Przedstawiamy protokół dla opartego na szkle, półhydroponicznego systemu eksperymentalnego, wspierającego wzrost różnych filogenetycznie odrębnych roślin z mikrobami lub bez. System jest kompatybilny z różnymi podłożami wzrostowymi i umożliwia nieniszczące pobieranie próbek wysięku korzeniowego do dalszej analizy.
Artykuł metodologiczny
Wszechstronny system szklanych słoików do półhydroponicznego profilowania wysięku korzeniowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wysięki korzeniowe kształtują interfejs roślina-gleba, biorą udział w obiegu składników odżywczych i modulują interakcje z organizmami glebowymi. Wysięki korzeniowe są dynamiczne i kształtowane przez warunki biologiczne, środowiskowe i eksperymentalne. Ze względu na ich dużą różnorodność i niskie stężenia, dokładne profile wysięku są trudne do określenia, tym bardziej w środowiskach naturalnych, w których obecne są inne organizmy, które przewracają związki pochodzenia roślinnego i same wytwarzają dodatkowe związki. Wprowadzony tutaj system eksperymentalny półhydroponicznego szklanego słoika pozwala na kontrolę nad czynnikami biologicznymi, środowiskowymi i eksperymentalnymi. Pozwala na wzrost różnych filogenetycznie odrębnych gatunków roślin przez okres do kilku miesięcy z drobnoustrojami lub bez, w różnych podłożach wzrostowych. Konstrukcja na bazie szkła oferuje tło o niskiej zawartości metabolitów, co zapewnia wysoką czułość i niewielki wpływ na środowisko, ponieważ można ją ponownie wykorzystać. Próbki wysięków można pobierać w sposób nieniszczący, a w razie potrzeby warunki mogą być zmieniane w trakcie eksperymentu. Konfiguracja jest kompatybilna z analizą spektrometrii mas i innymi dalszymi procedurami analitycznymi. Podsumowując, przedstawiamy wszechstronny system wzrostu odpowiedni do wrażliwej analizy wysięku korzeniowego w różnych warunkach.
Wprowadzenie
Wśród gęsto zaludnionych gleb, ryzosfera stanowi niszę bogatą w węgiel. Jest kształtowany przez korzenie roślin poprzez wydzielanie do 20% asymilowanego węgla i jest siedliskiem społeczności mikroorganizmów, które różnią się od mikrobiomu glebowego zamieszkującego glebę1,2,3,4,5,6. Ponieważ naukowcy badają korzystne funkcje mikroorganizmów związanych z korzeniami i związany z nimi potencjał zrównoważonego rolnictwa7, obserwacja ta, często określana jako efekt ryzosfery, stała się przedmiotem rosnących wysiłków naukowych. Jednak do tej pory dialog chemiczny między mikroorganizmami a roślinami, który ma być czynnikiem napędzającym efekt ryzosfery, pozostaje słabo poznany, a zatem mechanistyczne zrozumienie rozwoju niezawodnych rozwiązań mikrobiologicznych w rolnictwie jest ograniczone8,9,10.
Rozszyfrowanie wysięków korzeniowych w środowisku glebowym, gdzie metabolity są łatwo wchłaniane przez cząsteczki gleby i szybko przekształcane przez społeczności mikrobiologiczne, nie jest proste, szczególnie dla gatunków roślin o delikatnym systemie korzeniowym, takich jak modelowa roślina Arabidopsis thaliana11. Dlatego w większości badań próbki wysięków korzeniowych pobiera się z systemów hydroponicznych. W tych mikrokosmosach nadziemne części roślin są utrzymywane na miejscu przez niestandardowe uchwyty na rośliny lub bardziej dyskretne materiały, takie jak siatka, agar i szklane koraliki. Używane pojemniki obejmują zarówno szalki Petriego, płytki wielodołkowe, jak i różne niestandardowe i komercyjne pudełka z filtrami napowietrzającymi lub bez12,13,14,15,16,17,18,19. W zależności od systemu, warunki wzrostu roślin będą się znacznie różnić i w mniejszym lub większym stopniu odzwierciedlać warunki naturalne.
Tutaj prezentujemy szklany, półhydroponiczny system, który jest eksperymentalnie podatny i daje wysoce powtarzalne wyniki. Jest prosty w montażu i użytkowaniu oraz oparty na powszechnie dostępnych materiałach. System oparty jest na szklanym słoiku wypełnionym szklanymi koralikami, wykorzystując charakter wielokrotnego użytku i niskie właściwości wiążące wyrobów szklanych (Rysunek 1). Koraliki zapewniają fizyczne wsparcie dla rosnącej rośliny i symulują impedancję mechaniczną, przyczyniając się do bardziej przypominającej glebę architektury korzeniowej w porównaniu z konfiguracjami hydroponicznymi19,20,21. W przypadku zaszczepienia drobnoustrojami, szklane kulki tworzą powierzchnie, do których bakterie mogą się przyczepić.
Szklany słoik można zamknąć, aby zachować sterylność, a system jest zaprojektowany tak, aby zapewnić wystarczającą przestrzeń nad głową i cyrkulację powietrza, unikając środowiska nasyconego wilgocią. Słoiki nadają się do długotrwałego wzrostu różnych gatunków roślin i można je skalować w górę i w dół za pomocą słoików o różnych rozmiarach. Przedstawiono tutaj zastosowania dla sześciu gatunków roślin, obejmujących trawy C3 i C4, rośliny dwuliścienne i strączkowe. Wśród nich są gatunki modelowe A. thaliana (dwuliścienne), Brachypodium distachyon (jednoliścienne C3), Medicago truncatula (rośliny strączkowe), a także gatunki roślin uprawnych, takie jak Solanum lycopersicum (pomidor, dwuliścienny), Triticum aestivum (pszenica, jednoliścienny C3) i Sorgo bicolor (sorgo, jednoliścienne C4). Przedstawiony protokół obejmuje eksperymentalną konfigurację systemu, sterylizację nasion i kiełkowanie sześciu gatunków roślin, przesadzanie sadzonek do słoików, różne podłoża wzrostowe, inokulację drobnoustrojów, pobieranie próbek wysięku korzeniowego i przetwarzanie wysięku do analizy.
Protokół
1. Przygotowanie sadzonek: Powierzchniowa sterylizacja nasion
UWAGA: Sterylizacja powierzchni nasion i wszystkie następujące po nich kroki muszą być wykonane w sterylnych warunkach, chyba że zaznaczono inaczej. Kroki od 1.1 do 1.4 są specyficzne dla sterylizacji powierzchniowej nasion A. thaliana. Inne gatunki roślin mają alternatywne różnice w wielkości rurki (w zależności od liczby nasion i wielkości nasion), czasu w roztworach i roztworach sterylizacyjnych (tabela 1).
- Dodaj nasiona do probówki do mikrowirówki (maksymalnie 20 mg nasion) i przykryj nasiona 70% etanolem.
UWAGA: Etanol jest łatwopalny. Nie używać w pobliżu otwartego ognia. - Przenieś zamknięte probówki do mikrowirówki do wytrząsarki na 15 minut i ustaw obroty tak, aby nasiona były delikatnie poruszone.
- Ostrożnie usuń 70% etanolu za pomocą pipety i zastąp go 100% etanolem. Powtórz krok 1.2.
- Usuń 100% etanolu i wysusz nasiona, pozostawiając otwarte pokrywy probówek do mikrowirówek w sterylnym strumieniu powietrza.
- Gdy nasiona wyschną, rozłóż je równomiernie na 0,5-krotnym podłożu Murashige i Skoog (MS) z 0,7% fitoagarem, przesuwając probówkę lub używając sterylnych kleszczy. Zamknij płytki agarowe i uszczelnij je taśmą z mikroporami o długości 1,25 cm.
- Umieść płytki poziomo na półce w komorze wzrostowej (16 h światła/8 h ciemności, 22 °C w dzień/18 °C w nocy, 150-160 μmol m-2 s-1).
2. Przygotowanie sadzonek: Przeniesienie kiełkujących nasion na świeże talerze
UWAGA: Poniższe kroki są specyficzne dla A. thaliana i nie są potrzebne dla innych gatunków.
- Po wykiełkowaniu przenieś od 5 do 6 sadzonek na nowe 0,7% płytki z agarem fitograficznym z 0,5x pożywką MS, umieszczając sadzonki liniowo, około 3 cm od góry (patrz położenie rozety w Rysunek 2D).
- Uszczelnij płytki agarowe taśmą z mikroporami o średnicy 1,25 cm i uprawiaj pionowo w komorze wzrostu (Rysunek 2D), aż sadzonki będą gotowe do przeniesienia do słoików po 15-18 dniach od wykiełkowania (Tabela 2).
3. Przygotowanie systemu hydroponicznego: Ustawienie słoika
- Dodaj 150 ml czystych szklanych kulek o średnicy 5 mm do każdego czystego słoika i zamknij pokrywką (Rysunek 1A).
UWAGA: W tym protokole szklane koraliki o średnicy 5 mm są odpowiednie dla większości gatunków22, ale rozmiar koralików można dostosować w razie potrzeby. - Umieść wystarczającą ilość folii aluminiowej na zamkniętych słoikach, aby zakryć połączenie pokrywka-słoik i autoklaw (121 °C przez 20 minut) (Rysunek 1B).
- Przygotowane słoiki należy przykryć do momentu, gdy rośliny będą gotowe do przeniesienia (Tabela 2).
4. Przygotowanie systemu hydroponicznego: Dodawanie sadzonek
- Gdy sadzonki są gotowe do przeniesienia do słoików (Tabela 2), usuń folię aluminiową i pokrywki słoików w sterylnej ławce.
- Jeśli słoiki mają być zaszczepione bakteriami, wykonaj następujące kroki przed przejściem do kroku 4.3; w przeciwnym razie pomiń krok 4.2.
- Za pomocą sterylnej pętli inokulacyjnej pobrać pojedyncze kolonie z czystych kultur bakteryjnych na płytkach agarowych i zawiesić je w 750 μl sterylnego 10 mM MgCl2. Powtarzaj, aż roztwór będzie mętny.
- Opcjonalnie: Przemyć zawiesinę 3x 750 μL sterylnego 10 mM MgCl2 przez 5 minut odwirowania w temperaturze 1 000 × g i temperaturze pokojowej, a następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 750 μL 10 mM MgCl2.
- Fakultatywnie: W przypadku zaszczepiania kilku różnych gatunków bakterii, przed kontynuowaniem należy zmieszać zawiesiny pojedynczych szczepów przygotowanych w krokach 4.2.1-4.2.2 w równych proporcjach.
- Dostosuj gęstość optyczną przy długości fali 600 nm (OD600) do 0,2-0,4 cala 0,5x MS pożywki (pH 5,7 do 5,9, dostosowanej za pomocą KOH) lub innej wybranej pożywki wzrostowej (patrz krok 4.3). Ponownie zmierz średnicę zewnętrzną600, aby sprawdzić, czy roztwór został prawidłowo rozcieńczony.
UWAGA: KOH jest; Nosić rękawice i fartuch laboratoryjny. - Rozcieńczyć zawiesinę dalej do OD600 0,002-0,004 w tym samym podłożu (rozcieńczenie 1:100).
UWAGA: Ostateczna gęstość komórek będzie zależeć od użytego szczepu bakteryjnego, ale z naszego doświadczenia wynika, że inokulum to odpowiada około 3-6 × 105 komórkom mL-1. - Dodać 35 ml końcowego rozcieńczenia do słoika. Dodaj 35 ml sterylnej pożywki wzrostowej do słoików kontrolnych. Wymieszaj koraliki, aby równomiernie pokryły się 0,5 x pożywką MS przed przeniesieniem rośliny, aby korzenie nie wyschły. Przejdź do kroku 4.4.
- Dodaj 35 ml pożywki 0,5x MS do każdego słoika (pH 5,7 do 5,9, dostosuj za pomocą KOH). Wymieszaj koraliki, aby równomiernie pokryć pożywką 0,5x MS przed przeniesieniem roślin, aby korzenie nie wyschły.
UWAGA: Pożywkę wzrostową można modyfikować, na przykład poprzez usunięcie składników odżywczych, dodanie osmolitów w celu wywołania stresu solnego lub zastosowanie różnych wartości pH lub pożywki wzrostowej. UWAGA: KOH jest; Nosić rękawice i fartuch laboratoryjny. - Umieść 3-5 sadzonek A. thaliana w słoiku, umieszczając systemy korzeniowe między szklanymi koralikami.
UWAGA: Liczba roślin w słoiku jest inna dla innych gatunków (tabela 2). - Przesuwaj koraliki sterylnymi kleszkami lub łyżkami, aby przykryć korzenie i wyjmij liście z podłoża (Rysunek 1C).
UWAGA: Ostrożnie przesuwaj rośliny i koraliki, aby uniknąć złamania korzeni i zestresowania roślin. - Dodaj 2 paski taśmy mikroporowej o średnicy 1,25 cm na wierzch słoików i delikatnie umieść pokrywkę na wierzchu (Rysunek 1D-F).
UWAGA: Nie naciskaj pokrywy, aby nie utrudniać wymiany powietrza. - Zakryj szczelinę między pokrywką a słoikiem taśmą z mikroporami o średnicy 2,5 cm, aby zachować sterylność, umożliwiając jednocześnie wymianę powietrza, i umieść słoiki w komorze wzrostu (Rysunek 1G, H).
- Ustaw 4-8 słoików na warunki eksperymentalne, w zależności od pytania biologicznego i oczekiwanej zmienności.
- Należy upewnić się, że uwzględniono biologiczne kontrole ujemne (np. słoiki bez roślin) w celu uwzględnienia tła metabolitów systemu doświadczalnego. Ustanowić taką samą liczbę powtórzeń dla kontroli ujemnych jak dla eksperymentalnych produktów leczniczych (np. czworabryki).
- W przypadku dłuższych okresów wzrostu należy wymieniać pożywkę wzrostową co tydzień: usunąć pozostałą część pożywki za pomocą pipety objętościowej o pojemności 25 ml i dodać 35 ml świeżej pożywki.
5. Zbiór wysięków korzeniowych
- Gdy rośliny osiągną pożądany wiek, usuń taśmę z mikroporami o średnicy 2,5 cm i pokrywkę ze sterylnej ławki.
UWAGA: Dla A. thaliana w naszych warunkach wzrostu, 21 dni po wykiełkowaniu reprezentuje dojrzały etap wegetatywny przed rozpoczęciem kwitnienia. Etap rozwoju wegetatywnego jest specyficzny dla gatunku rośliny, a czas okresu wzrostu zmienia się w zależności od gatunku rośliny; Czas ten może być modyfikowany w zależności od pytania badawczego. - W celu przeprowadzenia badania sterylności należy podać 20 μl pożywki wzrostowej i odpipetować na płytki agarowe LB.
- W przypadku zaszczepionych słoików należy podać 100 μl pożywki wzrostowej do użycia do zliczania jednostek tworzących kolonie (CFU) (np. w serii rozcieńczeń23).
UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że gęstości bakterii wahają się w granicach 105-10 8 żywych komórek mL-1 pożywki wzrostowej.
- W przypadku zaszczepionych słoików należy podać 100 μl pożywki wzrostowej do użycia do zliczania jednostek tworzących kolonie (CFU) (np. w serii rozcieńczeń23).
- Usuń jak najwięcej podłoża wzrostowego za pomocą pipety wolumetrycznej o pojemności 25 ml, unikając uszkodzenia korzeni.
- Dodać 50 ml pożywki zbiorczej (np. 20 mM octanu amonu; pH 5,7-5,9 skorygowane HCl), pipetując wzdłuż ścianek słoika, aby uniknąć zwilżenia liści. Zamknij słoiki pokrywkami i inkubuj je w sterylnych warunkach przez żądany czas zbierania wysięku. W przypadku eksperymentów, w których liczy się czas, dobrym oknem zbierania danych jest 2 godziny.
UWAGA: HCl jest; Nosić rękawice i fartuch laboratoryjny. Aby uzyskać dłuższy czas zbierania wysięku z korzeni, ponownie owiń pokrywki taśmą i przenieś słoiki do komory wzrostu. - Po 2 godzinach pobrać żądaną ilość pożywki do probówek (np. 50 ml w przypadku testów lub analiz przy użyciu skoncentrowanych wysięków lub 2 ml w przypadku bezpośredniego stosowania). Zebrane wysięki korzeniowe należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania lub analizy.
- Podczas pracy z zaszczepionymi słoikami należy odwirowywać zebrane wysięki przez 10 minut w temperaturze 5 000 × g i temperaturze 4 °C, a do analizy używać wyłącznie supernatantów. Alternatywnie, przefiltruj wysięk za pomocą filtra 0,22 μm lub 0,45 μm.
- Jeśli eksperyment jest częścią szeregu czasowego, usuń wszystkie pozostałe pożywki zbiorcze ze słoików i dodaj 35 ml pożywki 0,5x MS. Załóż pokrywkę i taśmę 2,5 cm przed włożeniem słoików do komory wzrostu.
- Zmierz świeżą masę korzeni i pędów wszystkich roślin w jednym słoiku, aby później znormalizować wysięk korzeniowy według masy rośliny.
UWAGA: W razie potrzeby można dodatkowo pobrać próbki z tkanek roślinnych.
6. Przetwarzanie wysięków korzeniowych do spektrometrii mas
- W zależności od metody analitycznej, wysięk korzeniowy należy liofilizować w celu zagęszczenia i usunąć pożywkę zbiorczą (-80 °C przy 0,37 mbar, aż do momentu, gdy nie będzie płynu). Przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do analizy.
UWAGA: Przedstawione tutaj dane zostały wygenerowane za pomocą analizy TOF-MS z wtryskiem przepływu na przyrządzie do pomiaru czasu przelotu kwadrupolowego o dokładnej masie. - Przed wstrzyknięciem do przyrządu analitycznego należy rozpuścić liofilizowane wysięki lub rozcieńczyć nieprzetworzone wysięki korzeniowe pożywką w zależności od masy świeżego korzenia.
UWAGA: Pożywka została wybrana tak, aby była kompatybilna ze spektrometrem masowym. Jednak w zależności od metody analitycznej przed wstrzyknięciem mogą być konieczne etapy odsalania.
Wyniki
Przedstawiony tutaj system eksperymentalny umożliwia kontrolę czynników eksperymentalnych i środowiskowych zmieniających profile eksudacji korzeniowej. Porównano wzrost A. thaliana w różnych warunkach oświetlenia, w różnym wieku roślin oraz przy różnych gęstościach nasadzeń w dwóch różnych laboratoriach (Rycina 3). Rośliny w obu laboratoriach wydawały się zdrowe (Rycina 3A,B). Warunki krótkiego dnia (10 h światła vs 16 h światła, Rycina 3) doprowadziły do uzyskania większej masy korzeni w porównaniu z warunkami długiego dnia (Rycina 3C,D). Podobnie, całkowita masa korzeni wszystkich roślin hodowanych w warunkach długiego dnia była mniejsza niż w warunkach krótkiego dnia (Rycina 3C). Ogólnie zmienność wzrostu w obrębie słoików oraz pomiędzy nimi była niska w obu laboratoriach.
System szklanych słoików jest kompatybilny z różnymi gatunkami roślin i etapami ich rozwoju. Punkt końcowy dla analizy eksudatów korzeniowych przypada zazwyczaj na 21 dzień, ponieważ w naszych warunkach doświadczalnych wiele gatunków roślin znajduje się w dojrzałej fazie wegetatywnej przed przejściem do fazy reprodukcyjnej (Rycina 4A-E). Rośliny można łatwo usunąć z układu eksperymentalnego bez widocznego uszkodzenia systemu korzeniowego. Dzięki temu wyznaczanie masy tkanek lub wykorzystanie ich do dalszych analiz jest proste. Najwyższą masę części nadziemnych odnotowano dla pszenicy, następnie dla sorga i pomidora. Najwyższą masę korzeni odnotowano dla sorga, następnie dla pszenicy i M. truncatula. Stosunek masy korzeni do masy części nadziemnych różni się w zależności od gatunku. Ogólnie masa tkanek wahała się od 100 mg do 800 mg.
Kluczowym aspektem systemów eksperymentalnych umożliwiających zbieranie eksudatów korzeniowych jest kontrolowana inokulacja mikroorganizmami w celu badania interakcji roślina-mikrob w zdefiniowanym środowisku. Przedstawiony system eksperymentalny może pozostać sterylny nawet przy wielokrotnych manipulacjach (patrz warunek „kontrolny” na Rysunku 5), a bakterie mogą być dodawane i utrzymywane przez dłuższe okresy. Gdy 33-dniowe rośliny A. thaliana zainokulowano mieszaniną bakterii komensalnych o OD600 0,004, bakterie utrzymywały się przez 12 dni, co stanowiło pełny czas trwania eksperymentu (Rysunek 5). Liczba jednostek tworzących kolonie wzrosła nawet 100-krotnie w pożywce wzrostowej, a bakterie skolonizowały również korzenie (Rysunek 5C). Fenotypy roślin zainokulowanych były nieodróżnialne od fenotypów roślin sterylnych (Rysunek 5A,B).
Przedstawiony system eksperymentalny umożliwia zbieranie wysięków w wielu warunkach doświadczalnych. Tutaj prezentujemy profile wysięków A. thaliana Col-0 zebranych kolejno z tych samych roślin albo w octanie amonu, albo w wodzie (Rysunek 6A). Wysięki przechowywano w temperaturze -80 °C do momentu analizy, znormalizowano względem masy korzenia, a następnie poddano analizie spektrometrią mas. Próbki z słoików zawierających rośliny przefiltrowano względem kontroli eksperymentalnych (słoiki bez roślin). Z 2 163 metabolitów 436 wykazało sygnał powyżej tła (20,16%) i zostało zakwalifikowanych do dalszej analizy. Z nich 416, czyli 95% związków, wykazało wyraźne różnice w obfitości pomiędzy warunkami eksperymentalnymi. Jednakże 26 metabolitów nie można było przypisać do żadnego rodzaju związku, w związku z czym nie zostały one zdefiniowane. Większość metabolitów (406 lub 98%) występowała w większej obfitości w wysiękach zebranych do wody. Kolejne zbieranie wysięków najpierw do octanu amonu, a później do wody mogłoby wpływać na profil wysiękowania, ponieważ sygnały metaboliczne mogłyby ulegać rozcieńczeniu w czasie. Jednak prawie wyłącznie wyższy sygnał wysiękania w wodzie zebranej w drugim punkcie czasowym nie potwierdza tej hipotezy: zbieranie wysięków w czystej wodzie prawdopodobnie wywołuje szok osmotyczny u roślin, co powoduje zwiększoną obfitość metabolitów w porównaniu z rozpuszczalnikiem do zbierania ekimolarnym względem pożywki wzrostowej (20 mM octanu amonu jest ekimolarne do pożywki 0,5x MS). Badanie klas chemicznych zidentyfikowanych związków dla obu warunków wzrostu wykazało, że większość związków to kwasy organiczne i ich pochodne (28,6%), a następnie tlenowe związki organiczne (18%), związki organoheterocykliczne (14,2%) oraz lipidy (13,2%). Tylko niewielka część metabolitów należy do fenylopropanoidów i poliketydów (8,7%) oraz benzenoidów (6%). Organiczne związki azotu, nukleozydy, związki organosiarkowe, alkaloidy, lignany i związki pokrewne stanowią od 2% do 0,5% zaklasyfikowanych związków (Rysunek 6B). Przedstawiony tutaj rozkład metabolitów odpowiada już opublikowanym danym z wykorzystaniem innych typów systemów zbierania wysięków korzeniowych24.
Rysunek 1: Układ w słoikach szklanych. (A) Słoik z szklanymi kuleczkami. (B) Słoik z szklanymi kuleczkami przygotowany do autoklawowania. (C) Siewki w słoikach (widok z góry). (D) Siewki w słoiku (widok z góry) z taśmą mikroporową 1,25 cm. (E) Siewki w słoikach (widok z boku) z taśmą mikroporową 1,25 cm. (F) Siewki w słoikach (widok z boku) z taśmą mikroporową 1,25 cm i pokrywką. (G) Kompletny układ z siewkami w słoikach (widok z boku) z taśmą mikroporową 1,25 cm, pokrywką i taśmą mikroporową 2,5 cm. (H) Kompletny układ w słoikach (widok z góry). (I) Rośliny w wieku 21 dni gotowe do zbioru (widok z góry). Rozmiar słoika 147 mm wysokości x 100 mm średnicy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: Sterylizowane powierzchniowo siewki na szalkach z agarem z pożywką Murashige i Skoog 0,5x w komorze wzrostowej. (A) Arabidopsis thaliana (6 dni), (B) Brachypodium distachyon (6 dni), (C) Medicago truncatula (6 dni), (D) A. thaliana (18 dni). Rozmiar szalki z agarem 120 mm x 120 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Rośliny Arabidopsis thaliana Col-0 hodowane w słoikach w warunkach krótkiego i długiego dnia. (A) Słoik z trzema 33-dniowymi roślinami hodowanymi w warunkach krótkiego dnia (10 h światła/14 h ciemności, natężenie światła 220 µmol m-2 s-1, 21 °C dzień/18 °C noc) oraz (B) słoik z pięcioma 21-dniowymi roślinami hodowanymi w warunkach długiego dnia (16 h światła/8 h ciemności, natężenie światła 150-160 µmol m-2 s-1, 22 °C dzień/18 °C noc). Masa korzeni (C) wszystkich roślin z jednego słoika oraz (D) pojedynczych roślin. ** reprezentują wartości istotności testu t (p < 0.05). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4: Pięć filogenetycznie odrębnych gatunków w 21. dniu w układzie szklanych słoików sterylnych. (A) Modelowy jednoliścienny Brachypodium distachyon, (B) modelowa roślinna strączkowa Medicago truncatula, (C) dwuliścienna Solanum lycopersicum (pomidor), (D) dwuliścienna Sorghum bicolor, (E) jednoliścienna Triticum aestivum (pszenica). (F) Masa świeża korzeni i pędów gatunków hodowanych w szklanych słoikach. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
Rysunek 5: Arabidopsis thaliana Col-0 (33-dniowe) hodowane w warunkach krótkiego dnia. (A) W układzie sterylnym lub (B) inokulowane przez 12 dni konsorcjum bakterii komensalnych. (C) Jednostki tworzące kolonie dla sterylnych (kontrolnych) i inokulowanych słoików z podłożem wzrostowym (lewo) oraz korzeniem (prawo). N = 4 słoiki dla warunku kontrolnego sterylnego oraz n = 8 słoików dla warunku inokulowanego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 6: Wyraźne profile wysięków korzeniowych 21-dniowych A. thaliana Col-0. Wysięki zbierano przez 2 h w sterylnym 20 mM octanie amonu (pH 5.7), a następnie przez 2 h w sterylnie filtrowanej wodzie dejonizowanej. Metabolity wykryto za pomocą spektrometrii mas z wykorzystaniem wtrysku bezpośredniego. (A) Analiza głównych składowych 436 metabolitów wykrytych powyżej poziomu tła (porównanie słoików z roślinami i słoików bez roślin). PC: główna składowa z podaniem wyjaśnionej wariancji. Kolor niebieski: wysięki zebrane do wody, kolor żółty: wysięki zebrane do octanu amonu. (B) Wykres kołowy 416 metabolitów istotnie różniących się między warunkami eksperymentalnymi (test Tukeya), z kolorowaniem według superklasy (https://cfb.fiehnlab.ucdavis.edu/). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Gatunek | Przygotowanie nasion | Czas w 70% etanolu (min) | Stężenie podchlorynu sodu (NaClO) (v/v % wybielacza) | Czas w wybielaczu (min) | ||
| Arabidopsis thaliana | 15 | Brak; 100% etanol | 15 | |||
| Brachypodium distachyon* | Łuskanie | 0.5 | 6 | 5 | ||
| Medicago truncatula*a | 30 | 6 | 30 | |||
| Solanum lycopersicum* | 0.5 | 6 | 5 | |||
| Sorghum bicolor* | Łuskanie | 0.5 | 6 | 30 | ||
| Triticum aestivum* | Łuskanie | 0.5 | 12 | 20 | ||
Tabela 1: Metody sterylizacji powierzchniowej nasion dla wielu gatunków. *Przemyto 4-5x filtrowaną wodą dejonizowaną pomiędzy etapem z etanolem a wybielaczem oraz na koniec; a inkubacja przez 3-6 h po zastosowaniu wybielacza, z wymianą na filtrowaną wodę dejonizowaną co 30 min.
| Gatunek | Dzień przeniesienia do słoików | Liczba roślin |
| Brachypodium distachyon | 4 do 5 | 3 |
| Sorghum bicolor | 4 do 5 | 3 |
| Triticum aestivum | 4 do 5 | 2 |
| Medicago truncatula | 5 do 6 | 3 |
| Solanum lycopersicum | 7 do 8 | 3 |
| Arabidopsis thaliana | 17 | 3 do 5 |
Tabela 2: Wiek siewek w dniach w momencie przeniesienia do słoików oraz liczba roślin na słoik dla różnych gatunków roślin.
Dyskusja
Prezentowany tutaj system eksperymentalny opiera się na szklanych słoikach i szklanych koralikach, a tym samym zapewnia prosty, łatwy w utrzymaniu i wszechstronny system półhydroponiczny do badania wysięku korzeniowego w różnych kontekstach. Znalazł on zastosowanie w badaniach nad profilami wysięku różnych gatunków roślin25, reakcjami wysięku na różne warunki wzrostu25, a także wpływem właściwości fizykochemicznych gleby na wysięk22. System jest odpowiedni dla wszystkich testowanych tu gatunków roślin przez długie okresy wzrostu, od tygodni do miesięcy. Utrzymanie sterylnych warunków jest proste, podobnie jak inokulacja bakteriami, które utrzymują się przez analizowany 2-tygodniowy okres wzrostu. W ten sposób system eksperymentalny nie tylko pozwala na kontrolowane zbieranie wysięków korzeniowych w sterylnych warunkach, ale może być również wykorzystywany do badania interakcji roślina-mikroorganizm. Co więcej, pożywki dla roślin można zmieniać, aby badać reakcje metaboliczne na różne poziomy składników odżywczych, a okresy wzrostu można dostosowywać, dostosowując warunki oświetleniowe lub używając słoików o różnych rozmiarach.
Badanie wysięków korzeniowych w warunkach hydroponicznych lub półhydroponicznych pozostaje standardem w tej dziedzinie, głównie ze względu na zwiększoną rozdzielczość metabolitów o niskim stężeniu11. Wiele podejść hydroponicznych opiera się na szalkach Petriego, płytkach wielodołkowych lub innych małych pojemnikach, które umożliwiają sterylność i wysoką przepustowość, ale ograniczają eksperymenty do małych roślin lub sadzonek uprawianych w środowisku o wysokiej wilgotności 17,18,26,27. W prezentowanym układzie szklanych słoików wystarczająco dużo miejsca nad głową zapewniają stosunkowo duże słoiki, co pozwala na wydłużenie okresów wzrostu. Paski taśmy z mikroporami zapewniają wymianę powietrza przy jednoczesnym zachowaniu sterylności. Dzięki temu nawet wysokie rośliny jednoliścienne, takie jak jęczmień i kukurydza, mogą być uprawiane w szklanych słoikach przez wiele tygodni. Małe rośliny, takie jak A. thaliana i koniczyna, można badać przez 4-5 tygodni po wykiełkowaniu, w tym w fazie wegetatywnej i reprodukcyjnej.
Alternatywne konfiguracje hydroponiczne są również dostępne dla większych roślin, ale często wymagają one niestandardowych skrzynek i wlotów wykonanych z siatki, płyt piankowych i koszy do szczepienia do podparcia roślin 15,28,29,30. Ponadto urządzenia te zwykle nie są przystosowane do sterylizacji lub wymagają trudnych procedur konfiguracji i konserwacji, aby były wolne od zanieczyszczeń mikrobiologicznych i/lub chemicznych. Ustawienie i utrzymanie sterylności w prezentowanym systemie eksperymentalnym jest proste. Ponadto zastosowanie szkła do słoików i koralików zmniejsza obecność zanieczyszczeń wypłukiwanych z tworzyw sztucznych i oszczędza zasoby, ponieważ można je łatwo umyć i ponownie wykorzystać.
Szklane kulki były stosowane wcześniej, aby naśladować cząsteczki gleby. Indukują one naturalny rozwój korzeni w urządzeniach do pobierania próbek wysięku korzeniowego, takich jak pułapkiwysiękowe 31 lub inne systemy semihydroponiczne19. Konfiguracja szklanego słoika wykorzystuje ten rozwój i wprowadza koraliki jako powierzchnię kolonizacyjną dla drobnoustrojów. W glebie mikrobiom wokół korzeni roślin ewoluuje w środowisku półstałym, ze zwartymi cząstkami i przestrzeniami wypełnionymi powietrzem lub wodą. Mimo że konfiguracja szklanego słoika nie obejmuje aktywnego napowietrzania pożywki wzrostowej, w wyniku czego dolna faza ciekła prawdopodobnie nie zawiera optymalnego poziomu tlenu, połączenie większej objętości kulek z mniejszą objętością pożywki wzrostowej tworzy wilgotną, ale napowietrzoną górną fazę, w której drobnoustroje mogą rosnąć w warunkach tlenowych. Inni zaproponowali potrząsanie pojemnikami wzrostowymi26,28 lub użycie rurek sprzężonych z pompami powietrza19,29 w celu utrzymania dopływu powietrza w hydroponicznych systemach wzrostu. Jednak systemy te są albo skonfigurowane tak, aby nie były sterylne, albo wymagają specjalistycznego materiału i stałego nadzoru w celu utrzymania sterylności. Ponadto w przypadku potrząsania należy zachować dużą ostrożność, aby uniknąć zanurzenia pędów w roztworach wzrostowych i uszkodzenia systemów korzeniowych. Niemniej jednak, w razie potrzeby, przedstawiony układ doświadczalny można dostosować za pomocą dodatkowego materiału do napowietrzania.
Kluczowym aspektem, który należy wziąć pod uwagę we wszystkich badaniach interakcji roślina-mikroorganizm badających metabolizm, jest to, że drobnoustroje rozkładają związki pochodzenia roślinnego i samodzielnie wytwarzają metabolity. Bez specjalistycznego sterylnego zestawu doświadczalnego nie jest możliwe rozróżnienie metabolitów pochodzenia roślinnego i mikrobiologicznego. Aby zahamować aktywność mikrobiologiczną i wzbogacić związki pochodzenia roślinnego, Oburger i in. zaproponowali chemiczną sterylizację roztworu do pobierania próbek wysięku korzeniowego w celu zahamowania degradacji bakteryjnej32. Wpływ inhibitorów chemicznych można było badać w przedstawionym systemie doświadczalnym, porównując profile wysięku roślin sterylnych i niesterylnych leczonych inhibitorem lub bez niego.
Głównym ograniczeniem prezentowanego zestawu szklanych słoików jest to, że warunki wzrostu pozostają bardzo sztuczne w porównaniu z glebą. Wysięki z roślin uprawianych w glebie są często zbierane z systemów perkolacji13, w których przepływy rozpuszczalników są gromadzone u podstawy pojemników wzrostowych, lub z hybrydowych systemów glebowo-hydroponicznych, w których rośliny są początkowo uprawiane w glebie, a następnie przenoszone do warunków hydroponicznych 16,33. W przeciwieństwie do konfiguracji szklanych słoików, procedury te są zwykle destrukcyjne, nie pozwalając na wielokrotne zbieranie w czasie w zmieniających się środowiskach wzrostu. Ponadto, podczas gdy w systemach przesiąkających próbki tła glebowego są pobierane razem z wysiękami, w hybrydowych systemach glebowo-hydroponicznych problem wysokiego tła metabolicznego gleby jest omijany dzięki przeniesieniu do warunków hydroponicznych w celu zbierania wysięku. Chociaż wdrożono czas rekonwalescencji w celu zmniejszenia wycieku metabolitów przez zranione korzenie11, przenoszenie roślin jest bardzo uciążliwe i rany prawdopodobnie będą się utrzymywać, a metabolizm roślin może się zmienić w odpowiedzi na przeniesienie do warunków hydroponicznych. Co więcej, w wielu przypadkach szok osmotyczny jest wywoływany przez przeniesienie roślin do wody zamiast odpowiedniego roztworu wzrostowego16,33. W przedstawionym protokole roztwór wzrostowy jest wymieniany na roztwór równomolowy w celu utrzymania równowagi osmotycznej, nadal pozwalając na uchwycenie wysięku w krótkim, określonym oknie czasowym. Zmiana roztworu wzrostu jest powszechną praktyką w wielu opublikowanych badaniach i można ją łatwo osiągnąć w konfiguracjach hydroponicznych bez zranienia korzeni 12,16,26,34. Ze względu na swoją wszechstronność, prezentowany system eksperymentalny można łatwo dostosować do naśladowania bardziej naturalnych warunków, na przykład poprzez użycie sterylnego lub niesterylnego ekstraktu glebowego jako roztworu wzrostowego z obecnością lub bez obecności stałych cząstek gleby. Stopniowa zmiana w kierunku warunków naturalnych pozwala na badanie wpływu różnych właściwości fizykochemicznych gleby i obecności drobnoustrojów na metabolizm i fizjologię roślin. Zanim społeczność naukowa dobrze zrozumie wysięk w różnych środowiskach, pożądane jest równoległe stosowanie systemów glebowych i hydroponicznych, ponieważ obie konfiguracje mają swoje zalety i ograniczenia13.
Podsumowując, prezentowany półhydroponiczny zestaw eksperymentalny na bazie szkła wyróżnia się prostotą połączoną z dużą wszechstronnością zastosowań. Jest to przystępny, tani sposób zbierania i badania wysięku w sterylnych warunkach lub w połączeniu z drobnoustrojami i interakcjami między roślinami.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Prof. Dr. Nicoli Zamboni i Prof. Dr. Uwe Sauerowi z ETH Zürich, Szwajcaria, za określenie profili wysięku korzeniowego za pomocą bezpośredniego wstrzyknięcia oraz Prof. Dr. Klaus Schläppi z Uniwersytetu w Bazylei za bakterię komensalną A. thaliana. Ponadto wyrażamy uznanie dla Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki (PR00P3_185831 J.S., wspierając S.M., A.S., E.M.S.) oraz program stypendialny PSC-Syngenta (przyznany prof. dr Klausowi Schläppi i J.S., wspierający C.J.).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Proszek agarowy do bakteriologii | VWR | 20767.298 | |
| Folia aluminiowa | FORA GmbH | ||
| Octan amonu | Sigma-Aldrich | 32301-1KG | Odczynnik ACS, > Eur - 98% |
| Autoklaw VX-150 | Systec | 1150 | |
| Balance | Sartorius | QUINTIX64-1S | |
| Wirówka | Hermle Labortechnik GmbH | 305.00 V05 | |
| Kuwety | Greiner Bio-One | 613101 | |
| Difco LB Broth, Lennox | BD | 240210 | |
| Etanol | Reuss-Chemie AG | RC-A15-A-005L | |
| Filtrowana woda dejonizowana | Merck | Millipore Milli-Q IQ7000 | |
| Koraliki szklane | Carl Roth | HH56.1 | 5 mm |
| Kwas solny | Merk | 1.00317.1000 | |
| Pętla inokulacyjna | Karl Hammacher GmbH | HWO_070-21 | |
| Słoiki | Weck | 105741 | 850 ml |
| Liofilizator | Christ | Alpha 2-4 LSCplus | |
| Sześciowodny chlorek magnezu | Carl Roth | 2189.1 | |
| Matrix Termowstrząsarka orbitalna | IKA | 10006248 | |
| Probówka do mikrowirówek | Sarstedt AG & Co. KG | 72.695.500 | Probówka reakcyjna SafeSeal, 2 mL, taśma PP |
| Micropore | Taśma mikroporowa 3M | 1530-0 | 1,25 cm x 9,1 m |
| 3M | 1530-1 | 2,5 cm x 9,1 m | |
| Murashige & Skoog Medium (MS) | Duchefa Biochemie | M0221.0050 | |
| Komora wzrostowa | Percival | SE41-TLCU4 | 16 godzin światła/8 ciemnych. 22 ° C dzień/18 nocy |
| Fitoagar | Duchefa Biochemie | P1003.1000 | |
| Wodorotlenek potasu | Sigma-Aldrich | 8.14353.0100 | |
| Spektrofotometr SmartSpec Plus | Bio-Rad | 170-2525 | |
| Roztwór podchlorynu sodu, 12% Cl | Carl Roth | 9062.4 | |
| Kwadratowa szalka Petriego | Greiner Bio-One | 688102 | 120x120x17 mm, z otworami wentylacyjnymi |
| Stericup Quick release | Millipore | S2GPU05RE | 0,22 i mikro; m PES, 500 mL |
| Sterylna ławka | FASTER S.r.l. | FlowFast H 18 |
Bibliografia
- Sasse, J., Martinoia, E., Northen, T. Feed your friends: do plant exudates shape the root microbiome. Trends in Plant Science. 23 (1), 25-41 (2018).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
- Lopez, J. L., et al. Growth rate is a dominant factor predicting the rhizosphere effect. The ISME Journal. 17 (9), 1396-1405 (2023).
- Hu, L., et al. Root exudate metabolites drive plant-soil feedbacks on growth and defense by shaping the rhizosphere microbiota. Nature Communications. 9 (1), 2738(2018).
- Edwards, J., et al. Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (8), 911-920 (2015).
- Bulgarelli, D., et al. Structure and function of the bacterial root microbiota in wild and domesticated barley. Cell Host Microbe. 17 (3), 392-403 (2015).
- Li, J., Wang, J., Liu, H., Macdonald, C. A., Singh, B. K. Application of microbial inoculants significantly enhances crop productivity: A meta-analysis of studies from 2010 to 2020. Journal of Sustainable Agriculture and Environment. 1 (3), 216-225 (2022).
- Escudero-Martinez, C., Bulgarelli, D. Engineering the crop microbiota through host genetics. Annual Review of Phytopathology. 61, 257-277 (2023).
- Poppeliers, S. W., Sanchez-Gil, J. J., de Jonge, R. Microbes to support plant health: understanding bioinoculant success in complex conditions. Current Opinion in Microbiology. 73, 102286(2023).
- O'Callaghan, M., Ballard, R. A., Wright, D. Soil microbial inoculants for sustainable agriculture: Limitations and opportunities. Soil Use and Management. 38 (3), 1340-1369 (2022).
- Oburger, E., Jones, D. L. Sampling root exudates - Mission impossible. Rhizosphere. 6, 116-133 (2018).
- Yuan, J., et al. Root exudates drive the soil-borne legacy of aboveground pathogen infection. Microbiome. 6 (1), 156(2018).
- Vismans, G., et al. Coumarin biosynthesis genes are required after foliar pathogen infection for the creation of a microbial soil-borne legacy that primes plants for SA-dependent defenses. Scientific Reports. 12 (1), 22473(2022).
- Strehmel, N., Böttcher, C., Schmidt, S., Scheel, D. Profiling of secondary metabolites in root exudates of Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 108, 35-46 (2014).
- Song, Y., Pieterse, C. M. J., Bakker, P., Berendsen, R. L. Collection of sterile root exudates from foliar pathogen-inoculated plants. Methods in Molecular Biology. 2232, 305-317 (2021).
- Oburger, E., et al. A quick and simple spectrophotometric method to determine total carbon concentrations in root exudate samples of grass species. Plant Soil. 478 (1-2), 273-281 (2022).
- Koprivova, A., et al. Root-specific camalexin biosynthesis controls the plant growth-promoting effects of multiple bacterial strains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (31), 15735-15744 (2019).
- Gao, J., et al. Ecosystem fabrication (EcoFAB) protocols for the construction of laboratory ecosystems designed to study plant-microbe interactions. Journal of Visualized Experiments. (134), e57170(2018).
- Lopez-Guerrero, M. G., et al. A glass bead semi-hydroponic system for intact maize root exudate analysis and phenotyping. Plant Methods. 18 (1), 25(2022).
- Boeuf-Tremblay, V., Plantureux, S., Guckert, A. Influence of mechanical impedance on root exudation of maize seedlings at two development stages. Plant and Soil. 172, 279-287 (1995).
- Groleau-Renaud, V., Plantureux, S., Guckert, A. Influence of plant morphology on root exudation of maize subjected to mechanical impedance in hydroponic conditions. Plant and Soil. 201, 231-239 (1998).
- Sasse, J., et al. Root morphology and exudate availability are shaped by particle size and chemistry in Brachypodium distachyon. Plant Direct. 4 (7), 00207(2020).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. Arabidopsis Book. 1, 0039(2002).
- Monchgesang, S., et al. Natural variation of root exudates in Arabidopsis thaliana-linking metabolomic and genomic data. Scientific Reports. 6, 29033(2016).
- McLaughlin, S., Zhalnina, K., Kosina, S., Northen, T. R., Sasse, J. The core metabolome and root exudation dynamics of three phylogenetically distinct plant species. Nature Communications. 14 (1), 1649(2023).
- Badri, D. V., Chaparro, J. M., Zhang, R., Shen, Q., Vivanco, J. M. Application of natural blends of phytochemicals derived from the root exudates of Arabidopsis to the soil reveal that phenolic-related compounds predominantly modulate the soil microbiome. Journal of Biological Chemistry. 288 (7), 4502-4512 (2013).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Nathoo, N., Bernards, M. A., MacDonald, J., Yuan, Z. C. A hydroponic co-cultivation system for simultaneous and systematic analysis of plant/microbe molecular interactions and signaling. Journal of Visualized Experiments. (125), e55955(2017).
- Nguyen, N. T., McInturf, S. A., Mendoza-Cozatl, D. G. Hydroponics: a versatile system to study nutrient allocation and plant responses to nutrient availability and exposure to toxic elements. Journal of Visualized Experiments. (113), e54317(2016).
- Yi, Y., Li, Z., Kuipers, O. P. Plant-microbe interaction: transcriptional response of Bacillus Mycoides to potato root exudates. Journal of Visualized Experiments. (137), e57606(2018).
- Phillips, R. P., Erlitz, Y., Bier, R., Bernhardt, E. S. New approach for capturing soluble root exudates in forest soils. Functional Ecology. 22 (6), 990-999 (2008).
- Oburger, E., et al. Root exudation of phytosiderophores from soil-grown wheat. New Phytologist. 203 (4), 1161-1174 (2014).
- Neal, A. L., Ahmad, S., Gordon-Weeks, R., Ton, J. Benzoxazinoids in root exudates of maize attract Pseudomonas putida to the rhizosphere. PLoS One. 7 (4), e35498(2012).
- Miao, Y., et al. Exogenous salicylic acid alleviates salt stress by improving leaf photosynthesis and root system architecture in cucumber seedlings. Scientia Horticulturae. 272, 109577(2020).
Przedruki i uprawnienia
