Artykuł metodologiczny

Wykrywanie wielogenowego polimorfizmu pojedynczego nukleotydu w raku żołądka w oparciu o platformę sekwencjonowania półprzewodników jonowych

1.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66058

⸱

10 maja 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Nanfang Hospital, Southern Medical University, 2Research and Development Department, Guangzhou Darui Biotechnology Co., Ltd, 3Key Laboratory of Antibody Engineering of Guangdong Higher Education Institutes, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 4Provincial Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, Southern Medical University

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Ten protokół proponuje całościowe procedury laboratoryjne wymagane do wykrywania polimorfizmów pojedynczego nukleotydu w próbkach raka żołądka w oparciu o platformę sekwencjonowania półprzewodników jonowych. Szczegółowo opisano również sekwencje docelowe, adaptery ligaturujące, wzmacnianie i oczyszczanie biblioteki oraz kryteria kontroli jakości.

Streszczenie

Rak żołądka jest powszechnym nowotworem niejednorodnym. Większość pacjentów ma zaawansowanego raka żołądka w momencie diagnozy i często wymaga chemioterapii. Chociaż 5-fluorouracyl (5-FU) jest szeroko stosowany w leczeniu, jego czułość terapeutyczna i tolerancja na lek nadal muszą zostać określone, co podkreśla znaczenie zindywidualizowanego podawania. Farmakogenetyka może pomóc w klinicznym wdrożeniu zindywidualizowanego leczenia. Polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP), jako marker genetyczny, przyczyniają się do doboru odpowiednich schematów i dawek chemioterapii. Niektóre SNP są związane z metabolizmem kwasu foliowego, celem terapeutycznym 5-FU. Reduktaza metylenotetrahydrofolianu (MTHFR) rs1801131 i rs1801133, reduktaza dihydrofolianowa (DHFR) rs1650697 i rs442767, syntaza metioniny (MTR) rs1805087, hydrolaza gamma-glutamylowa (GGH) rs11545078 i nośnik substancji rozpuszczonej 19 członek 1 (SLC19A1) rs1051298 były badane w różnych rodzajach nowotworów i przeciwnowotworowych lekach przeciwfolianowych, które mają potencjalne znaczenie prognostyczne i przewodnie dla zastosowanie 5-FU. Technologia sekwencjonowania półprzewodników nowej generacji może szybko wykrywać SNP związane z rakiem żołądka. Za każdym razem, gdy zasada jest wydłużana w łańcuchu DNA, uwalniany jest H+, powodując lokalne zmiany pH. Czujnik jonowy wykrywa zmiany pH i przekształca sygnały chemiczne w sygnały cyfrowe, uzyskując sekwencjonowanie przez syntezę. Technika ta charakteryzuje się niskim zapotrzebowaniem na próbkę, prostą obsługą, niskimi kosztami i dużą szybkością sekwencjonowania, co jest korzystne dla prowadzenia zindywidualizowanej chemioterapii przez SNP.

Wprowadzenie

Rak żołądka jest dużym obciążeniem w dziedzinie globalnego zdrowia publicznego. Według Global Cancer Statistics 2020, opublikowanego przez Międzynarodową Agencję Badań nad Rakiem (IARC), rak żołądka jest piątym najczęściej diagnozowanym nowotworem i czwartą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem. Na całym świecie częstość występowania wskaźnika standaryzowanego według wieku w Azji Wschodniej jest najwyższa zarówno u mężczyzn, jak i kobiet1. Występowanie raka żołądka jest podstępne, co oznacza, że pacjenci często we wczesnym stadium nie mają żadnych oczywistych i specyficznych objawów. Spośród wszystkich pacjentów z rakiem żołądka, w krajach, w których nie przeprowadza się rutynowych badań przesiewowych, 80%-90% pacjentów jest albo diagnozowanych w zaawansowanym stadium, gdy guz nie może być operowany, albo dochodzi do nawrotów w ciągu 5 lat po operacji2.

W przypadku zaawansowanego lub przerzutowego raka żołądka, głównym sposobem leczenia jest chemioterapia, która może poprawić przeżywalność i jakość życia pacjentów. W początkowej terapii pacjentów z przerzutowym rakiem żołądka głównym wyborem dla schematu chemioterapii pierwszego rzutu jest schemat platynowo-fluoropirymidynowy3. Fluoropirymidyna obejmuje głównie 5-fluorouracyl (5-FU) i doustne pochodne fluoropirymidyny, takie jak kapecytabina i tegafur. Głównym celem 5-FU są enzymy związane z metabolizmem kwasu foliowego, które hamują syntezę DNA i spowalniają wzrost tkanki nowotworowej. Działania niepożądane leków ograniczają ich użyteczność, a do najczęstszych działań niepożądanych należą biegunka, zapalenie błony śluzowej, supresja szpiku kostnego i zespół ręka-stopa. Doniesiono, że odpowiedź terapeutyczna i działania niepożądane leku są ściśle związane z czynnikami w szlaku metabolicznym kwasu foliowego. Warto zauważyć, że homozygotyczna mutacja rs1801131 została zidentyfikowana jako wskaźnik zespołu ręka-stopa (p = 4,1 x 10-6, OR = 9,99, 95% CI: 3,84-27,8)4. Chociaż fluoropirymidyny są szeroko stosowane w chemioterapii przeciwnowotworowej, ich chemooporność jest częstym stanem awaryjnym, powodującym niepowodzenie terapeutyczne w leczeniu raka żołądka. Na przykład ogólny wskaźnik odpowiedzi wynosi tylko 10%-15% wśród pacjentów z zaawansowanym rakiem jelita grubego leczonych tylko 5-FU5. Ponadto fluoropirymidyny mają toksyczność, której nie można zignorować. Reakcje toksyczności wywołane przez 5-FU obejmują głównie biegunkę, zespół ręka-stopa, zapalenie jamy ustnej, neutropenię, małopłytkowość, neurotoksyczność, a nawet śmierć6. Ciężka toksyczność związana z leczeniem występuje u 10%-30% pacjentów leczonych fluoropirymidynami, a śmiertelna toksyczność występuje u 0,5%-1% tych pacjentów7.

Badanie jakości życia pacjentów z zaawansowanym rakiem żołądka wykazało, że wskaźnik odpowiedzi był mniejszy niż 50% u tych, którzy otrzymali chemioterapię opartą na 5-FU8. Dlatego zrozumienie czynników związanych z czułością chemioterapii opartej na 5-FU jest szczególnie ważne dla precyzyjnego leczenia, aby zmaksymalizować wskaźnik odpowiedzi i skuteczność przy jednoczesnej minimalizacji toksyczności. Biorąc pod uwagę, że 5-FU jest ściśle związany z metabolizmem kwasu foliowego, warianty genetyczne enzymów w szlaku metabolicznym kwasu foliowego mogą być jednym z czynników. Około 90% zmienności sekwencji ludzkiej przypisuje się mutacjom pojedynczej zasady w DNA, znanym jako polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP)9. Kiedy SNP zmieniają właściwości enzymatyczne metabolizmu kwasu foliowego, może to prowadzić do indywidualnych różnic w skuteczności, toksyczności i chemooporności na fluorouracyl u pacjentów z rakiem żołądka.

Reduktaza metylenotetrahydrofolianu (MTHFR) jest głównie używana do przekształcania 5,10-metylenotetrahydrofolianu (5,10-MTHF) w 5-metylotetrahydrofolian. 5-FdUMP, metabolit 5-FU, tworzy nieaktywny trójskładnikowy z 5,10-MTHF i syntazą tymidylanową (TS), hamując aktywność TS i prowadząc do niedoboru dTMP10. Akumulacja 5,10-MTHF może nasilać efekt hamowania 5-FU na TS, co jest skorelowane z aktywnością MTHFR. MTHFR rs1801131 i rs1801133 są najczęstszymi polimorfizmami, które są związane z niższą aktywnością enzymu (spadek o 75% dla rs1801133 i 30% dla rs181131) i akumulacją 5,10-MTHF11.

Reduktaza dihydrofolianu (DHFR) jest kluczowym enzymem w metabolizmie folianów i syntezie DNA. DHFR redukuje dihydrofolian za pomocą NADPH do tetrahydrofolianu (THF), który jest używany do przenoszenia jednostki jednowęglowej. SNP DHFR mogą wpływać na jego ekspresję, zmieniać aktywność i obfitość THF, a także dodatkowo wpływać na metabolizm folianów i wrażliwość 5-FU. Mutacja punktowa DHFR rs1650697 występuje w głównym promotorze genu DHFR, co zwiększa ekspresję DHFR 12. Badanie wykazało, że rs442767 jest związany ze skutecznością i toksycznością przeciwzapalnych leków przeciwnowotworowych, takich jak pemetreksed i metotreksat. Jeśli chodzi o SNP rs442767, genotyp GT oznacza dziedziczenie allelu G i allelu T w tym samym locus na chromosomach homologicznych od każdego z rodziców. Podobnie genotypy GG i TT oznaczają dziedziczenie odpowiednio dwóch alleli G lub dwóch alleli T. W porównaniu z genotypem GT+TT, GG wiąże się ze zmniejszonym czasem przeżycia wolnego od zdarzeń i zwiększonym ryzykiem13. Sugeruje to, że rs442767 może prowadzić do pewnego potencjalnego wpływu na 5-FU.

Syntaza metioniny (MTR) katalizuje remetylację homocysteiny do metioniny, która odgrywa ważną rolę w metabolizmie folianów. MTR rs1805087 jest najczęstszym polimorfizmem genu MTR. MTR rs1805087 zastępuje kwas asparaginowy glicyną w potencjalnie funkcjonalnym miejscu białka, co może zmniejszać aktywność MTR. Osoby z allelem G miały podwyższony poziom folianów w osoczu i obniżony poziom homocysteiny w osoczu14. Wręcz przeciwnie, badanie wykazało, że rs1805087 nie ma statystycznie istotnego związku ze skutecznością 5-FU. Ale to badanie koncentrowało się na raku jelita grubego, a wielkość próby była niewielka. Związek między rs1805087 a skutecznością 5-FU u pacjentów z rakiem żołądka pozostaje do zbadania15.

Hydrolaza gamma-glutamylowa (GGH) to enzym lizosomalny, który reguluje wewnątrzkomórkowe stężenie folianów. Kwas pteroiloglutaminowy jest synonimem kwasu foliowego, który składa się z pteryny, kwasu p-aminometylobenzoesowego i kwasu glutaminowego. W organizmach występują dwie formy kwasu foliowego, folian monoglutaminianu i folian poliglutaminianu. Poliglutaminian THF jest enzymatycznie przekształcany w monoglutaminowy folian przez GGH, kolejno uwalniając monoglutaminian (mono-Glu) lub di-glutaminian (di-Glu)16. Badanie dotyczące ekspresji GGH u pacjentów z miejscowo zaawansowanym rakiem żołądka wykazało, że wysoka ekspresja GGH może zmniejszyć 5,10-MTHF i TS, co oznacza, że do osiągnięcia efektu hamującego TS u tych pacjentów potrzebna jest tylko niewielka dawka 5-FU17. GG jest biomarkerem prognostycznym u pacjentów z miejscowo zaawansowanym rakiem żołądka leczonych pooperacyjną chemioterapią uzupełniającą z S-1, prolekiem 5-FU, i odgrywa ważną rolę w utrzymaniu homeostazy wewnątrzkomórkowej kwasu foliowego18. GGH rs11545078 jest wariantem missense i zmienia Thr-127 na Ile-127. Badanie skupiające się na specyficzności substratowej GGH sugeruje, że rs11545078, w porównaniu z typem dzikim, skutkuje wyższym Km i niższą wydajnością katalityczną dla metotreksatu, a struktura jest podobna do kwasu foliowego19. Wspólne zbadanie związku między rs11545078 a wynikami klinicznymi 5-FU jest obiecującą strategią zrozumienia oporności na leki.

Nośnik substancji rozpuszczonej 19 członek 1 (SLC19A1), zwany również transporterem zredukowanego kwasu foliowego, jest typowym ułatwiającym białkiem transbłonowym, które importuje zredukowane foliany, których komórki ssaków nie są w stanie syntetyzować de novo, co jest rozpoznawane w celu oszacowania odpowiedzi guza na 5-FU20. Jednak przeprowadzono tylko kilka badań dotyczących związku między polimorfizmem 5-FU a polimorfizmem SLC19A121. U pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca otrzymujących pemetreksed, który jest analogiem kwasu foliowego, rs1051298 w genie SLC19A1 przyczynił się do zwiększenia ryzyka wystąpienia wszystkich działań niepożądanych i zmniejszenia całkowitego przeżycia22,23. SLC19A1 rs1051298, wariant regionu 3' bez translacji dotyczący metabolizmu kwasu foliowego, może pomóc wyjaśnić niektóre indywidualne różnice dotyczące terapii 5-FU. Celem jest ocena związku między rs1051298 a opornością na 5-FU u pacjentów z rakiem żołądka.

Zestaw oparty na sekwencjonowaniu półprzewodników, służy do jakościowego wykrywania genów in vitro (Rysunek 1), który może wykryć 7 wybranych SNP w 5 genach, mutacje rs1801131 i rs1801133 genu MTHFR, mutacje rs1650697 i rs442767 genu DHFR, mutacje rs1805087 genu MTR, rs11545078 mutacje genu GGH i rs1051298 genu SLC19A1 gen w próbkach tkanki nowotworowej pacjentów z rakiem żołądka. Po pierwsze, próbkę kwasu nukleinowego wyekstrahowano, a fragment docelowy został specjalnie amplifikowany przez PCR. Uniwersalny adapter do sekwencjonowania został dodany na obu końcach fragmentu DNA, aby skonstruować bibliotekę, która może być używana do sekwencjonowania. Następnie przeprowadzono amplifikację biblioteki sekwencjonowania metodą PCR w celu utworzenia matrycy sekwencjonowania. Matryca dodatnia została wzbogacona, aby spełnić wymagania sekwencjonowania. Korzystanie z systemu sekwencjonowania półprzewodników, poprzez zamocowanie nici DNA w maleńkim otworze chipa półprzewodnikowego. Polimeraza DNA przyjmuje jednoniciowy DNA jako matrycę i syntetyzuje komplementarną nić DNA zgodnie z zasadą komplementarnego parowania zasad. Za każdym razem, gdy zasada jest wydłużana w łańcuchu DNA, uwalniany jest proton, powodując lokalne zmiany pH. Czujnik jonowy wykrywa zmiany pH i przekształca sygnały chemiczne na sygnały cyfrowe, dzięki czemu zasady mogą być interpretowane w czasie rzeczywistym, a na koniec można uzyskać sekwencję zasad każdego segmentu DNA. Wykorzystano analizę bioinformatyczną w celu dopasowania tych sekwencji do mapy referencyjnej ludzkiego genomu. Kiedy geny związane z rakiem żołądka mutują, odpowiadające im sekwencje zasad DNA ulegną zmianie, aby uzyskać informacje o mutacjach powiązanych genów.

Wynik może wyświetlać status mutacji genów i stanowić punkt odniesienia dla klinicystów do wyboru odpowiednich typów i dawek leków chemioterapeutycznych oraz przewidywania oporności na leki u pacjentów z rakiem żołądka. Wyniki badań służą jednak wyłącznie jako odniesienie kliniczne i nie są zalecane jako jedyna podstawa do zindywidualizowanego leczenia pacjentów. Klinicyści powinni dokonać kompleksowej oceny w oparciu o stan pacjenta, wskazania do stosowania leków, reakcje na leczenie i inne wskaźniki badań laboratoryjnych.

Protokół

Wszystkie protokoły oraz próbki tkanek raka żołądka (krok 1), pobrane podczas endoskopii górnego odcinka przewodu pokarmowego lub zabiegu chirurgicznego i wykorzystane w niniejszym badaniu, zostały przejrzane i zatwierdzone przez komisję etyki medycznej w dniu 24 lipca 2023 r. (NFEC-2023-298). Ponadto protokół ten został opracowany wyłącznie w celu zilustrowania detekcji wielu genów w raku żołądka, bez przeprowadzania porównań kohortowych, w związku z czym nie określa on żadnych specyficznych kryteriów włączenia lub wykluczenia pacjentów. Pacjenci/uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę na udział w badaniu.

1. Przygotowanie bloków zatopionych w parafinie z raka żołądka

  1. Skonfiguruj system do zatapiania tkanek, składający się z rezerwuaru i dozownika parafiny oraz płyt grzewczych i chłodzących, zgodnie z określonymi wytycznymi eksploatacyjnymi.
  2. Wyjmij przygotowaną do zatopienia tkankę z dehydratora i umieść ją w szczelinie magazynowej centrum zatapiania.
  3. Dobierz odpowiednie formy do zatapiania w zależności od wielkości tkanki, wlej wystarczającą ilość roztopionej parafiny, aby przykryć tkankę, a następnie umieść formę na płycie grzewczej.
  4. Wyjmij tkankę z kaset i ułóż błonę śluzową żołądka prostopadle do podstawy formy do zatapiania, aby zapewnić, że płaszczyzna przekroju przechodzi przez wszystkie warstwy tkanki. Ustabilizuj położenie tkanki w formie.
  5. Umieść kasetę na górze formy, a następnie dolej parafinię, aby całkowicie wypełnić formę.
  6. Umieść formę z zatopioną tkanką na płycie chłodzącej, a po zestaleniu parafiny oddziel bloki z tkanem od form.

2. Izolacja kwasów nukleinowych z próbek

  1. Użyj zestawów do ekstrakcji i oczyszczania kwasów nukleinowych, aby wyizolować kwasy nukleinowe z próbek tkanek zatopionych w parafinie.
  2. Użyj kwantyfikatora kwasów nukleinowych do oznaczenia ilości wyekstrahowanego kwasu nukleinowego. Zaleca się, aby stężenie kwasu nukleinowego wynosiło powyżej 2 ng/µL.
    UWAGA: Materiały wykorzystane na tym etapie znajdują się w Tabeli materiałów.

3. Przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania

  1. Przygotowanie przed eksperymentem
    1. Włączyć lampę UV w komorze z laminarnym przepływem powietrza i sterylizować przez 30 min. Następnie wyłączyć lampę UV i włączyć wentylator, aby wietrzyć komorę przez 10 min.
    2. Wyjąć kwasy nukleinowe z lodówki o temperaturze -20 ± 5 °C, sprawdzić i zapisać identyfikator próbki, kod kreskowy kwasu nukleinowego oraz numer etykiety przypisanej do próbki. Po weryfikacji umieścić próbkę w statywie do probówek wiriówek w celu rozpuszczenia w temperaturze pokojowej (RT), a następnie wirCować przez 10 s przy stałej prędkości 2 50 x g w celu przygotowania.
  2. Amplifikacja PCR fragmentu docelowego
    1. Wyjąć roztwór do reakcji przechwytywania fragmentów, starter amplifikacyjny dla raka żołądka oraz starter amplifikacji fuzyjnej z dedykowanego zestawu do wspólnego wykrywania wielu genów raka żołądka i umieścić je na lodzie do rozpuszczenia. Po rozpuszczeniu wstrząsnąć i wymieszać, odwirować przez 10 s oraz przygotować wodę wolną od nukleaz. Szczegółowe informacje o starterach przedstawiono w Tabeli 1.
      UWAGA: Zestaw nie jest jeszcze dostępny w sprzedaży komercyjnej, w celu uzyskania dalszych szczegółów należy skontaktować się z autorami.
    2. Przygotować probówkę do reakcji PCR o pojemności 0,2 mL, kolejno dodać do niej odczynniki zgodnie z Tabelą uzupełniającą 1, wymieszać na wirówce typu vortex przez 5 s i odwirować natychmiast przez 10 s przy stałej prędkości 2 50 x g, tak aby na ściankach i zakrętce probówki nie pozostały wyraźne krople. Próbki RNA należy poddać odwrotnej transkrypcji do cDNA, a następnie wykorzystać do późniejszej konstrukcji biblioteki. Produkty cDNA należy dodawać do probówek kolejno zgodnie z Tabelą uzupełniającą 2.
    3. Umieścić każdą probówkę z reakcją w termocyklerze. W przypadku próbek DNA uruchomić program amplifikacji zgodnie ze szczegółami w Tabeli 2. W przypadku produktów cDNA uruchomić program amplifikacji zgodnie ze szczegółami w Tabeli 3.
  3. Trawienie sekwencji startera
    1. Wyjąć enzym do trawienia starterów i umieścić go na lodzie do rozpuszczenia. Po amplifikacji wyjąć wyżej wymienione probówki z reakcją, dodać do każdej probówki 2 µL enzymu do trawienia starterów, zapewniając uzyskanie objętości całkowitej 2 µL.
    2. Wymieszać roztwór reakcyjny w probówce PCR na wirówce typu vortex i odwirować natychmiast przez 10 s przy stałej prędkości 2 50 x g.
    3. Umieścić każdą probówkę z reakcją w termocyklerze i uruchomić program zgodnie ze szczegółami w Tabeli 4.
  4. Ligacja adaptera
    1. Umieścić odczynniki do łączenia adapterów na lodzie w celu rozpuszczenia. Przygotować probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL, a następnie wymieszać poszczególne składniki zgodnie z Tabelą 5 i oznaczyć ją jako mieszaninę adapterów X.
      UWAGA: Odczynniki do łączenia adapterów obejmują adaptery P1 oraz specyficzne adaptery X, numerowane od 1 do 48. Są one zaprojektowane w celu unikalnego znakowania różnych próbek. Podczas dodawania specyficznego adaptera należy otwierać tylko jedną probówkę na raz, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej specyficznych adapterów. Rozcieńczona mieszanina specyficznych adapterów może być przechowywana w temperaturze -20 ± 5 °C. W procesach sekwencjonowania próbki nie są przetwarzane pojedynczo; zamiast tego wiele próbek, z których każda jest znakowana specyficznym adapterem, jest łączonych w jedną wspólną bibliotekę do sekwencjonowania. Metoda ta umożliwia późniejsze rozróżnienie próbek na podstawie sekwencji ich specyficznych adapterów.
    2. Wyjąć z termocyklera produkt trawienia starterów (2 µL). Kolejno dodać do probówki odczynniki zgodnie z Tabelą 6, wymieszać na wirówce typu vortex przez 5 s. Odwirować przy niskiej prędkości przez 10 s przy stałej wartości 2 50 x g, tak aby na ściankach i zakrętce probówki nie pozostały wyraźne krople.
    3. Umieścić probówkę z reakcją w termocyklerze. W przypadku próbek DNA uruchomić program amplifikacji zgodnie ze szczegółami w Tabeli 7. W przypadku produktów cDNA uruchomić program amplifikacji zgodnie ze szczegółami w Tabeli 8.
  5. Oczyszczanie produktu ligacji i amplifikacja
    1. Wyjąć wcześniej magnetyczne kulki do oczyszczania DNA z lodówki o temperaturze 2-8 °C, wymieszać je równomiernie na wirówce typu vortex i odwirować natychmiast przez 10 s przy stałej prędkości 2 50 x g. Inkubować kulki magnetyczne w temperaturze RT przez 30 min.
    2. Przygotować probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL o niskiej adsorpcji i przenieść do odpowiedniej probówki produkt reakcji ligacji.
    3. Dodać do każdej probówki 45 µL magnetycznych kulek do oczyszczania DNA, dobrze wymieszać na wirówce typu vortex, odwirować natychmiast przez 10 s i inkubować w temperaturze RT przez 5 min.
    4. Umieścić probówkę na statywie magnetycznym na 3 min. Odpipować i usunąć nadsącz, unikając pobrania kulek.
    5. Przenieść 30 µL świeżo przygotowanego 75% etanolu do probówki do mikrocentryfugi i delikatnie obrócić probówki 4 razy o 180°. Po przejaśnieniu się roztworu szybko usunąć nadsącz. Unikać pobrania kulek. Powtórzyć procedurę płukania jeszcze raz.
    6. Zdjąć probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL ze statywu magnetycznego i krótko odwirować (10 s przy stałej prędkości 2 50 x g). Umieścić probówki z powrotem na statywie magnetycznym i wypipować pozostały płyn. Upewnić się, że na ściankach probówek nie pozostał płyn.
    7. Otworzyć zakrętki każdej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL i suszyć kulki w temperaturze RT przez 5 min. Kontrolować stopień wysuszenia kulek. Po wyschnięciu kulek magnetycznych sprawdzić, czy na powierzchni nie ma plam z wody. W razie potrzeby odpowiednio wydłużyć czas suszenia, jeśli kulki są zbyt wilgotne. Natychmiast zamknąć zakrętki, jeśli na kulkach pojawią się pęknięcia, i przejść do następnego kroku w celu amplifikacji i oczyszczania biblioteki.
  6. Amplifikacja i oczyszczanie biblioteki
    1. Wcześniej umieścić odczynniki do PCR na lodzie w celu rozpuszczenia, wymieszać na wirówce typu vortex i odwirować przez 10 s. Zdjąć probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL ze statywu magnetycznego, dodać do probówki odczynniki PCR zgodnie z Tabelą 9, zamknąć zakrętkę i wymieszać na wirówce typu vortex przez 5 s. Odwirować krótko (10 s), aby na ściankach i zakrętce probówki nie było wyraźnych kropli cieczy.
    2. Przenieść powyższy produkt do nowej probówki PCR. Inkubować próbkę w termocyklerze. W przypadku próbek DNA uruchomić program amplifikacji zgodnie ze szczegółami w Tabeli 10. W przypadku produktów cDNA uruchomić program amplifikacji zgodnie ze szczegółami w Tabeli 1.
    3. Przygotować nową probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL o niskiej adsorpcji. Odwirować probówkę PCR przez 10 s po inkubacji. Przenieść produkt z probówki PCR do probówki EP.
    4. Dodać do każdej probówki 25 µL magnetycznych kulek do oczyszczania DNA. Dobrze wymieszać na wirówce typu vortex, odwirować przy niskiej prędkości i inkubować w temperaturze RT przez 5 min.
    5. Umieścić probówki na statywie magnetycznym na 3 min i poczekać, aż roztwór stanie się przejrzysty. Przenieść nadsącz do nowych probówek do mikrocentryfugi. Unikać pobrania kulek.
    6. Dodać do każdej probówki 60 µL magnetycznych kulek do oczyszczania DNA. Dobrze wymieszać na wirówce typu vortex, odwirować przy niskiej prędkości i inkubować w temperaturze RT przez 5 min.
    7. Umieścić probówki na statywie magnetycznym na 3 min i poczekać, aż roztwór stanie się przejrzysty. Usunąć nadsącz. Unikać pobrania kulek.
    8. Przenieść 30 µL świeżo przygotowanego 75% etanolu do probówek i delikatnie obrócić probówki 4 razy o 180°. Po przejaśnieniu się roztworu szybko wypipować i usunąć nadsącz. Unikać pobrania kulek. Powtórzyć procedurę płukania raz.
    9. Zdjąć probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL ze statywu magnetycznego i krótko odwirować (10 s). Włożyć probówki z powrotem do statywu magnetycznego i wypipować pozostały płyn. Upewnić się, że na ściankach probówek nie pozostał płyn.
    10. Otworzyć zakrętki probówek o pojemności 1,5 mL i suszyć kulki w temperaturze RT przez 5 min. Kontrolować stopień wysuszenia kulek. Po wyschnięciu kulek magnetycznych na powierzchni nie powinny być widoczne plamy z wody. W razie potrzeby odpowiednio wydłużyć czas suszenia, jeśli kulki są zbyt wilgotne. Natychmiast zamknąć zakrętkę, jeśli na kulkach pojawią się pęknięcia.
    11. Wpipować 50 µL eluentu do probówek, wymieszać dobrze na wirówce typu vortex. Odwirować krótko (5 s przy stałej prędkości 2 500 x g) i pozostawić probówki w temperaturze RT na 5 min.
    12. Umieścić probówki na statywie magnetycznym na 3 min i poczekać, aż roztwór stanie się przejrzysty. Ostrożnie przenieść ciecz do nowej probówki i oznaczyć nazwę biblioteki.
    13. Przechowywać bibliotekę tymczasowo w lodówce w temperaturze 2-8 °C do czasu wykonania oznaczenia ilościowego lub przechowywać bibliotekę w lodówce w temperaturze -20 ± 5 °C w celu długoterminowego przechowywania.

4. Ilościowe oznaczenie skonstruowanej biblioteki

  1. Użyj urządzenia do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych, aby określić ilość biblioteki. Jeśli stężenie biblioteki wynosi ≥ 0,2 ng/µLjest ona odpowiednia. W przeciwnym razie należy ponownie przygotować bibliotekę.
  2. Wymieszać równe objętości DNA (lub RNA) i oznaczyć stężenie roztworu. Na podstawie wyniku ilościowego rozcieńczyć zmieszany roztwór do stężenia 10 pmol/L, korzystając z poniższego wzoru.
    figure-protocol-1
    UWAGA: Alternatywną metodą jest rozcieńczenie biblioteki do stężenia 10 pmol/L zgodnie z formułą, a następnie przeprowadzenie ilościowego pomiaru za pomocą fluorescencyjnego ilościowego PCR. Biblioteki DNA (lub RNA) należy zmieszać w równych ilościach, opierając się na wynikach ilościowych otrzymanych z urządzenia do PCR.
  3. Wymieszać bibliotekę DNA o stężeniu 10 pmol/L oraz bibliotekę RNA w stosunku 4:1. Uzyskaną mieszaninę bibliotek DNA i RNA wykorzystać do sekwencjonowania komputerowego.

5. Sekwencjonowanie

  1. Przeprowadź sekwencjonowanie zgodnie z instrukcją uniwersalnego zestawu do reakcji sekwencjonowania24,25 (metoda sekwencjonowania półprzewodnikowego).

6. Kontrola jakości próbek

  1. Pozytywna kontrola jakości DNA w raku żołądka: Należy pobrać pozytywną kontrolę DNA w raku żołądka i przeprowadzić test zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu. Kontrola jest dostarczana w zestawie. Wynik wskazuje na wykrycie mutantów genów MTHFR, DHFR, MTR, GGH oraz SLC19A1.
  2. Negatywna kontrola jakości DNA w raku żołądka: Należy pobrać negatywną kontrolę DNA w raku żołądka i przeprowadzić test zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu. Kontrola jest dostarczana w zestawie. Wynik wskazuje na wykrycie typów dzikich genów MTHFR, DHFR, MTR, GGH oraz SLC19A1.
    UWAGA: Należy upewnić się, że kryteria zostały spełnione w obu przypadkach; w przeciwnym razie wymagane jest ponowne przeprowadzenie detekcji.

7. Analiza danych

  1. Uruchom odpowiednie wtyczki (Variant Caller, Coverage Analysis oraz oprogramowanie Ion Reporter) w oprogramowaniu Torrent Suite, aby uzyskać wyniki analizy próbek. Oceń wyniki detekcji w próbkach na podstawie wyników analizy z wtyczek.

Wyniki

Wyznaczanie wyników testów opiera się na dodatniej wartości oceny, która jest również uznawana za przedział referencyjny. Do wykrywania w zebranych próbkach klinicznych należy zastosować metodę sekwencjonowania półprzewodnikowego. Jeśli wartość częstości mutacji genów MTHFR, DHFR, MTR, GGH oraz SLC19A1 wynosi ≥ 5%, wynik detekcji wskazuje na mutant odpowiadającego genu. Gdy wartość częstości mutacji wynosi < 5%, wynik detekcji wskazuje na typ dziki odpowiadającego genu26.

Do określenia wiarygodności wyników detekcji można zastosować następujące kryteria. Po pierwsze, wyniki testu są wiarygodne, jeśli średnie pokrycie wyników sekwencjonowania DNA wynosi ≥ 50, a liczba zmapowanych odczytów wyników sekwencjonowania RNA wynosi ≥ 2027. W przeciwnym razie zaleca się powtórzenie testu. Po drugie, średnie pokrycie pozytywnej kontroli jakości DNA dla raka żołądka musi wynosić ≥ 50, a wynik testu powinien potwierdzić obecność mutacji rs180131 i rs18013 w genie MTHFR, mutacji rs1650697 i rs42767 w genie DHFR, mutacji rs1805087 w genie MTR, mutacji rs1545078 w genie GGH oraz mutacji rs1051298 w genie SLC19A1 jako wyników pozytywnych. W przeciwnym razie zaleca się powtórzenie testu. Po trzecie, średnie pokrycie negatywnej kontroli jakości DNA dla raka żołądka musi wynosić ≥ 50, a wyniki detekcji powinny wykazać, że wszystkie miejsca w zakresie detekcji tego zestawu są typu dzikiego. W przeciwnym razie zaleca się powtórzenie testu. Na koniec, jeśli stężenie biblioteki jest niższe niż 0.2 ng/µL, może to wynikać z degradacji DNA lub RNA w próbce, nieprzestrzegania rygorystycznie procesu eksperymentalnego lub użycia przeterminowanych odczynników podczas badania. Powyższe warunki mogą spowodować spadek jakości sekwencjonowania lub jej niepowodzenie. W takim przypadku zaleca się ponowne przygotowanie biblioteki.

Z wykorzystaniem tego zestawu wykonuje się serię etapów w celu przygotowania biblioteki do sekwencjonowania z próbek klinicznych. Biblioteka jest następnie sekwencjonowana na platformie sekwencjonowania półprzewodnikowego jonowego, a do adnotacji wyników służy program ANNOVAR. Po sekwencjonowaniu sporządzany jest dokument podsumowujący typy mutantów dla każdej próbki. Brak określonego typu mutanta wskazywał, że w próbce nie wystąpiła ta konkretna mutacja. Tabela uzupełniająca 3 przedstawia typowy przykład takiego zestawienia. Tabela 12 zawiera podstawowe informacje o wykrytych tutaj SNP. Analiza poszczególnych SNP przy użyciu adnotacji opartej na filtrach w różnych bazach danych, takich jak 10 Genomes Project (10g2015aug; https://www.internationalgenome.org/; Tabela 13) oraz Exome Aggregation Consortium (ExAC; https://gnomad.broadinstitute.org/; Tabela 14), może wykazać, że różne SNP występują w znacznym stopniu w różnych populacjach.

figure-results-1
Rysunek 1Schemat blokowy protokołu. Schemat detekcji wielu genów w raku żołądka z wykorzystaniem metody sekwencjonowania półprzewodnikowego. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

ChromosomLokalizacjaInterwał projektowania starterówStarter lewyPrawe startery
chr111854475chr1:11854175-185475ACAGGATGGG
GAAGTCACAG		AAACCGGAAT
GGTCACAAAG
11856377chr1:1185607-18567CTTCAGGTCA
GCCTCAAAGC		TCCCTGTGGT
CTTCATCC
chr579950780chr5:7950480-7951080CGCCGCACAT
AGTAGGTTCT		CTTCCTC
CAGCCCTATC
79951495chr5:795195-7951795CTTGGGTCAC
CTGCACAGTA		ATTTTGAAGC
ACCCAAGCTG
chr1237048499chr1:23704819-23704879GTCAAAGGCC
AGTCCCTTCT		CTCCCTTCAC
CAACTGTGCT
chr863938763chr8:63938463-63939063CAGTGAAGTT
CAGCGGCAT		TATTTTCCTGT
GTGGGGCAC
chr2146934825chr21:46934525-46935125CCAACCTGAG
ATGGCTTTTC		TCCTTGGTGC
TCTTGCTTTT

Tabela 1: Primery użyte dla siedmiu wybranych SNP w pięciu genach.Ta tabela zawiera informacje o położeniu primerów dla SNP związanych z opornością na 5-FU w raku żołądka.

TemperaturaCzasLiczba cykli
99 °C2 min1 cykl
99 °C15 s2 cykle
60 °C4 min
10 °CPrzytrzymać1 cykl

Tabela 2: Program cyklu termicznego dla amplifikacji DNA. Przedstawiono warunki reakcji termicznej, takie jak temperatura, czas i liczba cykli.

KrokTemperaturaCzasLiczba cykli
Aktywacja enzymów99 °C2 min1 cykl
 Denaturacja99 °C15 s30 cykli
Hybrydyzacja i elongacja60 °C4 min
Zachować10 °CPrzytrzymać1 cykl

Tabela 3: Program cyklu termicznego dla amplifikacji cDNA. Przedstawiono warunki reakcji termicznej, takie jak temperatura, czas i liczba cykli.

TemperaturaCzasLiczba cykli
50 °C10 min1 cykl
5 °C10 min1 cykl
60 °C20 min1 cykl
10 °CPodtrzymanie1 cykl

Tabela 4: Program cyklu termicznego dla trawienia sekwencji starterów. Przedstawiono warunki reakcji termicznych, takie jak temperatura, czas i liczba cykli.

KomponentTom
adapter P11.5 μL
Specyficzny adapter X1.5 μL
Woda wolna od nukleaz3 μL
Całkowita objętość układu reakcyjnego6 μL
X: Oznacza konkretny numer adaptera

Tabela 5: Kolejność dodawania odczynników do przygotowania mieszaniny adapterów. Dodawać odczynniki do probówki w podanej tutaj kolejności.

KomponentObjętość
Bufor łączący4 μL
Mieszanina adapterów X2 μL
Ligaza DNA2 μL
Całkowita objętość układu reakcyjnego30 μL

Tabela 6: Kolejność dodawania odczynników podczas produkcji trawionych starterów. Dodawać odczynniki do probówki w podanej tutaj kolejności.

TemperaturaCzasLiczba cykli
22 °C30 min1 cykl
72 °C10 min1 cykl
10 °CPrzytrzymaj1 cykl

Tabela 7: Program cyklu termicznego dla przyłączania adaptera do DNA. Przedstawiono warunki reakcji termicznych, takie jak temperatura, czas i liczba cykli.

TemperaturaCzasLiczba cykli
22 °C30 min1 cykl
68 °C5 min1 cykl
72 °C5 min1 cykl
10 °CPrzytrzymaj1 cykl

Tabela 8: Program cyklu termicznego dla przyłączenia adaptera do cDNA. Przedstawiono warunki reakcji termicznych, takie jak temperatura, czas i liczba cykli.

KomponentTom
Roztwór reakcyjny amplifikacji biblioteki50 μL
Mieszanina starterów do biblioteki2 μL
Całkowita objętość układu reakcyjnego52 μL

Tabela 9: Kolejność dodawania odczynników do amplifikacji. Dodawać odczynniki do probówki w podanej tutaj kolejności.

TemperaturaCzasLiczba cykli
98 °C2 min1 cykl
98 °C15 s5 cykli
60 °C1 min
10 °CPrzytrzymać1 cykl

Tabela 10: Program cyklu termicznego dla amplifikacji biblioteki DNA. Przedstawiono warunki reakcji termicznych, takie jak temperatura, czas oraz liczba cykli.

TemperaturaCzasLiczba cykli
98 °C2 min1 cykl
98 °C15 s5 cykli
64 °C1 min
10 °CPrzytrzymać1 cykl

Tabela 1: Program cyklu termicznego dla amplifikacji biblioteki cDNA. Przedstawiono warunki reakcji termicznych, takie jak temperatura, czas i liczba cykli.

rs180131rs18013rs1650697rs42767rs1805087rs1545078rs1051298
RefTGAGAGG
AltGAGTGAA
Funkc.ref
Gen z wersją		eksonowyeksonowyUTR5upstreameksonowyeksonowyUTR3
Gen.ref
Gen z wersją		MTHFRMTHFRDHFRDHFRMTRGGHSLC19A1
Szczegóły genu
.refGeneZWer.		..NG_02304.1:
g.5020T>G		...NM_01205206.1:
c.*64C>T;
NM_01205207.1:
c.*746C>T;
NM_19425.2:c.
*746C>T
ExonicFunc
.refGeneZWersją		niesynonimiczny;
SNV		niesynonimiczny;
SNV		..niesynonimowy;
SNV		niesynonimowy;
SNV (pojedynczy wariant nukleotydowy)		.
Zmiana aminokwasowa (AAChange)
GenZ Ver		MTHFR:NM_0
130358.1:exo
n8:c.A1409C:p.
E470A;MTHFR:
NM_05957.4:
ekson8:c.A1286
C:p.E429A		MTHFR:NM_0
130358.1:egzosoma
n5:c.C788T:p.
A263V;MTHFR:N
M_05957.4:e
xon5:c.C65T:
p.A22V		..MTR:NM_012
91939.1:ekson2
5:c.A2603G:p.
D868G;MTR:N
M_01291940.
1:ekson25:c.A1
535G:p.D512G;
MTR:NM_02
54.2:ekson26:c.
A2756G:p.D91
9G		GGH:NM_03878
.2:ekson5:c.C452T:
p.T151I		jin
cytoBand1p36.21p36.25q14.15q14.11q438q12.321q22.3

Tabela 12: Istotne informacje o SNP. Adnotacja próbek przy użyciu programu ANNOVAR.

MTHFRDHFRMTRGGHSLC19A1
rs180131rs18013rs1650697rs42767rs1805087rs11545078rs1051298
10g2015aug_all0.2494010.2454070.768570.2901360.2182510.0854630.524361
10g2015aug_afr0.15130.090.93490.03180.2840.0560.572
10g2015aug_amr0.15130.47410.750.3910.1720.04030.4323
10g2015aug_eas0.21920.29560.6070.58530.10520.08730.5635
10g2015aug_eur0.31310.36480.750.31910.1730.09240.493
100g2015aug_sas0.41720.1860.6790.280.3210.14830.52

Tabela 13: Adnotacja SNP w Projekcie 10 Genomów na podstawie filtrowania.

MTHFRDHFRMTRGGHSLC19A1
rs180131rs18013rs1650697rs42767rs1805087rs1545078rs1051298
ExAC_ALL0.2950.3037..0.20910.0936.
ExAC_AFR0.15880.1124..0.26660.0545.
ExAC_AMR0.15550.5141..0.18640.0361.
ExAC_EAS0.21480.3052..0.11320.0824.
ExAC_FIN0.31280.2227..0.18920.0581.
ExAC_NFE0.31910.345..0.19190.0969.
ExAC_OTH0.3040.3062..0.21080.0973.
ExAC_SAS0.41530.1409..0.3160.165.

Tabela 14: Adnotacja SNP w Exome Aggregation Consortium oparta na filtrach.

Tabela uzupełniająca 1: Kolejność dodawania odczynników do amplifikacji DNA. Dodaj odczynniki do probówki w podanej tutaj kolejności. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Kolejność dodawania odczynników do amplifikacji cDNADodaj odczynniki do probówki w podanej kolejności. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 3: Przykład wyników sekwencjonowania próbek klinicznych. W dokumentacji zostaną odnotowane wyłącznie mutacje występujące w badanych okazach. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Eksperci kliniczni jednogłośnie zgadzają się, że pacjenci, nawet z tym samym typem i stadium raka żołądka, mogą mieć znacznie różne reakcje na identyczne podejście do leczenia. Lata badań ujawniły naukowcom, że indywidualne różnice przypisuje się głównie naturze raka żołądka jako niejednorodnej, polimorficznej i różnorodnie zróżnicowanej populacji komórkowej, co prowadzi do znacznych indywidualnych różnic w odpowiedziach na leczenie28. W związku z tym pobieranie próbek raka żołądka za pomocą endoskopii lub chirurgii górnego odcinka przewodu pokarmowego oraz próbek krwi, w połączeniu z wysokoprzepustowym sekwencjonowaniem do analizy genetycznej, umożliwia spersonalizowane leczenie raka żołądka. Strategia ta ma na celu zwiększenie skuteczności leczenia klinicznego i zmniejszenie ryzyka wystąpienia ciężkich toksycznych działań niepożądanych. Postęp w technologii sekwencjonowania półprzewodników jonowych sprawił, że spersonalizowane leczenie stało się praktyczną rzeczywistością29.

Oto kilka ograniczeń tej metody testowej. Zastosowany tutaj zestaw służy przede wszystkim do diagnostyki in vitro , a więc ogranicza się do wykrywania mutacji rs1801131 i rs1801133 genu MTHFR , rs1650697 i rs442767 genu DHFR , rs1805087 genu MTR , rs11545078 genu GGH oraz rs1051298 genu SLC19A1. Nie można wykryć mutacji w innych sekcjach. Ze względu na znaczną niejednorodność tkanki nowotworowej, różne lokalizacje pobierania próbek mogą wpływać na wyniki wykrywania. W przypadku próbek tkanek zatopionych w parafinie przechowywanych przez dłuższy czas, DNA i RNA mogą ulec degradacji w pewnym stopniu, wpływając na wyniki testu. Nieuzasadnione pobieranie, transport i przetwarzanie próbek, a także niewłaściwa eksploatacja eksperymentu i środowisko eksperymentalne mogą prowadzić do wyników fałszywie ujemnych lub fałszywie dodatnich. Wynik wykrywania nie może być gwarantowany, jeśli stężenie kwasu nukleinowego jest niższe niż 2 ng/μl. Wyniki testów zestawu służą wyłącznie do celów klinicznych. Wybór spersonalizowanego leczenia dla pacjentów należy rozważyć w połączeniu z ich objawami/przedmiotami, wywiadem medycznym, innymi badaniami laboratoryjnymi i reakcjami na leczenie. Negatywne wyniki nie mogą całkowicie wykluczyć istnienia mutacji genu docelowego. Negatywne wyniki mogą być również spowodowane zbyt małą liczbą komórek nowotworowych w próbce, nadmierną degradacją kwasu nukleinowego lub stężeniem genu docelowego w układzie reakcji amplifikacji poniżej granicy wykrywalności.

Niektóre wskaźniki wydajności zastosowanego zestawu są zgodne z opisem. Czułość analityczna: W przypadku próbek DNA minimalna wykrywalna ilość całkowitego kwasu nukleinowego w tym zestawie wynosi 10 ng i można wykryć 5% szybkość mutacji. W przypadku próbek RNA minimalna wykrywalna ilość całkowitego kwasu nukleinowego w tym zestawie wynosi 10 ng. Dodatni i ujemny wskaźnik koincydencji: Dodatni i ujemny wskaźnik koincydencji sięga 100%. Granica wykrywalności (LOD): Można użyć łącznie 14 referencji LOD, ponumerowanych od L1 do L14. L1-L11 to referencje LOD genów MTHFR, DHFR, MTR, GGH i SLC19A1 , a ich wyniki wykrywania powinny być takie, że typy mutacji odpowiednich miejsc genów są dodatnie, a wskaźniki koincydencji wynoszą 100%. Powtarzalność: Można zastosować łącznie pięć powtarzalnych materiałów referencyjnych o numerach R1-R5. R1 jest silnie dodatnim powtarzalnym materiałem referencyjnym (mutacja rs67376798 genu DPYD ). R2, który zawiera tę mutację w mniejszej liczbie, jest słabo dodatnim powtarzalnym materiałem referencyjnym (mutacja rs67376798 genu DPYD ), R3 jest ujemnym powtarzalnym materiałem referencyjnym (6 miejsc genów DPYD, MTHFR i ABCB1 jest wykrywanych jako typ dziki). Każda próbka referencyjna musi zostać przebadana 10 razy, upewniając się, że wyniki tych powtarzających się ocen odpowiadają ich wcześniej określonym klasyfikacjom. Objętość danych: Efektywna objętość danych próbek DNA i RNA powinna być kontrolowana powyżej 0,05 M. Głębokość sekwencjonowania próbek DNA powinna być kontrolowana powyżej 500, a zmapowane odczyty próbek RNA powinny być kontrolowane powyżej 20000. Test zakłóceń: Na ten zestaw nie mają wpływu endogenne substancje zakłócające (trójglicerydy i albumina) oraz egzogenne substancje zakłócające (formalina i odwodniony alkohol).

Podczas eksperymentu należy przestrzegać pewnych środków ostrożności. Zastosowany tutaj zestaw może być używany wyłącznie do badań in vitro. Prosimy o uważne przeczytanie niniejszej instrukcji przed eksperymentem i korzystanie z niej w okresie ważności. Elementy zestawu w różnych partiach nie mogą być używane zamiennie. Zaleca się używanie jednorazowych materiałów eksploatacyjnych do tego zestawu, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Podczas użytkowania tego zestawu zaleca się stosowanie głowicy ssącej z wkładem filtrującym. W celu uniknięcia wszelkich potencjalnych zagrożeń biologicznych w próbce, badaną próbkę należy uznać za substancje zakaźne w celu uniknięcia kontaktu ze skórą i błoną śluzową. Zaleca się obchodzenie się z próbkami w komorze bezpieczeństwa biologicznego, która może zapobiec wydostawaniu się aerozoli. Probówki i przyssawki używane w operacji należy wysterylizować przed wyrzuceniem. Eksploatacja i utylizacja próbek powinny spełniać wymagania odpowiednich przepisów ustawowych i wykonawczych: Ogólnych wytycznych dotyczących bezpieczeństwa biologicznego mikrobiologicznych laboratoriów biomedycznych oraz Przepisów Ministerstwa Zdrowia w sprawie gospodarki odpadami medycznymi30,31. Personel doświadczalny musi przejść profesjonalne szkolenie, działać ściśle według instrukcji i ściśle oddzielić obszary zgodnie z procesem doświadczalnym. Na każdym etapie czynności doświadczalnej stosuje się specjalne przyrządy i wyposażenie, a przedmioty na każdym etapie każdego obszaru nie mogą być używane zamiennie. Personel doświadczalny musi ściśle oddzielić obszary zgodnie z procesem doświadczalnym. Na każdym etapie czynności doświadczalnej stosuje się specjalne przyrządy i sprzęt. W razie potrzeby podejmij środki ochronne, takie jak rękawice, odzież robocza itp. Utylizacja odpadów powinna być zgodna z odpowiednimi przepisami krajowymi.

Chociaż ten artykuł koncentruje się na siedmiu SNP w obrębie pięciu genów związanych z rakiem żołądka, sekwencjonowanie w praktycznych zastosowaniach nie ogranicza się tylko do tych pięciu genów. Niniejsza praca definitywnie ustala istotną korelację między siedmioma SNP a wrażliwością na chemioterapię 5-FU w raku żołądka.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie jest wspierane przez Badanie Mechanizmu i Roli szlaku ERK2/Snai1/AGPS/PUFA-PL w oporności komórek raka żołądka na ferroptozę wywołaną apatynibem (Numer pozycji: 82172814), wspierane przez National Nature Science Foundation of China; Badanie roli i mechanizmu czynnika transkrypcyjnego 1 palca cynkowego w modulowaniu oporności komórek raka żołądka na ferroptozę indukowaną przez apatynib za pośrednictwem wielonienasyconego szlaku fosfolipidowego eteru (numer pozycji: 2022A1515010267), wspierany przez Komitet Prowincji Guangdong ds. Finansowania Badań Podstawowych i Stosowanych; oraz Badania i zastosowanie odczynnika do diagnostyki wrażliwości na chemoterapię 5-FU w raku żołądka (numer pozycji: 201903010072), Projekty Naukowe i Technologiczne w Kantonie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml probówek DNA LoBindEppendorf30108051
50 ml probówekGreiner Bio-One227261
Amplifikacyjny starter raka żołądkaThermo FisherStartery są syntetyzowane przez Thermo Fshier zgodnie z sekwencją w Tabela 1.
DeparafinowanieQiagen19093
Oczyszczanie DNA Koraliki magnetyczneBechkmanA63881
Alkohol etylowyOdczynnik chemiczny Guangzhou
Fabryka Thermo Fisher Scientific		http://www.chemicalreagent.com/
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0Thermo Fisher4480441
Życie wodne wolne od nukleaz TechnologieAM9932
Probówki do PCRAxygenPCR-02D-C
Probówki do PCRAxygenPCR-02D-C
Końcówki do pipet Wysokiej jakości produktyhttps://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
Mini kolumny RNA PureLinkThermo FisherA29839
RecoverAll Kompletny zestaw do izolacji kwasów nukleinowychThermo FisherAM1975
Mini wirówka stołowaSCILOGESS1010E
Thermal CyclerTechnologies4375786
Ultramikro analizator kwasów nukleinowychBEIJING ORIENTAL SCIENCE & ROZWÓJ TECHNOLOGII SP. Z O.O.BD-1000
naukowe Life

Bibliografia

  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Wagner, A. D., et al. Chemotherapy for advanced gastric cancer. Cochrane Database Syst Rev. 8, (2017).
  3. Shah, M. A., et al. Immunotherapy and targeted therapy for advanced gastroesophageal cancer: Asco guideline. J Clin Oncol. 41 (7), 1470-1491 (2023).
  4. Loganayagam, A., et al. Pharmacogenetic variants in the dpyd, tyms, cda and mthfr genes are clinically significant predictors of fluoropyrimidine toxicity. Br J Cancer. 108 (12), 2505-2515 (2013).
  5. Giacchetti, S., et al. Phase iii multicenter randomized trial of oxaliplatin added to chronomodulated fluorouracil-leucovorin as first-line treatment of metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol. 18 (1), 136-147 (2000).
  6. Hoff, P. M., et al. Comparison of oral capecitabine versus intravenous fluorouracil plus leucovorin as first-line treatment in 605 patients with metastatic colorectal cancer: Results of a randomized phase iii study. J Clin Oncol. 19 (8), 2282-2292 (2001).
  7. Meulendijks, D., et al. Clinical relevance of dpyd variants c.1679t>g, c.1236g>a/hapb3, and c.1601g>a as predictors of severe fluoropyrimidine-associated toxicity: A systematic review and meta-analysis of individual patient data. Lancet Oncol. 16 (16), 1639-1650 (2015).
  8. Sadighi, S., Mohagheghi, M. A., Montazeri, A., Sadighi, Z. Quality of life in patients with advanced gastric cancer: A randomized trial comparing docetaxel, cisplatin, 5-fu (tcf) with epirubicin, cisplatin, 5-fu (ecf). BMC Cancer. 6, 274(2006).
  9. Collins, F. S., Brooks, L. D., Chakravarti, A. A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation. Genome Res. 8 (12), 1229-1231 (1998).
  10. Ladner, R. D. The role of dutpase and uracil-DNA repair in cancer chemotherapy. Curr Protein Pept Sci. 2 (4), 361-370 (2001).
  11. Capitain, O., et al. The influence of fluorouracil outcome parameters on tolerance and efficacy in patients with advanced colorectal cancer. Pharmacogenomics J. 8 (4), 256-267 (2008).
  12. Askari, B. S., Krajinovic, M. Dihydrofolate reductase gene variations in susceptibility to disease and treatment outcomes. Curr Genomics. 11 (8), 578-583 (2010).
  13. Ceppi, F., et al. DNA variants in dhfr gene and response to treatment in children with childhood b all: Revisited in aieop-bfm protocol. Pharmacogenomics. 19 (2), 105-112 (2018).
  14. Sharp, L., Little, J. Polymorphisms in genes involved in folate metabolism and colorectal neoplasia: A huge review. Am J Epidemiol. 159 (5), 423-443 (2004).
  15. Yousef, A. M., et al. The association of polymorphisms in folate-metabolizing genes with response to adjuvant chemotherapy of colorectal cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 82 (2), 237-243 (2018).
  16. Schneider, E., Ryan, T. J. Gamma-glutamyl hydrolase and drug resistance. Clin Chim Acta. 374 (1-2), 25-32 (2006).
  17. Moran, R. G. Roles of folylpoly-gamma-glutamate synthetase in therapeutics with tetrahydrofolate antimetabolites: An overview. Semin Oncol. 26 (2), 24-32 (1999).
  18. Maezawa, Y., et al. High gamma-glutamyl hydrolase and low folylpolyglutamate synthetase expression as prognostic biomarkers in patients with locally advanced gastric cancer who were administrated postoperative adjuvant chemotherapy with s-1. J Cancer Res Clin Oncol. 146 (1), 75-86 (2020).
  19. Cheng, Q., et al. A substrate specific functional polymorphism of human gamma-glutamyl hydrolase alters catalytic activity and methotrexate polyglutamate accumulation in acute lymphoblastic leukaemia cells. Pharmacogenetics. 14 (8), 557-567 (2004).
  20. Zhang, Q., et al. Recognition of cyclic dinucleotides and folates by human slc19a1. Nature. 612 (7938), 170-176 (2022).
  21. Ulrich, C. M., et al. Polymorphisms in folate-metabolizing enzymes and response to 5-fluorouracil among patients with stage ii or iii rectal cancer (int-0144; swog 9304). Cancer. 120 (21), 3329-3337 (2014).
  22. Zhang, X., et al. Discovery of novel biomarkers of therapeutic responses in han chinese pemetrexed-based treated advanced nsclc patients. Front Pharmacol. 10, 944(2019).
  23. Corrigan, A., et al. Pharmacogenetics of pemetrexed combination therapy in lung cancer: Pathway analysis reveals novel toxicity associations. Pharmacogenomics J. 14 (5), 411-417 (2014).
  24. Ion 520 & ion 530 ext kit - chef user guide. Thermofisherscientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0015805_Ion520_530ExTKit_UG.pdf (2023).
  25. Ion genestudio s5 instrument user guide. Thermofisherscientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0017528_Ion_GeneStudio_S5_Instrument_UG.pdf (2023).
  26. Parkin, N. T., et al. Multi-laboratory comparison of next-generation to sanger-based sequencing for hiv-1 drug resistance genotyping. Viruses. 12 (7), 694(2020).
  27. Ziller, M. J., Hansen, K. D., Meissner, A., Aryee, M. J. Coverage recommendations for methylation analysis by whole-genome bisulfite sequencing. Nat Methods. 12 (3), 230-232 (2015).
  28. Lordick, F., et al. Unmet needs and challenges in gastric cancer: The way forward. Cancer Treat Rev. 40 (6), 692-700 (2014).
  29. Kumar, K. R., Cowley, M. J., Davis, R. L. Next-generation sequencing and emerging technologies. Semin Thromb Hemost. 45 (7), 661-673 (2019).
  30. Chinese Centres for Disease Control and Prevention. Ministry of Health of the People's Republic of China. WS 233-2002. Chinese Centres for Disease Control and Prevention. , 1-64 (2002).
  31. China Environmental Protection Industry. Medical waste management regulations. China Environmental Protection Industry. (1), 6-10 (2004).

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Multi-Gene Single Nucleotide Polymorphism Detection in Gastric Cancer Based on Ion Semiconductor Sequencing Platform
Posted by JoVE Editors on 6/05/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66058

Tagi

Farmakogenetykawrażliwość na 5-fluorouracyldetekcja wielogenowaoczyszczanie DNAkulki magnetyczneamplifikacja PCRindywidualna chemioterapia
Wykrywanie wielogenowego polimorfizmu pojedynczego nukleotydu w raku żołądka w oparciu o platformę sekwencjonowania półprzewodników jonowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.