Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie testu rozszczepienia pod tarczami i znakowania (CUT&Tag) w badaniach mioblastów myszy

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66066

⸱

1 marca 2024

 ,  , 
1Guangzhou Laboratory, 2The Key Laboratory of Biological Targeting Diagnosis, Therapy and Rehabilitation of Guangdong Higher Education Institutes, The Fifth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

Badacze nowi w dziedzinie epigenetyki uznają CUT&Tag za znacznie łatwiejszą alternatywę dla testów ChIP. Projekt CUT&Tag przyniósł ogromne korzyści badaniom epigenetycznym na rzadkich i pierwotnych populacjach komórek, uzyskując wysokiej jakości dane z bardzo niewielu komórek. Protokół ten opisuje wykonywanie testów H3K4me1 CUT&Tag na mysich mioblastach wyizolowanych z mięśni kończyn tylnych myszy.

Streszczenie

Ten dokument o protokole ma na celu dostarczenie nowym badaczom pełnych szczegółów korzystania z Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) do profilowania lokalizacji genomowych czynników wiążących chromatynę, znaczników histonów i wariantów histonów. Protokoły CUT&Tag bardzo dobrze sprawdzają się w przypadku mysich mioblastów i świeżo wyizolowanych komórek macierzystych mięśni (MuSC). Można je łatwo zastosować do wielu innych typów komórek, o ile komórki mogą być unieruchomione przez kulki Concanavalin-A. W porównaniu z CUT&Tag, testy immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) są czasochłonnymi eksperymentami. Testy ChIP wymagają wstępnej obróbki chromatyny, zanim materiał chromatyczny będzie mógł być użyty do immunoprecypitacji. W sieciowaniu ChIP (X-ChIP) wstępna obróbka chromatyny obejmuje sieciowanie i sonikację w celu fragmentacji chromatyny. W przypadku natywnego ChIP (N-ChIP) rozdrobnione chromatyny są zwykle osiągane przez trawienie nukleazy mikrokokowej (MNazy). Zarówno sonikacja, jak i trawienie MNazy wprowadzają pewne odchylenia do eksperymentów ChIP. Testy CUT&Tag mogą być zakończone w mniejszej liczbie kroków i wymagają znacznie mniejszej liczby komórek w porównaniu z ChIP, ale dostarczają bardziej bezstronnych informacji na temat czynników transkrypcyjnych lub znaczników histonowych w różnych lokalizacjach genomu. CUT&Tag może pracować z zaledwie 5 000 komórek. Ze względu na wyższą czułość i niższy sygnał tła niż w przypadku ChIP, naukowcy mogą spodziewać się uzyskania wiarygodnych danych szczytowych z zaledwie kilku milionów odczytów po sekwencjonowaniu.

Wprowadzenie

Test CUT&Tag został wynaleziony, aby zrekompensować niektóre jawne wady ChIPs1. Dwie główne wady ChIP to: 1) stronniczość wynikająca z fragmentacji chromatyny oraz 2) niekompetencja do pracy z niską liczbą komórek. Testy X-ChIP opierają się na sonikacji lub trawieniu MNazy w celu uzyskania fragmentów chromatyny, podczas gdy N-ChIP najczęściej wykorzystuje trawienie MNazy w celu uzyskania nukleosomów. Sonikacja wykazuje skłonność do zrelaksowanych lokalizacji chromatyny, takich jak regiony promotorowe2, i najwyraźniej trawienie MNazy działa również wydajniej na rozluźnione włókna chromatyny. Co więcej, niektórzy stwierdzili, że trawienie MNazy wykazuje również stronniczość zależną od sekwencji DNA3. W związku z tym, na etapie przygotowania danych wejściowych testów ChIP, niemożliwe jest uzyskanie fragmentów chromatyny ze wszystkich rodzajów lokalizacji genomowych w sposób idealnie losowy. Co więcej, testy ChIP zwykle generują wyższe sygnały tła w porównaniu do CUT&Tag i wymagają ponad 10 razy więcej odczytów niż CUT&Tag, aby zaakcentować, gdzie znajdują się szczyty1,4,5. To wyjaśnia, dlaczego eksperymenty ChIP muszą zaczynać się od znacznie większej liczby komórek niż CUT&Tag. Nie stanowi to problemu podczas badania linii komórkowych, ponieważ mogą one być powtarzalnie pasażowane, aby osiągnąć bardzo wysoką liczbę komórek. Jednak test ChIP zdecydowanie nie jest silnym narzędziem epigenetycznym do badania rzadkich lub cennych populacji komórek pierwotnych, chociaż komórki pierwotne mają oczywiście bardziej praktyczne i medyczne implikacje.

Podczas gdy długa i skomplikowana procedura ChIP zniechęca niektórych badaczy do nauki lub korzystania z tej techniki, ludzie czują się bardziej komfortowo z łatwiejszymi testami, takimi jak immunocytochemia (ICC) lub immunofluorescencja (IF). Test CUT&Tag zasadniczo przypomina proces eksperymentów ICC i IF, ale odbywa się tylko w probówce. CUT&Tag nie potrzebuje na początku rozdrobnionej chromatyny, a zamiast tego genom musi być nienaruszony, aby związać przeciwciała1. W pierwszym dniu eksperymentu ChIP badacze zwykle spędzają do 4 godzin na przygotowaniu pofragmentowanych chromatyn z jąder za pomocą sonikacji lub trawienia MNazy, zanim krótkie fragmenty chromatyny będą mogły zostać zmieszane z kulkami przeciwciała4,5. W przeciwieństwie do tego, pierwszy dzień pracy procedury CUT&Tag polega po prostu na unieruchomieniu komórek za pomocą kulek Concanavalin-A, a następnie dodaniu przeciwciała pierwotnego do kulek komórkowych. Wymaga to tylko ~40 min1.

Warto wspomnieć, że Cięcie pod Cele i Uwalnianie za pomocą Nukleazy (CUT&RUN) jest ważną alternatywą dla CUT&Tag. CUT&RUN powstał w oparciu o podobny mechanizm działania jak CUT&Tag. W CUT&Tag przeciwciała kierują transpozazę pA/G-Tn5 do wszystkich miejsc, w których enzym wycina fragment chromatyny, a w międzyczasie znakuje go adapterami tworzącymi bibliotekę, podczas gdy w CUT&RUN rolę pA/G-Tn5 pełni pA/G-MNaza, która wykonuje tylko część tnącą zadania6. W związku z tym, w porównaniu do CUT&Tag, CUT&RUN wymaga dodatkowego etapu, którym jest przyklejenie adapterów bibliotecznych do fragmentaryzowanych fragmentów DNA pA/G-MNase7,8. Ze względu na duże podobieństwa między CUT&Tag i CUT&RUN, badacze zaznajomieni z CUT&Tag z łatwością przystosują się do biegłego wykonywania CUT&RUN. Należy jednak zauważyć, że istnieją pewne drobne różnice między CUT&Tag a CUT&RUN. Protokoły CUT&RUN zwykle wykorzystują fizyczne stężenie soli (~150 mM) na etapach mycia, podczas gdy w CUT&Tag bufor myjący 300-Dig ma wysoką zawartość soli. Dlatego CUT&Tag jest dobry w kontrolowaniu tła podczas profilowania znaczników/wariantów histonów lub czynników transkrypcyjnych, ponieważ białka te bezpośrednio i silnie wiążą DNA1. CUT&Tag może napotkać problemy podczas profilowania czynników związanych z chromatyną, które nie wiążą bezpośrednio DNA i wykazują słabe powinowactwo do chromatyny. Etapy mycia o wysokiej zawartości soli w CUT&Tag mogą usunąć czynniki związane z chromatyną i nie powodować żadnych sygnałów w końcowym wyjściu. Chociaż istnieją udane przypadki, w których CUT&Tag może być używany do profilowania niektórych białek niebędących czynnikami histone/nietranskrypcyjnymi9, nadal zalecamy CUT&RUN zamiast CUT&Tag w celu profilowania słabo związanych białek związanych z chromatyną.

Po osiągnięciu przez ssaki wieku dorosłego, ich tkanki mięśni szkieletowych nadal zawierają komórki macierzyste mięśni. Podczas urazu mięśni te komórki macierzyste mogą być aktywowane i ulegać ekspansji i różnicowaniu liczby komórek w celu regeneracji uszkodzonych włókien mięśniowych10. Te komórki macierzyste są znane jako komórki macierzyste mięśni / satelitarne (MuSC). Po wyizolowaniu MuSC od zwierząt lub aktywacji przez uszkodzenie mięśni, zaczynają się namnażać i stają się mioblastami.

Aby uzyskać MuSCs z trawienia mięśni szkieletowych myszy, często używane są markery powierzchniowe MuSC, takie jak Vcam1 (Cd106), Cd34 i α7-integryna (Itga7) pojedynczo lub w kombinacjach do wzbogacania MuSC podczas sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)11. Wykazano, że Cd31-/Cd45-/Sca1-/Vcam1+ jest prawdopodobnie najlepszą kombinacją markerów, aby uzyskać >95% czystych MuSCs12. FACS może wyizolować czyste MuSC zaraz po strawieniu świeżych mięśni. Jeśli jednak projekt eksperymentalny nie wymaga czystych MuSC bezpośrednio w momencie ich izolacji, wstępne posiewy są bardziej opłacalne niż FACS w celu uzyskania >90% czystych mioblastów (potomstwo MuSC).

MuSCs świeżo wyizolowane od myszy nie namnażają się efektywnie w pożywce F10 Hama uzupełnionej płodową surowicą bydlęcą (FBS). Aby lepiej zwiększyć liczbę komórek MuSC i uzyskać wystarczającą ilość mioblastów, zamiast FBS należy stosować bydlęcą surowicę wzrostu (BGS). Jeśli jednak BGS nie jest dostępny, pełne podłoże F10 Hama (zawierające około 20% FBS) można zmieszać z równą objętością pożywki warunkowej komórek T, aby radykalnie przyspieszyć ekspansję mioblastów13. W związku z tym protokół ten będzie również opisywał przygotowanie pożywek MuSC kondycjonowanych pożywkami z komórek T.

Najważniejsze, ten protokół dostarcza kompletnego przykładu przeprowadzania testów H3K4me1 CUT&Tag na mysich mioblastach wyizolowanych z mięśni kończyn tylnych myszy. Należy pamiętać, że protokół ten dotyczy również innych typów komórek oraz znaczników histonów i wariantów histonów, a czytelnicy muszą jedynie zoptymalizować liczbę komórek lub ilości przeciwciał dla swoich przypadków w oparciu o wzbogacenie określonych znaczników histonów lub wariantów, które badają.

Aby można było użyć w CUT&Tag lub CUT&RUN, Tn5 lub MNaza musi być połączona z białkiem A lub białkiem G, aby wytworzyć pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNazę lub pG-MNazę. Wygląda na to, że zarówno białko A, jak i białko G mogą być łączone z tymi enzymami w tym samym czasie, aby wytworzyć pA/G-Tn5 lub pA/G-MNazę. Białko A i białko G wykazują zróżnicowane powinowactwo do IgG różnych gatunków. Dlatego całkowite połączenie białka A i białka G z enzymem może przezwyciężyć ten problem i sprawić, że enzym będzie kompatybilny z przeciwciałami wielu gatunków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Metody przedstawione w tym manuskrypcie są zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratorium w Kantonie. Myszy użyte do wygenerowania reprezentatywnych wyników tego manuskryptu były trzymane i utrzymywane zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Laboratorium w Kantonie.

1. Izolacja Myoblast od mięśni tylnych kończyn myszy (Przykład użycia 1 myszy)

  1. Rozcieńczyć lodowaty kwas octowy za pomocą ddH2O do 0,02 M i złożyć go w autoklawie.
  2. Rozcieńczyć kolagen (z ogona szczura) do 0,1 mg/ml 0,02 M kwasem octowym.
  3. Dodaj ten roztwór kolagenu do naczyń hodowlanych, aby pokryć dno naczynia w inkubatorze komórkowym o temperaturze 37 °C na noc.
  4. Przed użyciem usuń roztwór kolagenu i umyj naczynie dwukrotnie 1x PBS. Roztwór kolagenu może być ponownie użyty 8-10 razy.
  5. Poświęć 8-12-tygodniową mysz. (Stare myszy mają słabe plony MuSC i mioblastów.)
  6. Odizoluj i umieść wszystkie mięśnie kończyn tylnych myszy w 10-centymetrowym naczyniu.
  7. Użyj 1x PBS (z penicyliną/streptomycyną) do płukania mięśni 4 razy. Po każdym płukaniu zawsze przełóż mięśnie na nową płytkę.
  8. Po ostatnim płukaniu usuń PBS i zmiel mięśnie nożyczkami.
  9. Dodaj 6 ml 1x PBS zawierającego dypazę II (1,1 U/ml) i kolagenazę II (830 U/mL) w celu strawienia mięśni mielonych, a trawienie powinno trwać ~1,5 godziny.
  10. Aby przeprowadzić trawienie, przenieś rozdrobnione mięśnie do rurki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C lub bezpośrednio pozostaw rozdrobnione mięśnie w naczyniu i umieść je w inkubatorze komórkowym CO2 o temperaturze 37 °C.
  11. Jeśli używasz inkubatora komórkowego do trawienia, kołysz naczyniem co 15-30 minut, aby dobrze wymieszać trawienie.
    UWAGA: Dyspaza II powinna być najpierw przygotowana jako zapas 11 U/ml z podłożem DMEM (bez surowicy), a kolagenaza II powinna być wykonana jako 10 000 U/ml z 1x PBS.
  12. Po zakończeniu trawienia użyj plastikowej pipety o pojemności 10 ml, aby kilkakrotnie przepłukać strawione tkanki w górę iw dół, aby dokładnie zhomogenizować mieszaninę wytrawiania.
  13. Dodaj 10 ml pożywki wzrostowej MuSC/Myoblast, aby spowolnić trawienie. Szczegółowe informacje na temat przygotowania pożywek wzrostowych MuSC/Myoblast można znaleźć w sekcji 2.
  14. Przepuść mieszaninę przez sitko o średnicy 70 μm. Użyj 1x PBS do przepłukania płytki wytrawiającej i przepuść ten PBS również przez sitko, aby zebrać wszystkie komórki na płytce wytrawiającej.
  15. Wirować przy 350 x g przez 10 minut i wyrzucić supernatant w próżni.
  16. Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 20 ml 1x PBS i przepuścić komórki przez sitko o średnicy 40 μm.
  17. Wirować przy 350 x g przez 5 minut i usunąć supernatant za pomocą próżni.
  18. Użyj 20 ml pożywki wzrostowej MuSC/Myoblast, aby ponownie zawiesić komórki i umieścić je na 10-centymetrowej normalnej plastikowej płytce. W tym czasie MuSC nie mogą przyczepiać się do dna płytki i pozostają w większości unoszące się w podłożu.
    UWAGA: Jest to pierwsze wstępne powlekanie na płytach plastikowych.
  19. Po 1,5 godziny krótko rozbujaj płytkę i przenieś płyn do dwóch pokrytych kolagenem 10-centymetrowych naczyń, z których każde zawiera 10 ml kultury. Teraz MuSC przyczepią się i będą rosły na płytkach pokrytych kolagenem. Zmień nośnik po 2 dniach. Płytki pokryte kolagenem przygotowuje się jak w krokach 1-4 tego rozdziału.
  20. Po kolejnym dniu przeprowadź komórki przez pasż: Usuń pożywkę, umyj komórki raz 1x PBS i trypsynizuj komórki.
  21. Użyj pożywki wzrostowej MuSC/Myoblast, aby spłukać komórki z płytek, przenieś komórki na nową plastikową płytkę i inkubuj w inkubatorze komórkowym przez 40 minut.
    UWAGA: Jest to drugie wstępne powlekanie na płytkach z tworzywa sztucznego.
  22. Wlej kulturę na nową plastikową płytkę i inkubuj w inkubatorze komórkowym przez kolejne 20 minut.
    UWAGA: Jest to trzecie wstępne powlekanie na płytkach plastikowych.
  23. Następnie podziel supernatant na płytce na 8 pokrytych kolagenem 10-centymetrowych szalek, aby przeprowadzić subkulturę komórek. Stosunek przejścia wynosi tutaj 2: 8 (1: 4). Po trzykrotnym wstępnym posiewie opisanym powyżej, mioblasty mogą osiągnąć ponad 90% czystości. Dlatego po tym momencie nie ma potrzeby wstępnego powlekania podczas dalszego przechodzenia mioblastów.

2. Przygotowanie pożywki MuSC/Myoblast (Przykład przygotowania z 5 myszy)

  1. Poświęć 5 młodych i zdrowych myszy typu dzikiego, wyizoluj śledziony i raz przepłucz śledziony 1x PBS (z penicyliną/streptomycyną).
  2. Użyj nożyczek, aby usunąć ciemne części/plamy na śledzionie, jeśli występują. Wyrzuć śledzionę, jeśli większość z niej stała się.
  3. Umieść wszystkie 5 śledziony w sitku o wielkości 40 μm na górze probówki o pojemności 50 ml.
  4. Otwórz sterylne opakowanie strzykawki o pojemności 1 ml, wyciągnij tłok i wyrzuć cylinder.
  5. W sitku o średnicy 40 μm przytrzymaj gumowy korek i użyj podpórki kciuka tłoka, aby zmielić i rozdzielić tkanki śledziony na pojedyncze komórki. Należy uważać, aby nie dotknąć i nie zanieczyścić podpórki pod kciuk tłoka podczas rozrywania opakowania strzykawki.
  6. Podczas mielenia śledziony od czasu do czasu użyj 1x PBS, aby zmyć zdysocjowane komórki śledziony do probówki o pojemności 50 ml pod sitkiem.
  7. Po przepłukaniu wszystkich komórek śledziony do probówki o pojemności 50 ml przez sitko, należy odwirować probówkę o stężeniu 500 x g przez 10 minut.
  8. Użyj 1 ml 1x buforu do lizy czerwonych krwinek, aby ponownie zawiesić osad. Lizuj czerwone krwinki przez ~ 1 min.
    UWAGA: 10x Bufor do lizy czerwonych krwinek zawiera 155 mM NH4Cl, 10 mM NaHCO3 i 1 mM sól disodową EDTA w ddH2O. Filtrować do sterylizacji i nie autoklawować. Rozcieńczyć z ddH2O do 1x przed użyciem.
  9. Napełnij probówkę o pojemności 50 ml 1x PBS, aby zatrzymać proces lizy czerwonych krwinek.
  10. Ponownie przecedzić zawiesinę komórek za pomocą sitka o średnicy 40 μm, a następnie odwirować przy 500 x g przez 10 minut.
  11. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 2 ml pełnej pożywki RPMI-1640 (pożywki RPMI-1640 z 10% FBS i penicyliną/streptomycyną) z bardzo delikatnym pipetowaniem.
  12. Dodaj więcej pełnych mediów RPMI-1640 do probówki i dobrze wymieszaj. Rozprowadzić zawiesinę komórkową do dziesięciu kolb hodowlanych T75. Ostateczna objętość kultury w każdej kolbie hodowlanej T75 powinna wynosić 20 ml.
  13. Dodać 10 μl bulionu Concanavalin-A do każdej kolby hodowlanej T75 i dobrze wymieszać. Konkanawalina-A aktywuje proliferację limfocytów T.
    UWAGA: Zapas konkanawaliny-A wynosi 4 mg/ml i jest przygotowany przez rozpuszczenie konkanawaliny-A w 1x PBS. Sam Concanavalin-A jest tutaj używany i nie należy go mylić z kulkami Concanavalin-A używanymi w późniejszych testach CUT&Tag.
  14. Po 48 godzinach uzupełnij każdą kolbę T75 kolejnymi 20 ml pełnej pożywki RPMI-1640, tak aby całkowita objętość wzrosła do 40 ml.
  15. Kolejne 24 godziny później zebrać wszystkie kultury do każdej kolby T75 i odwirować przy 600 x g przez 3 minuty.
  16. Supernatant jest pożywką warunkową limfocytami T i może być przechowywany w temperaturze od -20 °C do -80 °C przez okres do 2 miesięcy. Wyrzuć granulki komórek śledziony. Przed użyciem należy rozmrozić pożywkę z komórkami T i dalej wysterylizować pożywkę za pomocą filtra 0,22 μm.
  17. Aby przygotować pełne podłoże F10 Hama, dodaj 100 ml FBS, 300 μl bulionu bFGF i 6 ml penicyliny/streptomycyny do 500 ml pożywki F10 Hama.
    UWAGA: bulion bFGF wynosi 5 μg/ml i jest przygotowany przez rozpuszczenie bFGF w pożywce F10 szynki.
  18. Wymieszaj pełne podłoże F10 szynki z przefiltrowanymi pożywkami warunkowymi z komórek T opisanymi powyżej w stosunku 1:1, aby uzyskać pożywkę wzrostową MuSC / Myoblast.

3. CUT&Tag z mioblastami (Przykład 3 reakcji CUT&Tag)

  1. Przygotowanie kluczowych odczynników
    1. Oczyść transpozazę pA/G-Tn5 z hodowli bakteryjnej we własnym zakresie za pomocą opublikowanej metody14. Enzym ten osiąga swoją funkcjonalną formę tylko do momentu, gdy zostanie zamontowany za pomocą adapterów DNA tworzących bibliotekę. Co najważniejsze, pA/G-Tn5 jest komercyjnie dostępny z wielu źródeł.
    2. Oligonukleotydy do produkcji adapterów przedstawiono w tabeli 1. W szczególności wyżarzanie Oligo-Rev odpowiednio z Oligo-A i Oligo-B, aby odpowiednio uzyskać dwuniciowy adapter-A i adapter-B. Szczegółowe informacje na temat wyżarzania w celu wykonania adapterów można znaleźć gdzie indziej14.
    3. Inkubować Adapter-A i Adapter-B z transpozazą pA/G-Tn5 w temperaturze pokojowej (RT) przez 2 godziny. Wtedy transpozaza ta przyjmie swoją funkcjonalną formę. W kolejnych sekcjach tego manuskryptu forma funkcyjna pA/G-Tn5 będzie określana jako pA/G-Tn5a.
      UWAGA: Jeśli pA/G-Tn5 został zakupiony zamiast wyprodukowanego we własnym zakresie, upewnij się, że wyjaśniłeś, czy zakupiony element jest zamontowany pA/G-Tn5 za pomocą adapterów (innymi słowy, gotowy do użycia), czy jest to tylko sam enzym pA/G-Tn5. Jeśli jest to tylko enzym, przygotuj dwa opisane powyżej adaptery i zamontuj je na pA/G-Tn5 przed ostatecznym użyciem tego enzymu do CUT&Tag.
    4. Aby zapoznać się z recepturami bufora wiążącego, bufora myjącego, bufora Dig-wash, bufora 300-Dig i bufora tagowania, czytelnicy mogą również zapoznać się z Kaya-Okur et al.1.
    5. Przygotuj bufor wiążący, który zawiera 20 mM HEPES pH 7,5, 10 mM KCl, 1 mM CaCl2 i 1 mM MnCl2.
    6. Przygotuj bufor do mycia, który zawiera 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM spermidyny i 1x koktajl inhibitorów proteazy.
    7. Zrób digitoninę jako skoncentrowany bulion w DMSO, a następnie przygotuj bufor do płukania Dig-wash, dodając digitoninę do buforu Wash do stężenia 0,5 mg / ml.
    8. Przygotować bufor przeciwciał, dodając EDTA do stężenia 2 mM i BSA do stężenia 0,1%, do buforu Dig-wash.
    9. Przygotuj bufor 300-Dig zawierający 20 mM HEPES pH 7,5, 300 mM NaCl, 0,5 mM spermidyny, 1x koktajl inhibitorów proteazy i 0,1-0,5 mg / ml digitoniny.
    10. Przygotuj bufor do znakowania, uzupełniając bufor 300-Dig o 10 mM MgCl2. MgCl2 może aktywować aktywność enzymatyczną pA / G-Tn5a.
      UWAGA: Informacje dotyczące innych materiałów znajdują się w pliku Tabela materiałów.
  2. Aktywacja kulki Concanavalin-A
    1. Wymieszać 30 μl kulek Concanavalin-A (10 μl na każdą reakcję) z 300 μl buforu wiążącego w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odwróć kilka razy, aby dobrze wymieszać. Umieść rurkę na stojaku magnetycznym. Gdy ciecz będzie klarowna, usuń supernatant.
    2. Wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego, dodaj 300 μl buforu wiążącego do probówki, dobrze wymieszaj i równomiernie podziel na 3 probówki z paskiem 8-PCR. Oznacz każdą probówkę z jedną reakcją CUT&Tag.
    3. Umieść pasek probówki 8-PCR na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż płyn będzie klarowny.
    4. Odessać supernatant i wyjąć probówki ze stojaka magnetycznego. Dodaj 10 μl buforu wiążącego do każdej probówki i dobrze wymieszaj. Umieść przygotowane koraliki na lodzie lub w temperaturze 4 °C, aż komórki będą gotowe do kontynuowania.
  3. Wiązanie komórek na koralikach Concanavalin-A
    1. Trypsynizuj hodowane mioblasty myszy z płytek, umyj komórki raz za pomocą RT 1x PBS i ostatecznie ponownie zawieś komórki w buforze Wash w RT. Unikaj nadmiernej trypsynizacji, ponieważ może to zagrozić powinowactwu błony komórkowej do kulek konkanawaliny-A.
    2. Dostosuj gęstość komórek do około 7 x 105 komórek/ml w buforze Wash tak, aby 100 μl zawiesiny komórek zawierało około 70 000 komórek, co wystarcza na jedną reakcję CUT&Tag.
    3. Odpipetować 100 μl zawiesiny komórek do każdej probówki z paskiem probówki 8-PCR, która zawiera już 10 μl przygotowanych kulek Concanavalin-A. Dobrze wymieszać i inkubować na wytrząsarce typu "ruch huśtawki" przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Umieść pasek w probówce 8-PCR na stojaku magnetycznym. Poczekaj, aż się wyczyści i usuń supernatant.
    5. Aby ocenić, czy kulki Concanavalin-A skutecznie sekwestrowały komórki, należy sprawdzić supernatant pod mikroskopem, aby zobaczyć, ile komórek pozostało w supernatancie. Po etapie wiązania kulki Concanavalin-A w supernatancie należy zaobserwować bardzo mało komórek lub nie zaobserwować ich wcale.
  4. Inkubacja komórek z przeciwciałem pierwszorzędowym
    1. Dla każdej próbki rozcieńczyć 1 μl przeciwciała H3K4me1 w 50 μl buforu przeciwciał i dodać rozcieńczone przeciwciało do każdej probówki z próbką. Dobrze wymieszaj kulki z rozcieńczonym przeciwciałem, kilkakrotnie odwracając probówki. Umieścić próbki na wytrząsarce "ruch huśtawki" w celu inkubacji w temperaturze 4 °C przez noc.
      UWAGA: Jak wspomniał dr Steven Henikoff1, nie było konieczne stosowanie negatywnej kontroli IgG we wszystkich testach CUT&Tag. W porównaniu z ChIP, testy CUT&Tag mają znacznie niższy sygnał tła lub nie mają go wcale. W związku z tym użycie IgG do przeprowadzenia testu CUT&Tag "kontroli ujemnej" nie wprowadza żadnych użytecznych informacji. Z kolei użycie przeciwciała zwalidowanego przez CUT&Tag do przeprowadzenia kontroli pozytywnej jest ważne dla oceny, czy test CUT&Tag zadziałał.
  5. Inkubacja komórek z przeciwciałem drugorzędowym
    1. Następnego dnia rano umieść próbki na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż próbki się wyczyszczą.
    2. Usuń supernatant, który jest przeciwciałem pierwszorzędowym. Nie ma potrzeby mycia koralików; Bezpośrednio dodać 50 μl rozcieńczonego (1:100) przeciwciała drugorzędowego do każdej probówki z próbką.
      UWAGA: Przeciwciało drugorzędowe rozcieńcza się buforem Dig-wash w stosunku 1:100. Aby umożliwić bardziej efektywne rozpoznawanie pA/G-Tn5a, przeciwciała drugorzędowe nie powinny być sprzężone z żadnymi cząsteczkami lub grupami, takimi jak HRP, biotyna lub fluorofory.
    3. Dobrze wymieszać i inkubować na wytrząsarce "ruch huśtawki" w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    4. Umieść próbki z powrotem na stojaku magnetycznym, poczekaj, aż próbki się oczyszczą i wyrzuć supernatant.
    5. Dodać 200 μl buforu Dig-wash do każdej probówki i kilkakrotnie odwrócić, aby zmyć nadmiar przeciwciał.
    6. Umieść go z powrotem na stojaku magnetycznym, poczekaj, aż się wyczyści i usuń supernatant. Powtórz to płukanie jeszcze dwa razy, aby całkowicie usunąć nadmiar niezwiązanych przeciwciał.
  6. Inkubacja komórek z pA/G-Tn5a
    1. Po ostatnim umyciu umieść próbki na stojaku magnetycznym, poczekaj, aż próbki się wyklarują i usuń cały płyn z probówki. Do każdej probówki z próbką dodać 100 μl buforu 300-Dig zawierającego pA/G-Tn5a w stężeniu 0,04 μM. Dobrze wymieszać i inkubować na huśtawce przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    2. Umieść na stojaku magnetycznym. Poczekaj, aż próbki się oczyszczą i usuń supernatant.
    3. Dodać 200 μl buforu 300-Dig do każdej próbki, dobrze wymieszać i umieścić na wytrząsarce, aby umyć próbkę przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    4. Umieść na stojaku magnetycznym. Poczekaj, aż próbki się oczyszczą i usuń supernatant. Powtórz to pranie jeszcze dwa razy, aby usunąć nadmierne pA/G-Tn5a i obniżyć tło.
  7. Podział i znakowanie genomów
    1. Po ostatnim praniu umieść próbki na stojaku magnetycznym i dokładnie odpipetuj płyn z probówki. Do każdej próbki dodać 50 μl buforu do znakowania. Dobrze wymieszać i inkubować w maszynie do PCR w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Nie używaj funkcji podgrzewania pokrywki w maszynie do PCR.
      UWAGA: Opcjonalnie, ze względu na zużycie materiału podczas następnego etapu oczyszczania genomowego DNA, niektóre impulsowe DNA mogą zostać dodane do bufora Tagmentation, tak aby skok pojawił się w końcowych wynikach sekwencjonowania i mógł być wykorzystany do normalizacji danych. Metodę przygotowania i wykorzystania kolczastego DNA można znaleźć gdzie indziej14.
  8. Całkowite oczyszczenie genomowego DNA
    1. Po znakowaniu dodać kolejne 150 μl buforu Tagmentation dla każdej próbki. Całkowita objętość wynosi teraz 200 μL.
    2. Następnie do każdej próbki dodaj 10 μl 0,5 M EDTA, 3 μl 10% SDS i 2,5 μl 20 mg/ml Proteinazy K. Vortex, aby dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 55°C przez 2 godziny.
    3. Odpipetować każdą próbkę do 200 μl fenolu/chloroformu w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować przez 10 s. Wirować przy 18 000 x g przez 5 minut. Przenieść górną warstwę do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    4. Dodać 200 μl chloroformu do każdej probówki i wirować przez 10 s. Wirować przy 18 000 x g przez 5 minut.
    5. Zassać górną warstwę do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Następnie do każdej próbki dodać 550 μl 100% etanolu, aby wytrącić DNA w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę. Aby lepiej uwidocznić osad DNA, dodaj 1 μl glikogenu o stężeniu 20 mg/ml.
    6. Wirować z maksymalną prędkością (>18 000 x g) przez 15 minut, aby uzyskać granulat DNA.
    7. Ostrożnie odlać sklarant nad osadem, przemyć osad glikogenu/DNA 75% etanolem i ponownie odwirować z maksymalną prędkością przez 5 minut.
    8. Usunąć 75% etanolu i ponownie zawiesić osad glikogenu/DNA z 21 μl ddH2O.
  9. Przygotowanie i sekwencjonowanie bibliotek
    1. Skonfiguruj PCR przygotowujący bibliotekę. Aby zindeksować próbki, które mają być sekwencjonowane razem, należy użyć innego startera N7XX Illumina dla każdej próbki i uniwersalnego startera N5XX Illumina. W przypadku indeksowania więcej niż 12 próbek wymagane będą również różne startery N5XX Illumina. Illumina dostarcza dwanaście starterów N7XX i osiem starterów N5XX, więc całkowita liczba kombinacji N7XX z N5XX wynosi 12 x 8 = 96. Układ reakcji PCR przedstawiono w Tabeli 2.
    2. Z grubsza określ numer cyklu PCR w PCR przygotowującym bibliotekę na podstawie liczby komórek użytej w teście CUT&Tag. Zwykle w przypadku testu CUT&Tag wykorzystującego 50 000-100 000 komórek wystarczy 9-12 cykli, a liczba komórek w zakresie 10 000-50 000 może wymagać do 14 cykli. Program PCR jest przedstawiony w tabeli 3.
      UWAGA: W przypadku większości testów CUT&Tag, jeśli przeciwciało działało prawidłowo, liczba cyklu PCR między 9 a 14 powinna zawsze generować przydatną bibliotekę do sekwencjonowania. Dobra biblioteka to zwykle 10-50 ng / μL (oznaczone testem kubitowym) w stężeniu i 20-30 μl w objętości. Wręcz przeciwnie, jeśli przeciwciało nie działało wydajnie i konkretnie, to samo zwiększenie liczby cykli nie może uratować eksperymentów. Nadmierna liczba cykli w ogóle nie wpływa korzystnie na wyniki, a zamiast tego wprowadza więcej duplikatów PCR, co później skomplikuje analizę danych.
    3. Użyj dostępnych na rynku kulek do oczyszczania/wyboru rozmiaru DNA, aby oczyścić DNA biblioteki i wybrać DNA o pożądanych rozmiarach.
    4. Rozcieńczyć małą porcję oczyszczonej biblioteki wodą i użyć jej do qPCR ze starterami specyficznymi dla locus w celu sprawdzenia wzbogaceń, jak w eksperymentach ChIP-qPCR. Przed sekwencjonowaniem biblioteki może to pomóc w ustaleniu, czy CUT&Tag zadziałał.
    5. Wykonaj sekwencjonowanie i analizę danych zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Zestawy CUT&Tag są dostępne na rynku w kilku firmach, a jeden z przykładów można znaleźć w pliku Table of Materials.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przed związaniem komórek z koralikami z konkawaliną A należy sprawdzić zawiesinę komórkową pod mikroskopem. Analogicznie, po inkubacji komórek z koralikami z konkawaliną A należy umieścić probówki z próbkami na statywie magnetycznym, a następnie ponownie zaobserwować nadsącz za pomocą mikroskopu. Służy to ocenie wydajności wychwytu komórek przez koraliki z konkawaliną A. Bufor płukący zawierający 7 x 105 komórek/mL powinien wyglądać pod mikroskopem tak, jak na Rysunku 1A. Z kolei ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Określona liczba komórek wymagana w określonej reakcji CUT&Tag całkowicie zależy od wzbogacenia znaków/wariantów histonów lub białek wiążących chromatynę, które mają być badane. Zwykle w przypadku bardzo wzbogaconych znaczników histonowych, takich jak H3K4me1, H3K4me3 i H3K27ac itp., 25 000-50 000 mioblastów jest wystarczające dla jednej reakcji CUT&Tag. Jednak niektóre rzadkie białka wiążące chromatynę mogą wymagać nawet 250 000 komórek. Liczba komórek używana w testach CUT&Tag jest krytyczna, która, jeśli nie jest dobr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Strategiczny Priorytetowy Program Badawczy Chińskiej Akademii Nauk (XDA16020400 do PH); Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (32170804 do PH).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
bFGFR& D Systems233-FB-025
KolagenCorning354236
Kolagenaza IIWorthingtonLS004177
Concanavalin-ASigma-AldrichC5275
Koraliki Concanavalin-ABangsLaboratories BP531
DigitoninaSigma-Aldrich300410
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Płodowa surowica bydlęcaPrzeciwciało HycloneSH30396.03
H3K4me1 abcamab8895
Szynka F10 mediaThermo Fisher Scientific11550043
Hiperaktywny uniwersalny CUT& Zestaw do oznaczania tagów dla Illumina VazymeTD903Ten zestaw został przez nas przetestowany pod kątem prawidłowego działania
Stojak magnetyczny na probówki EP 1,5 mlQualityardQYM06
Stojak magnetyczny na paski probówek 8-PCRAnosun MagneticCLJ16/21-021
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master MixNEBM0541LDo tworzenia bibliotek Reakcja PCR
pA-Tn5VazymeS603-01Przed użyciem należy go zamontować za pomocą adapterów
Koktajl inhibitorów proteazySigma-Aldrich5056489001
Proteinaza KBeyotimeST535-100mg
RPMI-1640 MediaThermo Fisher ScientificC11875500BT
Przeciwciało wtórne (świnka morska anty-królicza IgG)Przeciwciała-onlineABIN101961
SpermidynaSigma-AldrichS2626
TruePrep Index Kit V2 dla Illumina VazymeTD202Ten zestaw zawiera podkłady Illumina N7XX i N5XX 
Czyste koraliki VAHTS DNA VazymeN411Może zastąpić koraliki Ampure XP. Może oczyszczać CUT& Biblioteki znaczników i wybieranie fragmentów DNA według rozmiaru

Bibliografia

  1. Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun. 10 (1), 1930(2019).
  2. Skene, P. J., Henikoff, S. A simple method for generating high-resolution maps of genome-wide protein binding. eLife. 4, e09225(2015).
  3. Nikitina, T., Wang, D., Gomberg, M., Grigoryev, S. A., Zhurkin, V. B. Combined micrococcal nuclease and exonuclease III digestion reveals precise positions of the nucleosome core/linker junctions: implications for high-resolution nucleosome mapping. J Mol Biol. 425 (11), 1946-1960 (2013).
  4. Policastro, R. A., Zentner, G. E. Enzymatic methods for genome-wide profiling of protein binding sites. Brief Funct Genomics. 17 (2), 138-145 (2018).
  5. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18602-18607 (2013).
  6. Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, e21856(2017).
  7. Mezger, A., et al. High-throughput chromatin accessibility profiling at single-cell resolution. Nat Commun. 9, 3647(2018).
  8. Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nat Commun. 8, 14049(2017).
  9. Nakka, K., et al. JMJD3 activated hyaluronan synthesis drives muscle regeneration in an inflammatory environment. Science. 377 (6606), 666-669 (2022).
  10. Fu, X., Wang, H., Hu, P. Stem cell activation in skeletal muscle regeneration. Cell Mol Life Sci. 72 (9), 1663-1677 (2015).
  11. Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skelet Muscle. 6, 35(2016).
  12. Giordani, L., et al. High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations. Mol Cell. 74 (3), 609-621.e6 (2019).
  13. Fu, X., et al. Combination of inflammation-related cytokines promotes long-term muscle stem cell expansion. Cell Res. 25 (6), 655-673 (2015).
  14. Li, Y., et al. Chromatin and transcription factor profiling in rare stem cell populations using CUT&Tag. STAR Protoc. 2 (3), 100751(2021).
  15. Tapscott, S. J., Davis, R. L., Lassar, A. B., Weintraub, H. MyoD: a regulatory gene of skeletal myogenesis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 280, discussion 3-6 (1990).
  16. Wardle, F. C. Master control: transcriptional regulation of mammalian Myod. J Muscle Res Cell Motil. 40 (2), 211-226 (2019).
  17. Local, A., et al. Identification of H3K4me1-associated proteins at mammalian enhancers. Nat Genet. 50 (1), 73-82 (2018).
  18. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  19. Faralli, H., et al. UTX demethylase activity is required for satellite cell-mediated muscle regeneration. J Clin Invest. 126 (4), 1555-1565 (2016).
  20. Yang, J. H., et al. Myogenic transcriptional activation of MyoD mediated by replication-independent histone deposition. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 85-90 (2011).
  21. Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nat Protoc. 15 (10), 3264-3283 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

CUT And Tagprofilowanie chromatynymioblasty mysiekomórki macierzyste mięśniimmunoprecypitacja chromatynykulki z konkanawaliną Amodyfikacje histonówtest tagmentacjiprzygotowanie biblioteki PCRprzeciwciało anty-H3K4me1
Wykorzystanie testu rozszczepienia pod tarczami i znakowania (CUT&Tag) w badaniach mioblastów myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.