Artykuł metodologiczny

Wykrywanie wielogenowego polimorfizmu pojedynczego nukleotydu w raku żołądka w oparciu o platformę sekwencjonowania półprzewodników jonowych

DOI:

10.3791/66058

⸱

10 maja 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Nanfang Hospital, Southern Medical University, 2Research and Development Department, Guangzhou Darui Biotechnology Co., Ltd, 3Key Laboratory of Antibody Engineering of Guangdong Higher Education Institutes, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 4Provincial Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, Southern Medical University

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół proponuje całościowe procedury laboratoryjne wymagane do wykrywania polimorfizmów pojedynczego nukleotydu w próbkach raka żołądka w oparciu o platformę sekwencjonowania półprzewodników jonowych. Szczegółowo opisano również sekwencje docelowe, adaptery ligaturujące, wzmacnianie i oczyszczanie biblioteki oraz kryteria kontroli jakości.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak żołądka jest powszechnym nowotworem niejednorodnym. Większość pacjentów ma zaawansowanego raka żołądka w momencie diagnozy i często wymaga chemioterapii. Chociaż 5-fluorouracyl (5-FU) jest szeroko stosowany w leczeniu, jego czułość terapeutyczna i tolerancja na lek nadal muszą zostać określone, co podkreśla znaczenie zindywidualizowanego podawania. Farmakogenetyka może pomóc w klinicznym wdrożeniu zindywidualizowanego leczenia. Polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP), jako marker genetyczny, przyczyniają się do doboru odpowiednich schematów i dawek chemioterapii. Niektóre SNP są związane z metabolizmem kwasu foliowego, celem terapeutycznym 5-FU. Reduktaza metylenotetrahydrofolianu (MTHFR) rs1801131 i rs1801133, reduktaza dihydrofolianowa (DHFR) rs1650697 i rs442767, syntaza metioniny (MTR) rs1805087, hydrolaza gamma-glutamylowa (GGH) rs11545078 i nośnik substancji rozpuszczonej 19 członek 1 (SLC19A1) rs1051298 były badane w różnych rodzajach nowotworów i przeciwnowotworowych lekach przeciwfolianowych, które mają potencjalne znaczenie prognostyczne i przewodnie dla zastosowanie 5-FU. Technologia sekwencjonowania półprzewodników nowej generacji może szybko wykrywać SNP związane z rakiem żołądka. Za każdym razem, gdy zasada jest wydłużana w łańcuchu DNA, uwalniany jest H+, powodując lokalne zmiany pH. Czujnik jonowy wykrywa zmiany pH i przekształca sygnały chemiczne w sygnały cyfrowe, uzyskując sekwencjonowanie przez syntezę. Technika ta charakteryzuje się niskim zapotrzebowaniem na próbkę, prostą obsługą, niskimi kosztami i dużą szybkością sekwencjonowania, co jest korzystne dla prowadzenia zindywidualizowanej chemioterapii przez SNP.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak żołądka jest dużym obciążeniem w dziedzinie globalnego zdrowia publicznego. Według Global Cancer Statistics 2020, opublikowanego przez Międzynarodową Agencję Badań nad Rakiem (IARC), rak żołądka jest piątym najczęściej diagnozowanym nowotworem i czwartą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem. Na całym świecie częstość występowania wskaźnika standaryzowanego według wieku w Azji Wschodniej jest najwyższa zarówno u mężczyzn, jak i kobiet1. Występowanie raka żołądka jest podstępne, co oznacza, że pacjenci często we wczesnym stadium nie mają żadnych oczywistych i specyficznych objawów. Spośród wszystkich pacjentów z rakiem żołądka, w krajach, w których nie przeprowadza się rutynowych badań przesiewowych, 80%-90% pacjentów jest albo diagnozowanych w zaawansowanym stadium, gdy guz nie może być operowany, albo dochodzi do nawrotów w ciągu 5 lat po operacji2.

W przypadku zaawansowanego lub przerzutowego raka żołądka, głównym sposobem leczenia jest chemioterapia, która może poprawić przeżywalność i jakość życia pacjentów. W początkowej terapii pacjentów z przerzutowym rakiem żołądka głównym wyborem dla schematu chemioterapii pierwszego rzutu jest schemat platynowo-fluoropirymidynowy3. Fluoropirymidyna obejmuje głównie 5-fluorouracyl (5-FU) i doustne pochodne fluoropirymidyny, takie jak kapecytabina i tegafur. Głównym celem 5-FU są enzymy związane z metabolizmem kwasu foliowego, które hamują syntezę DNA i spowalniają wzrost tkanki nowotworowej. Działania niepożądane leków ograniczają ich użyteczność, a do najczęstszych działań niepożądanych należą biegunka, zapalenie błony śluzowej, supresja szpiku kostnego i zespół ręka-stopa. Doniesiono, że odpowiedź terapeutyczna i działania niepożądane leku są ściśle związane z czynnikami w szlaku metabolicznym kwasu foliowego. Warto zauważyć, że homozygotyczna mutacja rs1801131 została zidentyfikowana jako wskaźnik zespołu ręka-stopa (p = 4,1 x 10-6, OR = 9,99, 95% CI: 3,84-27,8)4. Chociaż fluoropirymidyny są szeroko stosowane w chemioterapii przeciwnowotworowej, ich chemooporność jest częstym stanem awaryjnym, powodującym niepowodzenie terapeutyczne w leczeniu raka żołądka. Na przykład ogólny wskaźnik odpowiedzi wynosi tylko 10%-15% wśród pacjentów z zaawansowanym rakiem jelita grubego leczonych tylko 5-FU5. Ponadto fluoropirymidyny mają toksyczność, której nie można zignorować. Reakcje toksyczności wywołane przez 5-FU obejmują głównie biegunkę, zespół ręka-stopa, zapalenie jamy ustnej, neutropenię, małopłytkowość, neurotoksyczność, a nawet śmierć6. Ciężka toksyczność związana z leczeniem występuje u 10%-30% pacjentów leczonych fluoropirymidynami, a śmiertelna toksyczność występuje u 0,5%-1% tych pacjentów7.

Badanie jakości życia pacjentów z zaawansowanym rakiem żołądka wykazało, że wskaźnik odpowiedzi był mniejszy niż 50% u tych, którzy otrzymali chemioterapię opartą na 5-FU8. Dlatego zrozumienie czynników związanych z czułością chemioterapii opartej na 5-FU jest szczególnie ważne dla precyzyjnego leczenia, aby zmaksymalizować wskaźnik odpowiedzi i skuteczność przy jednoczesnej minimalizacji toksyczności. Biorąc pod uwagę, że 5-FU jest ściśle związany z metabolizmem kwasu foliowego, warianty genetyczne enzymów w szlaku metabolicznym kwasu foliowego mogą być jednym z czynników. Około 90% zmienności sekwencji ludzkiej przypisuje się mutacjom pojedynczej zasady w DNA, znanym jako polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP)9. Kiedy SNP zmieniają właściwości enzymatyczne metabolizmu kwasu foliowego, może to prowadzić do indywidualnych różnic w skuteczności, toksyczności i chemooporności na fluorouracyl u pacjentów z rakiem żołądka.

Reduktaza metylenotetrahydrofolianu (MTHFR) jest głównie używana do przekształcania 5,10-metylenotetrahydrofolianu (5,10-MTHF) w 5-metylotetrahydrofolian. 5-FdUMP, metabolit 5-FU, tworzy nieaktywny trójskładnikowy z 5,10-MTHF i syntazą tymidylanową (TS), hamując aktywność TS i prowadząc do niedoboru dTMP10. Akumulacja 5,10-MTHF może nasilać efekt hamowania 5-FU na TS, co jest skorelowane z aktywnością MTHFR. MTHFR rs1801131 i rs1801133 są najczęstszymi polimorfizmami, które są związane z niższą aktywnością enzymu (spadek o 75% dla rs1801133 i 30% dla rs181131) i akumulacją 5,10-MTHF11.

Reduktaza dihydrofolianu (DHFR) jest kluczowym enzymem w metabolizmie folianów i syntezie DNA. DHFR redukuje dihydrofolian za pomocą NADPH do tetrahydrofolianu (THF), który jest używany do przenoszenia jednostki jednowęglowej. SNP DHFR mogą wpływać na jego ekspresję, zmieniać aktywność i obfitość THF, a także dodatkowo wpływać na metabolizm folianów i wrażliwość 5-FU. Mutacja punktowa DHFR rs1650697 występuje w głównym promotorze genu DHFR, co zwiększa ekspresję DHFR 12. Badanie wykazało, że rs442767 jest związany ze skutecznością i toksycznością przeciwzapalnych leków przeciwnowotworowych, takich jak pemetreksed i metotreksat. Jeśli chodzi o SNP rs442767, genotyp GT oznacza dziedziczenie allelu G i allelu T w tym samym locus na chromosomach homologicznych od każdego z rodziców. Podobnie genotypy GG i TT oznaczają dziedziczenie odpowiednio dwóch alleli G lub dwóch alleli T. W porównaniu z genotypem GT+TT, GG wiąże się ze zmniejszonym czasem przeżycia wolnego od zdarzeń i zwiększonym ryzykiem13. Sugeruje to, że rs442767 może prowadzić do pewnego potencjalnego wpływu na 5-FU.

Syntaza metioniny (MTR) katalizuje remetylację homocysteiny do metioniny, która odgrywa ważną rolę w metabolizmie folianów. MTR rs1805087 jest najczęstszym polimorfizmem genu MTR. MTR rs1805087 zastępuje kwas asparaginowy glicyną w potencjalnie funkcjonalnym miejscu białka, co może zmniejszać aktywność MTR. Osoby z allelem G miały podwyższony poziom folianów w osoczu i obniżony poziom homocysteiny w osoczu14. Wręcz przeciwnie, badanie wykazało, że rs1805087 nie ma statystycznie istotnego związku ze skutecznością 5-FU. Ale to badanie koncentrowało się na raku jelita grubego, a wielkość próby była niewielka. Związek między rs1805087 a skutecznością 5-FU u pacjentów z rakiem żołądka pozostaje do zbadania15.

Hydrolaza gamma-glutamylowa (GGH) to enzym lizosomalny, który reguluje wewnątrzkomórkowe stężenie folianów. Kwas pteroiloglutaminowy jest synonimem kwasu foliowego, który składa się z pteryny, kwasu p-aminometylobenzoesowego i kwasu glutaminowego. W organizmach występują dwie formy kwasu foliowego, folian monoglutaminianu i folian poliglutaminianu. Poliglutaminian THF jest enzymatycznie przekształcany w monoglutaminowy folian przez GGH, kolejno uwalniając monoglutaminian (mono-Glu) lub di-glutaminian (di-Glu)16. Badanie dotyczące ekspresji GGH u pacjentów z miejscowo zaawansowanym rakiem żołądka wykazało, że wysoka ekspresja GGH może zmniejszyć 5,10-MTHF i TS, co oznacza, że do osiągnięcia efektu hamującego TS u tych pacjentów potrzebna jest tylko niewielka dawka 5-FU17. GG jest biomarkerem prognostycznym u pacjentów z miejscowo zaawansowanym rakiem żołądka leczonych pooperacyjną chemioterapią uzupełniającą z S-1, prolekiem 5-FU, i odgrywa ważną rolę w utrzymaniu homeostazy wewnątrzkomórkowej kwasu foliowego18. GGH rs11545078 jest wariantem missense i zmienia Thr-127 na Ile-127. Badanie skupiające się na specyficzności substratowej GGH sugeruje, że rs11545078, w porównaniu z typem dzikim, skutkuje wyższym Km i niższą wydajnością katalityczną dla metotreksatu, a struktura jest podobna do kwasu foliowego19. Wspólne zbadanie związku między rs11545078 a wynikami klinicznymi 5-FU jest obiecującą strategią zrozumienia oporności na leki.

Nośnik substancji rozpuszczonej 19 członek 1 (SLC19A1), zwany również transporterem zredukowanego kwasu foliowego, jest typowym ułatwiającym białkiem transbłonowym, które importuje zredukowane foliany, których komórki ssaków nie są w stanie syntetyzować de novo, co jest rozpoznawane w celu oszacowania odpowiedzi guza na 5-FU20. Jednak przeprowadzono tylko kilka badań dotyczących związku między polimorfizmem 5-FU a polimorfizmem SLC19A121. U pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca otrzymujących pemetreksed, który jest analogiem kwasu foliowego, rs1051298 w genie SLC19A1 przyczynił się do zwiększenia ryzyka wystąpienia wszystkich działań niepożądanych i zmniejszenia całkowitego przeżycia22,23. SLC19A1 rs1051298, wariant regionu 3' bez translacji dotyczący metabolizmu kwasu foliowego, może pomóc wyjaśnić niektóre indywidualne różnice dotyczące terapii 5-FU. Celem jest ocena związku między rs1051298 a opornością na 5-FU u pacjentów z rakiem żołądka.

Zestaw oparty na sekwencjonowaniu półprzewodników, służy do jakościowego wykrywania genów in vitro (Rysunek 1), który może wykryć 7 wybranych SNP w 5 genach, mutacje rs1801131 i rs1801133 genu MTHFR, mutacje rs1650697 i rs442767 genu DHFR, mutacje rs1805087 genu MTR, rs11545078 mutacje genu GGH i rs1051298 genu SLC19A1 gen w próbkach tkanki nowotworowej pacjentów z rakiem żołądka. Po pierwsze, próbkę kwasu nukleinowego wyekstrahowano, a fragment docelowy został specjalnie amplifikowany przez PCR. Uniwersalny adapter do sekwencjonowania został dodany na obu końcach fragmentu DNA, aby skonstruować bibliotekę, która może być używana do sekwencjonowania. Następnie przeprowadzono amplifikację biblioteki sekwencjonowania metodą PCR w celu utworzenia matrycy sekwencjonowania. Matryca dodatnia została wzbogacona, aby spełnić wymagania sekwencjonowania. Korzystanie z systemu sekwencjonowania półprzewodników, poprzez zamocowanie nici DNA w maleńkim otworze chipa półprzewodnikowego. Polimeraza DNA przyjmuje jednoniciowy DNA jako matrycę i syntetyzuje komplementarną nić DNA zgodnie z zasadą komplementarnego parowania zasad. Za każdym razem, gdy zasada jest wydłużana w łańcuchu DNA, uwalniany jest proton, powodując lokalne zmiany pH. Czujnik jonowy wykrywa zmiany pH i przekształca sygnały chemiczne na sygnały cyfrowe, dzięki czemu zasady mogą być interpretowane w czasie rzeczywistym, a na koniec można uzyskać sekwencję zasad każdego segmentu DNA. Wykorzystano analizę bioinformatyczną w celu dopasowania tych sekwencji do mapy referencyjnej ludzkiego genomu. Kiedy geny związane z rakiem żołądka mutują, odpowiadające im sekwencje zasad DNA ulegną zmianie, aby uzyskać informacje o mutacjach powiązanych genów.

Wynik może wyświetlać status mutacji genów i stanowić punkt odniesienia dla klinicystów do wyboru odpowiednich typów i dawek leków chemioterapeutycznych oraz przewidywania oporności na leki u pacjentów z rakiem żołądka. Wyniki badań służą jednak wyłącznie jako odniesienie kliniczne i nie są zalecane jako jedyna podstawa do zindywidualizowanego leczenia pacjentów. Klinicyści powinni dokonać kompleksowej oceny w oparciu o stan pacjenta, wskazania do stosowania leków, reakcje na leczenie i inne wskaźniki badań laboratoryjnych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie protokoły i próbki tkanek raka żołądka (krok 1), uzyskane z endoskopii lub operacji górnego odcinka przewodu pokarmowego, użyte w tym badaniu, zostały przejrzane i zatwierdzone przez komisję etyki medycznej 24 lipca 2023 r. (NFEC-2023-298). Poza tym protokół ten ma na celu wyłącznie zilustrowanie wykrywania wielu genów w raku żołądka bez angażowania się w porównania kohortowe, dlatego nie narzuca żadnych konkretnych kryteriów włączania lub wykluczania pacjentów. Pacjenci/uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę na udział w tym badaniu.

1. Przygotowanie osadzonych bloków raka żołądka

  1. Skonfiguruj system zatapiania tkanek, składający się ze zbiornika parafiny i dozownika, wraz z ciepłymi i zimnymi płytkami, zgodnie z zalecanymi wytycznymi operacyjnymi.
  2. Wyjmij przygotowaną tkankę do zatopienia z suszarki i umieść ją w gnieździe do przechowywania centrum zatapiania.
  3. Wybierz pasujące formy do zatapiania w zależności od rozmiaru tkanki, wlej tyle stopionej parafiny, aby pokryć tkankę, a następnie umieść formę na ciepłej płycie.
  4. Wyjmij tkankę z kaset i umieść błonę śluzową żołądka prostopadle do podstawy formy osadzającej, aby płaszczyzna przekroju poprzecznego przecięła wszystkie warstwy tkanki. Wyrównaj tkankę w formie.
  5. Ustaw kasetę na wierzchu formy, a następnie wtórnie wlej parafinę, wypełniając formę.
  6. Umieść osadzoną formę na zimnej płycie, a po zestaleniu się parafiny oderwij osadzone bloki z form.

2. Ekstrakcja kwasu nukleinowego z próbek

  1. Użyj zestawów do ekstrakcji i oczyszczania kwasów nukleinowych do ekstrakcji kwasów nukleinowych z próbek tkanek zanurzonych w parafinie.
  2. Użyj kwantyfikatora kwasu nukleinowego, aby określić ilościowo wyekstrahowany kwas nukleinowy. Zaleca się, aby stężenie kwasu nukleinowego było większe niż 2 ng/μL.
    UWAGA: Użyte tutaj materiały są dostępne w Tabeli Materiałów.

3. Przygotowanie do biblioteki sekwencjonowania

  1. Przygotowanie przed eksperymentem
    1. Włącz lampę UV w ultra czystym stole warsztatowym, sterylizuj przez 30 minut. Następnie wyłącz lampę UV i włącz wentylator, aby wentylować przez 10 minut.
    2. Wyjąć kwas nukleinowy z lodówki w temperaturze -20 ± 5 °C, sprawdzić i zapisać identyfikator próbki, kod kreskowy kwasu nukleinowego i konkretny numer etykiety przypisany do próbki. Po weryfikacji umieścić go na stojaku na probówki wirówkowe w celu rozpuszczenia w temperaturze pokojowej (RT) i odwirować przez 10 sekund, ze stałym czasem 2,500 x g w trybie czuwania.
  2. Amplifikacja PCR fragmentu docelowego
    1. Weź roztwór reakcyjny do wychwytywania fragmentów, starter amplifikacyjny raka żołądka i starter do amplifikacji fuzyjnej z niestandardowego zestawu do wykrywania wielogenowych stawów raka żołądka i umieść je na lodzie w celu stopienia. Po stopieniu wstrząsnąć i wymieszać, odwirować przez 10 s i przygotować wodę bez nukleaz. Szczegółowe informacje na temat podkładu znajdują się w tabeli 1.
      UWAGA: Zestaw nie jest jeszcze dostępny na rynku, skontaktuj się z autorami w celu uzyskania dalszych informacji.
    2. Przygotować probówkę reakcyjną PCR o pojemności 0,2 ml, dodawać odczynniki do probówki kolejno zgodnie z tabelą uzupełniającą 1, wirować i mieszać przez 5 s, a następnie natychmiast odwirowywać przez 10 s, przy stałej masie 2,500 x g, tak aby na ściance probówki i pokrywie nie było widocznych kropli. Próbki RNA są poddawane odwrotnej transkrypcji na cDNA, a następnie wykorzystywane do późniejszej budowy biblioteki. Produkty cDNA dodaje się kolejno do probówek zgodnie z tabelą uzupełniającą 2.
    3. Umieść każdą probówkę reakcyjną na termocyklerze. W przypadku próbek DNA uruchom program amplifikacji zgodnie z opisem w Tabeli 2. W przypadku produktów cDNA uruchom program amplifikacji zgodnie z opisem w Tabeli 3.
  3. Trawienie sekwencji starterów
    1. Wyjmij enzym trawienia startera i połóż go na lodzie do stopienia. Po amplifikacji wyjmij powyższe probówki reakcyjne, dodaj 2 μl enzymu wytrawiającego starter do każdej probówki i upewnij się, że całkowita objętość wynosi 22 μl.
    2. Zmieszać roztwór reakcyjny w probówce do PCR i natychmiast odwirować przez 10 s, ze stałą wartością 2,500 x g.
    3. Umieść każdą probówkę reakcyjną na termocyklerze i uruchom program zgodnie z opisem w Tabeli 4.
  4. Podwiązanie adaptera
    1. Umieść adapter łączący odczynniki na lodzie, aby się rozpuścił. Przygotować probówkę do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, a następnie wymieszać każdy składnik zgodnie z tabelą 5 i oznaczyć go jako mieszaninę adaptera X.
      UWAGA: Odczynniki do łączenia adapterów obejmują adaptery P1 i określone adaptery X, ponumerowane od 1 do 48. Są one przeznaczone do unikalnego oznaczania różnych próbek. Podczas dodawania określonego adaptera należy otwierać tylko jedną rurkę na raz, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu określonego adaptera. Rozcieńczona mieszanina adaptera może być przechowywana w temperaturze od -20 ± 5 °C do czasu czuwania. W przepływach pracy sekwencjonowania próbki nie są przetwarzane pojedynczo, a raczej wiele próbek, z których każda jest oznaczona określonym adapterem, jest łączonych w ujednoliconą bibliotekę w celu sekwencjonowania. Metoda ta umożliwia późniejsze różnicowanie próbek na podstawie ich określonych sekwencji adapterów.
    2. Wyjąć strawiony produkt podkładowy (22 μl) z termocyklera. Dodawać odczynniki do probówki kolejno zgodnie z tabelą 6, wirować i mieszać przez 5 sekund. Wirować na niskich obrotach przez 10 s, ze stałą wartością 2 500 x g, tak aby nie było widocznego upuszczania na ściankę i pokrywę probówki.
    3. Umieść rurkę reakcyjną na termocyklerze. W przypadku próbek DNA uruchomić program amplifikacji zgodnie z opisem w Tabeli 7. W przypadku produktów cDNA uruchom program amplifikacji zgodnie z opisem w Tabeli 8.
  5. Oczyszczanie produktu ligacji i amplifikacja
    1. Kulki magnetyczne do oczyszczania DNA należy wcześniej wyjąć z lodówki o temperaturze 2-8 °C, równomiernie je rozmieszać i natychmiast odwirować przez 10 sekund, przy stałej masie 2 500 x g. Równoważ kulki magnetyczne w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    2. Przygotować probówkę do mikrowirówki o niskiej adsorpcji o pojemności 1,5 ml i przenieść produkt reakcji ligacji do odpowiedniej probówki.
    3. Dodać 45 μl kulek magnetycznych oczyszczonych DNA do każdej probówki, odwirować i dobrze wymieszać, natychmiast odwirować przez 10 s i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    4. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 3 minuty. Wyrzuć supernatant i unikaj pipetowania kulek.
    5. Przenieś 300 μl nowo przygotowanego 75% etanolu do probówki mikrowirówki i delikatnie obróć probówki 4x pod kątem 180°. Gdy roztwór będzie klarowny, szybko wyrzucić supernatant. Unikaj pipetowania kulek. Powtórz procedurę prania jeszcze 1x.
    6. Wyjmij probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml ze stojaka magnetycznego i krótko odwiruj (10 s, ze stałą wartością 2,500 x g). Umieść probówki z powrotem w stojaku magnetycznym i odpipetuj pozostały płyn. Upewnij się, że na ściance rurki nie ma resztek płynu.
    7. Otwórz nakrętkę każdej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i susz kulki w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Zwróć uwagę na stan sucho-mokry kulek. Po wyschnięciu kulek magnetycznych sprawdź, czy na powierzchni nie ma plam z wody. Wydłuż odpowiednio czas schnięcia, jeśli kulki magnetyczne są zbyt mokre. Natychmiast zamknij pokrywę, jeśli na koralikach pojawią się jakiekolwiek pęknięcia i kontynuuj następny krok, aby wzmocnić i oczyścić bibliotekę.
  6. Wzmocnienie i oczyszczenie biblioteki
    1. Umieść odczynniki związane z PCR na lodzie w celu rozpuszczenia, zwiruj je i odwiruj przez 10 sekund. Wyjmij probówkę mikrowirówki o pojemności 1,5 ml ze stojaka magnetycznego, odpipetuj regenty PCR do probówki zgodnie z tabelą 9 i zamknij nakrętkę i wiruj przez 5 sekund. Odwiruj krótko (10 s), aby nie uzyskać widocznej kropli cieczy na ściance probówki i pokrywie.
    2. Przenieś powyższy produkt do nowej probówki do PCR. Inkubować próbkę na termocyklerze. W przypadku próbek DNA uruchomić program amplifikacji zgodnie z opisem w Tabeli 10. W przypadku produktów cDNA uruchom program amplifikacji zgodnie z opisem w Tabeli 11.
    3. Przygotuj nową probówkę do mikrowirówek o niskiej adsorpcji o pojemności 1,5 ml. Odwirować probówkę PCR przez 10 s po inkubacji. Przenieść produkt z probówki PCR do probówki EP.
    4. Do każdej probówki dodać 25 μl kulek magnetycznych oczyszczonych z DNA. Dobrze zwirować i wymieszać, odwirować z niską prędkością i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    5. Umieść probówki na stojaku magnetycznym na 3 minuty i poczekaj, aż roztwór stanie się klarowny. Przenieść supernatant do nowych probówek do mikrowirówek. Unikaj pipetowania kulek.
    6. Do każdej probówki dodać 60 μl kulek magnetycznych oczyszczonych z DNA. Dobrze zwirować i wymieszać, odwirować z niską prędkością i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    7. Umieść probówki na stojaku magnetycznym na 3 minuty i poczekaj, aż roztwór stanie się klarowny. Odrzucić supernatant. Unikaj pipetowania kulek.
    8. Przenieś 300 μl nowo przygotowanego 75% etanolu do probówek i delikatnie obróć probówki 4x o 180°. Gdy roztwór będzie klarowny, szybko odpipetować i wyrzucić supernatant. Unikaj pipetowania kulek. Powtórz procedurę prania 1x.
    9. Wyjmij probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml ze stojaka magnetycznego i krótko odwiruj (10 s). Włóż probówki z powrotem do stojaka magnetycznego i odpipetuj pozostały płyn. Upewnij się, że na ściance rurki nie ma resztek płynu.
    10. Otwórz nakrętki probówek o pojemności 1,5 ml i susz kulki w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Zwróć uwagę na stan sucho-mokry kulek. Po wysuszeniu kulek magnetycznych na powierzchni nie ma plamy z wody. Wydłuż odpowiednio czas schnięcia, jeśli kulki magnetyczne są zbyt mokre. Natychmiast zamknij pokrywę, jeśli na koralikach pojawią się jakiekolwiek pęknięcia.
    11. Odpipetować 50 μl eluentu do probówek, odwirować i dobrze wymieszać. Odwirować krótko (5 s, z ustalonym 2 500 x g) i umieścić probówki w temperaturze pokojowej na 5 minut.
    12. Umieść probówki na stojaku magnetycznym na 3 minuty i poczekaj, aż roztwór stanie się klarowny. Ostrożnie wyjmij płyn do nowej probówki i zaznacz nazwę biblioteki.
    13. Przechowywać bibliotekę w lodówce w temperaturze 2-8 °C tymczasowo i poczekać na oznaczenie ilościowe lub przechowywać bibliotekę w lodówce w temperaturze -20 ± 5 °C do długotrwałego przechowywania.

4. Kwantyfikacja zbudowanej biblioteki

  1. Użyj kwantyfikatora kwasu nukleinowego, aby określić ilościowo bibliotekę. Jeśli stężenie biblioteczne wynosi ≥ 0,2 ng/μL, jest kwalifikowane. W przeciwnym razie odbuduj bibliotekę.
  2. Wymieszaj równą objętość DNA (lub RNA) i określ ilościowo roztwór. Zgodnie z wynikiem ilościowym, rozcieńczyć zmieszany roztwór do 100 pmol/l, stosując następujący wzór:
    figure-protocol-1
    UWAGA: Alternatywą jest rozcieńczenie biblioteki do 100 pmol/L zgodnie ze wzorem, a następnie ilościowe oznaczenie za pomocą fluorescencyjnego ilościowego PCR. Wymieszaj biblioteki DNA (lub RNA) równomiernie zgodnie z ilościowymi wynikami instrumentu PCR.
  3. Wymieszaj 100 pmol/L biblioteki DNA i biblioteki RNA w stosunku 4:1. Użyj zmieszanego roztworu biblioteki DNA i RNA do sekwencjonowania komputerowego.

5. Sekwencjonowanie

  1. Sekwencjonowanie należy przeprowadzić, odwołując się do instrukcji uniwersalnego zestawu do sekwencjonowania reakcji24,25(metoda sekwencjonowania półprzewodników).

6. Kontrola jakości próbek

  1. Pozytywna kontrola jakości DNA raka żołądka: Weź pozytywną kontrolę DNA raka żołądka i wykonaj test zgodnie z instrukcją zestawu. Sterowanie jest dostarczane z zestawem. Wynik pokazuje, że wykryto mutanty genów MTHFR, DHFR, MTR, GGH i SLC19A1.
  2. Negatywna kontrola jakości DNA raka żołądka: Weź negatywną kontrolę DNA raka żołądka i wykonaj test zgodnie z instrukcją zestawu. Sterowanie jest dostarczane z zestawem. Wynik pokazuje, że wykryto dzikie typy genów MTHFR, DHFR, MTR, GGH i SLC19A1.
    UWAGA: Upewnij się, że kryteria są spełnione w obu przypadkach, w przeciwnym razie wymagane jest ponowne wykrycie.

7. Analiza danych

  1. Uruchom odpowiednią wtyczkę (Variant Caller, Coverage Analysis i Ion Reporter Software) w oprogramowaniu Torrent Suite, aby uzyskać wyniki analizy próbek. Oceń wyniki wykrywania próbki zgodnie z wynikami analizy wtyczki.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Określenie wyników testu opiera się na wartości pozytywnej oceny, która jest również rozpoznawana jako przedział odniesienia. Użyj metody sekwencjonowania półprzewodników, aby wykryć pobrane próbki kliniczne. Gdy wartość częstości mutacji genów MTHFR, DHFR, MTR, GGH i SLC19A1 wynosi ≥ 5%, wynikiem wykrycia jest mutacja odpowiedniego genu. Gdy wartość częstości mutacji wynosi < 5 %, wynikiem wykrycia jest dziki typ odpowiedniego genu26.

Następujące kryteria mogą być użyte do określenia, czy wyniki wykrywania są wiarygodne. Po pierwsze, jeśli średni zasięg wyników sekwencjonowania DNA wynosi ≥ 500, a zmapowane odczyty wyników sekwencjonowania RNA wynoszą ≥ 20000, wyniki testu są wiarygodne27. W przeciwnym razie zaleca się ponowne przetestowanie. Po drugie, średni zasięg pozytywnej kontroli jakości DNA raka żołądka wynosi ≥ 500, a wynik testu powinien być zgodny z mutacjami rs1801131 i rs1801133 genu MTHFR, mutacjami rs1650697 i rs442767 genu DHFR, mutacją rs1805087 genu MTR, mutacją rs11545078 genu GGH i mutacją rs1051298 genu SLC19A1 gen jako pozytywny. W przeciwnym razie zaleca się ponowne przetestowanie. Po trzecie, średni zasięg negatywnej kontroli jakości DNA raka żołądka wynosi ≥ 500, a wyniki wykrywania powinny pokazać, że wszystkie miejsca w zakresie wykrywania tego zestawu są typu dzikiego. W przeciwnym razie zaleca się ponowne przetestowanie. Wreszcie, stężenie biblioteczne jest niższe niż 0,2 ng/μl, co może być spowodowane degradacją DNA lub RNA w próbce lub nieścisłym przestrzeganiem procesu eksperymentalnego lub użyciem przeterminowanych odczynników podczas eksperymentu. Powyższe warunki mogą spowodować pogorszenie lub niepowodzenie jakości sekwencjonowania. Zaleca się odbudowanie biblioteki.

Z tym zestawem, wykonuje się szereg kroków, aby zbudować bibliotekę sekwencjonowania z próbek klinicznych. Biblioteka jest następnie sekwencjonowana na platformie sekwencjonowania półprzewodników jonowych, a ANNOVAR służy do opisywania wyników. Po sekwencjonowaniu dokument jest używany do podsumowania typów mutantów dla każdej próbki. Brak typu zmutowanego wskazywał, że próbka nie przeszła tej konkretnej mutacji. Tabela uzupełniająca3 stanowi typowy przykład takiego zjawiska. Tabela 12 zawiera podstawowe informacje o wykrytych tutaj SNP. Analiza każdego SNP za pomocą adnotacji opartej na filtrach w różnych bazach danych, takich jak 1000 Genomes Project (1000g2015asier; https://www.internationalgenome.org/; Tabela 13) oraz Konsorcjum Agregacji Egzomu (ExAC; https://gnomad.broadinstitute.org/; Tabela 14) może ujawnić, że różne SNP są istotnie obecne w różnych populacjach.

figure-results-1
Rysunek 1: Diagram przepływu dla protokołu. Schemat blokowy wykrywania wielogenowego raka żołądka przy użyciu metody sekwencjonowania półprzewodnikowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział:
chromosomlokalizacjaInterwał projektowania podkładuLewy podkładPrawy podkład
chr111854475chr1:11854175-11854775ACAGGATGGG
GAAGTCACAG (GAAGTCACAG)		AAACCGGAAT
GGTCACAAAG powiedział:
11856377chr1:11856077-11856677CTTCAGGTCA
GCCTCAAAGC powiedział:		TCCCTGTGGT
CTCTTCATCC
chr579950780chr5:79950480-79951080CGCCGCACAT
AGTAGGTTCT powiedział:		CTTCCTCCTC
CAGCCCTATC (Biblioteka Główna Angielski)
79951495chr5:79951195-79951795CTTGGGTCAC
CTGCACAGTA powiedział:		ATTTTGAAGC
ZGODNOŚĆ
CHR1237048499chr1:237048199-237048799GTCAAAGGCC
AGTCCCTTCT		CTCCCTTCAC
CAACTGTGCT
CHR863938763chr8:63938463-63939063CAGTGAAGTT
CAGCGGCAT (Kot Południowy)		TATTTTCCTGT
GTGGGGCAC powiedział:
CHR2146934825chr21:46934525-46935125CCAACCTGAG
ATGGCTTTTC		TCCTTGGTGC
TCTTGCTTTT powiedział:

Tabela 1: Startery używane dla siedmiu wybranych SNP w pięciu genach. W tym arkuszu przedstawiono informacje o lokalizacji starterów SNP związanych z opornością na 5-FU w raku żołądka.

temperaturaGodzinaLiczba cykli
99 °CCzas trwania: 2 min1 cykl
99 °C15 sekund22 cykle
60 °CCzas trwania: 4 min
10 °Ctrzymać1 cykl

Tabela 2: Program cyklu termicznego do amplifikacji DNA. Pokazane są warunki reakcji termicznej, takie jak temperatura, czas i cykle.

kroktemperaturaGodzinaLiczba cykli
Aktywuj enzymy99 °CCzas trwania: 2 min1 cykl
Deturat99 °C15 sekund30 cykli
Wyżarzanie i wydłużanie60 °CCzas trwania: 4 min
zachować10 °Ctrzymać1 cykl

Tabela 3: Program cyklu termicznego dla amplifikacji cDNA. Pokazane są warunki reakcji termicznej, takie jak temperatura, czas i cykle.

temperaturaGodzinaLiczba cykli
50 °CCzas trwania: 10 min1 cykl
55 °CCzas trwania: 10 min1 cykl
60 °CCzas trwania: 20 min1 cykl
10 °Ctrzymać1 cykl

Tabela 4: Program cyklu termicznego do trawienia sekwencji starterów. Pokazane są warunki reakcji termicznych, takie jak temperatura, czas i cykle.

składnikgłośność
Adapter P11,5 μL
Specjalny adapter X1,5 μL
Woda wolna od nukleaz3 μL
Całkowita objętość układu reakcyjnego6 μL
X: Wskazuje konkretny numer adaptera

Tabela 5: Kolejność dodawania odczynników do przygotowania mieszanki adaptera. Dodaj odczynniki do probówki w podanej tutaj kolejności.

składnikgłośność
Bufor przyłączeniowy4 μl
Mieszanka adaptera X2 μl
Ligaza DNA2 μl
Całkowita objętość układu reakcyjnego30 μL

Tabela 6: Sekwencja dodawania odczynników do produkcji strawionego startera. Dodaj odczynniki do probówki w podanej tutaj kolejności.

temperaturaGodzinaLiczba cykli
22 °CCzas trwania: 30 min1 cykl
72 °CCzas trwania: 10 min1 cykl
10 °Ctrzymać1 cykl

Tabela 7: Program cyklu termicznego do podłączenia adaptera do DNA. Pokazane są warunki reakcji termicznych, takie jak temperatura, czas i cykle.

temperaturaGodzinaLiczba cykli
22 °CCzas trwania: 30 min1 cykl
68 °CCzas trwania: 5 min1 cykl
72 °CCzas trwania: 5 min1 cykl
10 °Ctrzymać1 cykl

Tabela 8: Program cyklu termicznego do podłączenia adaptera do cDNA. Pokazane są warunki reakcji termicznych, takie jak temperatura, czas i cykle.

składnikgłośność
Roztwór reakcyjny amplifikacji biblioteki50 μL
Biblioteka mieszanina podkładowa2 μl
Całkowita objętość układu reakcyjnego52 μL

Tabela 9: Sekwencja dodawania odczynników do amplifikacji. Dodaj odczynniki do probówki w podanej tutaj kolejności.

temperaturaGodzinaLiczba cykli
98 °CCzas trwania: 2 min1 cykl
98 °C15 sekund5 cykli
60 °C1 min
10 °Ctrzymać1 cykl

Tabela 10: Program cyklu termicznego do amplifikacji biblioteki DNA. Pokazane są warunki reakcji termicznych, takie jak temperatura, czas i cykle.

temperaturaGodzinaLiczba cykli
98 °CCzas trwania: 2 min1 cykl
98 °C15 sekund5 cykli
64 °C1 min
10 °Ctrzymać1 cykl

Tabela 11: Program cyklu termicznego do amplifikacji biblioteki cDNA. Pokazane są warunki reakcji termicznych, takie jak temperatura, czas i cykle.

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział:
Przekaźnik rs1801131Przekaźnik rs1801133Przekaźnik rs1650697rs442767Przekaźnik rs1805087Przekaźnik rs11545078Przekaźnik rs1051298
RefTZZAZZAZZ
AltZZAZTZZAZA
Func.ref
GeneWithVer		EgzoniczneEgzoniczneAparat UTR5NadrzędnegoEgzoniczneEgzonicznePrzekaźnik UTR3
Gene.ref
GeneWithVer		MTHFR (Międzynarodowy transport lotniczy)MTHFR (Międzynarodowy transport lotniczy)Certyfikat DHFRCertyfikat DHFRMtrGGH powiedział:SLC19A1
GeneDetail
.refGeneWithVer		..NG_023304.1:
g.5020T>G		...NM_001205206.1:
c.*64C>T;
NM_001205207.1:
c.*746C>T;
NM_194255.2:c.
*746C>T
ExonicFunc
.refGeneWithVer		niesynonimiczny;
Kanał SNV		niesynonimiczny;
Kanał SNV		..niesynonimiczny;
Kanał SNV		niesynonimiczny;
Kanał SNV		.
AAChange.ref
GeneWithVer		MTHFR:NM_00
1330358.1:egzo
n8:c.A1409C:p.
E470A; MTHFR:
NM_005957.4:
exon8:c.A1286
C:p.E429A		MTHFR:NM_00
1330358.1:egzo
n5:c.C788T:p.
A263V; MTHFR:N
M_005957.4:e
xon5:c.C665T:
p.A222V		..MTR:NM_0012
91939.1:ekson2
5:c.A2603G:p.
D868G; MTR:N
M_001291940.
1:exon25:c.A1
535G:p.D512G;
MTR:NM_0002
54.2:Egson26:c.
A2756G:p.D91
9 GB		GGH:NM_003878
.2:ekson5:c.C452T:
p.T151I		Jin
cytoBand (pasmo cytologiczne)1P36.221P36.225q14.15q14.11Q438q12.321q22.3

Tabela 12: Istotne informacje o SNP. Opisywanie próbek za pomocą ANNOVAR.

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: pkt. TGL TGL pkt. piksela pkt. oczka: pkt. jezdnego TGL jedn. pkt. TGL jedn. jedn. TGL pkt. pkt. TGL jezdnego jedn. pkt. TGL TGL jezdnego TGL jezdnego pkt.
MTHFRDHFRMtrGGH powiedział:SLC19A1
Przekaźnik rs1801131Przekaźnik rs1801133Przekaźnik rs1650697rs442767Przekaźnik rs1805087Przekaźnik rs11545078Przekaźnik rs1051298
1000g2015aug_allNumer katalogowy: 0,2494010,245407Numer katalogowy: 0,76857Numer katalogowy: 0,290136Numer katalogowy: 0,218251Numer katalogowy: 0,085463Numer katalogowy: 0,524361
1000g2015aug_afr0,15130,090,93490,03180,28440,0560,5772
1000g2015aug_amr0,15130,47410,7550,39910,17720,04030,4323
1000g2015aug_eas0,21920,29560,66070,58530,10520,08730,5635
1000g2015aug_eur0,31310,36480,75550,31910,1730,09240,4493
1000g2015aug_sas0,41720,11860,67790,2280,32110,14830,5552

Tabela 13: Adnotacja SNP oparta na filtrach w projekcie 1000 genomów.

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: pkt. cmok. TGL pkt. jedn. pkt. jedn. pkt. jezdnego propozycji pkt. pkt. TGL TGL TGL jedn. pkt. TGL pkt. pkt. TGL TGL TGL pkt. pkt.
MTHFRDHFRMtrGGH powiedział:SLC19A1
Przekaźnik rs1801131Przekaźnik rs1801133Przekaźnik rs1650697rs442767Przekaźnik rs1805087Przekaźnik rs11545078Przekaźnik rs1051298
ExAC_ALL0,2950,3037..0,20910,0936.
ExAC_AFR0,15880,1124..0,26660,0545.
ExAC_AMR0,15550,5141..0,18640,0361.
ExAC_EAS0,21480,3052..0,11320,0824.
ExAC_FIN0,31280,2227..0,18920,0581.
ExAC_NFE0,31910,345..0,19190,0969.
ExAC_OTH0,3040,3062..0,21080,0973.
ExAC_SAS0,41530,1409..0,3160,165.

Tabela 14: Adnotacja SNP oparta na filtrach w Konsorcjum Agregacji Exome.

Tabela uzupełniająca 1: Sekwencja dodawania odczynników do amplifikacji DNA. Dodaj odczynniki do probówki w podanej tutaj kolejności. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Sekwencja dodawania odczynników do amplifikacji cDNA. Dodaj odczynniki do probówki w podanej tutaj kolejności. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 3: Przykład wyników sekwencjonowania próbek klinicznych. W dokumentach zostaną odnotowane jedynie mutacje obecne w próbkach. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperci kliniczni jednogłośnie zgadzają się, że pacjenci, nawet z tym samym typem i stadium raka żołądka, mogą mieć znacznie różne reakcje na identyczne podejście do leczenia. Lata badań ujawniły naukowcom, że indywidualne różnice przypisuje się głównie naturze raka żołądka jako niejednorodnej, polimorficznej i różnorodnie zróżnicowanej populacji komórkowej, co prowadzi do znacznych indywidualnych różnic w odpowiedziach na leczenie28. W związku z tym pobieranie próbek raka żołądka za pomocą endoskopii lub chirurgii górnego odcinka przewodu pokarmowego oraz próbek krwi, w połączeniu z wysokoprzepustowym sekwencjonowaniem do analizy genetycznej, umożliwia spersonalizowane leczenie raka żołądka. Strategia ta ma na celu zwiększenie skuteczności leczenia klinicznego i zmniejszenie ryzyka wystąpienia ciężkich toksycznych działań niepożądanych. Postęp w technologii sekwencjonowania półprzewodników jonowych sprawił, że spersonalizowane leczenie stało się praktyczną rzeczywistością29.

Oto kilka ograniczeń tej metody testowej. Zastosowany tutaj zestaw służy przede wszystkim do diagnostyki in vitro , a więc ogranicza się do wykrywania mutacji rs1801131 i rs1801133 genu MTHFR , rs1650697 i rs442767 genu DHFR , rs1805087 genu MTR , rs11545078 genu GGH oraz rs1051298 genu SLC19A1. Nie można wykryć mutacji w innych sekcjach. Ze względu na znaczną niejednorodność tkanki nowotworowej, różne lokalizacje pobierania próbek mogą wpływać na wyniki wykrywania. W przypadku próbek tkanek zatopionych w parafinie przechowywanych przez dłuższy czas, DNA i RNA mogą ulec degradacji w pewnym stopniu, wpływając na wyniki testu. Nieuzasadnione pobieranie, transport i przetwarzanie próbek, a także niewłaściwa eksploatacja eksperymentu i środowisko eksperymentalne mogą prowadzić do wyników fałszywie ujemnych lub fałszywie dodatnich. Wynik wykrywania nie może być gwarantowany, jeśli stężenie kwasu nukleinowego jest niższe niż 2 ng/μl. Wyniki testów zestawu służą wyłącznie do celów klinicznych. Wybór spersonalizowanego leczenia dla pacjentów należy rozważyć w połączeniu z ich objawami/przedmiotami, wywiadem medycznym, innymi badaniami laboratoryjnymi i reakcjami na leczenie. Negatywne wyniki nie mogą całkowicie wykluczyć istnienia mutacji genu docelowego. Negatywne wyniki mogą być również spowodowane zbyt małą liczbą komórek nowotworowych w próbce, nadmierną degradacją kwasu nukleinowego lub stężeniem genu docelowego w układzie reakcji amplifikacji poniżej granicy wykrywalności.

Niektóre wskaźniki wydajności zastosowanego zestawu są zgodne z opisem. Czułość analityczna: W przypadku próbek DNA minimalna wykrywalna ilość całkowitego kwasu nukleinowego w tym zestawie wynosi 10 ng i można wykryć 5% szybkość mutacji. W przypadku próbek RNA minimalna wykrywalna ilość całkowitego kwasu nukleinowego w tym zestawie wynosi 10 ng. Dodatni i ujemny wskaźnik koincydencji: Dodatni i ujemny wskaźnik koincydencji sięga 100%. Granica wykrywalności (LOD): Można użyć łącznie 14 referencji LOD, ponumerowanych od L1 do L14. L1-L11 to referencje LOD genów MTHFR, DHFR, MTR, GGH i SLC19A1 , a ich wyniki wykrywania powinny być takie, że typy mutacji odpowiednich miejsc genów są dodatnie, a wskaźniki koincydencji wynoszą 100%. Powtarzalność: Można zastosować łącznie pięć powtarzalnych materiałów referencyjnych o numerach R1-R5. R1 jest silnie dodatnim powtarzalnym materiałem referencyjnym (mutacja rs67376798 genu DPYD ). R2, który zawiera tę mutację w mniejszej liczbie, jest słabo dodatnim powtarzalnym materiałem referencyjnym (mutacja rs67376798 genu DPYD ), R3 jest ujemnym powtarzalnym materiałem referencyjnym (6 miejsc genów DPYD, MTHFR i ABCB1 jest wykrywanych jako typ dziki). Każda próbka referencyjna musi zostać przebadana 10 razy, upewniając się, że wyniki tych powtarzających się ocen odpowiadają ich wcześniej określonym klasyfikacjom. Objętość danych: Efektywna objętość danych próbek DNA i RNA powinna być kontrolowana powyżej 0,05 M. Głębokość sekwencjonowania próbek DNA powinna być kontrolowana powyżej 500, a zmapowane odczyty próbek RNA powinny być kontrolowane powyżej 20000. Test zakłóceń: Na ten zestaw nie mają wpływu endogenne substancje zakłócające (trójglicerydy i albumina) oraz egzogenne substancje zakłócające (formalina i odwodniony alkohol).

Podczas eksperymentu należy przestrzegać pewnych środków ostrożności. Zastosowany tutaj zestaw może być używany wyłącznie do badań in vitro. Prosimy o uważne przeczytanie niniejszej instrukcji przed eksperymentem i korzystanie z niej w okresie ważności. Elementy zestawu w różnych partiach nie mogą być używane zamiennie. Zaleca się używanie jednorazowych materiałów eksploatacyjnych do tego zestawu, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Podczas użytkowania tego zestawu zaleca się stosowanie głowicy ssącej z wkładem filtrującym. W celu uniknięcia wszelkich potencjalnych zagrożeń biologicznych w próbce, badaną próbkę należy uznać za substancje zakaźne w celu uniknięcia kontaktu ze skórą i błoną śluzową. Zaleca się obchodzenie się z próbkami w komorze bezpieczeństwa biologicznego, która może zapobiec wydostawaniu się aerozoli. Probówki i przyssawki używane w operacji należy wysterylizować przed wyrzuceniem. Eksploatacja i utylizacja próbek powinny spełniać wymagania odpowiednich przepisów ustawowych i wykonawczych: Ogólnych wytycznych dotyczących bezpieczeństwa biologicznego mikrobiologicznych laboratoriów biomedycznych oraz Przepisów Ministerstwa Zdrowia w sprawie gospodarki odpadami medycznymi30,31. Personel doświadczalny musi przejść profesjonalne szkolenie, działać ściśle według instrukcji i ściśle oddzielić obszary zgodnie z procesem doświadczalnym. Na każdym etapie czynności doświadczalnej stosuje się specjalne przyrządy i wyposażenie, a przedmioty na każdym etapie każdego obszaru nie mogą być używane zamiennie. Personel doświadczalny musi ściśle oddzielić obszary zgodnie z procesem doświadczalnym. Na każdym etapie czynności doświadczalnej stosuje się specjalne przyrządy i sprzęt. W razie potrzeby podejmij środki ochronne, takie jak rękawice, odzież robocza itp. Utylizacja odpadów powinna być zgodna z odpowiednimi przepisami krajowymi.

Chociaż ten artykuł koncentruje się na siedmiu SNP w obrębie pięciu genów związanych z rakiem żołądka, sekwencjonowanie w praktycznych zastosowaniach nie ogranicza się tylko do tych pięciu genów. Niniejsza praca definitywnie ustala istotną korelację między siedmioma SNP a wrażliwością na chemioterapię 5-FU w raku żołądka.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie jest wspierane przez Badanie Mechanizmu i Roli szlaku ERK2/Snai1/AGPS/PUFA-PL w oporności komórek raka żołądka na ferroptozę wywołaną apatynibem (Numer pozycji: 82172814), wspierane przez National Nature Science Foundation of China; Badanie roli i mechanizmu czynnika transkrypcyjnego 1 palca cynkowego w modulowaniu oporności komórek raka żołądka na ferroptozę indukowaną przez apatynib za pośrednictwem wielonienasyconego szlaku fosfolipidowego eteru (numer pozycji: 2022A1515010267), wspierany przez Komitet Prowincji Guangdong ds. Finansowania Badań Podstawowych i Stosowanych; oraz Badania i zastosowanie odczynnika do diagnostyki wrażliwości na chemoterapię 5-FU w raku żołądka (numer pozycji: 201903010072), Projekty Naukowe i Technologiczne w Kantonie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml probówek DNA LoBindEppendorf30108051
50 ml probówekGreiner Bio-One227261
Amplifikacyjny starter raka żołądkaThermo FisherStartery są syntetyzowane przez Thermo Fshier zgodnie z sekwencją w Tabela 1.
DeparafinowanieQiagen19093
Oczyszczanie DNA Koraliki magnetyczneBechkmanA63881
Alkohol etylowyOdczynnik chemiczny Guangzhou
Fabryka Thermo Fisher Scientific		http://www.chemicalreagent.com/
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0Thermo Fisher4480441
Życie wodne wolne od nukleaz TechnologieAM9932
Probówki do PCRAxygenPCR-02D-C
Probówki do PCRAxygenPCR-02D-C
Końcówki do pipet Wysokiej jakości produktyhttps://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
Mini kolumny RNA PureLinkThermo FisherA29839
RecoverAll Kompletny zestaw do izolacji kwasów nukleinowychThermo FisherAM1975
Mini wirówka stołowaSCILOGESS1010E
Thermal CyclerTechnologies4375786
Ultramikro analizator kwasów nukleinowychBEIJING ORIENTAL SCIENCE & ROZWÓJ TECHNOLOGII SP. Z O.O.BD-1000
naukowe Life

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Wagner, A. D., et al. Chemotherapy for advanced gastric cancer. Cochrane Database Syst Rev. 8, (2017).
  3. Shah, M. A., et al. Immunotherapy and targeted therapy for advanced gastroesophageal cancer: Asco guideline. J Clin Oncol. 41 (7), 1470-1491 (2023).
  4. Loganayagam, A., et al. Pharmacogenetic variants in the dpyd, tyms, cda and mthfr genes are clinically significant predictors of fluoropyrimidine toxicity. Br J Cancer. 108 (12), 2505-2515 (2013).
  5. Giacchetti, S., et al. Phase iii multicenter randomized trial of oxaliplatin added to chronomodulated fluorouracil-leucovorin as first-line treatment of metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol. 18 (1), 136-147 (2000).
  6. Hoff, P. M., et al. Comparison of oral capecitabine versus intravenous fluorouracil plus leucovorin as first-line treatment in 605 patients with metastatic colorectal cancer: Results of a randomized phase iii study. J Clin Oncol. 19 (8), 2282-2292 (2001).
  7. Meulendijks, D., et al. Clinical relevance of dpyd variants c.1679t>g, c.1236g>a/hapb3, and c.1601g>a as predictors of severe fluoropyrimidine-associated toxicity: A systematic review and meta-analysis of individual patient data. Lancet Oncol. 16 (16), 1639-1650 (2015).
  8. Sadighi, S., Mohagheghi, M. A., Montazeri, A., Sadighi, Z. Quality of life in patients with advanced gastric cancer: A randomized trial comparing docetaxel, cisplatin, 5-fu (tcf) with epirubicin, cisplatin, 5-fu (ecf). BMC Cancer. 6, 274(2006).
  9. Collins, F. S., Brooks, L. D., Chakravarti, A. A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation. Genome Res. 8 (12), 1229-1231 (1998).
  10. Ladner, R. D. The role of dutpase and uracil-DNA repair in cancer chemotherapy. Curr Protein Pept Sci. 2 (4), 361-370 (2001).
  11. Capitain, O., et al. The influence of fluorouracil outcome parameters on tolerance and efficacy in patients with advanced colorectal cancer. Pharmacogenomics J. 8 (4), 256-267 (2008).
  12. Askari, B. S., Krajinovic, M. Dihydrofolate reductase gene variations in susceptibility to disease and treatment outcomes. Curr Genomics. 11 (8), 578-583 (2010).
  13. Ceppi, F., et al. DNA variants in dhfr gene and response to treatment in children with childhood b all: Revisited in aieop-bfm protocol. Pharmacogenomics. 19 (2), 105-112 (2018).
  14. Sharp, L., Little, J. Polymorphisms in genes involved in folate metabolism and colorectal neoplasia: A huge review. Am J Epidemiol. 159 (5), 423-443 (2004).
  15. Yousef, A. M., et al. The association of polymorphisms in folate-metabolizing genes with response to adjuvant chemotherapy of colorectal cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 82 (2), 237-243 (2018).
  16. Schneider, E., Ryan, T. J. Gamma-glutamyl hydrolase and drug resistance. Clin Chim Acta. 374 (1-2), 25-32 (2006).
  17. Moran, R. G. Roles of folylpoly-gamma-glutamate synthetase in therapeutics with tetrahydrofolate antimetabolites: An overview. Semin Oncol. 26 (2), 24-32 (1999).
  18. Maezawa, Y., et al. High gamma-glutamyl hydrolase and low folylpolyglutamate synthetase expression as prognostic biomarkers in patients with locally advanced gastric cancer who were administrated postoperative adjuvant chemotherapy with s-1. J Cancer Res Clin Oncol. 146 (1), 75-86 (2020).
  19. Cheng, Q., et al. A substrate specific functional polymorphism of human gamma-glutamyl hydrolase alters catalytic activity and methotrexate polyglutamate accumulation in acute lymphoblastic leukaemia cells. Pharmacogenetics. 14 (8), 557-567 (2004).
  20. Zhang, Q., et al. Recognition of cyclic dinucleotides and folates by human slc19a1. Nature. 612 (7938), 170-176 (2022).
  21. Ulrich, C. M., et al. Polymorphisms in folate-metabolizing enzymes and response to 5-fluorouracil among patients with stage ii or iii rectal cancer (int-0144; swog 9304). Cancer. 120 (21), 3329-3337 (2014).
  22. Zhang, X., et al. Discovery of novel biomarkers of therapeutic responses in han chinese pemetrexed-based treated advanced nsclc patients. Front Pharmacol. 10, 944(2019).
  23. Corrigan, A., et al. Pharmacogenetics of pemetrexed combination therapy in lung cancer: Pathway analysis reveals novel toxicity associations. Pharmacogenomics J. 14 (5), 411-417 (2014).
  24. Ion 520 & ion 530 ext kit - chef user guide. Thermofisherscientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0015805_Ion520_530ExTKit_UG.pdf (2023).
  25. Ion genestudio s5 instrument user guide. Thermofisherscientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0017528_Ion_GeneStudio_S5_Instrument_UG.pdf (2023).
  26. Parkin, N. T., et al. Multi-laboratory comparison of next-generation to sanger-based sequencing for hiv-1 drug resistance genotyping. Viruses. 12 (7), 694(2020).
  27. Ziller, M. J., Hansen, K. D., Meissner, A., Aryee, M. J. Coverage recommendations for methylation analysis by whole-genome bisulfite sequencing. Nat Methods. 12 (3), 230-232 (2015).
  28. Lordick, F., et al. Unmet needs and challenges in gastric cancer: The way forward. Cancer Treat Rev. 40 (6), 692-700 (2014).
  29. Kumar, K. R., Cowley, M. J., Davis, R. L. Next-generation sequencing and emerging technologies. Semin Thromb Hemost. 45 (7), 661-673 (2019).
  30. Chinese Centres for Disease Control and Prevention. Ministry of Health of the People's Republic of China. WS 233-2002. Chinese Centres for Disease Control and Prevention. , 1-64 (2002).
  31. China Environmental Protection Industry. Medical waste management regulations. China Environmental Protection Industry. (1), 6-10 (2004).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Multi-Gene Single Nucleotide Polymorphism Detection in Gastric Cancer Based on Ion Semiconductor Sequencing Platform
Posted by JoVE Editors on 6/05/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66058

Tagi

Farmakogenetykawra liwo na 5 fluorouracyldetekcja wielogenowaoczyszczanie DNAkulki magnetyczneamplifikacja PCRindywidualna chemioterapia

Powiązane artykuły