Wykorzystanie testu rozszczepienia pod tarczami i znakowania (CUT&Tag) w badaniach mioblastów myszy

Podsumowanie

Badacze nowi w dziedzinie epigenetyki uznają CUT&Tag za znacznie łatwiejszą alternatywę dla testów ChIP. Projekt CUT&Tag przyniósł ogromne korzyści badaniom epigenetycznym na rzadkich i pierwotnych populacjach komórek, uzyskując wysokiej jakości dane z bardzo niewielu komórek. Protokół ten opisuje wykonywanie testów H3K4me1 CUT&Tag na mysich mioblastach wyizolowanych z mięśni kończyn tylnych myszy.

Streszczenie

Ten dokument o protokole ma na celu dostarczenie nowym badaczom pełnych szczegółów korzystania z Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) do profilowania lokalizacji genomowych czynników wiążących chromatynę, znaczników histonów i wariantów histonów. Protokoły CUT&Tag bardzo dobrze sprawdzają się w przypadku mysich mioblastów i świeżo wyizolowanych komórek macierzystych mięśni (MuSC). Można je łatwo zastosować do wielu innych typów komórek, o ile komórki mogą być unieruchomione przez kulki Concanavalin-A. W porównaniu z CUT&Tag, testy immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) są czasochłonnymi eksperymentami. Testy ChIP wymagają wstępnej obróbki chromatyny, zanim materiał chromatyczny będzie mógł być użyty do immunoprecypitacji. W sieciowaniu ChIP (X-ChIP) wstępna obróbka chromatyny obejmuje sieciowanie i sonikację w celu fragmentacji chromatyny. W przypadku natywnego ChIP (N-ChIP) rozdrobnione chromatyny są zwykle osiągane przez trawienie nukleazy mikrokokowej (MNazy). Zarówno sonikacja, jak i trawienie MNazy wprowadzają pewne odchylenia do eksperymentów ChIP. Testy CUT&Tag mogą być zakończone w mniejszej liczbie kroków i wymagają znacznie mniejszej liczby komórek w porównaniu z ChIP, ale dostarczają bardziej bezstronnych informacji na temat czynników transkrypcyjnych lub znaczników histonowych w różnych lokalizacjach genomu. CUT&Tag może pracować z zaledwie 5 000 komórek. Ze względu na wyższą czułość i niższy sygnał tła niż w przypadku ChIP, naukowcy mogą spodziewać się uzyskania wiarygodnych danych szczytowych z zaledwie kilku milionów odczytów po sekwencjonowaniu.

Wprowadzenie

Test CUT&Tag został wynaleziony, aby zrekompensować niektóre jawne wady ChIPs¹. Dwie główne wady ChIP to: 1) stronniczość wynikająca z fragmentacji chromatyny oraz 2) niekompetencja do pracy z niską liczbą komórek. Testy X-ChIP opierają się na sonikacji lub trawieniu MNazy w celu uzyskania fragmentów chromatyny, podczas gdy N-ChIP najczęściej wykorzystuje trawienie MNazy w celu uzyskania nukleosomów. Sonikacja wykazuje skłonność do zrelaksowanych lokalizacji chromatyny, takich jak regiony promotorowe², i najwyraźniej trawienie MNazy działa również wydajniej na rozluźnione włókna chromatyny. Co więcej, niektórzy stwierdzili, że trawienie MNazy wykazuje również stronniczość zależną od sekwencji DNA³. W związku z tym, na etapie przygotowania danych wejściowych testów ChIP, niemożliwe jest uzyskanie fragmentów chromatyny ze wszystkich rodzajów lokalizacji genomowych w sposób idealnie losowy. Co więcej, testy ChIP zwykle generują wyższe sygnały tła w porównaniu do CUT&Tag i wymagają ponad 10 razy więcej odczytów niż CUT&Tag, aby zaakcentować, gdzie znajdują się szczyty^1,4,5. To wyjaśnia, dlaczego eksperymenty ChIP muszą zaczynać się od znacznie większej liczby komórek niż CUT&Tag. Nie stanowi to problemu podczas badania linii komórkowych, ponieważ mogą one być powtarzalnie pasażowane, aby osiągnąć bardzo wysoką liczbę komórek. Jednak test ChIP zdecydowanie nie jest silnym narzędziem epigenetycznym do badania rzadkich lub cennych populacji komórek pierwotnych, chociaż komórki pierwotne mają oczywiście bardziej praktyczne i medyczne implikacje.

Podczas gdy długa i skomplikowana procedura ChIP zniechęca niektórych badaczy do nauki lub korzystania z tej techniki, ludzie czują się bardziej komfortowo z łatwiejszymi testami, takimi jak immunocytochemia (ICC) lub immunofluorescencja (IF). Test CUT&Tag zasadniczo przypomina proces eksperymentów ICC i IF, ale odbywa się tylko w probówce. CUT&Tag nie potrzebuje na początku rozdrobnionej chromatyny, a zamiast tego genom musi być nienaruszony, aby związać przeciwciała¹. W pierwszym dniu eksperymentu ChIP badacze zwykle spędzają do 4 godzin na przygotowaniu pofragmentowanych chromatyn z jąder za pomocą sonikacji lub trawienia MNazy, zanim krótkie fragmenty chromatyny będą mogły zostać zmieszane z kulkami przeciwciała^4,5. W przeciwieństwie do tego, pierwszy dzień pracy procedury CUT&Tag polega po prostu na unieruchomieniu komórek za pomocą kulek Concanavalin-A, a następnie dodaniu przeciwciała pierwotnego do kulek komórkowych. Wymaga to tylko ~40 min¹.

Warto wspomnieć, że Cięcie pod Cele i Uwalnianie za pomocą Nukleazy (CUT&RUN) jest ważną alternatywą dla CUT&Tag. CUT&RUN powstał w oparciu o podobny mechanizm działania jak CUT&Tag. W CUT&Tag przeciwciała kierują transpozazę pA/G-Tn5 do wszystkich miejsc, w których enzym wycina fragment chromatyny, a w międzyczasie znakuje go adapterami tworzącymi bibliotekę, podczas gdy w CUT&RUN rolę pA/G-Tn5 pełni pA/G-MNaza, która wykonuje tylko część tnącą zadania⁶. W związku z tym, w porównaniu do CUT&Tag, CUT&RUN wymaga dodatkowego etapu, którym jest przyklejenie adapterów bibliotecznych do fragmentaryzowanych fragmentów DNA pA/G-MNase^7,8. Ze względu na duże podobieństwa między CUT&Tag i CUT&RUN, badacze zaznajomieni z CUT&Tag z łatwością przystosują się do biegłego wykonywania CUT&RUN. Należy jednak zauważyć, że istnieją pewne drobne różnice między CUT&Tag a CUT&RUN. Protokoły CUT&RUN zwykle wykorzystują fizyczne stężenie soli (~150 mM) na etapach mycia, podczas gdy w CUT&Tag bufor myjący 300-Dig ma wysoką zawartość soli. Dlatego CUT&Tag jest dobry w kontrolowaniu tła podczas profilowania znaczników/wariantów histonów lub czynników transkrypcyjnych, ponieważ białka te bezpośrednio i silnie wiążą DNA¹. CUT&Tag może napotkać problemy podczas profilowania czynników związanych z chromatyną, które nie wiążą bezpośrednio DNA i wykazują słabe powinowactwo do chromatyny. Etapy mycia o wysokiej zawartości soli w CUT&Tag mogą usunąć czynniki związane z chromatyną i nie powodować żadnych sygnałów w końcowym wyjściu. Chociaż istnieją udane przypadki, w których CUT&Tag może być używany do profilowania niektórych białek niebędących czynnikami histone/nietranskrypcyjnymi⁹, nadal zalecamy CUT&RUN zamiast CUT&Tag w celu profilowania słabo związanych białek związanych z chromatyną.

Po osiągnięciu przez ssaki wieku dorosłego, ich tkanki mięśni szkieletowych nadal zawierają komórki macierzyste mięśni. Podczas urazu mięśni te komórki macierzyste mogą być aktywowane i ulegać ekspansji i różnicowaniu liczby komórek w celu regeneracji uszkodzonych włókien mięśniowych¹⁰. Te komórki macierzyste są znane jako komórki macierzyste mięśni / satelitarne (MuSC). Po wyizolowaniu MuSC od zwierząt lub aktywacji przez uszkodzenie mięśni, zaczynają się namnażać i stają się mioblastami.

Aby uzyskać MuSCs z trawienia mięśni szkieletowych myszy, często używane są markery powierzchniowe MuSC, takie jak Vcam1 (Cd106), Cd34 i α7-integryna (Itga7) pojedynczo lub w kombinacjach do wzbogacania MuSC podczas sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)¹¹. Wykazano, że Cd31^-/Cd45^-/Sca1^-/Vcam1⁺ jest prawdopodobnie najlepszą kombinacją markerów, aby uzyskać >95% czystych MuSCs¹². FACS może wyizolować czyste MuSC zaraz po strawieniu świeżych mięśni. Jeśli jednak projekt eksperymentalny nie wymaga czystych MuSC bezpośrednio w momencie ich izolacji, wstępne posiewy są bardziej opłacalne niż FACS w celu uzyskania >90% czystych mioblastów (potomstwo MuSC).

MuSCs świeżo wyizolowane od myszy nie namnażają się efektywnie w pożywce F10 Hama uzupełnionej płodową surowicą bydlęcą (FBS). Aby lepiej zwiększyć liczbę komórek MuSC i uzyskać wystarczającą ilość mioblastów, zamiast FBS należy stosować bydlęcą surowicę wzrostu (BGS). Jeśli jednak BGS nie jest dostępny, pełne podłoże F10 Hama (zawierające około 20% FBS) można zmieszać z równą objętością pożywki warunkowej komórek T, aby radykalnie przyspieszyć ekspansję mioblastów¹³. W związku z tym protokół ten będzie również opisywał przygotowanie pożywek MuSC kondycjonowanych pożywkami z komórek T.

Najważniejsze, ten protokół dostarcza kompletnego przykładu przeprowadzania testów H3K4me1 CUT&Tag na mysich mioblastach wyizolowanych z mięśni kończyn tylnych myszy. Należy pamiętać, że protokół ten dotyczy również innych typów komórek oraz znaczników histonów i wariantów histonów, a czytelnicy muszą jedynie zoptymalizować liczbę komórek lub ilości przeciwciał dla swoich przypadków w oparciu o wzbogacenie określonych znaczników histonów lub wariantów, które badają.

Aby można było użyć w CUT&Tag lub CUT&RUN, Tn5 lub MNaza musi być połączona z białkiem A lub białkiem G, aby wytworzyć pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNazę lub pG-MNazę. Wygląda na to, że zarówno białko A, jak i białko G mogą być łączone z tymi enzymami w tym samym czasie, aby wytworzyć pA/G-Tn5 lub pA/G-MNazę. Białko A i białko G wykazują zróżnicowane powinowactwo do IgG różnych gatunków. Dlatego całkowite połączenie białka A i białka G z enzymem może przezwyciężyć ten problem i sprawić, że enzym będzie kompatybilny z przeciwciałami wielu gatunków.

Protokół

Metody przedstawione w tym manuskrypcie są zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratorium w Kantonie. Myszy użyte do wygenerowania reprezentatywnych wyników tego manuskryptu były trzymane i utrzymywane zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Laboratorium w Kantonie.

1. Izolacja Myoblast od mięśni tylnych kończyn myszy (Przykład użycia 1 myszy)

1. Rozcieńczyć lodowaty kwas octowy za pomocą ddH₂O do 0,02 M i złożyć go w autoklawie.
2. Rozcieńczyć kolagen (z ogona szczura) do 0,1 mg/ml 0,02 M kwasem octowym.
3. Dodaj ten roztwór kolagenu do naczyń hodowlanych, aby pokryć dno naczynia w inkubatorze komórkowym o temperaturze 37 °C na noc.
4. Przed użyciem usuń roztwór kolagenu i umyj naczynie dwukrotnie 1x PBS. Roztwór kolagenu może być ponownie użyty 8-10 razy.
5. Poświęć 8-12-tygodniową mysz. (Stare myszy mają słabe plony MuSC i mioblastów.)
6. Odizoluj i umieść wszystkie mięśnie kończyn tylnych myszy w 10-centymetrowym naczyniu.
7. Użyj 1x PBS (z penicyliną/streptomycyną) do płukania mięśni 4 razy. Po każdym płukaniu zawsze przełóż mięśnie na nową płytkę.
8. Po ostatnim płukaniu usuń PBS i zmiel mięśnie nożyczkami.
9. Dodaj 6 ml 1x PBS zawierającego dypazę II (1,1 U/ml) i kolagenazę II (830 U/mL) w celu strawienia mięśni mielonych, a trawienie powinno trwać ~1,5 godziny.
10. Aby przeprowadzić trawienie, przenieś rozdrobnione mięśnie do rurki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C lub bezpośrednio pozostaw rozdrobnione mięśnie w naczyniu i umieść je w inkubatorze komórkowym CO₂ o temperaturze 37 °C.
11. Jeśli używasz inkubatora komórkowego do trawienia, kołysz naczyniem co 15-30 minut, aby dobrze wymieszać trawienie.
    UWAGA: Dyspaza II powinna być najpierw przygotowana jako zapas 11 U/ml z podłożem DMEM (bez surowicy), a kolagenaza II powinna być wykonana jako 10 000 U/ml z 1x PBS.
12. Po zakończeniu trawienia użyj plastikowej pipety o pojemności 10 ml, aby kilkakrotnie przepłukać strawione tkanki w górę iw dół, aby dokładnie zhomogenizować mieszaninę wytrawiania.
13. Dodaj 10 ml pożywki wzrostowej MuSC/Myoblast, aby spowolnić trawienie. Szczegółowe informacje na temat przygotowania pożywek wzrostowych MuSC/Myoblast można znaleźć w sekcji 2.
14. Przepuść mieszaninę przez sitko o średnicy 70 μm. Użyj 1x PBS do przepłukania płytki wytrawiającej i przepuść ten PBS również przez sitko, aby zebrać wszystkie komórki na płytce wytrawiającej.
15. Wirować przy 350 x g przez 10 minut i wyrzucić supernatant w próżni.
16. Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 20 ml 1x PBS i przepuścić komórki przez sitko o średnicy 40 μm.
17. Wirować przy 350 x g przez 5 minut i usunąć supernatant za pomocą próżni.
18. Użyj 20 ml pożywki wzrostowej MuSC/Myoblast, aby ponownie zawiesić komórki i umieścić je na 10-centymetrowej normalnej plastikowej płytce. W tym czasie MuSC nie mogą przyczepiać się do dna płytki i pozostają w większości unoszące się w podłożu.
    UWAGA: Jest to pierwsze wstępne powlekanie na płytach plastikowych.
19. Po 1,5 godziny krótko rozbujaj płytkę i przenieś płyn do dwóch pokrytych kolagenem 10-centymetrowych naczyń, z których każde zawiera 10 ml kultury. Teraz MuSC przyczepią się i będą rosły na płytkach pokrytych kolagenem. Zmień nośnik po 2 dniach. Płytki pokryte kolagenem przygotowuje się jak w krokach 1-4 tego rozdziału.
20. Po kolejnym dniu przeprowadź komórki przez pasż: Usuń pożywkę, umyj komórki raz 1x PBS i trypsynizuj komórki.
21. Użyj pożywki wzrostowej MuSC/Myoblast, aby spłukać komórki z płytek, przenieś komórki na nową plastikową płytkę i inkubuj w inkubatorze komórkowym przez 40 minut.
    UWAGA: Jest to drugie wstępne powlekanie na płytkach z tworzywa sztucznego.
22. Wlej kulturę na nową plastikową płytkę i inkubuj w inkubatorze komórkowym przez kolejne 20 minut.
    UWAGA: Jest to trzecie wstępne powlekanie na płytkach plastikowych.
23. Następnie podziel supernatant na płytce na 8 pokrytych kolagenem 10-centymetrowych szalek, aby przeprowadzić subkulturę komórek. Stosunek przejścia wynosi tutaj 2: 8 (1: 4). Po trzykrotnym wstępnym posiewie opisanym powyżej, mioblasty mogą osiągnąć ponad 90% czystości. Dlatego po tym momencie nie ma potrzeby wstępnego powlekania podczas dalszego przechodzenia mioblastów.

2. Przygotowanie pożywki MuSC/Myoblast (Przykład przygotowania z 5 myszy)

1. Poświęć 5 młodych i zdrowych myszy typu dzikiego, wyizoluj śledziony i raz przepłucz śledziony 1x PBS (z penicyliną/streptomycyną).
2. Użyj nożyczek, aby usunąć ciemne części/plamy na śledzionie, jeśli występują. Wyrzuć śledzionę, jeśli większość z niej stała się.
3. Umieść wszystkie 5 śledziony w sitku o wielkości 40 μm na górze probówki o pojemności 50 ml.
4. Otwórz sterylne opakowanie strzykawki o pojemności 1 ml, wyciągnij tłok i wyrzuć cylinder.
5. W sitku o średnicy 40 μm przytrzymaj gumowy korek i użyj podpórki kciuka tłoka, aby zmielić i rozdzielić tkanki śledziony na pojedyncze komórki. Należy uważać, aby nie dotknąć i nie zanieczyścić podpórki pod kciuk tłoka podczas rozrywania opakowania strzykawki.
6. Podczas mielenia śledziony od czasu do czasu użyj 1x PBS, aby zmyć zdysocjowane komórki śledziony do probówki o pojemności 50 ml pod sitkiem.
7. Po przepłukaniu wszystkich komórek śledziony do probówki o pojemności 50 ml przez sitko, należy odwirować probówkę o stężeniu 500 x g przez 10 minut.
8. Użyj 1 ml 1x buforu do lizy czerwonych krwinek, aby ponownie zawiesić osad. Lizuj czerwone krwinki przez ~ 1 min.
   UWAGA: 10x Bufor do lizy czerwonych krwinek zawiera 155 mM NH₄Cl, 10 mM NaHCO₃ i 1 mM sól disodową EDTA w ddH₂O. Filtrować do sterylizacji i nie autoklawować. Rozcieńczyć z ddH₂O do 1x przed użyciem.
9. Napełnij probówkę o pojemności 50 ml 1x PBS, aby zatrzymać proces lizy czerwonych krwinek.
10. Ponownie przecedzić zawiesinę komórek za pomocą sitka o średnicy 40 μm, a następnie odwirować przy 500 x g przez 10 minut.
11. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 2 ml pełnej pożywki RPMI-1640 (pożywki RPMI-1640 z 10% FBS i penicyliną/streptomycyną) z bardzo delikatnym pipetowaniem.
12. Dodaj więcej pełnych mediów RPMI-1640 do probówki i dobrze wymieszaj. Rozprowadzić zawiesinę komórkową do dziesięciu kolb hodowlanych T75. Ostateczna objętość kultury w każdej kolbie hodowlanej T75 powinna wynosić 20 ml.
13. Dodać 10 μl bulionu Concanavalin-A do każdej kolby hodowlanej T75 i dobrze wymieszać. Konkanawalina-A aktywuje proliferację limfocytów T.
    UWAGA: Zapas konkanawaliny-A wynosi 4 mg/ml i jest przygotowany przez rozpuszczenie konkanawaliny-A w 1x PBS. Sam Concanavalin-A jest tutaj używany i nie należy go mylić z kulkami Concanavalin-A używanymi w późniejszych testach CUT&Tag.
14. Po 48 godzinach uzupełnij każdą kolbę T75 kolejnymi 20 ml pełnej pożywki RPMI-1640, tak aby całkowita objętość wzrosła do 40 ml.
15. Kolejne 24 godziny później zebrać wszystkie kultury do każdej kolby T75 i odwirować przy 600 x g przez 3 minuty.
16. Supernatant jest pożywką warunkową limfocytami T i może być przechowywany w temperaturze od -20 °C do -80 °C przez okres do 2 miesięcy. Wyrzuć granulki komórek śledziony. Przed użyciem należy rozmrozić pożywkę z komórkami T i dalej wysterylizować pożywkę za pomocą filtra 0,22 μm.
17. Aby przygotować pełne podłoże F10 Hama, dodaj 100 ml FBS, 300 μl bulionu bFGF i 6 ml penicyliny/streptomycyny do 500 ml pożywki F10 Hama.
    UWAGA: bulion bFGF wynosi 5 μg/ml i jest przygotowany przez rozpuszczenie bFGF w pożywce F10 szynki.
18. Wymieszaj pełne podłoże F10 szynki z przefiltrowanymi pożywkami warunkowymi z komórek T opisanymi powyżej w stosunku 1:1, aby uzyskać pożywkę wzrostową MuSC / Myoblast.

3. CUT&Tag z mioblastami (Przykład 3 reakcji CUT&Tag)

1. Przygotowanie kluczowych odczynników
   1. Oczyść transpozazę pA/G-Tn5 z hodowli bakteryjnej we własnym zakresie za pomocą opublikowanej metody¹⁴. Enzym ten osiąga swoją funkcjonalną formę tylko do momentu, gdy zostanie zamontowany za pomocą adapterów DNA tworzących bibliotekę. Co najważniejsze, pA/G-Tn5 jest komercyjnie dostępny z wielu źródeł.
   2. Oligonukleotydy do produkcji adapterów przedstawiono w tabeli 1. W szczególności wyżarzanie Oligo-Rev odpowiednio z Oligo-A i Oligo-B, aby odpowiednio uzyskać dwuniciowy adapter-A i adapter-B. Szczegółowe informacje na temat wyżarzania w celu wykonania adapterów można znaleźć gdzie indziej¹⁴.
   3. Inkubować Adapter-A i Adapter-B z transpozazą pA/G-Tn5 w temperaturze pokojowej (RT) przez 2 godziny. Wtedy transpozaza ta przyjmie swoją funkcjonalną formę. W kolejnych sekcjach tego manuskryptu forma funkcyjna pA/G-Tn5 będzie określana jako pA/G-Tn5a.
      UWAGA: Jeśli pA/G-Tn5 został zakupiony zamiast wyprodukowanego we własnym zakresie, upewnij się, że wyjaśniłeś, czy zakupiony element jest zamontowany pA/G-Tn5 za pomocą adapterów (innymi słowy, gotowy do użycia), czy jest to tylko sam enzym pA/G-Tn5. Jeśli jest to tylko enzym, przygotuj dwa opisane powyżej adaptery i zamontuj je na pA/G-Tn5 przed ostatecznym użyciem tego enzymu do CUT&Tag.
   4. Aby zapoznać się z recepturami bufora wiążącego, bufora myjącego, bufora Dig-wash, bufora 300-Dig i bufora tagowania, czytelnicy mogą również zapoznać się z Kaya-Okur et al.¹.
   5. Przygotuj bufor wiążący, który zawiera 20 mM HEPES pH 7,5, 10 mM KCl, 1 mM CaCl₂ i 1 mM MnCl₂.
   6. Przygotuj bufor do mycia, który zawiera 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM spermidyny i 1x koktajl inhibitorów proteazy.
   7. Zrób digitoninę jako skoncentrowany bulion w DMSO, a następnie przygotuj bufor do płukania Dig-wash, dodając digitoninę do buforu Wash do stężenia 0,5 mg / ml.
   8. Przygotować bufor przeciwciał, dodając EDTA do stężenia 2 mM i BSA do stężenia 0,1%, do buforu Dig-wash.
   9. Przygotuj bufor 300-Dig zawierający 20 mM HEPES pH 7,5, 300 mM NaCl, 0,5 mM spermidyny, 1x koktajl inhibitorów proteazy i 0,1-0,5 mg / ml digitoniny.
   10. Przygotuj bufor do znakowania, uzupełniając bufor 300-Dig o 10 mM MgCl₂. MgCl₂ może aktywować aktywność enzymatyczną pA / G-Tn5a.
       UWAGA: Informacje dotyczące innych materiałów znajdują się w pliku Tabela materiałów.
2. Aktywacja kulki Concanavalin-A
   1. Wymieszać 30 μl kulek Concanavalin-A (10 μl na każdą reakcję) z 300 μl buforu wiążącego w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odwróć kilka razy, aby dobrze wymieszać. Umieść rurkę na stojaku magnetycznym. Gdy ciecz będzie klarowna, usuń supernatant.
   2. Wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego, dodaj 300 μl buforu wiążącego do probówki, dobrze wymieszaj i równomiernie podziel na 3 probówki z paskiem 8-PCR. Oznacz każdą probówkę z jedną reakcją CUT&Tag.
   3. Umieść pasek probówki 8-PCR na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż płyn będzie klarowny.
   4. Odessać supernatant i wyjąć probówki ze stojaka magnetycznego. Dodaj 10 μl buforu wiążącego do każdej probówki i dobrze wymieszaj. Umieść przygotowane koraliki na lodzie lub w temperaturze 4 °C, aż komórki będą gotowe do kontynuowania.
3. Wiązanie komórek na koralikach Concanavalin-A
   1. Trypsynizuj hodowane mioblasty myszy z płytek, umyj komórki raz za pomocą RT 1x PBS i ostatecznie ponownie zawieś komórki w buforze Wash w RT. Unikaj nadmiernej trypsynizacji, ponieważ może to zagrozić powinowactwu błony komórkowej do kulek konkanawaliny-A.
   2. Dostosuj gęstość komórek do około 7 x 10⁵ komórek/ml w buforze Wash tak, aby 100 μl zawiesiny komórek zawierało około 70 000 komórek, co wystarcza na jedną reakcję CUT&Tag.
   3. Odpipetować 100 μl zawiesiny komórek do każdej probówki z paskiem probówki 8-PCR, która zawiera już 10 μl przygotowanych kulek Concanavalin-A. Dobrze wymieszać i inkubować na wytrząsarce typu "ruch huśtawki" przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   4. Umieść pasek w probówce 8-PCR na stojaku magnetycznym. Poczekaj, aż się wyczyści i usuń supernatant.
   5. Aby ocenić, czy kulki Concanavalin-A skutecznie sekwestrowały komórki, należy sprawdzić supernatant pod mikroskopem, aby zobaczyć, ile komórek pozostało w supernatancie. Po etapie wiązania kulki Concanavalin-A w supernatancie należy zaobserwować bardzo mało komórek lub nie zaobserwować ich wcale.
4. Inkubacja komórek z przeciwciałem pierwszorzędowym
   1. Dla każdej próbki rozcieńczyć 1 μl przeciwciała H3K4me1 w 50 μl buforu przeciwciał i dodać rozcieńczone przeciwciało do każdej probówki z próbką. Dobrze wymieszaj kulki z rozcieńczonym przeciwciałem, kilkakrotnie odwracając probówki. Umieścić próbki na wytrząsarce "ruch huśtawki" w celu inkubacji w temperaturze 4 °C przez noc.
      UWAGA: Jak wspomniał dr Steven Henikoff¹, nie było konieczne stosowanie negatywnej kontroli IgG we wszystkich testach CUT&Tag. W porównaniu z ChIP, testy CUT&Tag mają znacznie niższy sygnał tła lub nie mają go wcale. W związku z tym użycie IgG do przeprowadzenia testu CUT&Tag "kontroli ujemnej" nie wprowadza żadnych użytecznych informacji. Z kolei użycie przeciwciała zwalidowanego przez CUT&Tag do przeprowadzenia kontroli pozytywnej jest ważne dla oceny, czy test CUT&Tag zadziałał.
5. Inkubacja komórek z przeciwciałem drugorzędowym
   1. Następnego dnia rano umieść próbki na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż próbki się wyczyszczą.
   2. Usuń supernatant, który jest przeciwciałem pierwszorzędowym. Nie ma potrzeby mycia koralików; Bezpośrednio dodać 50 μl rozcieńczonego (1:100) przeciwciała drugorzędowego do każdej probówki z próbką.
      UWAGA: Przeciwciało drugorzędowe rozcieńcza się buforem Dig-wash w stosunku 1:100. Aby umożliwić bardziej efektywne rozpoznawanie pA/G-Tn5a, przeciwciała drugorzędowe nie powinny być sprzężone z żadnymi cząsteczkami lub grupami, takimi jak HRP, biotyna lub fluorofory.
   3. Dobrze wymieszać i inkubować na wytrząsarce "ruch huśtawki" w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
   4. Umieść próbki z powrotem na stojaku magnetycznym, poczekaj, aż próbki się oczyszczą i wyrzuć supernatant.
   5. Dodać 200 μl buforu Dig-wash do każdej probówki i kilkakrotnie odwrócić, aby zmyć nadmiar przeciwciał.
   6. Umieść go z powrotem na stojaku magnetycznym, poczekaj, aż się wyczyści i usuń supernatant. Powtórz to płukanie jeszcze dwa razy, aby całkowicie usunąć nadmiar niezwiązanych przeciwciał.
6. Inkubacja komórek z pA/G-Tn5a
   1. Po ostatnim umyciu umieść próbki na stojaku magnetycznym, poczekaj, aż próbki się wyklarują i usuń cały płyn z probówki. Do każdej probówki z próbką dodać 100 μl buforu 300-Dig zawierającego pA/G-Tn5a w stężeniu 0,04 μM. Dobrze wymieszać i inkubować na huśtawce przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   2. Umieść na stojaku magnetycznym. Poczekaj, aż próbki się oczyszczą i usuń supernatant.
   3. Dodać 200 μl buforu 300-Dig do każdej próbki, dobrze wymieszać i umieścić na wytrząsarce, aby umyć próbkę przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
   4. Umieść na stojaku magnetycznym. Poczekaj, aż próbki się oczyszczą i usuń supernatant. Powtórz to pranie jeszcze dwa razy, aby usunąć nadmierne pA/G-Tn5a i obniżyć tło.
7. Podział i znakowanie genomów
   1. Po ostatnim praniu umieść próbki na stojaku magnetycznym i dokładnie odpipetuj płyn z probówki. Do każdej próbki dodać 50 μl buforu do znakowania. Dobrze wymieszać i inkubować w maszynie do PCR w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Nie używaj funkcji podgrzewania pokrywki w maszynie do PCR.
      UWAGA: Opcjonalnie, ze względu na zużycie materiału podczas następnego etapu oczyszczania genomowego DNA, niektóre impulsowe DNA mogą zostać dodane do bufora Tagmentation, tak aby skok pojawił się w końcowych wynikach sekwencjonowania i mógł być wykorzystany do normalizacji danych. Metodę przygotowania i wykorzystania kolczastego DNA można znaleźć gdzie indziej¹⁴.
8. Całkowite oczyszczenie genomowego DNA
   1. Po znakowaniu dodać kolejne 150 μl buforu Tagmentation dla każdej próbki. Całkowita objętość wynosi teraz 200 μL.
   2. Następnie do każdej próbki dodaj 10 μl 0,5 M EDTA, 3 μl 10% SDS i 2,5 μl 20 mg/ml Proteinazy K. Vortex, aby dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 55^°C przez 2 godziny.
   3. Odpipetować każdą próbkę do 200 μl fenolu/chloroformu w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować przez 10 s. Wirować przy 18 000 x g przez 5 minut. Przenieść górną warstwę do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
   4. Dodać 200 μl chloroformu do każdej probówki i wirować przez 10 s. Wirować przy 18 000 x g przez 5 minut.
   5. Zassać górną warstwę do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Następnie do każdej próbki dodać 550 μl 100% etanolu, aby wytrącić DNA w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę. Aby lepiej uwidocznić osad DNA, dodaj 1 μl glikogenu o stężeniu 20 mg/ml.
   6. Wirować z maksymalną prędkością (>18 000 x g) przez 15 minut, aby uzyskać granulat DNA.
   7. Ostrożnie odlać sklarant nad osadem, przemyć osad glikogenu/DNA 75% etanolem i ponownie odwirować z maksymalną prędkością przez 5 minut.
   8. Usunąć 75% etanolu i ponownie zawiesić osad glikogenu/DNA z 21 μl ddH₂O.
9. Przygotowanie i sekwencjonowanie bibliotek
   1. Skonfiguruj PCR przygotowujący bibliotekę. Aby zindeksować próbki, które mają być sekwencjonowane razem, należy użyć innego startera N7XX Illumina dla każdej próbki i uniwersalnego startera N5XX Illumina. W przypadku indeksowania więcej niż 12 próbek wymagane będą również różne startery N5XX Illumina. Illumina dostarcza dwanaście starterów N7XX i osiem starterów N5XX, więc całkowita liczba kombinacji N7XX z N5XX wynosi 12 x 8 = 96. Układ reakcji PCR przedstawiono w Tabeli 2.
   2. Z grubsza określ numer cyklu PCR w PCR przygotowującym bibliotekę na podstawie liczby komórek użytej w teście CUT&Tag. Zwykle w przypadku testu CUT&Tag wykorzystującego 50 000-100 000 komórek wystarczy 9-12 cykli, a liczba komórek w zakresie 10 000-50 000 może wymagać do 14 cykli. Program PCR jest przedstawiony w tabeli 3.
      UWAGA: W przypadku większości testów CUT&Tag, jeśli przeciwciało działało prawidłowo, liczba cyklu PCR między 9 a 14 powinna zawsze generować przydatną bibliotekę do sekwencjonowania. Dobra biblioteka to zwykle 10-50 ng / μL (oznaczone testem kubitowym) w stężeniu i 20-30 μl w objętości. Wręcz przeciwnie, jeśli przeciwciało nie działało wydajnie i konkretnie, to samo zwiększenie liczby cykli nie może uratować eksperymentów. Nadmierna liczba cykli w ogóle nie wpływa korzystnie na wyniki, a zamiast tego wprowadza więcej duplikatów PCR, co później skomplikuje analizę danych.
   3. Użyj dostępnych na rynku kulek do oczyszczania/wyboru rozmiaru DNA, aby oczyścić DNA biblioteki i wybrać DNA o pożądanych rozmiarach.
   4. Rozcieńczyć małą porcję oczyszczonej biblioteki wodą i użyć jej do qPCR ze starterami specyficznymi dla locus w celu sprawdzenia wzbogaceń, jak w eksperymentach ChIP-qPCR. Przed sekwencjonowaniem biblioteki może to pomóc w ustaleniu, czy CUT&Tag zadziałał.
   5. Wykonaj sekwencjonowanie i analizę danych zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Zestawy CUT&Tag są dostępne na rynku w kilku firmach, a jeden z przykładów można znaleźć w pliku Table of Materials.

Wyniki

Zanim zwiążesz komórki z koralikami Concanavalin-A, sprawdź zawiesinę komórek pod mikroskopem. W związku z tym, po inkubacji komórek z kulkami Concanavalin-A, umieść probówki z próbkami na stojaku magnetycznym, a supernatant należy ponownie obserwować pod mikroskopem. Ma to na celu ocenę, jak skutecznie komórki zostały wychwycone przez kulki Concanavalin-A. Bufor do płukania zawierający 7 x 10⁵ komórek/ml powinien wyglądać następująco: Rysunek 1A pod mikroskopem. Natomiast Rysunek 1B pokazuje supernatant po związaniu koralików Concanavalin-A, gdzie koraliki usunęły wszystkie komórki. Nie ma sensu przechodzić do kolejnych etapów CUT&Tag, jeśli kulki Concanavalin-A nawet nie wychwytywały skutecznie komórek. Bufor do przemywania nie powinien zawierać żadnej zawartości surowicy ani EDTA/EGTA, ponieważ mogą one znieść wiązanie błony komórkowej z kulkami konkanawaliny-A. Albumina surowicy bydlęcej nie zakłóca jednak wiązania konkanawaliny-A z komórkami.

Po stworzeniu bibliotek CUT&Tag metodą PCR, mała porcja biblioteki (3-4 μL) może być poddana elektroforezie na 1,2-1,5% żelu agarozowym, aby sprawdzić, czy biblioteka jest dobra. Rysunek 2 pokazuje przykład udanych bibliotek H3K4me1 CUT&Tag, które stworzyliśmy. W znaku histonowym lub wariancie histonu CUT&Tag większość rozszczepionych jednostek to najwyraźniej mononukleosomy, chociaż dwa nukleosomy można również wyciąć razem. Trzy nukleosomy wycięte i oznaczone razem byłyby bardzo rzadkie. Dlatego w elektroforezie bibliotek CUT&Tag ze znakami histonowymi należy obserwować macierz nukleosomów zawierającą mononukleosomy, dinukleosomy i bardzo mało trinukleosomów. Nukleosomy zawierają 147 pz DNA, ale z adapterami sekwencjonowania dodanymi przez transpozazę Tn5 i bibliotekę PCR, całkowity rozmiar mononukleosomu CUT&Tagged powinien wynosić 300 pz, jak pokazano w Rysunek 2.

Zanim wydasz pieniądze na wysokoprzepustowe sekwencjonowanie bibliotek CUT&Tag, inną metodą kontroli jakości jest przeprowadzenie qPCR z użyciem starterów specyficznych dla locus. Jest to równoznaczne z wykonaniem ChIP-qPCR. Co więcej, startery specyficzne dla locus w CUT&Tag qPCR zostały zaprojektowane w oparciu o te same zasady, co startery ChIP-qPCR. Rysunek 3 pokazuje amplifikację qPCR w różnych miejscach na locus genu Myod1. Myod1 koduje główny czynnik transkrypcyjny, MyoD, który określa linię mięśni szkieletowych podczas miogenezy¹⁵. Jak pokazano w Rysunek 3, H3K4me1 jest wysoce wzbogacony w wzmacniacz rdzenia (CER) i dystalny region regulatorowy (DRR) locus Myod1. CER i DRR są bardzo dobrze znanymi regionami wzmacniającymi dla Myod1¹⁶. Jest to zgodne z dobrze udokumentowanym fenotypem, że H3K4me1 konkretnie oznacza zamówione wzmacniacze¹⁷. Co więcej, Rysunek 3 pokazuje, że poziom H3K4me1 jest bardzo niski w proksymalnym regionie regulatorowym (PRR), ponieważ nukleosomy w regionie proksymalnym aktywnych promotorów są zwykle modyfikowane za pomocą H3K4me3¹⁸ zamiast H3K4me1. Wszystkie pary starterów dla tych ocenianych loci są wcześniej opublikowane^19,20, a sekwencje można znaleźć w tabeli 4. Zwykle, po kontroli jakości za pomocą bibliotecznej elektroforezy DNA i qPCR na określonych loci, naukowcy będą pewni, że przystąpią do sekwencjonowania.

Rysunek 1: Mioblasty ponownie zawieszone w buforze Wash. Zdjęcia mikroskopowe wykonane (A) przed i (B) po związaniu koralików Concanavalin-A. Panel B pokazuje, że po inkubacji kulek Concanavalin-A w zawiesinie nie pozostały prawie żadne komórki, co wskazuje, że komórki zostały skutecznie wychwycone przez kulki. Małe cząstki w panelu B mogą być nadmiernymi kulkami konkanawaliny-A. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Elektroforeza bibliotek CUT&Tag. Przeprowadzono trzy niezależne testy H3K4me1 CUT&Tag, a każdy z nich został przekształcony w bibliotekę sekwencjonowania przy użyciu starterów Illumina i PCR. Każdy H3K4me1 CUT&Tag wykorzystywał 70 000 mysich mioblastów. Biblioteki zawierają głównie znakowane mononukleosomy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Amplifikacja qPCR różnych lokalizacji w locus genu Myod1. qPCR pokazuje, że w mysich mioblastach znacznik H3K4me1 jest wysoce wzbogacony w regionach wzmacniających genu Myod1, który jest zgodny z opublikowanymi conclusions. CER, a DRR są opublikowanymi wzmacniaczami Myod1, które znajdują się przed promotorem Myod1. Należy pamiętać, że PRR nie ma akumulacji H3K4me1, co jest również zgodne z faktem, że aktywne promotory są głównie oznaczone H3K4me3. Wzbogacenia obliczono przez normalizację do wzbogacenia H3K4me1 na "pustyni genowej" próbki "Powtórz 1". Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

powiedział:

nazwa	Sekwencje (5'-3'):
Oligo-Rev	phos-CTGTCTCTTATACACATCT
Oligo-A	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG
Oligo-B	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG

Tabela 1: Sekwencje oligologiczne do montażu Adaptera-A i Adaptera-B na transpozazie pA/G-Tn5.

ułamek	głośność
Oczyszczone genomowe DNA po reakcji CUT&Tag	21 μL
Podkład N5XX (10 μM)	2 μl
Podkład N7XX (10 μM)	2 μl
NEBNext High-Fidelity 2× PCR Master Mix	25 μL
	Razem 50 μL

Tabela 2: Konfiguracja PCR do przygotowania biblioteki CUT&Tag przy użyciu starterów indeksujących Illumina. Jeśli używasz komercyjnego zestawu CUT&Tag, który zawiera odczynniki biblioteczne do PCR, takie jak mieszanina polimerazy DNA, postępuj zgodnie z instrukcją tego zestawu, aby skonfigurować bibliotekę PCR.

krok	temperatura	Godzina	Numer cyklu
1	72 oC	Czas trwania: 3 min	1
cyfra arabska	95 oC	Czas trwania: 3 min	1
3	98 oC	10 sekund	9 do 14
4	60 oC	5 s, a następnie przejdź do kroku 3
5	72 oC	1 min	1
6	4 oC	trzymać	N/a

Tabela 3: Program PCR do przygotowania biblioteki CUT&Tag przy użyciu starterów indeksujących Illumina.

lokalizacja	Sekwencje podkładowe (5'-3')
CER	Dla: GGG CAT TTA TGG GTC TTC CT
	Wersja: CTC ATG CCT GGT GTT TAG GG
-15 000	Dla: TGC CCA GAG CCT AGA ATC AT
	Wersja: TCA, TGC, ATC, CTT, GCT, GGA, TA
-7,000	Dla: GGC ATG GGA GGT TTA TAG CA
	Wersja: ATG CCA CTA TGC AAT CCA CA
DRR	Dla: TCA GGA CCA GGA CCA TGT CT
	Obr.: CTG GAC CTG TGG CCT CTT AC
PRR	Dla: GAG TAG ACA CTG GAG AGG CTT GG
	Wersja: GAA, AGC, AGT, GTC, CTG, GG
CDS1	Dla: KOT CTG ACA CTG GAG TCG CTT TG
	Wersja: CAA, GCA, ACA, CTC, CTT, GTC, ATC, AC
CDS2	Dla: GTG AGC CTT GCA CAC CAC CTA AGC C
	Wersja: GTT GCA CTA CAC AGC ATG CCT G
IgH	Dla: ACC CTG GGA AGA CCA TAC TTA ATC T
	Wersja: CCA TCC ACA CTC GTG CCT TA
Pustynia genowa	Dla: TCC TCC CCA TCT GTG TCA TC
	Wersja: GGA TCC ATC ACC ATC AAT AAC C

Tabela 4: Startery specyficzne dla locus do testowania wzbogacenia H3K4me1 w różnych miejscach genu Myod1.

Dyskusja

Określona liczba komórek wymagana w określonej reakcji CUT&Tag całkowicie zależy od wzbogacenia znaków/wariantów histonów lub białek wiążących chromatynę, które mają być badane. Zwykle w przypadku bardzo wzbogaconych znaczników histonowych, takich jak H3K4me1, H3K4me3 i H3K27ac itp., 25 000-50 000 mioblastów jest wystarczające dla jednej reakcji CUT&Tag. Jednak niektóre rzadkie białka wiążące chromatynę mogą wymagać nawet 250 000 komórek. Liczba komórek używana w testach CUT&Tag jest krytyczna, która, jeśli nie jest dobrze obsługiwana, zwykle powoduje niepowodzenie testu. Użycie nadmiernej liczby komórek w reakcji CUT&Tag jest szkodliwe, zwłaszcza w przypadku badania bardzo wzbogaconych znaczników histonowych. Rozpoczęcie od zbyt wielu komórek oznacza niewystarczającą ilość przeciwciał przydzielonych do każdej komórki. CUT&Tag działa nie tylko w przypadku bardzo małej liczby komórek, ale może być stosowany na poziomie^{pojedynczej komórki 1}.

Przede wszystkim zastosowanie wiarygodnego i zwalidowanego przeciwciała o wysokim powinowactwie i swoistości jest zawsze kluczem do udanego testu CUT&Tag. Podobnie jak testy ChIP, immunoprecypitacji (IP) i IF, CUT&Tag wymaga również rodzaju przeciwciał, które mogą rozpoznać naturalnie sfałdowane antygeny¹. W przeciwieństwie do tego, przeciwciała, które rozpoznają tylko zrelaksowane peptydy w Western blot, powinny być bezwzględnie unikane w CUT&Tag.

Jeśli optymalizacja liczby komórek lub użycie zwalidowanego immunofluorescencyjnie lub dobrze cytowanego przeciwciała nadal nie może rozwiązać problemu słabego sygnału w teście CUT&Tag, sprawdź, czy białko będące przedmiotem zainteresowania jest białkiem związanym z chromatyną, które słabo wiąże się lub nawet nie wiąże się bezpośrednio z DNA. W takim przypadku, jak wspomniano wcześniej, przełącz się na używanie CUT&RUN zamiast CUT&Tag. Alternatywnie, lekka fiksacja, taka jak 5 minut w 0,5% paraformaldehydzie (a następnie 10 minut hartowanie w 0,1 M glicynie), może być metodą wartą przetestowania. Ponieważ jednak nigdy nie praktykowaliśmy utrwalania w żadnych testach CUT&Tag, ani nawet nie natknęliśmy się na konieczność utrwalania komórek przed wykonaniem CUT&Tag, nie możemy udzielić dalszych uwag na temat sieciowania.

Rozumiemy, że niektóre wersje protokołów CUT&Tag mogą twierdzić, że zarówno RT (2 godziny), jak i 4 °C (przez noc) dla etapu inkubacji przeciwciał pierwotnych mogą przynieść przyzwoite wyniki²¹. Zalecamy jednak stosowanie 4 °C (przez noc), a nie RT przez 2 godziny. Z drugiej strony nie zaleca się również przedłużania czasu inkubacji dłużej niż jedną noc.

Jeśli chodzi o czułość, kontrolę tła i stopień złożoności dla badaczy, CUT&Tag jest lepszy od testów ChIP. Jeśli trzeba mieć pewne wady dla CUT&Tag w porównaniu z ChIP, to jedyną z nich jest to, że protokoły CUT&Tag nie zawierają wewnętrznej metody normalizacji, takiej jak użycie "Input" w teście ChIP¹. W związku z tym, porównując wysokości pików między próbkami za pomocą CUT&Tag, badacze muszą na początek wyrównać liczbę komórek między próbkami. Niezwykle ważne jest również uwzględnienie replik technicznych.

Protokół ten przedstawia pełne szczegóły wykonywania CUT&Tag w mysich mioblastach, dostarczając udanego przykładu H3K4me1 CUT&Tag w tym typie komórek. Opisana tutaj metoda może być bezpośrednio zastosowana do świeżo wyizolowanych MuSC bez żadnych modyfikacji. Co więcej, eksperymenty CUT&Tag dotyczące znaczników histonowych, wariantów histonów lub czynników transkrypcyjnych w innych typach komórek mogą być również przeprowadzane zgodnie z tym protokołem. W przypadku miotub lub włókien mięśniowych jądra można najpierw wyizolować, a następnie przeprowadzić CUT&Tag na jądrach mięśniowych. W ten sposób można traktować jądra w taki sam sposób, w jaki traktuje się komórki w tym protokole CUT&Tag. Miorurki i włókna mięśniowe są komórkami wielojądrowymi i nie testowaliśmy, czy miorurki lub włókna mięśniowe mogą być bezpośrednio związane z kulkami Concanavalin-A, chociaż może to być wykonalne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
bFGF	R& D Systems	233-FB-025
Kolagen	Corning	354236
Kolagenaza II	Worthington	LS004177
Concanavalin-A	Sigma-Aldrich	C5275
Koraliki Concanavalin-A	Bangs	Laboratories BP531
Digitonina	Sigma-Aldrich	300410
Dispase II	Thermo Fisher Scientific	17105041
Płodowa surowica bydlęca	Przeciwciało Hyclone	SH30396.03
H3K4me1	abcam	ab8895
Szynka F10 media	Thermo Fisher Scientific	11550043
Hiperaktywny uniwersalny CUT& Zestaw do oznaczania tagów dla Illumina	Vazyme	TD903	Ten zestaw został przez nas przetestowany pod kątem prawidłowego działania
Stojak magnetyczny na probówki EP 1,5 ml	Qualityard	QYM06
Stojak magnetyczny na paski probówek 8-PCR	Anosun Magnetic	CLJ16/21-021
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	NEB	M0541L	Do tworzenia bibliotek Reakcja PCR
pA-Tn5	Vazyme	S603-01	Przed użyciem należy go zamontować za pomocą adapterów
Koktajl inhibitorów proteazy	Sigma-Aldrich	5056489001
Proteinaza K	Beyotime	ST535-100mg
RPMI-1640 Media	Thermo Fisher Scientific	C11875500BT
Przeciwciało wtórne (świnka morska anty-królicza IgG)	Przeciwciała-online	ABIN101961
Spermidyna	Sigma-Aldrich	S2626
TruePrep Index Kit V2 dla Illumina	Vazyme	TD202	Ten zestaw zawiera podkłady Illumina N7XX i N5XX
Czyste koraliki VAHTS DNA	Vazyme	N411	Może zastąpić koraliki Ampure XP. Może oczyszczać CUT& Biblioteki znaczników i wybieranie fragmentów DNA według rozmiaru