Wszechstronny system szklanych słoików do półhydroponicznego profilowania wysięku korzeniowego

Wśród gęsto zaludnionych gleb, ryzosfera stanowi niszę bogatą w węgiel. Jest kształtowany przez korzenie roślin poprzez wydzielanie do 20% asymilowanego węgla i jest siedliskiem społeczności mikroorganizmów, które różnią się od mikrobiomu glebowego zamieszkującego glebę^1,2,3,4,5^,6. Ponieważ naukowcy badają korzystne funkcje mikroorganizmów związanych z korzeniami i związany z nimi potencjał zrównoważonego rolnictwa⁷, obserwacja ta, często określana jako efekt ryzosfery, stała się przedmiotem rosnących wysiłków naukowych. Jednak do tej pory dialog chemiczny między mikroorganizmami a roślinami, który ma być czynnikiem napędzającym efekt ryzosfery, pozostaje słabo poznany, a zatem mechanistyczne zrozumienie rozwoju niezawodnych rozwiązań mikrobiologicznych w rolnictwie jest ograniczone^8,9,10.

Rozszyfrowanie wysięków korzeniowych w środowisku glebowym, gdzie metabolity są łatwo wchłaniane przez cząsteczki gleby i szybko przekształcane przez społeczności mikrobiologiczne, nie jest proste, szczególnie dla gatunków roślin o delikatnym systemie korzeniowym, takich jak modelowa roślina Arabidopsis thaliana¹¹. Dlatego w większości badań próbki wysięków korzeniowych pobiera się z systemów hydroponicznych. W tych mikrokosmosach nadziemne części roślin są utrzymywane na miejscu przez niestandardowe uchwyty na rośliny lub bardziej dyskretne materiały, takie jak siatka, agar i szklane koraliki. Używane pojemniki obejmują zarówno szalki Petriego, płytki wielodołkowe, jak i różne niestandardowe i komercyjne pudełka z filtrami napowietrzającymi lub bez^{12,13,14,15,16,17,18,19}. W zależności od systemu, warunki wzrostu roślin będą się znacznie różnić i w mniejszym lub większym stopniu odzwierciedlać warunki naturalne.

Tutaj prezentujemy szklany, półhydroponiczny system, który jest eksperymentalnie podatny i daje wysoce powtarzalne wyniki. Jest prosty w montażu i użytkowaniu oraz oparty na powszechnie dostępnych materiałach. System oparty jest na szklanym słoiku wypełnionym szklanymi koralikami, wykorzystując charakter wielokrotnego użytku i niskie właściwości wiążące wyrobów szklanych (Rysunek 1). Koraliki zapewniają fizyczne wsparcie dla rosnącej rośliny i symulują impedancję mechaniczną, przyczyniając się do bardziej przypominającej glebę architektury korzeniowej w porównaniu z konfiguracjami hydroponicznymi^19,20,21. W przypadku zaszczepienia drobnoustrojami, szklane kulki tworzą powierzchnie, do których bakterie mogą się przyczepić.

Szklany słoik można zamknąć, aby zachować sterylność, a system jest zaprojektowany tak, aby zapewnić wystarczającą przestrzeń nad głową i cyrkulację powietrza, unikając środowiska nasyconego wilgocią. Słoiki nadają się do długotrwałego wzrostu różnych gatunków roślin i można je skalować w górę i w dół za pomocą słoików o różnych rozmiarach. Przedstawiono tutaj zastosowania dla sześciu gatunków roślin, obejmujących trawy C3 i C4, rośliny dwuliścienne i strączkowe. Wśród nich są gatunki modelowe A. thaliana (dwuliścienne), Brachypodium distachyon (jednoliścienne C3), Medicago truncatula (rośliny strączkowe), a także gatunki roślin uprawnych, takie jak Solanum lycopersicum (pomidor, dwuliścienny), Triticum aestivum (pszenica, jednoliścienny C3) i Sorgo bicolor (sorgo, jednoliścienne C4). Przedstawiony protokół obejmuje eksperymentalną konfigurację systemu, sterylizację nasion i kiełkowanie sześciu gatunków roślin, przesadzanie sadzonek do słoików, różne podłoża wzrostowe, inokulację drobnoustrojów, pobieranie próbek wysięku korzeniowego i przetwarzanie wysięku do analizy.

1. Przygotowanie sadzonek: Powierzchniowa sterylizacja nasion

UWAGA: Sterylizacja powierzchni nasion i wszystkie następujące po nich kroki muszą być wykonane w sterylnych warunkach, chyba że zaznaczono inaczej. Kroki od 1.1 do 1.4 są specyficzne dla sterylizacji powierzchniowej nasion A. thaliana. Inne gatunki roślin mają alternatywne różnice w wielkości rurki (w zależności od liczby nasion i wielkości nasion), czasu w roztworach i roztworach sterylizacyjnych (tabela 1).

1. Dodaj nasiona do probówki do mikrowirówki (maksymalnie 20 mg nasion) i przykryj nasiona 70% etanolem.
   UWAGA: Etanol jest łatwopalny. Nie używać w pobliżu otwartego ognia.
2. Przenieś zamknięte probówki do mikrowirówki do wytrząsarki na 15 minut i ustaw obroty tak, aby nasiona były delikatnie poruszone.
3. Ostrożnie usuń 70% etanolu za pomocą pipety i zastąp go 100% etanolem. Powtórz krok 1.2.
4. Usuń 100% etanolu i wysusz nasiona, pozostawiając otwarte pokrywy probówek do mikrowirówek w sterylnym strumieniu powietrza.
5. Gdy nasiona wyschną, rozłóż je równomiernie na 0,5-krotnym podłożu Murashige i Skoog (MS) z 0,7% fitoagarem, przesuwając probówkę lub używając sterylnych kleszczy. Zamknij płytki agarowe i uszczelnij je taśmą z mikroporami o długości 1,25 cm.
6. Umieść płytki poziomo na półce w komorze wzrostowej (16 h światła/8 h ciemności, 22 °C w dzień/18 °C w nocy, 150-160 μmol ^{m-2 s-1}).

2. Przygotowanie sadzonek: Przeniesienie kiełkujących nasion na świeże talerze

UWAGA: Poniższe kroki są specyficzne dla A. thaliana i nie są potrzebne dla innych gatunków.

1. Po wykiełkowaniu przenieś od 5 do 6 sadzonek na nowe 0,7% płytki z agarem fitograficznym z 0,5x pożywką MS, umieszczając sadzonki liniowo, około 3 cm od góry (patrz położenie rozety w Rysunek 2D).
2. Uszczelnij płytki agarowe taśmą z mikroporami o średnicy 1,25 cm i uprawiaj pionowo w komorze wzrostu (Rysunek 2D), aż sadzonki będą gotowe do przeniesienia do słoików po 15-18 dniach od wykiełkowania (Tabela 2).

3. Przygotowanie systemu hydroponicznego: Ustawienie słoika

1. Dodaj 150 ml czystych szklanych kulek o średnicy 5 mm do każdego czystego słoika i zamknij pokrywką (Rysunek 1A).
   UWAGA: W tym protokole szklane koraliki o średnicy 5 mm są odpowiednie dla większości gatunków²², ale rozmiar koralików można dostosować w razie potrzeby.
2. Umieść wystarczającą ilość folii aluminiowej na zamkniętych słoikach, aby zakryć połączenie pokrywka-słoik i autoklaw (121 °C przez 20 minut) (Rysunek 1B).
3. Przygotowane słoiki należy przykryć do momentu, gdy rośliny będą gotowe do przeniesienia (Tabela 2).

4. Przygotowanie systemu hydroponicznego: Dodawanie sadzonek

1. Gdy sadzonki są gotowe do przeniesienia do słoików (Tabela 2), usuń folię aluminiową i pokrywki słoików w sterylnej ławce.
2. Jeśli słoiki mają być zaszczepione bakteriami, wykonaj następujące kroki przed przejściem do kroku 4.3; w przeciwnym razie pomiń krok 4.2.
   1. Za pomocą sterylnej pętli inokulacyjnej pobrać pojedyncze kolonie z czystych kultur bakteryjnych na płytkach agarowych i zawiesić je w 750 μl sterylnego 10 mM MgCl₂. Powtarzaj, aż roztwór będzie mętny.
   2. Opcjonalnie: Przemyć zawiesinę 3x 750 μL sterylnego 10 mM MgCl₂ przez 5 minut odwirowania w temperaturze 1 000 × g i temperaturze pokojowej, a następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 750 μL 10 mM MgCl₂.
   3. Fakultatywnie: W przypadku zaszczepiania kilku różnych gatunków bakterii, przed kontynuowaniem należy zmieszać zawiesiny pojedynczych szczepów przygotowanych w krokach 4.2.1-4.2.2 w równych proporcjach.
   4. Dostosuj gęstość optyczną przy długości fali 600 nm (OD₆₀₀) do 0,2-0,4 cala 0,5x MS pożywki (pH 5,7 do 5,9, dostosowanej za pomocą KOH) lub innej wybranej pożywki wzrostowej (patrz krok 4.3). Ponownie zmierz średnicę zewnętrzną₆₀₀, aby sprawdzić, czy roztwór został prawidłowo rozcieńczony.
      UWAGA: KOH jest; Nosić rękawice i fartuch laboratoryjny.
   5. Rozcieńczyć zawiesinę dalej do OD₆₀₀ 0,002-0,004 w tym samym podłożu (rozcieńczenie 1:100).
      UWAGA: Ostateczna gęstość komórek będzie zależeć od użytego szczepu bakteryjnego, ale z naszego doświadczenia wynika, że inokulum to odpowiada około 3-6 × 10⁵ komórkom ^mL-1.
   6. Dodać 35 ml końcowego rozcieńczenia do słoika. Dodaj 35 ml sterylnej pożywki wzrostowej do słoików kontrolnych. Wymieszaj koraliki, aby równomiernie pokryły się 0,5 x pożywką MS przed przeniesieniem rośliny, aby korzenie nie wyschły. Przejdź do kroku 4.4.
3. Dodaj 35 ml pożywki 0,5x MS do każdego słoika (pH 5,7 do 5,9, dostosuj za pomocą KOH). Wymieszaj koraliki, aby równomiernie pokryć pożywką 0,5x MS przed przeniesieniem roślin, aby korzenie nie wyschły.
   UWAGA: Pożywkę wzrostową można modyfikować, na przykład poprzez usunięcie składników odżywczych, dodanie osmolitów w celu wywołania stresu solnego lub zastosowanie różnych wartości pH lub pożywki wzrostowej. UWAGA: KOH jest; Nosić rękawice i fartuch laboratoryjny.
4. Umieść 3-5 sadzonek A. thaliana w słoiku, umieszczając systemy korzeniowe między szklanymi koralikami.
   UWAGA: Liczba roślin w słoiku jest inna dla innych gatunków (tabela 2).
5. Przesuwaj koraliki sterylnymi kleszkami lub łyżkami, aby przykryć korzenie i wyjmij liście z podłoża (Rysunek 1C).
   UWAGA: Ostrożnie przesuwaj rośliny i koraliki, aby uniknąć złamania korzeni i zestresowania roślin.
6. Dodaj 2 paski taśmy mikroporowej o średnicy 1,25 cm na wierzch słoików i delikatnie umieść pokrywkę na wierzchu (Rysunek 1D-F).
   UWAGA: Nie naciskaj pokrywy, aby nie utrudniać wymiany powietrza.
7. Zakryj szczelinę między pokrywką a słoikiem taśmą z mikroporami o średnicy 2,5 cm, aby zachować sterylność, umożliwiając jednocześnie wymianę powietrza, i umieść słoiki w komorze wzrostu (Rysunek 1G, H).
8. Ustaw 4-8 słoików na warunki eksperymentalne, w zależności od pytania biologicznego i oczekiwanej zmienności.
9. Należy upewnić się, że uwzględniono biologiczne kontrole ujemne (np. słoiki bez roślin) w celu uwzględnienia tła metabolitów systemu doświadczalnego. Ustanowić taką samą liczbę powtórzeń dla kontroli ujemnych jak dla eksperymentalnych produktów leczniczych (np. czworabryki).
10. W przypadku dłuższych okresów wzrostu należy wymieniać pożywkę wzrostową co tydzień: usunąć pozostałą część pożywki za pomocą pipety objętościowej o pojemności 25 ml i dodać 35 ml świeżej pożywki.

5. Zbiór wysięków korzeniowych

1. Gdy rośliny osiągną pożądany wiek, usuń taśmę z mikroporami o średnicy 2,5 cm i pokrywkę ze sterylnej ławki.
   UWAGA: Dla A. thaliana w naszych warunkach wzrostu, 21 dni po wykiełkowaniu reprezentuje dojrzały etap wegetatywny przed rozpoczęciem kwitnienia. Etap rozwoju wegetatywnego jest specyficzny dla gatunku rośliny, a czas okresu wzrostu zmienia się w zależności od gatunku rośliny; Czas ten może być modyfikowany w zależności od pytania badawczego.
2. W celu przeprowadzenia badania sterylności należy podać 20 μl pożywki wzrostowej i odpipetować na płytki agarowe LB.
   1. W przypadku zaszczepionych słoików należy podać 100 μl pożywki wzrostowej do użycia do zliczania jednostek tworzących kolonie (CFU) (np. w serii rozcieńczeń²³).
      UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że gęstości bakterii wahają się w granicach 10^{5-10 8} żywych komórek ^mL-1 pożywki wzrostowej.
3. Usuń jak najwięcej podłoża wzrostowego za pomocą pipety wolumetrycznej o pojemności 25 ml, unikając uszkodzenia korzeni.
4. Dodać 50 ml pożywki zbiorczej (np. 20 mM octanu amonu; pH 5,7-5,9 skorygowane HCl), pipetując wzdłuż ścianek słoika, aby uniknąć zwilżenia liści. Zamknij słoiki pokrywkami i inkubuj je w sterylnych warunkach przez żądany czas zbierania wysięku. W przypadku eksperymentów, w których liczy się czas, dobrym oknem zbierania danych jest 2 godziny.
   UWAGA: HCl jest; Nosić rękawice i fartuch laboratoryjny. Aby uzyskać dłuższy czas zbierania wysięku z korzeni, ponownie owiń pokrywki taśmą i przenieś słoiki do komory wzrostu.
5. Po 2 godzinach pobrać żądaną ilość pożywki do probówek (np. 50 ml w przypadku testów lub analiz przy użyciu skoncentrowanych wysięków lub 2 ml w przypadku bezpośredniego stosowania). Zebrane wysięki korzeniowe należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania lub analizy.
   1. Podczas pracy z zaszczepionymi słoikami należy odwirowywać zebrane wysięki przez 10 minut w temperaturze 5 000 × g i temperaturze 4 °C, a do analizy używać wyłącznie supernatantów. Alternatywnie, przefiltruj wysięk za pomocą filtra 0,22 μm lub 0,45 μm.
6. Jeśli eksperyment jest częścią szeregu czasowego, usuń wszystkie pozostałe pożywki zbiorcze ze słoików i dodaj 35 ml pożywki 0,5x MS. Załóż pokrywkę i taśmę 2,5 cm przed włożeniem słoików do komory wzrostu.
7. Zmierz świeżą masę korzeni i pędów wszystkich roślin w jednym słoiku, aby później znormalizować wysięk korzeniowy według masy rośliny.
   UWAGA: W razie potrzeby można dodatkowo pobrać próbki z tkanek roślinnych.

6. Przetwarzanie wysięków korzeniowych do spektrometrii mas

1. W zależności od metody analitycznej, wysięk korzeniowy należy liofilizować w celu zagęszczenia i usunąć pożywkę zbiorczą (-80 °C przy 0,37 mbar, aż do momentu, gdy nie będzie płynu). Przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do analizy.
   UWAGA: Przedstawione tutaj dane zostały wygenerowane za pomocą analizy TOF-MS z wtryskiem przepływu na przyrządzie do pomiaru czasu przelotu kwadrupolowego o dokładnej masie.
2. Przed wstrzyknięciem do przyrządu analitycznego należy rozpuścić liofilizowane wysięki lub rozcieńczyć nieprzetworzone wysięki korzeniowe pożywką w zależności od masy świeżego korzenia.
   UWAGA: Pożywka została wybrana tak, aby była kompatybilna ze spektrometrem masowym. Jednak w zależności od metody analitycznej przed wstrzyknięciem mogą być konieczne etapy odsalania.

Wprowadzony tutaj system eksperymentalny pozwala na kontrolę eksperymentalnych i środowiskowych czynników zmieniających profile wysięku korzeniowego. Porównaliśmy wzrost A. thaliana w różnych warunkach oświetleniowych, wieku roślin i gęstości roślin w dwóch różnych laboratoriach (Rysunek 3). Rośliny wyglądały zdrowo we wszystkich laboratoriach (Rysunek 3A,B). Warunki dnia krótkiego (10 h światła vs. 16 h światła, Rysunek 3) skutkowały większą masą korzeni w porównaniu z warunkami długiego dnia (Rysunek 3C,D). Podobnie, całkowita masa korzeni wszystkich roślin uprawianych w warunkach długiego dnia była mniejsza niż w warunkach dnia krótkiego (Rysunek 3C). Ogólnie rzecz biorąc, zmienność wzrostu w słoikach i między nimi była niska we wszystkich laboratoriach.

System szklanych słoików jest kompatybilny z różnymi gatunkami roślin i etapami rozwoju. Punktem końcowym analizy wysięku korzeniowego jest zwykle 21 dni, ponieważ w naszych warunkach eksperymentalnych wiele gatunków roślin znajduje się w dojrzałym stadium wegetatywnym przed przejściem do etapu reprodukcyjnego (Rysunek 4A-E). Rośliny można łatwo usunąć z systemu doświadczalnego bez widocznych uszkodzeń systemu korzeniowego. W związku z tym określenie masy tkanek lub wykorzystanie tkanek do dalszej analizy jest proste. Największą masę pędów stwierdzono w przypadku pszenicy, a następnie sorgo i pomidora. Największą masę korzeni stwierdzono w przypadku sorgo, a następnie pszenicy i M. truncatula. Stosunek korzenia do pędu różni się w zależności od gatunku. Ogólnie rzecz biorąc, masa tkanek wahała się od 100 mg do 800 mg.

Centralnym aspektem systemów eksperymentalnych pozwalających na zbieranie wysięku z korzeni jest kontrolowane zaszczepianie mikrobami w celu zbadania interakcji roślina-mikroba w określonym środowisku. Przedstawiony system eksperymentalny może być utrzymywany w sterylności nawet przy wielokrotnych manipulacjach (patrz warunek 'kontrolny' w Rysunek 5), a bakterie mogą być dodawane i utrzymywane przez dłuższy czas. Kiedy 33-dniowe rośliny A. thaliana zostały zaszczepione mieszaniną bakterii komensalnych o OD600 0,004, bakterie utrzymywały się przez 12 dni, co było pełnym czasem trwania eksperymentu (Ryc. 5). Jednostki tworzące kolonie nawet zwiększyły się 100-krotnie w pożywce, a także skolonizowały korzenie (Rysunek 5C). Fenotypy inokulowanych roślin były nie do odróżnienia od tych z roślin sterylnych (Ryc. 5A,B).

Prezentowany system eksperymentalny pozwala na zbieranie wysięku w wielu warunkach eksperymentalnych. W tym miejscu przedstawiamy profile wysiękowe A. thaliana Col-0 zebrane kolejno w octanie amonu lub w wodzie z tych samych roślin (Ryc. 6A). Wysięki przechowywano w temperaturze -80 °C do czasu analizy, normalizowano przez masę korzeni i analizowano za pomocą spektrometrii mas. Próbki słoików zawierających rośliny przefiltrowano pod kątem kontroli eksperymentalnej (słoiki bez roślin). Spośród 2 163 metabolitów, 436 wykazało sygnał powyżej tła (20,16%) i zostały zachowane do analizy. Spośród nich 416 lub 95% związków wykazało wyraźną obfitość w warunkach eksperymentalnych. Jednak 26 metabolitów nie można przypisać żadnemu rodzajowi związku i w związku z tym nie są one zdefiniowane. Większość metabolitów (406 lub 98%) występowała w większej obfitości w wysiękach zbieranych w wodzie. Kolejne gromadzenie wysięków najpierw w octanie amonu, a później w wodzie, może wpływać na profil wysięku, ponieważ sygnały metaboliczne mogą z czasem rozrzedzać się. Jednak prawie wyłącznie wyższy sygnał wysięku w wodzie zebranej jako drugi punkt czasowy nie potwierdza tej hipotezy: gromadzenie się wysięku w czystej wodzie prawdopodobnie powoduje szok osmotyczny dla roślin, co powoduje zwiększoną obfitość metabolitów w porównaniu z rozpuszczalnikiem do zbierania równomolowym z roztworem wzrostowym (20 mM octan amonu jest równomolowy z 0,5x pożywką MS). Badania klas chemicznych zidentyfikowanych związków w obu warunkach wzrostu wykazały, że większość związków to kwasy organiczne i pochodne (28,6%), a następnie organiczne związki tlenu (18%), związki organo-heterocykliczne (14,2%) i lipidy (13,2%). Tylko niewielka podgrupa metabolitów należy do fenylopropanoidów i poliketydów (8,7%) oraz benzenoidów (6%). Organiczne związki azotu, nukleozydy, związki siarkoorganiczne, alkaloidy, lignany i związki pokrewne stanowią od 2% do 0,5% sklasyfikowanych związków (Rysunek 6B). Rozkład metabolitów przedstawionych tutaj odpowiada już opublikowanym danym przy użyciu innych typów systemów zbierania wysięków korzeniowych24.

Rysunek 1: Ustawienie szklanego słoika. (A) Słoik ze szklanymi koralikami. (B) Słoik ze szklanymi koralikami gotowymi do sterylizacji w autoklawie. (C) Sadzonki w słoikach (widok z góry). (D) Sadzonki w słoiku (widok z góry) z taśmą mikroporową 1,25 cm. (E) Sadzonki w słoikach (widok z boku) z taśmą mikroporową 1,25 cm. (F) Sadzonki w słoikach (widok z boku) z taśmą mikroporową 1,25 cm i pokrywką. (G) Kompletny zestaw słoików z sadzonkami w słoikach (widok z boku) z taśmą mikroporową 1,25 cm, pokrywką i taśmą mikroporową 2,5 cm. (H) Pełna konfiguracja słoika (widok z góry). (I) Rośliny w wieku 21 dni i gotowe do zbioru (widok z góry). Rozmiar słoika 147 mm wysokość x 100 mm średnica. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Sadzonki sterylizowane powierzchniowo na 0,5x średnich płytkach agarowych Murashige i Skoog w komorze wzrostowej. (A) Arabidopsis thaliana (6 dni), (B) Brachypodium distachyon (6 dni), (C) Medicago truncatula (6 dni), (D) A. thaliana (18 dni). Rozmiar płytki agarowej 120 mm x 120 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Rośliny Arabidopsis thaliana Col-0 uprawiane w słoikach w warunkach krótkiego i długiego dnia. (A) Słoik z trzema 33-dniowymi roślinami uprawianymi w warunkach dnia krótkiego (10 h światła/14 h ciemności, 220 μmol m-2 s-1 natężenie światła, 21 °C dzień/18 °C noc) oraz (B) słoik z pięcioma 21-dniowymi roślinami uprawianymi w długich warunkach dziennych (16 h światła/8 h ciemności, 150-160 μmol m-2 s-1 natężenie światła, 22 °C w dzień/18 °C w nocy). Masa korzeni (C) wszystkich roślin z jednego słoika i (D) pojedynczych roślin. ** reprezentują wartości istotności testu t (p < 0,05). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Pięć filogenetycznie odrębnych gatunków w dniu 21 w systemie sterylnych szklanych słoików. (A) modelowy jednoliścienny Brachypodium distachyon, (B) model rośliny strączkowej Medicago truncatula, (C) dwuliścienne Solanum lycopersicum (pomidor), (D) dwuliścienne Sorgo bicolor, (E) jednoliścienne Triticum aestivum (pszenica). (F) Świeża masa korzeni i pędów gatunków hodowanych w szklanych słoikach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Arabidopsis thaliana Col-0 (33-dniowy) uprawiany w warunkach dnia dziennego. (A) w sterylnym układzie lub (B) zaszczepiany przez 12 dni konsorcjum bakterii komensalnych. (C) Jednostki tworzące kolonie dla sterylnych (kontrolnych) i zaszczepionych słoików z substratem wzrostu (po lewej) i korzeniem (po prawej). N = 4 słoiki dla sterylnych warunków kontrolnych i n = 8 słoików dla warunków zaszczepionych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Wyraźne profile wysięku korzeniowego dla 21-dniowej A. thaliana Col-0. Wysięki zbierano przez 2 godziny w sterylnym octanie amonu 20 mM (pH 5,7), a następnie przez 2 godziny w sterylnej, przefiltrowanej wodzie dejonizowanej. Metabolity wykryto za pomocą spektrometrii mas z wykorzystaniem bezpośredniego wstrzyknięcia. (A) Analiza głównych składowych 436 metabolitów wykrytych powyżej poziomu tła (porównanie słoików z roślinami i słoików bez roślin). PC: główny składnik z wyjaśnioną wielkością wariancji. Niebieski: wysięki zebrane w wodzie, żółte: wysięki zebrane w octanie amonu. (B) Wykres kołowy 416 metabolitów istotnie różniących się między warunkami eksperymentalnymi (test Tukeya) zabarwiony zgodnie z nadklasą (https://cfb.fiehnlab.ucdavis.edu/). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Metody sterylizacji nasion powierzchniowych dla wielu gatunków. *Myte 4-5x przefiltrowaną wodą dejonizowaną między etanolem a wybielaczem i na końcu; inkubacja przez 3-6 godzin po wybielaniu, zastępowanie przefiltrowaną wodą dejonizowaną co 30 minut.

Tabela 2: Wiek sadzonek w dniach do przeniesienia do słoików i liczba roślin w słoiku dla różnych gatunków roślin.

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.