Method Article

Wzorcowanie komórek przy użyciu strategii magnetyczno-archimedesowej

DOI:

10.3791/66063

⸱

February 2nd, 2024

 ,  ,  , 
1Department of Cardiology of The Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2State Key Laboratory of Transvascular Implantation Devices, 3Cardiovascular Key Laboratory of Zhejiang Province

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metodę tworzenia wzorców komórkowych bez tuszu, bez etykiet, niezależną od podłoża, opartą na efekcie magnetycznym Archimedesa.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wzorce komórek, pozwalające na precyzyjną kontrolę położenia komórek, stanowią unikalną przewagę w badaniu zachowania komórek. W tym protokole wprowadzana jest strategia wzorcowania komórek oparta na efekcie Magnetic-Archimedes (Mag-Arch). Takie podejście umożliwia precyzyjną kontrolę rozmieszczenia komórek bez użycia materiałów atramentowych lub cząstek etykietujących. Poprzez wprowadzenie odczynnika paramagnetycznego w celu zwiększenia podatności magnetycznej pożywki do hodowli komórkowej, komórki są odpychane przez magnesy i układają się we wzór komplementarny do zestawów magnetycznych umieszczonych pod podłożem mikroprzepływowym.

W tym artykule znajdują się szczegółowe procedury tworzenia wzorców komórkowych przy użyciu strategii opartej na Mag-Arch. Oferowane są metody tworzenia wzorów dla typów pojedynczych komórek, jak również dla wielu typów komórek do eksperymentów z kokulturą. Dodatkowo zamieszczono obszerne instrukcje dotyczące wytwarzania urządzeń mikroprzepływowych zawierających kanały do modelowania komórek. Osiągnięcie tej funkcji przy użyciu metod równoległych jest trudne, ale można to zrobić w uproszczony i opłacalny sposób. Wykorzystanie wzorców komórkowych opartych na Mag-Arch zapewnia naukowcom potężne narzędzie do badań in vitro.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wzorce komórkowe ewoluują w intuicyjną i potężną technologię do badań in vitro1. Manipulując pozycjami komórek na płytkach hodowlanych, zapewnia rozwiązania dla różnych eksperymentów, w tym migracji komórek2, biomimetycznej wielokomórkowej kokultury3, organoid assembly4, biomaterial studies5 i inne. W większości sytuacji do tworzenia wzorów komórek preferowana jest metoda bez tuszu i etykiet, ponieważ zapewnia łatwość obsługi i wysoką żywotność komórek w późniejszych badaniach.

Efekt Mag-Arch to zjawisko fizyczne, w którym obiekty diamagnetyczne w cieczach paramagnetycznych mają tendencję do przemieszczania się w kierunku obszarów o słabych polach magnetycznych6. Żywe komórki są naturalnie diamagnetyczne, podczas gdy pożywki do hodowli komórkowych mogą być paramagnetyczne poprzez dodanie rozpuszczalnych elementów paramagnetycznych, takich jak dimeglumine gadopentetanu (Gd-DTPA), powszechnie stosowany dożylnie w obrazowaniu magnetycznego rezonansu jądrowego jako środek kontrastowy7. W związku z tym oczekuje się, że komórki zostaną odepchnięte przez otaczający ośrodek paramagnetyczny i przemieszczą się w kierunku obszarów, w których pola magnetyczne są słabsze8. Wzorzyste pole magnetyczne można łatwo wygenerować za pomocą zestawu magnesów neodymowych. Idealnie byłoby, gdyby wzory komórek były montowane w opozycji do wzorów magnesów. Technicznie rzecz biorąc, jest to metoda bezznacznikowa, ponieważ jedyny dodatkowy odczynnik, Gd-DTPA, pozostaje w środowisku zewnątrzkomórkowym i nie wiąże się z komórkami. W ten sposób można łatwo uniknąć potencjalnych wpływów na późniejszą hodowlę komórkową poprzez wymianę pożywki. W porównaniu z innymi metodami1,3,9,10, strategia oparta na Mag-Arch nie wymaga składników biotuszu ani stosowania określonych cząstek, aby pozytywnie oznaczyć komórki. Ponadto wykazano, że działa na wielu podłożach adhezji komórek i jest zdolny do tworzenia wysokoprzepustowych wzorców komórkowych4.

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół tworzenia wzorów komórek za pomocą metody opartej na Mag-Arch, obejmujący wszystko, od produkcji urządzeń po dostosowywanie wzorca komórek. Oprócz zademonstrowanych przez nas wzorców, użytkownicy mogą łatwo tworzyć różne wzory komórek za pomocą magnesów i rozwiązania Gd-DTPA. Ponadto dostępne są również protokoły składania złożonych wzorców kokultur i manipulowania komórkami w zamkniętych chipach mikroprzepływowych.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Montaż zestawów magnesów

  1. Zmontuj zestawy magnesów do wzorów pasków.
    1. Wybierz płaskie prostokątne magnesy, jak pokazano na Rysunek 1A. Wymiary prostokątnych magnesów użytych do tej demonstracji wynoszą 1,5 mm × 10 mm × 35 mm (grubość × wysokość × długość) (patrz tabela materiałów). Grubość magnesów określa odstępy między paskami komórek.
    2. Pokrój płytki silikonowe o grubości 2 mm (patrz tabela materiałów) na prostokąty o wymiarach 2 mm × 8 mm × 30 mm. Upewnij się, że dwa ostatnie wymiary tych silikonowych płytek są nieco mniejsze niż wymiary prostokątnych magnesów wymienionych powyżej, aby zoptymalizować montaż. Grubość płytek silikonowych określa szerokość pasków komórek.
    3. Zmontuj prostokątne magnesy i płytki silikonowe warstwa po warstwie, jak pokazano na rysunku Rysunek 1A. Każdy zestaw magnesów składa się z 4 magnesów i 3 silikonowych płytek. Upewnij się, że bieguny każdego sąsiedniego magnesu są przeciwne, aby zestawy magnesów mogły się automatycznie wyrównać dzięki wewnętrznej sile przyciągania.
    4. Wysterylizuj magnesy przed użyciem.
      UWAGA: Zaleca się umycie zestawów magnetycznych czystą wodą, a następnie zanurzenie ich w 75% etanolu na 10 min. Całkowite wymiary tych zestawów magnesów wynoszą 12 mm × 10 mm × 35 mm, zaprojektowane tak, aby pasowały do standardowych 6-dołkowych płytek do hodowli komórkowych.
  2. Zmontuj zestawy magnesów dla wzorów z tablicą punktową
    1. Wybierz miniaturowe magnesy cylindryczne, jak pokazano na Rysunek 1B. Wymiary magnesów cylindrycznych użytych w tej demonstracji wynoszą Φ1,5 mm × 10 mm (średnica × wysokość), namagnesowanych w kierunku osiowym.
    2. Zamontuj cylindryczne magnesy zgodnie z ilustracją Rysunek 1B. Upewnij się, że każdy zestaw magnesów składa się z 36 cylindrycznych magnesów ułożonych w siatkę 6 × 6. Upewnij się również, że bieguny każdego sąsiedniego magnesu są przeciwne, aby umożliwić automatyczne wyrównanie zestawów magnesów ze względu na wewnętrzną siłę przyciągania.
    3. Wysterylizuj magnesy przed użyciem, postępując zgodnie z tą samą procedurą, co w kroku 1.1.4. Całkowite wymiary tych zestawów magnesów wynoszą 9 mm × 10 mm × 9 mm, zaprojektowane tak, aby pasowały do standardowych 6-dołkowych płytek do hodowli komórkowych.

2. Wzór komórek na szkiełkach

  1. Przygotuj urządzenie do hodowli komórkowej.
    1. Użyj silikonowych płytek o grubości 2 mm do stworzenia silikonowych form. Za pomocą dziurkacza wykonaj prostokątny otwór o długości 1 cm × 1 cm w płycie. Przytnij silikonową płytkę wokół otworu, aby stworzyć okrągłą formę (średnica = 25 mm) z otworem pośrodku, jak pokazano na Rysunek 1C.
    2. Dokładnie wyczyść formy silikonowe za pomocą myjki ultradźwiękowej. Wysterylizuj formy, myjąc je czystą wodą przez 10 minut, a następnie zastępując wodę 75% etanolem na kolejne 10 minut. Na koniec wysuszyć formy w pudełku sterylizatora w temperaturze 65 °C przez 60 minut.
    3. Przymocuj wysterylizowaną silikonową formę do okrągłego szkiełka szklanego o średnicy Φ25 mm i delikatnie dociśnij ją, aby silikon przylegał do szkła, jak pokazano na Rysunek 1C. Powstałe w ten sposób urządzenie do hodowli komórkowej będzie miało szklany spód i wnękę hodowlaną o pojemności 200 μl. Wymiary urządzenia wynoszą Φ25 mm × 2,15 mm, dzięki czemu nadaje się do standardowych 6-dołkowych płytek do hodowli komórkowych.
      UWAGA: Opisane powyżej urządzenie do hodowli komórkowej można zastąpić innymi szalkami Petriego o spodniej stronie cieńszej niż 0,5 mm, takimi jak szalki konfokalne.
    4. Umieść zestawy magnesów na płytce 6-dołkowej. Pęseta niemagnetyczna jest zalecana ze względu na łatwość obsługi.
      UWAGA: Wszystkie kolejne kroki powinny być wykonywane w sterylnych warunkach od tego momentu, aż do obserwacji wzorców komórek.
    5. Umieść urządzenie do hodowli komórkowej na górze magnesu umieszczonego w studzience płytki 6-dołkowej. Upewnij się, że urządzenie do hodowli komórkowej jest umieszczone poziomo, a spód ściśle styka się z zestawem magnesów.
  2. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych zawierającą Gd-DTPA
    1. Przygotować dostępną w handlu iniekcję Gd-DTPA (patrz Tabela Materiałów), zwykle o stężeniu 500 mM. Rozcieńczyć iniekcję, dodając 30 μl Gd-DTPA do iniekcji do 470 μl kompletnej pożywki do hodowli komórkowych, aby osiągnąć docelowe stężenie 30 mM.
      UWAGA: W zależności od lokalnych przepisów i dostępności, inne środki kontrastowe na bazie gadolinu (GBCA) o tym samym stężeniu docelowym mogą dawać podobne wyniki11.
  3. Utwórz wzorce komórek.
    1. Zbieraj komórki do tworzenia wzorów. W tej demonstracji do tworzenia wzorów użyto ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC, patrz Tabela Materiałów) (Rysunek 2). Odwirować komórki przez 5 minut przy 200 x g (w temperaturze pokojowej) w celu zebrania ich z zawiesiny i ponownego zawieszenia w pożywce zawierającej Gd-DTPA. Policz gęstość komórek.
    2. Dostosuj gęstość komórek do około ~2 × 105 komórek/ml za pomocą pożywki zawierającej Gd-DTPA. Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową i dodaj 200 μl do wnęki każdej formy do hodowli komórkowych, aby uzyskać pełną płyn powierzchnię.
    3. Ostrożnie przenieść płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych i inkubować przez 3-6 godzin, aż komórki dobrze przylegają do podłoża. Unikaj trzaskania drzwiami inkubatora, aby zapobiec zakłóceniom w montażu wzorów komórek. W przypadku komórek o słabym współczynniku adhezji, leczenie GBCA przez noc jest ogólnie bezpieczne12.
    4. Wzorzec komórkowy uważa się za zakończony, gdy komórki przylegają do dna wnęki urządzenia do hodowli komórek. Zastąp pożywkę zawierającą Gd-DTPA kompletną pożywką hodowlaną.
    5. Wyjmij urządzenie do hodowli komórkowej z zestawu magnesów. Można albo natychmiast obserwować wzór komórek, albo przenieść urządzenie na nową płytkę hodowlaną w celu dalszej hodowli.

3. Współkulturowanie za pomocą magnesu na boki: produkcja ruchomego szablonu

UWAGA: Poniższa procedura jest przedstawiona, aby wykorzystać wzorce komórek oparte na Mag-Arch i zbadać możliwości większej liczby zastosowań.

  1. Przygotuj urządzenie do tworzenia wzorów komórek paskowych, wykonując kroki 1 i 2. Zmniejsz jednak gęstość komórek do 1 × 105 komórek/ml i zastąp silikonowe płytki oddzielające magnesy cieńszymi, dzięki czemu każdy wzór komórek paskowych będzie cieńszy.
    UWAGA: Zapewnia to wystarczający obszar do ułożenia wielu komórek w paski. Jako odniesienie sugerujemy użycie silikonowych płytek o grubości 1 mm zamiast 2 mm do oddzielenia magnesów.
  2. Uporządkuj pierwszy typ komórek, jak pokazano w krokach 2.2-2.3. Ten krok wymaga również 3-6 godzin na zamocowanie ogniwa.
    UWAGA: Aby rozróżnić różne typy komórek w systemie kohodowli, użytkownicy mogą oznaczyć komórki barwnikami fluorescencyjnymi, takimi jak DiI, DiD lub trackerami komórek (CMTPX, CMFDA, CMMAC itp.) przed wykonaniem wzoru. Na przykład, w przypadku barwienia DiI i DiD, dodać 1 μl roztworu podstawowego (10 mM) (patrz Tabela materiałów) na 1 ml pożywki wolnej od FBS i dobrze wymieszać, aby uzyskać roztwór roboczy. Zastąp pożywkę hodowlaną roztworem roboczym, aby pokryć przylegające komórki. Po inkubacji przez 30 minut i trzykrotnym umyciu PBS przystąp do pobierania komórek.
  3. Po utworzeniu wzoru pierwszego typu komórek, przesuń urządzenie do hodowli komórkowej o 1 mm od magnesów poniżej w prawo, jak pokazano na rysunku Rysunek 3Aii.
  4. Delikatnie umyj szkiełka podstawowe dwukrotnie 200 μl PBS. Unikaj pozostawiania szkiełek do wyschnięcia.
  5. Uformuj drugi typ komórek w taki sam sposób, jak pokazano w krokach 2.2-2.3.
  6. Przesuń urządzenie do hodowli komórkowej o 1 mm od magnesów poniżej w prawo, jak pokazano na rysunku Rysunek 3Aiii, i ponownie umyj szkiełka 200 μl PBS. Uporządkuj trzeci typ komórek w taki sam sposób, jak pokazano w krokach 2.2-2.3.
  7. Po utworzeniu wzoru wszystkich typów komórek, delikatnie umyj szkiełka dwukrotnie 200 μl PBS i zastąp je kompletną pożywką do hodowli komórkowych.
  8. Wyjmij urządzenie do hodowli komórkowej z zestawu magnesów. Następnie można obserwować wzór komórek lub przenieść urządzenie na nową płytkę hodowlaną w celu dalszej hodowli.

4. Wzorcowanie współkultury poprzez dostosowanie stężenia Gd-DTPA

UWAGA: GBCA nie wpływają znacząco na adhezję komórek ani na późniejszy wzrost przy stężeniach roboczych (≤75 mM). Dodatkowo, na wzorce komórkowe wpływa stężenie Gd-DTPA: wyższe stężenia skutkują mniejszymi/cieńszymi wzorcami komórek. W ten sposób możliwe jest tworzenie systemów kohodowli poprzez proste dostosowanie stężenia Gd-DTPA. W tym przykładzie pokazano tworzenie wzorców koncentrycznych tablic kołowych.

  1. Ułóż wzór pierwszego typu komórek, jak pokazano w krokach 2.2-2.3, używając miniaturowych magnesów cylindrycznych z kroku 1.2. Oznacz komórki barwnikami fluorescencyjnymi, takimi jak DiI, DiD lub trackerami komórek (patrz krok 3) przed ich pobraniem, aby rozróżnić różne typy komórek w systemie kohodowli.
    UWAGA: Potrzebne będzie wyższe stężenie Gd-DTPA (50 mM zamiast 30 mM) i mniejsza gęstość komórek, około 1 × 105 komórek/ml.
  2. Po ułożeniu wzoru pierwszej matrycy komórek, delikatnie umyj szkiełka dwukrotnie 200 μl PBS. Nie dopuścić do wyschnięcia szkiełek.
  3. Uformuj drugi typ komórek, postępując zgodnie z tą samą procedurą, co poprzednio. Utrzymuj szkiełka w miarę nieruchomo na magnesach, aby zapobiec przemieszczeniu. Zaleca się przymocowanie silikonowej płytki z wgłębieniem, które pasuje do zestawów magnesów, do spodniej powierzchni szkiełka szklanego.
    UWAGA: W tym przypadku potrzebne będzie niższe stężenie Gd-DTPA (20 mM zamiast 30 mM), aby oczekiwano, że wzorce drugiej komórki będą większe niż pierwsze, jak pokazano w Rysunek 3B.
  4. Po wymodelowaniu wszystkich typów komórek, delikatnie umyj szkiełka dwukrotnie 200 μl PBS i zastąp pożywkę kompletną pożywką do hodowli komórkowych.
  5. Wyjmij urządzenie do hodowli komórkowej z zestawu magnesów. Następnie można obserwować wzór komórek lub przenieść urządzenie na nową płytkę hodowlaną w celu dalszej hodowli.

5. Wzorce komórek w chipie mikroprzepływowym

UWAGA: Metoda oparta na Mag-Arch została zademonstrowana do działania w zamkniętych, wąskich komorach w naszym poprzednim badaniu8. Oto przykład wzorowania tablic kropkowych w kanale mikroprzepływowym.

  1. Produkcja chipa z mikropłynami
    1. Dostosuj formy 40 mm × 75 mm × 20 mm z politetrafluoroetylenu (PTFE) (patrz Tabela materiałów) zawierające prostokątną wnękę 24 mm × 50 mm × 8 mm, jak pokazano w Rysunek 4A.
    2. Spłaszcz płytkę silikonową o grubości 0,5 mm. Wytnij płytki silikonowe zgodnie z kształtem kanału płynu, który ma prostokątną wnękę 15 mm × 20 mm × 0,5 mm z trójkątnymi obszarami buforowymi zarówno po stronie wlotu, jak i wylotu, jak pokazano na Rysunek 4A,B.
    3. Dostosuj prostokątne płyty szklane 40 mm × 75 mm. Czyść szklane płytki plazmą powietrzną przez 30 sekund.
    4. Natychmiast po oczyszczeniu plazmą powietrzną przykryj szklane płytki 0,5 ml dostępnego w handlu buforu antyadhezyjnego (patrz Tabela Materiałów) i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Umyj szklane talerze raz etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
    5. Przymocuj silikonową płytkę przygotowaną w kroku 5.1.2 bezpiecznie do środka szklanej płytki, jak pokazano na Rysunek 4A.
    6. Przygotować prepolimer polidimetylosiloksanu (PDMS) zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów). Dla każdego chipa PDMS odważyć 10 g składnika bazowego i 1 g środka wiążącego do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
    7. Dokładnie wymieszać środki za pomocą szklanego pręta mieszającego, aż małe pęcherzyki zostaną równomiernie rozprowadzone w koloidzie Mieszanie trwa 5-10 minut, w zależności od objętości koloidu. Odwirować prepolimer koloidalny przez 1 minutę przy 500 x g (w temperaturze pokojowej) w celu usunięcia pęcherzyków.
    8. Powoli wlej ~10 ml prepolimeru do wnęki, aby wypełnić formę PTFE.
    9. Ostrożnie umieść formę w zbiorniku próżniowym i trzymaj ją poziomo, aby zapobiec odpływaniu prepolimeru.
    10. Usuń resztki pęcherzyków powietrza z prepolimeru za pomocą pompy próżniowej. Odkurzanie trwa 120-180 min.
    11. W razie potrzeby wlej więcej prepolimeru, aby jeszcze bardziej wypełnić wnękę formy. Odkurzaj przez kolejne 60 minut.
    12. Ostrożnie przykryj formę z PTFE szklaną płytką, stroną z krzemionki skierowaną w stronę wnęki, jak pokazano na rysunku Rysunek 4Bi.
    13. Upewnij się, że wszystkie pęcherzyki zostały usunięte. Przenieś formę do pieca suszącego o temperaturze 60 °C, aby prepolimer zestalił się przez noc.
    14. Wyjmij formę z piekarnika. Po schłodzeniu ostrożnie wyjmij z formy zestaloną pokrywę PDMS. Utwórz wlot i wylot za pomocą dziurkacza igłowego Φ1 mm.
    15. Umyj pokrywę PDMS oraz szkiełka osłonowe 24 mm × 50 mm zgodnie z krokiem 2.1.2.
      UWAGA: Wykonaj następujące czynności w sterylnych warunkach.
    16. Zamocuj pokrywę PDMS i szkiełko pokrywy, aby utworzyć chip mikropłynu zawierający kanał przepływowy o wysokości około ~500 μm. Dolna strona powinna składać się ze szkiełka o grubości ~0,15 mm, aby umożliwić modelowanie komórek za pomocą strategii opartej na Mag-Arch.
  2. Zamontuj dostępne w handlu sterylne adaptery zarówno na wlocie, jak i na wylocie chipa do mikropłynów8.
  3. Przygotować 2% (w/v, rozpuszczony w PBS) żelatynowy bufor powlekający. Wysterylizuj bufor przez autoklawowanie.
  4. Wstrzyknąć żelatynowy bufor powlekający do chipa za pomocą adaptera wlotowego za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. Jeśli pojawią się bąbelki, przepłucz je dodatkowym buforem do powlekania.
  5. Umieść chip w naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 10 cm. Dodaj 1 ml PBS wokół dna naczynia, aby uniknąć wysuszenia. Przenieś naczynie do inkubatora kultur komórkowych. Malowanie trwa 30 minut.
  6. Przepłukać bufor powlekający 2 ml pożywki zawierającej Gd (30 mM) przez wlot.
  7. Delikatnie wstrzyknąć 1 ml zawiesiny komórkowej zawierającej 30 mM Gd-DTPA za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml.
  8. Wzorzec komórek, jak pokazano w krokach 2.2-2.3 za pomocą miniaturowych magnesów cylindrycznych z kroku 1.2.
    UWAGA: Zaleca się jednak przymocowanie silikonowej płytki z wgłębieniem, które pasuje do zestawów magnesów, do spodniej powierzchni szkiełka szklanego, jak pokazano na Rysunek 4Ci.
  9. Po wykonaniu wzoru delikatnie odświeżyć pożywkę zawartą w Gd-DTPA 1 ml kompletnego podłoża, przepłukując je strzykawką o pojemności 1 ml.
    UWAGA: Proces modelowania komórek w mikrofluidyce, od kroków 5.7-5.9, trwa około 180 minut, co jest podobne do modelowania komórek na standardowych szkiełkach szkiełkowych.
  10. Określ ilościowo wzory pod mikroskopem. W razie potrzeby podłącz chip do mikropłynów do krążącego urządzenia do hodowli w celu dalszej uprawy.
    UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że komórki są w stanie rosnąć przez co najmniej 72 godziny, gdy są wspierane przez proste urządzenie oparte na mikropompie, które zapewnia mikrofluidykom ciągły przepływ świeżej pożywki hodowlanej w inkubatorze komórkowym8.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prostokątne (1,5 mm × 10 mm × 35 mm) i cylindryczne (Φ1,5 m × 10 mm) magnesy zostały wybrane do stworzenia wzorów komórek jako demonstracja. Użytkownicy mają możliwość modyfikowania rozmiaru i kształtu magnesów lub składania ich w różny sposób, aby tworzyć różnorodne wzory komórek. W Rysunek 1A,B, magnesy zostały zmontowane, z biegunami magnetycznymi przedstawionymi na niebiesko (południe) i czerwono (północ) dla jasności. W tej konfiguracji magnesy przyciągają się nawzajem na boki i ustawiają się w jednej linii, jak pokazano na rysunku Rysunek 2. Rysunek 1C,D ilustruje strukturę urządzenia do hodowli komórkowej i procedurę tworzenia wzorów komórkowych.

Rysunek 2 przedstawia wzorce komórek typu mono. HUVEC znakowane GFP wykorzystano do obserwacji pod mikroskopem fluorescencyjnym. Komórki zostały zorganizowane we wzory pasków i kropek za pomocą odpowiednich zestawów magnesów. W przypadku HUVEC, które szybko przylegają do szkiełek podstawowych (w ciągu 120-180 min), cała procedura została zakończona w ciągu 4 godzin. Przestrzeganie protokołu zaowocowało wzorami o dobrze zdefiniowanych krawędziach i wysokiej jednorodności. Aby określić żywotność, komórki traktowano Gd-DTPA przez 12 godzin, czyli znacznie dłużej niż 3-6 godzin w kroku 2. Jednak zarówno barwienie żywe/martwe, jak i test CCK88 nie wykazały znaczącego spadku żywotności komórek. Stosunkowo wysokie stężenie Gd-DTPA (50 mM) wywołało różnicę statystyczną, ale nadal zachowało wskaźnik życia na poziomie 90,76% ± 1,78% (rysunek uzupełniający 1).

Opierając się na protokole modelowania komórek typu mono, dostarczono przykłady wzorców komórek wielotypowych dla potencjalnych zastosowań kokulturowych. W tym scenariuszu wykorzystano HUVEC, komórki raka jajnika A2780 i komórki mięśni gładkich (SMC). Aby je rozróżnić, komórki oznaczono GFP, DiD i DiI przed utworzeniem wzoru. Wykonując krok 3, wygenerowano trójdzielny wzór komórek z paskami ułożonymi obok siebie (Rysunek 3A). I odwrotnie, krok 4 został wykorzystany do utworzenia koncentrycznych tablic punktowych poprzez dostosowanie stężenia Gd-DTPA (Rysunek 3B). Pierwsza warstwa komórek została wybarwiona DiI (na czerwono) i wzięta za pomocą 50 mM Gd-DTPA, podczas gdy druga warstwa komórek została oznaczona GFP (na zielono) i wzorzysta za pomocą 25 mM Gd-DTPA. W związku z tym rozmiar kropki w pierwszej warstwie był mniejszy, otoczony koncentrycznie przez drugą warstwę komórek z kropkami. Różne typy komórek wykazywały różne szybkości przyczepiania i rozprzestrzeniania się, przy czym HUVEC przyczepiały się i rozprzestrzeniały szybko, A2780 przyczepiały się szybko, ale rozprzestrzeniały się wolniej, a SMC przyczepiały się i rozprzestrzeniały stosunkowo wolno. Wyniki te wykazały, że różne typy komórek mogą tworzyć wzorce komórkowe w ciągu 3 godzin i być wykorzystywane w eksperymentach z kokulturą.

Ponadto, wykazano, że wzorcowanie komórek za pomocą pola magnetycznego jest kompatybilne z zamkniętymi urządzeniami do hodowli wąskich, takimi jak chipy mikroprzepływowe. Postępując zgodnie z krokiem 5, wyprodukowano chipy mikroprzepływowe, a w ich obrębie wygenerowano tablice punktowe (Rysunek 4).

figure-results-1
Rysunek 1: Konfiguracja i schemat schematyczny wzoru komórek opartego na łuku magnetycznym. (A) Montaż zestawów magnesów do tworzenia wzorów komórek paskowych. (B) Montaż zestawów magnesów do generowania wzorów komórek z tablicą punktową. (C) Ustawienie urządzenia do hodowli komórkowej. (D) Procedura krok po kroku dotycząca tworzenia wzorców komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Montaż urządzeń i układanie HUVEC w paski i kropki. (A) Zestawy magnesów zamknięte w urządzeniach do hodowli komórkowej (i) i umieszczone na płytce do hodowli komórkowej (ii). (B) i (C) Zestawy magnesów i odpowiadające im wzorce komórek. Komórki znakowano zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) w celu wizualizacji wzorca komórkowego. Podziałka = 1,5 mm; Wstawki = 500 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Wzorcowanie systemów współkultur ze strategią krok po kroku. (A) Wzorowanie wzorców kokulturowych za pomocą magnesu na boki (i-iii). Komórki oznaczono GFP (zielony), DiD (niebieski) i DiI (czerwony) w celu rozróżnienia różnych typów komórek. Podziałka liniowa = 1 mm. (B) Wzór współkultury osiągnięty przez dostosowanie stężenia Gd-DTPA; (i) 50 mM, (ii) 20 mM. Podziałka = 1,5 mm; wstawki = 250 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Wzór komórek w komorze mikroprzepływowej. (A) Schemat ideowy formy mikroprzepływowej. (B) Wytwarzanie mikrofluidyków przy użyciu polidimetylosiloksanu (PDMS) (i,ii). (C) Wzorzec komórek w urządzeniu mikroprzepływowym (i,ii) i reprezentatywny wynik pokazujący wzorce komórek z tablicą punktową (iii). Komórki znakowano zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Podziałka = 3 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Wpływ Gd-DTPA na żywotność komórek. HUVEC traktowano różnymi stężeniami Gd-DTPA przez 12 godzin, a następnie poddano barwieniu żywym/martwym lub testowi CCK-8. (A) Żywe/martwe barwienie HUVEC. Podziałka = 200 μm. (B) Histogram przedstawiający wyniki barwienia żywego/martwego. (C) Histogram przedstawiający wyniki testu CCK-8. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modelowanie komórek oparte na Mag-Arch stanowi przyjazne dla użytkownika rozwiązanie dla większości laboratoriów biomedycznych. Metoda ta rozwija się równolegle do znaków bez atramentu, bez etykiet, niezależnie od podłoża i z możliwością wysokowydajnego wzorcowania 8,13. W przypadku wzorców komórek monotypowych tworzy wzorce komórek w jednoetapowy sposób. Procedura kończy się po prostu odświeżeniem pożywek hodowlanych.

W poprzednich badaniach wykorzystano cząstki magnetyczne do oznaczania komórek i przyciągania ich magnesami w celu utworzenia precyzyjnych wzorów14,15. Jednak obecność cząstek magnetycznych na komórkach wzbudziła obawy o potencjalny wpływ na zachowanie komórek. Wzorce komórkowe oparte na Mag-Arch przyjmują odwrotną strategię, przekształcając płyny zewnątrzkomórkowe w paramagnetyczne, a nie w komórki. Ta strategia znacznie ułatwia usunięcie dodatkowych odczynników paramagnetycznych poprzez odświeżenie pożywki hodowlanej. W ramach badań wygenerowano sfery komórkowe i tablice punktowe z wzorcami komórek opartymi na Mag-Arch11,16. W porównaniu z istniejącymi badaniami opartymi na Mag-Arch, metody przedstawione przez ten protokół mogą dowolnie dostosowywać kształt wzorów. Ponadto w protokole przedstawiono strategie wytwarzania systemów kokulturowych. Udowodniono również, że działa w zamkniętych, wąskich komorach do hodowli komórkowych, co testowaliśmy w mikrofluidyce.

Zamiast metod równoległych, które wymagają profesjonalnego sprzętu dobiodruku17, niestandardowychszablonów18 lub modyfikacji powierzchni kompleksu19, metoda oparta na Mag-Arch wymaga tylko dwóch potrzeb: magnesów i GBCA. Powierzchnia wzoru magnesu określa wzór komórki w odwrotnej kolejności. Zademonstrowano kilka wzorów pasków i tablic kropkowych jako podstawowych. Użytkownicy mogą dowolnie generować wzory z różnymi kształtami zestawów magnesów, które są obficie dostępne na rynku. Aby osiągnąć idealny wynik, zaleca się zastosowanie magnesów, które zapewniają wystarczającą siłę magnetyczną. W naszej praktyce przyjęliśmy magnesy neodymowo-żelazowo-borowe N52, których remanencja wynosiła ponad 1430 mT, a magnetyzm powierzchniowy ponad 100 mT na biegunach. W przypadku GBCA przyjęto Gd-DTPA, ponieważ jest stabilny w warunkach fizjologicznych i tanio dostępny w większości krajów i obszarów. Alternatywnie można przyjąć inne GBCA. Makrocykliczne niejonowe GBCA, takie jak gadobutrol i gadoteridol, mogą być lepszym wyborem w celu obniżenia cytotoksyczności podczas modelowania wrażliwych komórek do długotrwałego leczenia11,12.

Ograniczenie wzorca komórek opartego na Mag-Arch polega głównie na obszarze roboczym pola magnetycznego generowanego przez magnesy. Zgodnie ze wzorem odwrotności kwadratu, pole magnetyczne gwałtownie maleje wraz z odległością8. W związku z tym metoda Mag-Arch nie jest w stanie stworzyć idealnych wzorów komórek na ogólnych polistyrenowych naczyniach lub płytkach do hodowli komórek, których dno jest grubsze niż 1 mm. W związku z tym protokół musi działać na cieńszych powierzchniach hodowli komórkowych, takich jak szkiełka podstawowe lub konfokalne szalki do hodowli komórkowych. Podczas modelowania wewnątrz mikrofluidyki wymagane jest również, aby dolne szkiełka mikrofluidyki były cieńsze niż 0,5 mm. W przypadku tworzenia systemów kohodowli metoda może być czasochłonna, ponieważ każdy dodatkowy typ komórki wydłuża czas przyłączenia komórek o 3-6 godzin.

Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten zapewnia uproszczony sposób tworzenia wzorców komórkowych, które można powielić w większości laboratoriów bez specjalnego sprzętu. Użytkownicy mogą przyjąć go jako potężne narzędzie do badania zachowań komórek, naśladowania mikrośrodowisk wielokomórkowych lub testowania powinowactwa komórek biomateriałów8.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie jest wspierane finansowo przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2021YFA1101100), Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32000971), Fundusze Badań Podstawowych dla Uniwersytetów Centralnych (nr 2021FZZX001-42) oraz Fundusz Naukowy Gwiaździstej Nocy Instytutu Studiów Zaawansowanych Uniwersytetu Zhejiang w Szanghaju (Grant No. SN-ZJU-SIAS-004).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
A2780 komórki raka jajnikaProcellCL-0013
Pożywka do hodowli komórkowych (DMEM, wysoka glukoza)Gibco11995040
Szkiełka podstawoweCitotest Scientific80340-3610Do wytwarzania mikrofluidyki. Wymiar: 24 mm i razy; 50 mm
DiDMedChemExpress (MCE) HY-D1028Do znakowania komórek za pomocą czerwonej fluorescencji (Ex: 640 nm)
DiIMedChemExpress (MCE) HY-D0083 Do znakowania komórek za pomocą pomarańczowej fluorescencji (np. 550 nm)
Płodowa surowica bydlęca (FBS)BiochannelBC-SE-FBS07
Dimegluminan gadopentetate (Gd-DTPA)Beijing Beilu Pharmaceutical 
ŻelatynaSigma AldrichV900863
Szkiełka komórkoweCitotest Scientific80346-2510Średnica: 25 mm; grubość: 0,19-0,22 mm
Talerze szklaneSklepDo wytwarzania mikrofluidyki. Wymiar: 40 mm i razy; 75 mm
Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)ServicebioSTCC12103G-1
Magnesy neodymowo-żelazowo-borowe (N52)Nietoksyczna powłoka szklana Lalaci
(Gel Slick Solution)Lonza1049286Dla wygody wyjmowania z formy podczas wytwarzania mikrofluidyków
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)ServicebioG4200
Myjka plazmowaSANHOPTTPT-2S
Zestaw polidimetylosiloksanu (PDMS)DOWSILSYLGARD 184 Zestaw elastomerów silikonowychDo wytwarzania mikrofluidyki
Forma z politetrafluoroetylenu (PFTE)SklepDostosowane online, do wytwarzania mikrofluidyki
Płyta silikonowaSklep
Mięśnie gładkie Komórki (SMC)ProcellCL-0517
Myjka ultradźwiękowaSapeenCSA-02
H10860002 z narzędziami PURESHI z narzędziami PURESHI z narzędziami PURESHI

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Christian, J., et al. Control of cell adhesion using hydrogel patterning techniques for applications in traction force microscopy. J Vis Exp. 179, e63121(2022).
  2. Abbas, Y., Turco, M. Y., Burton, G. J., Moffett, A. Investigation of human trophoblast invasion in vitro. Hum Reprod Update. 26 (4), 501-513 (2020).
  3. Park, M., et al. Modulation of heterotypic and homotypic cell-cell interactions via zwitterionic lipid masks. Adv Healthc Mater. 6 (15), 1700063(2017).
  4. Ren, T., Chen, P., Gu, L., Ogut, M. G., Demirci, U. Soft ring-shaped cellu-robots with simultaneous locomotion in batches. Adv Mater. 32 (8), e1905713(2020).
  5. Ren, T., Steiger, W., Chen, P., Ovsianikov, A., Demirci, U. Enhancing cell packing in buckyballs by acoustofluidic activation. Biofabrication. 12 (2), 025033(2020).
  6. Ge, S., et al. Magnetic levitation in chemistry, materials science, and biochemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 59 (41), 17810-17855 (2020).
  7. Puluca, N., et al. Levitating cells to sort the fit and the fat. Adv Biosyst. 4 (6), e1900300(2020).
  8. Ren, T., et al. Programing cell assembly via ink-free, label-free magneto-archimedes based strategy. ACS Nano. 17 (13), 12072-12086 (2023).
  9. Li, Y. C., et al. Programmable laser-assisted surface microfabrication on a poly(vinyl alcohol)-coated glass chip with self-changing cell adhesivity for heterotypic cell patterning. ACS Appl Mater Interfaces. 7 (40), 22322-22332 (2015).
  10. Chliara, M. A., Elezoglou, S., Zergioti, I. Bioprinting on organ-on-chip: Development and applications. Biosensors (Basel). 12 (12), 1135(2022).
  11. Moncal, K. K., Yaman, S., Durmus, N. G. Levitational 3D bioassembly and density-based spatial coding of levitoids. Adv Funct Mater. 32 (50), 2204092(2022).
  12. Parfenov, V. A., et al. Magnetic levitational bioassembly of 3D tissue construct in space. Sci Adv. 6 (29), eaba4174(2020).
  13. Dell, A. C., Wagner, G., Own, J., Geibel, J. P. 3D bioprinting using hydrogels: Cell inks and tissue engineering applications. Pharmaceutics. 14 (12), 2596(2022).
  14. Ino, K., Ito, A., Honda, H. Cell patterning using magnetite nanoparticles and magnetic force. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1309-1317 (2007).
  15. Okochi, M., Matsumura, T., Honda, H. Magnetic force-based cell patterning for evaluation of the effect of stromal fibroblasts on invasive capacity in 3d cultures. Biosens Bioelectron. 42, 300-307 (2013).
  16. Mishriki, S., et al. Rapid magnetic 3D printing of cellular structures with mcf-7 cell inks. Research (Wash D C). 2019, 9854593(2019).
  17. Ozturk-Oncel, M. O., Leal-Martinez, B. H., Monteiro, R. F., Gomes, M. E., Domingues, R. M. A. A dive into the bath: Embedded 3D bioprinting of freeform in vitro models. Biomater Sci. 11, 5462-5473 (2023).
  18. Sahni, G., Yuan, J., Toh, Y. C. Stencil micropatterning of human pluripotent stem cells for probing spatial organization of differentiation fates. J Vis Exp. 112, e54097(2016).
  19. Joddar, B., et al. Engineering approaches for cardiac organoid formation and their characterization. Transl Res. 250, 46-67 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell PatterningMagnetic ArchimedesParamagnetic ReagentMicrofluidic DeviceCell DistributionMagnet SetsGd DTPACo Culture PatterningCell MigrationOrganoid Assembly

Related Articles