Artykuł metodologiczny

Modelowanie operacji zaćmy u myszy

DOI:

10.3791/66050

⸱

1 grudnia 2023

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Delaware

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda modeluje operację zaćmy in vivo, usuwając komórki włókna soczewki od dorosłych myszy i pozostawiając torebkę z dołączonymi komórkami nabłonka soczewki (LEC). Reakcja na uraz jest następnie oceniana w różnych momentach po operacji przy użyciu kryteriów molekularnych i morfologicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Operacja zaćmy (CS) jest skutecznym sposobem leczenia zaćmy, głównej przyczyny niepełnosprawności wzrokowej na całym świecie. Jednak CS prowadzi do zapalenia oka, a w dłuższej perspektywie może powodować zmętnienie tylnej torebki (PCO) i/lub zwichnięcie soczewki spowodowane pooperacyjnym przerostem komórek nabłonka soczewki (LEC) i ich konwersją do miofibroblastów i/lub nieprawidłowych komórek włóknistych. Jednak mechanizmy molekularne, za pomocą których CS powoduje stan zapalny i PCO, są nadal niejasne, ponieważ większość modeli in vitro nie podsumowuje reakcji na gojenie się ran LEC obserwowanej in vivo, podczas gdy tradycyjne modele zwierzęce operacji zaćmy, takie jak króliki, nie pozwalają na genetyczną manipulację ekspresją genów w celu przetestowania mechanizmów. Ostatnio nasze laboratorium i inne z powodzeniem wykorzystały genetycznie zmodyfikowane myszy do badania mechanizmów molekularnych, które napędzają indukcję sygnalizacji prozapalnej i przejścia nabłonka LEC do mezenchymalnego, co prowadzi do nowego wglądu w patogenezę PCO. W tym miejscu przedstawiamy ustalony protokół modelowania operacji zaćmy u myszy, który pozwala na solidne profilowanie transkrypcyjne odpowiedzi LEC na usunięcie komórek włókna soczewki za pomocą RNAseq, ocenę ekspresji białka za pomocą półilościowej immunofluorescencji oraz zastosowanie nowoczesnych narzędzi genetyki myszy do testowania funkcji genów, co do których przypuszczalnie występują w patogenezie ostrych następstw, takich jak zapalenie, a także późniejsza konwersja LEC do miofibroblastów i/lub nieprawidłowe komórki światłowodowe soczewki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Soczewka jest wysoce zorganizowaną, przezroczystą tkanką, która załamuje światło, tworząc wyraźnie ostry obraz na siatkówce1,2,3. Ten wyspecjalizowany narząd jest otoczony nieprzerwaną błoną podstawną (torebką), która izoluje soczewkę od innych części oka. Wewnętrzna przednia powierzchnia kapsułki zakotwicza monowarstwę komórek nabłonka soczewki (LEC), które następnie różnicują się na równiku soczewki w komórki włókien soczewki, które stanowią zdecydowaną większość soczewki3. Zaćma występuje, gdy soczewka traci przezroczystość z powodu czynników takich jak starzenie się, mutacje genetyczne, promieniowanie UV, stres oksydacyjny i uraz oka4. Zaćma jest główną przyczyną ślepoty na całym świecie, szczególnie w krajach o słabej opiece medycznej5. Jednak stan ten jest obecnie łatwo leczony przez chirurgiczne usunięcie nieprzezroczystych komórek soczewki przez fakoemulsyfikację, w której usuwa się centralną torebkę soczewki i przyczepiony nabłonek soczewki, a następnie używa się sondy wibracyjnej w celu rozbicia masy komórkowej soczewki na mniejsze fragmenty, które można odessać; pozostawiając torbę z kapsułkami z dołączonymi równikowymi LECami1. Wzrok jest wtedy najczęściej przywracany poprzez pooperacyjne wszczepienie sztucznej soczewki wewnątrzgałkowej (IOL).

Podczas gdy operacja zaćmy (CS) jest wysoce skuteczną i minimalnie inwazyjną metodą leczenia zaćmy, powrót pacjenta do zdrowia po operacji może być poważnie utrudniony przez rozwój zapalenia oka5,6,8. To zapalenie może powodować ból pooperacyjny, obrzęk siatkówki prowadzący do odwarstwienia siatkówki, a także zaostrzenie innych stanów zapalnych i zwłóknieniowych, takich jak zapalenie błony naczyniowej oka i jaskra4,7,8,9. Zapalenie oka po CS (PCS) jest zwykle leczone przeciwzapalnymi kroplami do oczu, które są nękane przez słabe przestrzeganie zaleceń przez pacjenta lub bezkroplową operację zaćmy, która może prowadzić do zwiększonej częstości występowania8,10,11. W dłuższej perspektywie wyniki CS mogą być zagrożone przez rozwój zmętnienia tylnej torebki (PCO)12. PCO występuje, gdy resztkowe LEC pozostawione po operacji ulegają reakcji gojenia się rany, namnażają się i migrują do tylnej torebki soczewki po miesiącach lub latach PCS przyczyniając się do wtórnej niedrożności wzroku13,14.

Zrozumienie mechanizmów molekularnych, dzięki którym CS powoduje takie ostre i przewlekłe reakcje, stanowi główne wyzwanie w tej dziedzinie, ponieważ większość literatury badającej PCO opiera się na indukcji konwersji LEC do miofibroblastów w hodowli poprzez leczenie aktywnym transformującym czynnikiem wzrostu beta (TGFβ)12,15. Modele ludzkich torebek torebkowych utworzone z soczewek zwłok hodowanych in vitro lepiej odzwierciedlają biologię PCS soczewki, ponieważ LEC są hodowane na swojej natywnej błonie podstawnej, ale są trudne do mechanicznego manipulowania, nie rekapitulują środowiska wewnątrzgałkowego i są z natury zmienne ze względu na zmienność soczewki do soczewki (lub dawcy do dawcy)16,17. Rabbit1,18 and non-human primate19,20 Modele in vivo operacji zaćmy rozwiązują niektóre z tych problemów, ale nadal nie są łatwe do manipulowania w badaniach mechanistycznych. Warto zauważyć, że wcześniejsze badanie regeneracji soczewki u ssaków wykazało znaczną regenerację soczewki w ciągu czterech tygodni po usunięciu komórek włókien soczewki od myszy, pozostawiając komórki nabłonka soczewki i torebkę w tyle, podczas gdy nie nastąpił odrost soczewki, gdy usunięto całą soczewkę21,22. Następnie uprościliśmy tę procedurę i zoptymalizowaliśmy ją pod kątem badania ostrej odpowiedzi LEC na usunięcie komórek światłowodowych soczewki, a następnie ich konwersję do mieszanej populacji komórek o właściwościach miofibroblastów i komórek włóknistych.

Korzystając z tego mysiego modelu operacji zaćmy, wykazaliśmy, że komórki nabłonka soczewki drastycznie przebudowują swój transkryptom przez 6 godzin PCS, aby wytworzyć liczne cytokiny prozapalne23, podczas gdy zaczynają wyrażać markery zwłóknieniowe już po 24 godzinach PCS12,23, przed wystąpieniem kanonicznej sygnalizacji TGFβ. Eksperymenty mechanistyczne na myszach z nokautem przy użyciu tego modelu wykazały, że ekspresja fibronektyny komórkowej przez LEC jest wymagana do trwałej odpowiedzi zwłóknieniowej PCS, prawdopodobnie ze względu zarówno na jej rolę w tworzeniu zwłóknieniowego ECM, jak i sygnalizacji komórkowej12. Inne badania wykazały, że integryna αVβ8 jest niezbędna do przejścia LEC do miofibroblastów ze względu na jej funkcję w aktywacji TGFβ, a potencjał tego podejścia do identyfikacji przewodów terapeutycznych anty-PCO został potwierdzony, ponieważ antagonista integryny αVβ8 również blokował LEC EMT15.

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół opisujący, jak usunąć komórki światłowodu soczewki od żywych myszy (Rysunek 1i Rysunek 4), pozostawiając torebkę soczewki i LEC do modelowania odpowiedzi LEC na operację zaćmy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Następujący protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Delaware na mocy protokołu #1039-2021-1. Zgodnie z zaleceniami Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) na rzecz wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych24, wszystkie operacje przeżycia oka mogą być wykonywane tylko w jednym oku. Szczegółowe informacje na temat odczynników i przyrządów używanych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów. Alternatywne podejścia do ekstrakcji włókien soczewki i szycia są pokazane na Rysunek 2 i Rysunek 3.

1. Zwierzęta

  1. Do tej procedury należy użyć dowolnego szczepu myszy typu dzikiego lub genetycznie zmodyfikowanego, który ma oczy z nienaruszonymi soczewkami.
    1. Użyj myszy C57BL/6 jako punktu wyjścia, ponieważ ich reakcje są wysoce powtarzalne zarówno na poziomie morfologicznym, jak i molekularnym25,26.
      UWAGA: Można użyć C57BL/6 lub dowolnego szczepu myszy. W protokole wideo mysz FVB służy do lepszej demonstracji wizualnej.
    2. Przeprowadzenie badań odpowiedzi mutantów na inne szczepy myszy z kontrolami dopasowanymi do szczepów.
      UWAGA: Przy odrobinie wprawy zabieg ten można wykonać na myszach, których soczewki mają zaćmę, o ile torebka soczewki jest nienaruszona, a soczewka nie uległa znacznemu upłynnieniu. Zobacz badanie myszy z warunkową delecją czynnika transkrypcyjnego Sip127.
  2. Wykonaj tę operację na myszach obu płci w wieku od 8 tygodni do 24 miesięcy25,26.
    1. Wykonaj tę operację u jeszcze młodszych myszy (po otwarciu powieki) z praktyką, chociaż będzie to trudniejsze, ponieważ te oczy będą znacznie mniejsze.
    2. Szczególną ostrożność należy zachować podczas operacji u starszych myszy ze względu na ich niższą tolerancję na znieczulenie25,26.
      UWAGA: Różnice płci w odpowiedziach chirurgicznych są bardziej powszechne u starszych myszy26.

2. Przygotowanie roztworów i narzędzi chirurgicznych

  1. Zaopatrz się w środki znieczulające i przeciwbólowe, krople rozszerzające, sterylny jednorazowy skalpel, kleszcze Dumonta #5, kleszcze do szwów 2-110, igły (26 G 1/2 i 27 G 45° wygięta końcówka dozująca 1"), strzykawki i zrównoważony roztwór soli fizjologicznej (BSS).
  2. Sterylizuj narzędzia chirurgiczne w autoklawie.

3. Przed znieczuleniem

  1. Przed znieczuleniem podaj myszy po jednej kropli 1% atropiny i 2,5% fenylefryny, aby rozszerzyć źrenicę (patrz Rysunek 1A) oka poddawanego operacji. Nałóż maść okulistyczną na nieoperowane oko, aby zapobiec wyschnięciu powierzchni.
    UWAGA: Oświadczenie ARVO dotyczące wykorzystania zwierząt w badaniach nad oczami 24 pozwala na przeprowadzenie operacji przetrwania tylko jednemu oku, pozostawiając drugie oko nietknięte, aby zwierzę zachowało wzrok. W związku z tym operacje przeżycia są zawsze jednostronne; Jednak przeciwległe, nieoperowane oko może być operowane tuż przed złożeniem ofiary, aby stworzyć dopasowaną do zwierzęcia kontrolę "czasu zero".
  2. Upewnij się, że krople do oczu nie spływają po pysku myszy i nie dostają się do nosa, ponieważ może to utrudnić jej oddychanie.
  3. Przygotować strzykawkę ze sterylnym BSS za pomocą sterylnej igły 26 G 1/2. Wyposażyć strzykawkę w sterylną,, wygiętą pod kątem 45° końcówkę dozującą o długości 1 cala (określaną poniżej jako końcówka dozująca).

4. Znieczulenie

  1. Po kroplach do oczu znieczulij mysz dootrzewnowym wstrzyknięciem roztworu ksylazyna/ketamina/acepromazyna (35 mg/kg, 80 mg/kg i 0,5 mg/kg) (Rysunek 1B).
    UWAGA: Znieczulenie wziewne może nie być możliwe, chyba że można użyć specjalistycznego stożka nosowego, aby umożliwić dostęp do oka potrzebnego do operacji.

5. Wykonanie nacięcia

  1. Gdy mysz jest całkowicie pod narkozą, mierzoną brakiem odruchu szczypania palców, a jej źrenica całkowicie się rozszerzy (2 mm) (Rysunek 4A), mysz jest gotowa do operacji.
    1. Przenieś znieczuloną mysz do etapu mikroskopu mikroskopu świetlnego do analizy związków. Użyj podkładki grzewczej, aby upewnić się, że mysz ma odpowiednią regulację termiczną i używaj sterylnych zasłon.
    2. Obejrzyj oko pod powiększeniem 10x-20x za pomocą mikroskopu preparacyjnego (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli materiałów).
  2. Wykonaj nacięcie 1-1,5 mm na środku rogówki za pomocą sterylnego skalpela chirurgicznego. Upewnij się, że nacięcie przechodzi przez rogówkę i nacina przednią torebkę soczewki (Rysunek 1C i Rysunek 4B).

6. Oddzielanie włókien soczewki od torebki

  1. Chwycić strzykawkę końcówką dozującą zawierającą sterylne BSS i delikatnie wypchnąć 1 kroplę BSS ponad rogówkę, aby zwilżyć powierzchnię do dalszej manipulacji.
  2. Oddziel masę włókna soczewki od kapsułki soczewki.
    1. Włóż końcówkę dozującą przez centralne nacięcie rogówki do nacięcia torebki soczewki, a następnie delikatnie przesuwaj igłę okrężnymi ruchami, powoli zwalniając BSS, aby oddzielić połączenia wierzchołkowo-wierzchołkowe między nabłonkiem soczewki a komórkami włóknistymi (rozwarstwienie wodne), ostatecznie wydalając masę włókna soczewki (Rysunek 1D).
    2. W większości przypadków masa włókna ostatecznie przylgnie do końcówki dozującej podczas tej procedury (Rysunek 2A). Jeśli tak się stanie, delikatnie wyjmij końcówkę dozującą z wewnętrznego oka; i wyczyść sterylnym ręcznikiem, aby usunąć tę tkankę. Powtarzaj, aż wszystkie komórki włókien soczewki zostaną usunięte.
    3. Alternatywnie, użyj mikro kleszczyków (numer 5 Dumont), aby wyodrębnić jądro soczewki (Rysunek 2B). W przypadku korzystania z tej metody należy uważać, aby pierwotne nacięcie rogówki przekraczało średnicę jądra, aby zapewnić łatwe usunięcie.
  3. Wypłucz kapsułkę soczewki sterylnym BSS, aby usunąć wszelkie pozostałe włókna.
  4. Upewnij się, że torebka soczewki pozostała wewnątrz oka ( Rysunek 1E i Rysunek 4C), oglądając jej półprzezroczysty/szklisty wygląd przez mikroskop.

7. Nadmuchiwanie przedniej komory i zszywanie nacięcia rogówki

  1. Napompuj przednią komorę do normalnej głębokości, wstrzykując BSS przez nacięcie do przedniej komory.
    1. Dodaj inhibitory lub aktywatory szlaków sygnałowych będących przedmiotem zainteresowania do BSS, aby przetestować ich rolę w reakcji na uszkodzenie soczewki12,15.
      UWAGA: Zwierzęta mogą być również leczone ogólnoustrojowo inhibitorami szlaku, które mogą być potrzebne w zależności od farmakokinetyki obrotu lekami, ponieważ równowaga cieczy wodnistej jest przywracana po operacji15.
  2. Zszyj nacięcie rogówki kwadratowymi węzłami za pomocą nylonowej nici 10-0 ze stożkową, zakrzywioną igłą 5,3 mm 1/2c (Rysunek 1F i Rysunek 4D-F).
    1. Umieść jeden kwadratowy ścieg węzłowy w środkowej części nacięcia lub dwa kwadratowe ściegi węzłowe zarówno w górnej, jak i dolnej połowie oryginalnego nacięcia (patrz Rysunek 3). Liczba szwów zależy od długości nacięcia rogówki.
    2. Nie należy nakłuwać obu płatków rogówki jednocześnie. Zamiast tego przytrzymaj jeden płatek rogówki za pomocą kleszczy w dłoni niedominującej i przepchnij igłę/nylon. Po nakłuciu jednej strony rogówki przepchnij igłę/nylon przez następną płatek rogówki. Zamknij płatki rogówki za pomocą ściegów z węzłem kwadratowym.

8. Opieka pooperacyjna

UWAGA: Miejscowo nakłada się maść z antybiotykiem na oko i podaje się środki przeciwbólowe. Myszy zwykle nie wykazują oznak niepokoju po początkowej operacji. W razie potrzeby można zastosować buprenorfinę w wersji o spowolnionym uwalnianiu.

  1. Bezpośrednio po tej operacji wykonaj następujące czynności podrzędne.
    1. Nałóż jedną kroplę 0,5% maści okulistycznej z erytromycyną bezpośrednio nad szwem. Upewnij się, że całe nacięcie jest pokryte maścią.
    2. Należy podać buprenorfinę we wstrzyknięciu dootrzewnowym (0,1 mg/kg).
  2. Pozwól myszy dojść do siebie po znieczuleniu w klatce umieszczonej na poduszce grzewczej, aby zoptymalizować wsparcie termiczne.
    UWAGA: Monitoruj zwierzę pod kątem oznak urazu, niepokoju lub dyskomfortu. Niektóre objawy obejmują infekcję/drapanie w miejscu operacji, przemieszczenie szwu, utratę sierści itp.

9. Monitorowanie odzyskiwania zwierząt

  1. Monitoruj powrót zwierzęcia do zdrowia po operacji, aż wybudzi się ze znieczulenia.
  2. Sprawdzaj myszy codziennie przez pierwsze 3 dni po zabiegu.
    UWAGA: Zwykle nie jest konieczne zdejmowanie szwów, ponieważ myszy są albo poświęcane przed pełnym wygojeniem (2 tygodnie PCS), albo szwy samoistnie wypadają.
  3. Buprenorfinę należy podawać doustnie, w razie potrzeby w celu złagodzenia bólu po 4-8 godzinach po zabiegu, w dawce 0,5 mg/kg (w galarecie) lub w dawce 0,1 mg/kg u osób niejedzących. Alternatywnie, buprenorfinę o przedłużonym uwalnianiu należy podawać tuż przed operacją.
    UWAGA: Jeśli to możliwe, należy stosować prewencyjne leki przeciwbólowe, jednak może to wymagać zmian w protokole przeciwbólowym, które wymagają przeglądu i zatwierdzenia przez instytucjonalną komisję ds. opieki i wykorzystania zwierząt.

10. Eutanazja

  1. Poddaj mysz eutanazji w pożądanym czasie po operacji
    1. Usunięto operowane oko przy użyciu nieoperowanego oka jako tkanki kontrolnej; lub ponownie znieczulić zwierzę, przeprowadzić operację usunięcia komórek włókna soczewki na wcześniej nieoperowanym oku przeciwległym, a następnie natychmiast poświęcić zwierzę (nie pozwalając mu obudzić się ze znieczulenia), aby zapewnić kontrolę działającą w czasie zerowym.
    2. Zapewnij szybkie wypreparowanie i pobranie tkanek.
      UWAGA: LEC ulegają zmianom transkryptomicznym w ciągu kilku minut po operacji, dlatego szybkie pobieranie tkanek i fiksacja/zamrażanie są konieczne podczas badania wczesnych odpowiedzi LEC na operację.

11. Przeprowadzanie dalszych analiz na pobranych tkankach soczewek

  1. Użyj uzyskanej tkanki do barwienia immunologicznego, sekwencjonowania RNA, hodowli komórkowej lub analizy zachodniej12,15,23,25,26,28. Cytometria przepływowa jest również teoretycznie możliwa12, chociaż niewielka liczba LEC w soczewce myszy (~40,000)29 oraz obecność resztek komórkowych związanych z kapsułką po operacji sprawiają, że jest to trudne.
  2. Barwienie immunologiczne
    1. Poddać mysz eutanazji w komorze poprzez inhalację CO2 (4 l/min) z butli gazowej. Zwiększ natężenie przepływu do 8-10 l/min, gdy mysz jest nieprzytomna i kontynuuj tę ekspozycję aż do całkowitego ustania oddychania plus 1 min.
      UWAGA: Mysz może zostać poddana eutanazji przy użyciu odpowiedniej metody zgodnie z wytycznymi AVMA dotyczącymi eutanazji zwierząt lub zgodnie z wytycznymi lub zasadami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt.
    2. Zadbaj o odpowiednią ofiarę, stosując wtórną metodę eutanazji, np. zwichnięcie szyjki macicy.
      UWAGA: Laboratorium Duncana zbadało punkty czasowe od minut do miesięcy PCS12,15,23.
    3. Po humanitarnym złożeniu myszy w ofierze należy odizolować operowane oko do analizy.
      1. Trzymaj mikrokleszczyki w ręce niedominującej, aby chwycić operowane oko, trzymając mikronożyczki w ręce dominującej.
      2. Delikatnie przytnij nerw wzrokowy i mięśnie zakotwiczające oko.
        UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z oczami, które były niedawno operowane, w porównaniu z tymi, które miały więcej czasu na gojenie PCS. Niedawno operowane oczy są bardziej kruche strukturalnie.
    4. Osadź wypreparowane oko w pożywce OCT w celu późniejszego kriosekcji, barwienia immunologicznego i półilościowej mikroskopii konfokalnej28,30.
  3. Izolacja torebki torebkowej z powiązanymi komórkami do sekwencjonowania RNA, hodowli komórkowej lub analizy western blot
    1. Poddać mysz eutanazji w komorze poprzez inhalację CO2 (4 l/min) z butli gazowej. Zwiększ natężenie przepływu do 8-10 l/min, gdy mysz jest nieprzytomna i kontynuuj tę ekspozycję aż do całkowitego ustania oddychania plus 1 minuta.
    2. Zadbaj o odpowiednią ofiarę, stosując wtórną metodę eutanazji, np. zwichnięcie szyjki macicy.
    3. Jeśli wymagany jest wczesny punkt czasowy PCS (w ciągu 1-2 dni), usuń szwy przed ekstrakcją tkanki lub wykonaj kolejne nacięcie w rogówce, przez które należy wyjąć torebkę soczewki.
      UWAGA: W późniejszych punktach czasowych PCS szwy prawdopodobnie wypadną, więc potrzebne będzie nowe nacięcie.
  4. Zlokalizuj półprzezroczystą kapsułę obiektywu.
    1. Delikatnie włóż mikrokleszki przez otwór rogówki, chwyć kapsułkę i wyjmij ją z przedniej komory.
    2. Umieść kapsułkę w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml lub naczyniu hodowlanym w celu dalszej analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na podstawie wyników tej metody chirurgicznej, Duncan Lab wykorzystało ten mysi model operacji zaćmy do skonstruowania przebiegu czasu reakcji na uraz komórek nabłonka soczewki po operacji (Rysunek 5). Po 6 godzinach od zabiegu 5% transkryptomu nabłonka soczewki ulega zróżnicowanej ekspresji (Figura 6A), w tym regulacja w górę licznych genów natychmiastowej wczesnej odpowiedzi i cytokin prozapalnych23 (Figura 6B). Do 24 godzin PCS transkr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta technika chirurgiczna wymaga zaawansowanej obsługi myszy i umiejętności mikrochirurgicznych, których rozwinięcie wymaga praktyki. Najtrudniejsze do opanowania jest umieszczenie cienkich szwów w rogówce w celu zamknięcia rany. Załóżmy, że eksperymentator jest całkowitym nowicjuszem w szyciu. W takim przypadku zaleca się, aby najpierw poćwiczyć przy użyciu sznurka i tkaniny, a następnie przejść do ćwiczeń za pomocą szwów o dużej średnicy na małych owocach, aby opanować ruchy rąk potrzebne do wykonania chirurgicznych kwa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laboratorium Duncan otrzymało wsparcie finansowe od firmy Pliantx na przetestowanie terapii anty-PCO przy użyciu tego modelu chirurgicznego.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Eye Institute (EY015279 i EY028597) oraz Delaware INBRE (P20 GM103446).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5% Maść okulistyczna erytryomycyny USPBaush Lomb24208-910-55
1% Siarczan atropiny roztwór okulistycznyAmneal60219-1748-2
1% Tropicamid roztwór okulistyczny USPAkorn17478-102-12
10-0 Nici nylonoweEthicon7707G
2,5% roztwór oftahlmiczny chlorowodorku fenylefryny USPAkorn17478-200-12
26 G 1/2 Igły - prosteBD PrecisionGlide5111
27 G 45° wygięta końcówka dozująca 1"Harfington
Zrównoważony roztwór soli fizjologicznejPhoenix57319-555-06
Bupranorfina (0,1 mg / kg)APP Pharmaceticals401730D
Roztwórchlorheksydyny
Uchwyt igły 2-110Duckworth & Nożyczki Kent2-110-3E
Noyes, prosteFine Science Tools12060-02
SMZ800 Mikroskop modelowy NikonNikon
Sterylny jednorazowy skalpel nr 11Pióro2975#11
Pęseta #5 DumontElectron Microscopy Sciences72700-D
Ksylazyna/Ketamina/Acepromazyna (35 mg / kg, 80 mg / kg, 0,5 mg / kg) roztwórAPP Pharmaceticals401730D

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wormstone, I. M., Wormstone, Y. M., Smith, A. J. O., Eldred, J. A. Posterior capsule opacification: What's in the bag. Prog Retin Eye Res. 82, 100905(2021).
  2. Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. Biological glass: structural determinants of eye lens transparency. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 366 (1568), 1250-1264 (2011).
  3. Danysh, B. P., Duncan, M. K. The lens capsule. Exp Eye Res. 88 (2), 151-164 (2009).
  4. Liu, Y. C., Wilkins, M., Kim, T., Malyugin, B., Mehta, J. S. Cataracts. Lancet. 390 (10094), 600-612 (2017).
  5. Khairallah, M., et al. Number of people blind or visually impaired by cataract worldwide and in world regions, 1990 to 2010. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (11), 6762-6769 (2015).
  6. Chan, E., Mahroo, O. A., Spalton, D. J. Complications of cataract surgery. Clin Exp Optom. 93 (6), 379-389 (2010).
  7. Taravati, P., Lam, D. L., Leveque, T., Van Gelder, R. N. Postcataract surgical inflammation. Curr Opin Ophthalmol. 23 (1), 12-18 (2012).
  8. Shihan, M. H., Novo, S. G., Duncan, M. K. Cataract surgeon viewpoints on the need for novel preventative anti-inflammatory and anti-posterior capsular opacification therapies. Curr Med Res Opin. 35 (11), 1971-1981 (2019).
  9. El-Harazi, S. M., Feldman, R. M. Control of intra-ocular inflammation associated with cataract surgery. Curr Opin Ophthalmol. 12 (1), 4-8 (2001).
  10. Lindstrom, R. L., Galloway, M. S., Grzybowski, A., Liegner, J. T. Dropless Cataract Surgery: An Overview. Curr Pharm Des. 23 (4), 558-564 (2017).
  11. Assil, K. K., et al. Dropless cataract surgery: modernizing perioperative medical therapy to improve outcomes and patient satisfaction. Curr Opin Ophthalmol. 32 (Suppl 1), S1-S12 (2021).
  12. Shihan, M. H., et al. Fibronectin has multifunctional roles in posterior capsular opacification (PCO). Matrix Biol. 90, 79-108 (2020).
  13. Wormstone, I. M., Wang, L., Liu, C. S. Posterior capsule opacification. Exp Eye Res. 88 (2), 257-269 (2009).
  14. Awasthi, N., Guo, S., Wagner, B. J. Posterior capsular opacification: a problem reduced but not yet eradicated. Arch Ophthalmol. 127 (4), 555-562 (2009).
  15. Shihan, M. H., et al. αVβ8 integrin targeting to prevent posterior capsular opacification. JCI Insight. 6 (21), e145715(2021).
  16. Wormstone, I. M. The human capsular bag model of posterior capsule opacification. Eye (Lond). 34 (2), 225-231 (2020).
  17. Wormstone, I. M., Collison, D. J., Hansom, S. P., Duncan, G. A focus on the human lens in vitro. Environ Toxicol Pharmacol. 21 (2), 215-221 (2006).
  18. Konopińska, J., Młynarczyk, M., Dmuchowska, D. A., Obuchowska, I. Posterior capsule opacification: A review of experimental studies. J Clin Med. 10 (13), 2847(2021).
  19. Koopmans, S. A., et al. Prevention of capsule opacification after accommodating lens refilling: pilot study of strategies evaluated in a monkey model. J Cataract Refract Surg. 40 (9), 1521-1535 (2014).
  20. Koopmans, S. A., et al. Accommodative lens refilling in rhesus monkeys. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (7), 2976-2984 (2006).
  21. Call, M. K., Grogg, M. W., Tsonis, P. A. Eye on regeneration. Anat Rec B New Anat. 287 (1), 42-48 (2005).
  22. Call, M. K., Grogg, M. W., Del Rio-Tsonis, K., Tsonis, P. A. Lens regeneration in mice: implications in cataracts. Exp Eye Res. 78 (2), 297-299 (2004).
  23. Novo, S. G., et al. The immediate early response of lens epithelial cells to lens injury. Cells. 11 (21), 3456(2022).
  24. ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. , https://www.arvo.org/About/policies/arvo-statement-for-the-use-of-animals-in-ophthalmic-and-vision-research/ (2021).
  25. Faranda, A. P., Shihan, M. H., Wang, Y., Duncan, M. K. The aging mouse lens transcriptome. Exp Eye Res. 209, 108663(2021).
  26. Faranda, A. P., Shihan, M. H., Wang, Y., Duncan, M. K. The effect of sex on the mouse lens transcriptome. Exp Eye Res. 209, 108676(2021).
  27. Grabitz, A. L., Duncan, M. K. Focus on molecules: Smad Interacting Protein 1 (Sip1, ZEB2, ZFHX1B). Exp Eye Res. 101, 105-106 (2012).
  28. Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 25, 100916(2021).
  29. Shi, Y., De Maria, A., Lubura, S., Sikic, H., Bassnett, S. The penny pusher: a cellular model of lens growth. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (2), 799-809 (2014).
  30. Reed, N. A., Oh, D. J., Czymmek, K. J., Duncan, M. K. An immunohistochemical method for the detection of proteins in the vertebrate lens. J Immunol Methods. 253 (1-2), 243-252 (2001).
  31. Jiang, J., Shihan, M. H., Wang, Y., Duncan, M. K. Lens epithelial cells initiate an inflammatory response following cataract surgery. Invest Ophthalmol Vis Sci. 59 (12), 4986-4997 (2018).
  32. Mamuya, F. A., et al. The roles of αV integrins in lens EMT and posterior capsular opacification. J Cell Mol Med. 18 (4), 656-670 (2014).
  33. Manthey, A. L., et al. The Zeb proteins δEF1 and Sip1 may have distinct functions in lens cells following cataract surgery. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5445-5455 (2014).
  34. Hupy, M. L., et al. Suppression of epithelial to mesenchymal transition markers in mouse lens by a Smad7-based recombinant protein. Chem Biol Interact. 344, 109495(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cataract SurgeryPosterior Capsule OpacificationLens Epithelial CellsMouse Cataract ModelTGF Beta SignalingAlpha V Beta Eight IntegrinMyofibroblast FormationOcular InflammationGenetic ManipulationImmunofluorescence Analysis

Powiązane artykuły