Protokół tutaj demonstruje szybki i ustandaryzowany przepływ pracy szybkiej oceny mikrobiologicznej na miejscu (M-ROSE), obejmujący trzy kroki: tworzenie preparatów, barwienie i interpretację. Protokół ten pomoże lekarzom w podejmowaniu szybkich decyzji klinicznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Szybka ocena mikrobiologiczna na miejscu w kierunku chorób zakaźnych płuc
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Szybkie rozpoczęcie empirycznej terapii przeciwinfekcyjnej jest kluczowe u pacjentów z niewyjaśnioną infekcją płuc. Chociaż w praktyce klinicznej pobieranie obrazowania jest stosunkowo proste, jego brak swoistości często wymaga dodatkowych czasochłonnych badań, takich jak posiew plwociny, posiew płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego lub sekwencjonowanie genetyczne w celu dokładnego zidentyfikowania etiologii leżącej u podstaw choroby. Co więcej, ograniczona skuteczność empirycznego leczenia przeciwinfekcyjnego może przyczyniać się do nadużywania antybiotyków. Ostatnie postępy w interpretacji tła mikrobiologicznego na szkiełkach do szybkiej oceny na miejscu (ROSE) umożliwiły klinicystom szybkie uzyskanie próbek za pomocą bronchoskopii (np. płukanie pęcherzyków płucnych, szczotkowanie błony śluzowej, zacisk tkankowy), ułatwiając barwienie przy łóżku pacjenta i interpretację, która dostarcza niezbędnych informacji o tle mikrobiologicznym. W związku z tym stanowi to podstawę do opracowania ukierunkowanego leczenia przeciwinfekcyjnego i zindywidualizowanych planów terapii lekowej. Dzięki lepszemu zrozumieniu, które patogeny powodują infekcje w czasie rzeczywistym, lekarze mogą uniknąć niepotrzebnych antybiotyków o szerokim spektrum działania, które przyczyniają się do oporności na antybiotyki. Ustanowienie szybkiego i ustandaryzowanego przepływu pracy M-ROSE na oddziałach chorób układu oddechowego lub intensywnej terapii znacznie pomoże lekarzom w formułowaniu dokładnych strategii leczenia pacjentów, co ma istotne implikacje kliniczne.
Wprowadzenie
Technika szybkiej oceny na miejscu (ROSE) jest wysoce efektywną metodą stosowaną w dziedzinie procedur chorób płuc. Umożliwia pobieranie próbek w czasie rzeczywistym i interwencję diagnostyczną, ułatwiając natychmiastową analizę cytologiczną1. To innowacyjne podejście polega na naniesieniu części próbki tkanki na szkiełko podstawowe przy zachowaniu jej integralności. Jedną z kluczowych zalet ROSE jest jej zdolność do ułatwiania szybkiej interpretacji informacji klinicznych za pomocą specjalistycznych technik mikroskopowych. Obejmuje to analizę morfologii komórki, klasyfikację, kwantyfikację, określenie proporcji składników, ocenę ułożenia, analizę korelacji, ocenę tła i identyfikację ciał obcych. Integrując wszystkie te dane z informacjami klinicznymi pacjenta, ROSE odgrywa kluczową rolę w ocenie adekwatności pobierania próbek i kierowaniu procedurami i technikami interwencyjnymi w czasie rzeczywistym2.
Jako spółka zależna technologii ROSE, technologia M-ROSE skupia się przede wszystkim na pozyskiwaniu mikrobiologicznego tła docelowych zmian, a nie na rozróżnianiu komórek łagodnych i złośliwych3,4. Z jednej strony M-ROSE umożliwia mikroskopową identyfikację patogenów, takich jak Aspergillus, Cryptococcus, Pneumocystis i Candida5. Z drugiej strony, ma istotne implikacje przewodnie w ocenie jakości próbek układu oddechowego, odróżnianiu chorób zakaźnych od niezakaźnych, odróżnianiu infekcji od zanieczyszczenia, a także ocenie ciężkości infekcji i rokowania6,7. Na przykład w próbce oddechowej współistnienie bakterii o identycznej morfologii z naciekającymi komórkami zapalnymi wskazuje na infekcję; I odwrotnie, obecność wielu morfologicznie zróżnicowanych bakterii, którym towarzyszą komórki nabłonkowe, sugeruje zanieczyszczenie. Zdolność do kompleksowej analizy informacji klinicznych i przewidywania wyników sprawia, że M-ROSE jest nieocenionym narzędziem w procedurach chorób płuc.
Podsumowując, ROSE służy jako kluczowy nośnik cytologiczny, który znacznie zwiększa skuteczność i precyzję diagnozowania chorób płuc. Jego wieloaspektowe możliwości przyczyniają się do poprawy wyników leczenia pacjentów, zapewniając szybką interwencję i ułatwiając dokładną diagnozę dzięki technikom pobierania próbek w czasie rzeczywistym i interwencji diagnostycznej. Należy jednak pamiętać, że postępy te polegają na uzyskiwaniu kwalifikowanych próbek. W niniejszym artykule przedstawiamy ustandaryzowany protokół M-ROSE obejmujący przygotowanie preparatów, techniki barwienia i wytyczne dotyczące interpretacji. Protokół ten służy jako nieocenione odniesienie dla klinicystów w ustalaniu dokładnych planów oceny i leczenia, ułatwiając jednocześnie podejmowanie decyzji dotyczących późniejszego postępowania z próbkami docelowymi.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Badanie kliniczne zostało zatwierdzone przez Komitet Zatwierdzający Szpitala Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Chongqing (nr 2022-ky-31). Typowy przypadek dotyczył pacjenta, u którego zdiagnozowano zapalenie płuc wywołane przez Pneumocystis i uzyskano od niego świadomą zgodę.
1. Wymagania sprzętowe i materiałowe dla ROSE
- Sprzęt: Zapoznaj się z plikiem Tabela materiałów, aby zapoznać się z urządzeniami używanymi w tym protokole.
UWAGA: Konieczne jest wykorzystanie dedykowanego mikroskopu cytologicznego i systemu obrazowania graficznego (Rysunek 1A). - Przygotowanie materiału (patrz Tabela materiałów).
- Przygotuj sterylne szkiełka do hodowli komórkowych (o silnej adhezji komórek), chłonny papier, bezpudrowe rękawiczki lateksowe, jednorazowe igły strzykawkowe o pojemności 2,5-5 ml i umieść kompletny zestaw roztworów barwiących Diff Quik (DQ) w szklanych słoikach do barwienia z uszczelnionymi pokrywkami dla łatwej obsługi (Rysunek 1).
2. Przepływ pracy M-ROSE
- Przygotowanie preparatów cytologicznych
UWAGA: Istnieje wiele sposobów przygotowania preparatów, a poniżej przedstawiono kilka powszechnie stosowanych metod przygotowania.- Prowadnice rolkowe
UWAGA: Podczas tego procesu należy zapewnić minimalną utratę próbki tkanki.- Usuń cząstki tkanki za pomocą jednorazowej igły strzykawkowej o pojemności 2,5-5 ml (Rysunek 2A).
- Rozprowadzić okrągły obszar o średnicy około 1 cm i umiarkowanej grubości, od wewnętrznej do zewnętrznej jednej trzeciej części barwionego końca (koniec wykazujący silne przyczepienie komórek) na sterylnym szkiełku cytologicznym.
- Zjeżdżalnie szczotkowe
UWAGA: Ta metoda ma zastosowanie do próbek uzyskanych przy użyciu konwencjonalnych szczotek komórkowych, szczoteczek do komórek zapobiegających zanieczyszczeniom lub szczoteczek do ultradrobnych komórek, a także próbek półpłynnych, takich jak plwocina i lepkie płyny ustrojowe.- Wysuń główkę szczoteczki i nałóż ją na dystalną trzecią część sterylnego szkiełka cytologicznego (szkiełko ma silne właściwości adhezyjne komórek), aby uzyskać prostokątny obszar o wymiarach około 2 cm x 1 cm o umiarkowanej grubości.
- Szkiełka natryskowe
- Umieścić igłę do nakłuwania na jednej trzeciej wybarwionego końca sterylnego szkiełka cytologicznego o silnej adhezji komórek.
- Zastosuj ciśnienie powietrza do końcówki igły do przekłuwania i włóż ją od wewnętrznej strony na zewnątrz, tworząc okrągły obszar o średniej grubości o średnicy około 1 cm.
- Prowadnice rolkowe
- Barwienie szkiełka cytologicznego
UWAGA: Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) zaleca szybkie barwienie szkiełka cytologicznego ROSE przy użyciu barwnika Diff's dye5. Barwnik Diff może być ponownie użyty, ale nie powtarzany wiele razy. Jeśli jest osad, należy go przefiltrować po użyciu. Zbyt głębokie barwienie może zostać odpowiednio odbarwione metanolem lub alkoholem, najlepiej już nie farbowanym. Jeśli barwienie jest zbyt głębokie lub zbyt płytkie, należy dostosować czas barwienia lub stężenie cieczy roboczej; wartość pH ma pewien wpływ na barwienie, a szkiełko powinno być czyste i wolne od zanieczyszczeń kwasowych i zasadowych. Zarówno roztwór Diff A, jak i roztwór Diff B są lotne i powinny być szczelnie zamknięte i przechowywane po użyciu.- Zanurz szkiełko w roztworze Diff A na 10-30 s (Rysunek 2B), a następnie przepłucz je w kąpieli barwiącej PBS, aby usunąć nadmiar roztworu Diff A i delikatnie strząśnij pozostały bufor (Rysunek 2C).
- Następnie zanurz szkiełko w roztworze Diff B na 20-40 s (Rysunek 2E).
- Na koniec wyczyść szkiełko w zbiorniku do barwienia wodą (Rysunek 2F), osusz i wytrzyj resztki płynu szkiełka papierem absorpcyjnym ( Rysunek 2D) i zakończ farbowanie.
UWAGA: M-ROSE umożliwia bezpośrednią wizualizację mikroorganizmów chorobotwórczych i ułatwia ocenę jakości próbek z dróg oddechowych, umożliwiając rozróżnienie między infekcją a brakiem infekcji oraz infekcją i zanieczyszczeniem, co ma zasadnicze znaczenie dla oceny ciężkości infekcji i rokowania. Sekcja dyskusji będzie dotyczyła tego aspektu, ponieważ nie obejmuje ona żadnych procedur eksperymentalnych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W typowym przypadku 63-letni mężczyzna zgłosił się do szpitala z kaszlem, gorączką i bólem w klatce piersiowej. U pacjenta wcześniej zdiagnozowano zespół nerczycowy, charakteryzujący się białkomoczem i obrzękami, i przez dłuższy czas otrzymywał on leczenie prednizonem oraz takrolimusem. Wstępne badania laboratoryjne wykazały liczbę białych krwinek na poziomie 10.49 x 109/L, liczbę neutrofili 8.87 x 109/L oraz stężenie białka C-reaktywnego we krwi pełnej i (1-3)-β-D-glukanu wynoszące odpowiednio 155....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Pulmonologia interwencyjna jest cenną gałęzią współczesnych chorób układu oddechowego; W szczególności znajduje szerokie zastosowanie w diagnostyce chorób płuc 8,9. W ostatnich latach diagnostyczna pulmonologia interwencyjna rozwija się ze względu na zwiększoną częstość występowania nowotworów złośliwych płuc, większą liczbę lekoopornych zakażeń patogenami występującymi w dolnych drogach oddechowych oraz wymagające zapytania o diagnozę kłopotliwych i krytycznych ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.
Podziękowania
Doceniamy projekt zachęt i wskazówek dla instytucji naukowo-badawczej w Chongqing (jxyn-2021-15 i jxyn-2021-2-6) za wsparcie finansowe.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Mikroskop cytologiczny | Olympus Corporation | CX43 | |
| Diff Quik (DQ) roztwory barwiące | Besso Biotechnology Co. LTD | G1541 | |
| Jednorazowe igły strzykawkowe 2,5-5 ml | Shandong Zhu Pharmaceutical Group | 20183150304 | |
| Bezpudrowe rękawiczki lateksowe | Henan Yadu Industrial Co., LTD | 20182140728 | |
| Sterylna komórka slajdy kulturowe | Jinan Preret przemysł i handel Co., LTD | 7101 |
Bibliografia
- Zhang, S., et al. Diagnostic value of endoscopic ultrasound-guided fine needle aspiration with rapid on-site evaluation performed by endoscopists in solid pancreatic lesions: A prospective, randomized controlled trial. J Gastroenterol Hepatol. 37 (10), 1975-1982 (2022).
- Bruno, P., et al. Efficacy and cost effectiveness of rapid on site examination (ROSE) in management of patients with mediastinal lymphadenopathies. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 17 (11), 1517-1522 (2013).
- Li, T., et al. Microbiology rapid on-site evaluation: a better method for Mucoid Pseudomonas Aeruginosa diagnosis in bronchiectasic patients. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 26 (5), 1738-1742 (2022).
- Tao, Y., et al. Application of microbiological rapid on-site evaluation in respiratory intensive care units: a retrospective study. Ann Transl Med. 10 (1), 7(2022).
- Yan, P., et al. The value of microbiology rapid on-site evaluation of sepsis caused by pulmonary infection. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 27 (12), 5862-5868 (2023).
- Muri, R., Trippel, M., Borner, U., Weidner, S., Trepp, R. The impact of rapid on-site evaluation on the quality and diagnostic value of thyroid nodule fine-needle aspirations. Thyroid. 32 (6), 667-674 (2022).
- Wang, Z., Shi, Y. Application of rapid on-site evaluation in contemporary pediatric interventional respiratory diseases. Chinese Journal of Practical Pediatrics. 12, 470-475 (2019).
- Shah, P. L., Herth, F. J. F. Progress in interventional pulmonology. Respiration. 95 (5), 287-288 (2018).
- Hsia, D., Musani, A. I. Interventional pulmonology. Med Clin North Am. 95 (6), 1095-1114 (2011).
- Moore, A. J., Mercer, R. M., Musani, A. I. Advances in interventional pulmonology. Clin Chest Med. 39 (1), 271-280 (2018).
- Majid, A., Fernandez-Bussy, S., Folch, E. Interventional pulmonology and solitary pulmonary nodule. Arch Bronconeumol. 54 (10), 497-498 (2018).
- Ali, M. S., Sorathia, L. Palliative care and interventional pulmonology. Clin Chest Med. 39 (1), 57-64 (2018).
- Czarnecka, K., Yasufuku, K. Interventional pulmonology: focus on pulmonary diagnostics. Respirology. 18 (1), 47-60 (2013).
- Schacht, M. J., et al. Endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration: performance of biomedical scientists on rapid on-site evaluation and preliminary diagnosis. Cytopathology. 27 (5), 344-350 (2016).
- Pearson, L., et al. Rapid on-site evaluation of fine-needle aspiration by non-cytopathologists: A systematic review and meta-analysis of diagnostic accuracy studies for adequacy assessment. Acta Cytol. 62 (4), 244-252 (2018).
- Arimura, K., et al. Cryobiopsy with endobronchial ultrasonography using a guide sheath for peripheral pulmonary lesions and DNA analysis by next generation sequencing and rapid on-site evaluation. Respir Investig. 57 (2), 150-156 (2019).
- Gianella, P., et al. Utility of rapid on-site cytologic evaluation during endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration in malignant and nonmalignant disease. Acta Cytol. 62 (5-6), 380-385 (2018).
- Natella, V., Cozzolino, I., Sosa Fernandez, L. V., Vigliar, E. Lymph nodes fine needle cytology in the diagnosis of infectious diseases: clinical settings. Infez Med. 20, 12-15 (2012).
- Baughman, R. P., Spencer, R. E., Kleykamp, B. O., Rashkin, M. C., Douthit, M. M. Ventilator associated pneumonia: quality of nonbronchoscopic bronchoalveolar lavage sample affects diagnostic yield. Eur Respir J. 16 (6), 1152-1157 (2000).
- Petrone, M. C., et al. Does cytotechnician training influence the accuracy of EUS-guided fine-needle aspiration of pancreatic masses. Dig Liver Dis. 44 (4), 311-314 (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
