanie obciążeniem mechanicznym. Kiedy tkanka kostna jest poddawana obciążeniu mechanicznemu, wysoce skoordynowany proces przebudowy kości jest indukowany przez sprzężenie resorpcji kości, po której następuje tworzenie kości, która może przesuwać zęby, aby osiągnąć cel ortodontyczny12,13.

Chociaż leczenie ortodontyczne jest szeroko stosowane w praktyce klinicznej, ponieważ nasza wiedza na temat biologicznych skutków obciążenia mechanicznego jest ograniczona, wyniki leczenia ortodontycznego są niekontrolowane. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, stworzono kilka modeli zwierzęcych, takich jak mysz, szczur, królik, kot, pies, małpa i świnia, w celu zbadania mechanizmu leżącego u podstaw mechanicznej przebudowy kości wywołanej obciążeniem (Tabela 1)14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31, 32. Duże zwierzęta, takie jak psy, małpy i świnie, mają pewną przewagę nad małymi zwierzętami w operacjach ortodontycznych - mają bardziej ludzkie zęby i uzębienie, dzięki czemu zabieg chirurgiczny jest łatwy do powtórzenia u ludzi. Dodatkowo, szeroki widok może zmniejszyć trudność operacji i umożliwić zastosowanie różnych schematów ortodontycznych33,34. Jednak duże zwierzęta są trudne do pozyskania, co prowadzi do wyzwań związanych z wielkością próby i podlegają ograniczeniom etycznym35. Ponadto rutynowe procedury ekstrakcji i skomplikowane instrumenty utrudniają przeprowadzanie eksperymentów, przez co rzadko wykorzystuje się duże zwierzęta.

W takich okolicznościach, gryzonie są głównie wykorzystywane do tworzenia modeli ortodontycznych. Wśród tych modeli szczury i króliki mają mniejszą trudność operacyjną i więcej schematów ruchów zębów w porównaniu z myszami. Jednak model mysi ma tę wyjątkową zaletę, że dostępna jest duża liczba genetycznie zmodyfikowanych myszy, co jest szczególnie ważne dla badania mechanizmów leżących u podstaw 36. Jednak model mysi jest najtrudniejszy do manipulowania ze względu na jego mały rozmiar. Przeglądając obecne metody, przesunięcie pierwszego zęba trzonowego w kierunku mezjalnym jest jedyną praktyczną metodą dla modelu ortodontycznego. Dwa urządzenia służą głównie do przesuwania sprężyny cewki zęba i elastycznej opaski. Korzystanie z gumki jest łatwiejsze, ale siła ortodontyczna jest bardzo zróżnicowana, co utrudnia uzyskanie stabilnych rezultatów.

Xu et al.15 stworzyli model mysi ze sprężyną śrubową na żuchwie. Jednak ze względu na ruchomość żuchwy i obturacyjny charakter języka, operacja szczęki jest zawsze pierwszym wyborem zarówno w rozważaniach śródoperacyjnych, jak i pooperacyjnych. Taddei et al.16 opisali bardziej szczegółowy protokół dotyczący mysiej szczęki 10 lat temu i należy dodać więcej szczegółów wizualnych i przezroczystych. Podsumowując, w protokole tym systematycznie opisano szczegółowy protokół ortodontycznego ruchu zębów w mysim modelu szczękowym, aby pomóc naukowcom opanować metodę modelowania w ustandaryzowany sposób i umożliwić ocenę porównawczą między różnymi badaniami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedury na zwierzętach w tym badaniu zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet Etyczny Zachodniochińskiej Szkoły Stomatologii, Uniwersytetu Sichuan (WCHSIRB-D-2017-041). W tym badaniu wykorzystano dorosłe myszy C57BL/6 (patrz tabela materiałów). Protokół ten dodaje obciążenie mechaniczne do prawego pierwszego trzonowca szczęki (M1) dla ruchu mezjalnego, w którym wysoce skoordynowany proces przebudowy kości jest indukowany przez sprzężenie resorpcji kości i tworzenia kości (Rysunek 1).

1. Przygotowanie przedoperacyjne

  1. Artykuły chirurgiczne
    1. Przygotuj następujące elementy chirurgiczne do operacji: platforma chirurgiczna (Rysunek 2A), mocowanie (Rysunek 2B), narzędzia chirurgiczne (Rysunek 2C i Rysunek uzupełniający S1), materiały ortodontyczne (Rysunek 2C) oraz materiały do odbudowy zębów (Rysunek 2D).
      UWAGA: Dostosowana sprężyna śrubowa jest wykonana na zamówienie i zapewnia siłę 10 cN po rozciągnięciu do 10 mm.
  2. sterylizacja
    1. Sterylizować narzędzia chirurgiczne w autoklawie, a wszystkie przedmioty chirurgiczne promieniowaniem ultrafioletowym przez co najmniej 30 minut.
  3. znieczulenie
    1. Znieczulić mysz, podając ketaminę (100 mg/kg) i diazepam (5 mg/kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym.
    2. Nałóż maść weterynaryjną na oczy myszy za pomocą bawełnianego patyczka, aby uniknąć wysuszenia oczu.
    3. Kontynuuj operację tylko wtedy, gdy mysz nie reaguje, gdy jej palce u nóg są ściśnięte kleszczami.

2. Proces chirurgiczny

  1. Rozłóż i przyklej kończyny znieczulonej myszy w pozycji leżącej na plecach do platformy operacyjnej za pomocą taśmy klejącej.
  2. Przypnij igłę 27 G po obu stronach powyżej głowy i kolejną igłę 27 G po obu stronach poniżej pachy.
  3. Owiń gumkę wokół powyższych dwóch igieł i górnych siekaczy, a drugą wokół kolejnych dwóch igieł i dolnych siekaczy. Zmień pozycje igły, aby kontrolować stopień otwarcia i orientację jamy ustnej (Rysunek 3A).
    UWAGA: W przypadku ortodontycznej operacji przesuwania zębów należy maksymalnie otworzyć usta, zanim buccinatora stanie się całkowicie szczelny. Język należy pociągnąć w stronę nieoperacyjną, aby odsłonić pole operacyjne i zapobiec niedokrwieniu.
  4. Zegnij 1,5 mm koniec drutu ze stali nierdzewnej 304 o długości 3 cm i wepchnij zagięty koniec przez przestrzeń międzypromienną między M1 a drugim zębem trzonowym szczęki (M2) od strony policzkowej za pomocą zakrzywionej pęsety okulistycznej (Rysunek 3B). Gdy podniebienny koniec drutu ligaturowego jest widoczny od strony podniebiennej, wyciągnij go do około połowy jego długości i przełóż przez jeden koniec niestandardowej sprężyny śrubowej.
  5. Zawiąż kwadratowy węzeł dwoma końcami drutu ligaturowego w kierunku mezjalnym szczęki M1, aż sprężyna zostanie mocno przymocowana do zęba (Rysunek 3C). Odejmij nadmiar drutu.
  6. Podobnie przebij drugi drut ze stali nierdzewnej 304 o długości 3 cm przez drugi koniec sprężyny śrubowej.
  7. Oczyść i osusz powierzchnie siekaczy wacikami. Nałóż kleje na wszystkie te powierzchnie za pomocą wacików i utwardź je światłem.
  8. Przełóż drugi drut ze stali nierdzewnej przez przestrzeń międzyzębową między siekaczami szczęki i zawiąż węzeł poślizgowy w kierunku wargowym (Rysunek 3D). Odejmij nadmiar drutu i spraw, aby reszta drutu leżała blisko powierzchni zęba.
  9. Wstrzyknąć światłoutwardzalną żywicę, aby pokryć węzeł i siekacze; utwardzić żywicę światłem (Rysunek 3E).

3. Postępowanie pooperacyjne

  1. Po zabiegu należy wstrzyknąć myszom dootrzewnowo 0,05 mg/kg buprenorfiny w celu znieczulenia pooperacyjnego.
  2. Umieść znieczuloną mysz na termostatycznym kocu elektrycznym o temperaturze 37 °C. Kiedy mysz odzyska przytomność podczas poruszania się, umieść ją z powrotem w oddzielnej klatce.
  3. Ze względu na ograniczoną funkcję siekaczy po operacji należy zastąpić zwykłą paszę twardą wyłącznie miękką dietą.
  4. Codziennie sprawdzaj aparaty ortodontyczne. Jeśli podczas inspekcji zostaną zaobserwowane jakiekolwiek warunki, które wpływają na przewodzenie siły ortodontycznej, takie jak deformacja sprężyny, poluzowanie sprężyny i odpadnięcie urządzenia, mysz powinna zostać wykluczona z eksperymentu.
  5. Aby zachować porównywalność eksperymentów, należy codziennie oceniać wagę myszy po operacji. Wszystkie myszy wykazujące utratę masy ciała przekraczającą 30% ich masy ciała sprzed operacji muszą zostać wykluczone z eksperymentu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przeprowadzono operację OTM u 11 dorosłych samców myszy (C57/BL6, w wieku 3 miesięcy). Zostały one poddane eutanazji w celu analizy wyników w 3., 8. i 14. dniu po zabiegu. W tych eksperymentach prawa strona szczęki stanowiła stronę operowaną, natomiast lewa strona szczęki była stroną kontrolną. Mikro-TK wykazało czasowy, sukcesywny wzrost odległości między M1 a M2: odpowiednio 30 µm, 70 µm i 110 µm w 3., 8. i 14. dniu po operacji (Rysunek 4). W obrębie więzadła przyzębnego o niskiej gęstości...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym artykule staraliśmy się krok po kroku opisać najprostszy protokół ortodontycznego ruchu zębów na mysim modelu szczęki, aby zbadać utajone mechanizmy przebudowy kości wywołanej obciążeniem mechanicznym. Oprócz badań nad przebudową kości, istnieją jeszcze inne główne zastosowania tej metody: 1) badania metodologiczne nad przyspieszeniem ruchu zębów ortodontycznych; 2) badania nad ortodontyczną resorpcją korzeni; 3) biologiczne mechanizmy ortodontycznego przemieszczania się zębów i bólu; 4) badania nad modelem transge...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin 82100982 grantu dla F.L.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Modele eksperymentalne: Linie myszy
C57/B6J Firma Gempharmatech Zwierzęta Doświadczalne C57/B6J
Krytyczne testy komercyjne
Zestaw do barwienia hematoksyliną i eozyną BiosharpBL700B
Masson" s Zestaw bejc trichromowychSolarbioG1340
Instruments
27 G igłaChengdu Xinjin Shifeng Aparatura medyczna i Instrumenty Co., Sp. z o.o.SB1-074(IV)
KlejeMinnesota Mining and Manufacturing Co., Ltd.41282
Tablica korkowaDELI Group Co., Ltd.8705
Kulki bawełnianeHaishi Hainuo Group Co.,   Ltd.
Patyczki bawełnianeLakong Medical Devices Co., Ltd.M6500R
Dostosowana sprężyna śrubowaChengdu Mingxing Spring Co., Ltd.1109-02
KleszczeChengdu Shifeng Co., Ltd.brak
Światłoutwardzalalna żywica płynnaShofu Dental Trading (SHANGHAI) Co., Ltd.
Utwardzacz światłaLiang Ya Dental Equipment Co., Ltd.LY-A180
Medyczne taśmy klejące Haishi Hainuo Group Co.,   Sp. z o.o.0008-2014
Włóknina medycznaHenan Yadu Industrial Co., Ltd.
Uchwyty do igiełChengdu Shifeng Co., Ltd.brak
GumkiHaishi Hainuo Group Co.,   Ltd.32X1
Nożyczki chirurgiczneChengdu Shifeng Co., Ltd.brak
PęsetaChengdu Shifeng Co., Ltd.żaden
2012004751878501011500018

Bibliografia

  1. Kenkre, J. S., Bassett, J. The bone remodeling cycle. Annals of Clinical Biochemistry. 55 (3), 308-327 (2018).
  2. Feng, X., McDonald, J. M. Disorders of bone remodeling. Annual Review of Pathology. 6 (1), 121-145 (2011).
  3. Alliston, T. Biological regulation of bone quality. Current Osteoporosis Reports. 12 (3), 366-375 (2014).
  4. Duncan, R. L., Turner, C. H. Mechanotransduction and the functional response of bone to mechanical strain. Calcified Tissue International. 57 (5), 344-358 (1995).
  5. García-Aznar, J. M., Nasello, G., Hervas-Raluy, S., Pérez, M. Á, Gómez-Benito, M. J. Multiscale modeling of bone tissue mechanobiology. Bone. 151 (10), 1-12 (2021).
  6. Rolvien, T., Amling, M. Disuse osteoporosis: clinical and mechanistic insights. Calcified Tissue International. 110 (5), 592-604 (2022).
  7. Vico, L., Hargens, A. Skeletal changes during and after spaceflight. Nature Reviews Rheumatology. 14 (4), 229-245 (2018).
  8. Iwaniec, U. T., Turner, R. T. Influence of body weight on bone mass, architecture and turnover. Journal of Endocrinology. 230 (3), R115-R130 (2016).
  9. Governale, L. S. Craniosynostosis. Pediatric Neurology. 53 (5), 394-401 (2015).
  10. Sahoo, N. K., Issar, Y., Thakral, A. Mandibular Distraction osteogenesis. Journal of Craniofacial Surgery. 30 (8), e743-e746 (2019).
  11. Roberts-Harry, D., Sandy, J. Orthodontics. Part 1: Who needs orthodontics. British Dental Journal. 195 (8), 433-437 (2003).
  12. Li, Y., Jacox, L. A., Little, S. H., Ko, C. C. Orthodontic tooth movement: The biology and clinical implications. Kaohsiung Journal of Medical Sciences. 34 (4), 207-214 (2018).
  13. Will, L. A. Orthodontic tooth movement: a historic prospective. Frontiers of Oral Biology. 18, 46-55 (2016).
  14. Xu, H., Lee, A., Sun, L., Naveh, G. R. S. 3D Imaging of PDL collagen fibers during orthodontic tooth movement in mandibular murine model. Journal of Visualized Experiments. (170), e62149(2021).
  15. Taddei, S. R., et al. Experimental model of tooth movement in mice: a standardized protocol for studying bone remodeling under compression and tensile strains. Journal of Biomechanics. 45 (16), 2729-2735 (2012).
  16. Deguchi, T., Takeshita, N., Balam, T. A., Fujiyoshi, Y., Takano-Yamamoto, T. Galanin-immunoreactive nerve fibers in the periodontal ligament during experimental tooth movement. Journal of Dental Research. 82 (9), 677-681 (2003).
  17. Gudhimella, S., et al. A rodent model using skeletal anchorage and low forces for orthodontic tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 155 (2), 254-263 (2019).
  18. Lira Dos Santos, E. J., et al. Orthodontic tooth movement alters cementocyte ultrastructure and cellular cementum proteome signature. Bone. 153 (12), 116-139 (2021).
  19. Danz, J. C., Bibby, B. M., Katsaros, C., Stavropoulos, A. Effects of facial tooth movement on the periodontium in rats: a comparison between conventional and low force. Journal of Clinical Periodontology. 43 (3), 229-237 (2016).
  20. Kohno, T., Matsumoto, Y., Kanno, Z., Warita, H., Soma, K. Experimental tooth movement under light orthodontic forces: rates of tooth movement and changes of the periodontium. Journal of Orthodontics. 29 (2), 129-135 (2002).
  21. Gad, A. M., Soliman, S. O. Evaluation of systemic Omega-3 PUFAs effect on orthodontic tooth movement in a rabbit model: RCT. Angle Orthodontist. 93 (4), 476-481 (2023).
  22. Huang, C. Y., et al. Comparison of tooth movement and biological response resulting from different force magnitudes combined with osteoperforation in rabbits. Journal of Applied Oral Science. 29 (2), 20200734(2021).
  23. Alhasyimi, A. A., Pudyani, P. P., Asmara, W., Ana, I. D. Enhancement of post-orthodontic tooth stability by carbonated hydroxyapatite-incorporated advanced platelet-rich fibrin in rabbits. Orthodontics & Craniofacial Research. 21 (2), 112-118 (2018).
  24. Elkattan, A. E., et al. Effects of Different Parameters of Diode Laser on Acceleration of Orthodontic Tooth Movement and Its Effect on Relapse: An Experimental Animal Study. Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 7 (3), 412-420 (2019).
  25. von Böhl, M., Maltha, J. C., Von Den Hoff, J. W., Kuijpers-Jagtman, A. M. Focal hyalinization during experimental tooth movement in beagle dogs. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 125 (5), 615-623 (2004).
  26. Machibya, F. M., et al. Effects of bone regeneration materials and tooth movement timing on canine experimental orthodontic treatment. Angle Orthodontist. 88 (2), 171-178 (2018).
  27. Deguchi, T., et al. Histomorphometric evaluation of alveolar bone turnover between the maxilla and the mandible during experimental tooth movement in dogs. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 133 (6), 889-897 (2008).
  28. Tanimoto, K., et al. Experimental tooth movement into new bone area regenerated by use of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Cleft Palate-craniofacial Journal. 52 (4), 386-394 (2015).
  29. Oltramari, P. V., et al. Orthodontic movement in bone defects filled with xenogenic graft: an experimental study in minipigs. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 131 (3), e10-e17 (2007).
  30. Verna, C., Dalstra, M., Lee, T. C., Melsen, B. Microdamage in porcine alveolar bone due to functional and orthodontic loading. European Journal of Morphology. 42 (1-2), 3-11 (2005).
  31. Steiner, G. G., Pearson, J. K., Ainamo, J. Changes of the marginal periodontium as a result of labial tooth movement in monkeys. Journal of Periodontology. 52 (6), 314-320 (1981).
  32. Celebi, A. A., Demirer, S., Catalbas, B., Arikan, S. Effect of ovarian activity on orthodontic tooth movement and gingival crevicular fluid levels of interleukin-1β and prostaglandin E(2) in cats. Angle Orthodontist. 83 (2), 70-75 (2013).
  33. Holmes, H. D., Tennant, M., Goonewardene, M. S. Augmentation of faciolingual gingival dimensions with free connective tissue grafts before labial orthodontic tooth movement: an experimental study with a canine model. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 127 (5), 562-572 (2005).
  34. Wennström, J. L., Lindhe, J., Sinclair, F., Thilander, B. Some periodontal tissue reactions to orthodontic tooth movement in monkeys. Journal of Clinical Periodontology. 14 (3), 121-129 (1987).
  35. Ibrahim, A. Y., Gudhimella, S., Pandruvada, S. N., Huja, S. S. Resolving differences between animal models for expedited orthodontic tooth movement. Orthodontics & Craniofacial Research. 20, 72-76 (2017).
  36. Kirschneck, C., Bauer, M., Gubernator, J., Proof, P., Schröder, A. Comparative assessment of mouse models for experimental orthodontic tooth movement. Scientific Reports. 10 (1), 1-12 (2020).
  37. Ransom, R. C., et al. Mechanoresponsive stem cells acquire neural crest fate in jaw regeneration. Nature. 563 (7732), 514-521 (2018).
  38. Mardas, N., et al. Experimental model for bone regeneration in oral and cranio-maxillo-facial surgery. Journal of Investigative Surgery. 27 (1), 32-49 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mysi model ortodontycznyprzebudowa kościobciążenie mechaniczneprzemieszczanie zębówanaliza micro-CTresorpcja kościtworzenie kościanaliza histopatologicznaanaliza regeneracyjna
Opracowanie mysiego modelu ortodontycznego szczęki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.