Generowanie linii komórkowej U937 z nokautem RIP1 przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Summary

W miarę jak protokoły związane z CRISPR stają się coraz bardziej użyteczne i dostępne, w określonych warunkach eksperymentalnych nadal mogą pojawić się komplikacje i przeszkody. Protokół ten przedstawia w zarysie tworzenie wchodzącej w interakcję z receptorem ludzkiej linii komórkowej kinazy serynowo-treoninowej 1 (RIPK1/RIP1) przy użyciu CRISPR/Cas9 i podkreśla potencjalne wyzwania napotkane podczas tego procesu.

Abstract

Protokół ten przedstawia procedurę wybijania genu RIP1 za pomocą CRISPR/Cas9 w ludzkiej linii komórkowej monocytów U937. Metoda wykorzystuje wyznaczone plazmidy przewodnikowe RNA i plazmidy upakowania lentiwirusa w celu uzyskania nokautu genu RIP1. Protokół rozwiązuje problemy i ulepsza tradycyjne metody CRISPR, umożliwiając jego replikację w przyszłych badaniach nad śmiercią komórki. Uzyskane w ten sposób zmutowane komórki można wykorzystać do badania mechanistycznych zmian w śmierci komórki, w których w przeciwnym razie odgrywałyby rolę funkcjonalne białka RIP1. Testy żywotności wykazały znaczne zmniejszenie śmierci komórek w komórkach nokautowych po indukcji nekroptozy. Mikroskopia fluorescencyjna ujawniła wyraźny spadek mitochondrialnych reaktywnych form tlenu (ROS) w komórkach nokautujących w tych samych warunkach. Razem te testy funkcjonalne potwierdzają utratę białka RIP1. Procedura ta, zoptymalizowana do użytku z ludzkimi monocytami U937, może być również dostosowana do celowania w inne kluczowe regulatory śmierci komórki, dając funkcjonalne, nieśmiertelne mutanty. Potencjalne pułapki są omawiane w całym tekście, aby zapewnić wgląd w wyzwania, które mogą pojawić się podczas generowania mutantów.

Introduction

Zastosowanie technologii edycji genów CRISPR/Cas9 szybko się rozwija od czasu jej odkrycia ^1,2,3. Zdolność do wbijania lub nokautowania genów w liniach komórkowych lub bakteriach jest nieoceniona dla postępu badań i zrozumienia mechanizmów wewnątrzkomórkowych 1,2,3,4,5,6. System CRISPR-Cas9 ulepsza poprzednie metody edycji genów, takie jak nukleaza efektorowa podobna do aktywatora transkrypcji (TALEN), upraszczając inżynierię specyficzności genów. Procedura ta obejmuje dwa podstawowe składniki: przewodnik RNA (gRNA) używany do lokalizacji zamierzonego celu genu oraz Cas9, który jest endonukleazą, która modyfikuje zamierzoną lokalizację genomu za pomocą dwuniciowego pęknięcia DNA ^3,4. gRNA będzie działać jako przewodnik dla endonukleazy Cas9 w celu zlokalizowania i zainicjowania dwuniciowego pęknięcia w zamierzonej sekwencji genetycznej poprzez parowanie zasad Watsona-Cricka. Pełny proces edycji genomu przez system CRISPR/Cas9 obejmuje maszynerię komórkową naprawiającą te dwuniciowe pęknięcia w DNA poprzez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) lub rekombinację homologiczną ^3,7. Bardziej prawdopodobne jest, że NHEJ wystąpi, skutecznie tworząc mutację w genomie, która powoduje utratę ekspresji docelowego genu ^3,4.

Źródła komercyjne były w stanie stworzyć biblioteki celów gRNA, które mogą być wyrażane poprzez wzrost i izolację bakterii, co znacznie poprawia ich łatwość użycia. Jednak głównym ograniczeniem systemu CRISPR/Cas9 jest trudność w dostarczaniu kompleksu gRNA i Cas9 do docelowych linii komórkowych. Ograniczenia te pojawiają się w liniach komórkowych zawiesinowych, ponieważ są one ogólnie określane jako trudne do transfekcji⁸. Typowe metody transfekcji nie są na ogół skuteczne w dostarczaniu systemu CRISPR/Cas9 do komórek zawiesinowych, dlatego metody dostarczania wirusa, takie jak transfekcja i transdukcja lentiwirusowa, są lepiej odpowiednie dla tego typu linii komórkowej ^8,9.

Ten rodzaj transfekcji wymaga wektora lentiwirusowego, który koduje endonukleazę gRNA i Cas9 wraz z dodanymi plazmidami upakowania lentiwirusa, które są transfekowane do linii komórkowej zdolnej do wytwarzania cząstek lentiwirusowych. Typowo wybieraną linią komórkową do tego procesu są komórki HEK293T, ponieważ są one łatwiejsze do transfekcji i bardzo wydajnie pracują w składaniu gRNA i Cas9 ^9,10. Cząstki te są następnie uwalniane jako lentiwirusy do supernatantu, który może być wykorzystany do transdukcji gRNA i Cas9 do zamierzonej zawiesinowej linii komórkowej, takiej jak ludzkie monocyty U937. W związku z tym opisana tutaj procedura ma następujące zmiany w porównaniu z ustalonymi metodami: (1) Alternatywna metoda transfekcji dla trudnych do transfekcji linii komórkowych; (2) Nie ma potrzeby koncentrowania plazmidowego DNA CRISPR ani używania ultrawirówki; oraz (3) Eliminuje potrzebę klonowania pojedynczych komórek.

Bezpośrednim celem tego artykułu było wyeliminowanie genu RIP1 w ludzkich monocytach U937. Kanoniczna forma nekroptozy szlaku śmierci komórki o wysokim stanie zapalnym jest kontrolowana przez RIP1, który służy jako kluczowy cel w badaniach nad śmiercią komórki. 11,12,13,14 Gdy RIP1 staje się aktywny poprzez autofosforylację, następnie rekrutuje i powoduje bezpośrednią fosforylację i aktywację kinazy serynowo-białkowej 3 (RIPK3 / RIP3) oddziałującej z receptorem i pseudokinazy podobnej do domeny (MLKL) w celu utworzenia nekrosomu. Po tym utworzeniu nekrosom może swobodnie poruszać się po komórce, aby wchodzić w interakcje z organellami, takimi jak mitochondria^12,13. W mitochondriach RIP1 nasila pętlę dodatniego sprzężenia zwrotnego z metabolizmem komórkowym, bezpośrednio wpływając na produkcję mitochondrialnych ROS, co z kolei sprzyja dalszej autofosforylacji RIP1, tworzeniu nekrosomów i dalszemu wykonywaniu nekroptozy 11,12,13,14.

Podczas gdy obecna grupa badawcza skupia się na roli RIP1 w śmierci komórki, inne powody do badania RIP1 obejmują jego rolę w stanach zapalnych i infekcjach. Po aktywacji przez receptory śmierci, takie jak receptory TNF, RIP1 promuje aktywację szlaku sygnałowego NF-κB, który wyzwala transkrypcję cytokin prozapalnych, chemokin i innych cząsteczek niezbędnych do rekrutacji komórek odpornościowych i wzmocnienia odpowiedzi zapalnej¹⁵. Oprócz aktywacji NF-κB, RIPK1 może również angażować szlaki sygnałowe MAPK, dodatkowo nasilając stan zapalny^15,16. Jeśli chodzi o jego rolę w odpowiedziach na zakażenie, RIP1 działa jako kluczowy mediator odpowiedzi zapalnej gospodarza, szczególnie w odpowiedzi na wzorce molekularne związane z patogenem (PAMP) rozpoznawane przez receptory rozpoznawania wzorców (PRR), takie jak receptory Toll-podobne (TLR)¹⁷. Co więcej, podczas sepsy RIP1 jest aktywowany przez sygnalizację przez receptory śmierci, takie jak receptor TNF, co prowadzi do inicjacji kaskad prozapalnych. RIPK1 pośredniczy w aktywacji szlaków NF-κB i MAPK, promując produkcję cytokin prozapalnych, takich jak TNF-α, IL-1β i IL-6, które są kluczowymi czynnikami wywołującymi ogólnoustrojową odpowiedź zapalną charakterystyczną dla sepsy¹⁸.

Protocol

Schematyczne przedstawienie procedury przedstawiono na rysunku 1. Przewodnik RNA (gRNA) i sekwencja docelowa podano w tabeli 1. Szczegółowe informacje na temat odczynników i używanego sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Zbieranie ukierunkowanego na RIP1 wektora ekspresji lentiwirusowej CRISPR gRNA zawierającego endonukleazę Cas9 i oporność na puromycynę z Escherichia coli

1. Kwadrantowa smuga E. coli zawierająca wektor lentiwirusowy gRNAna płytkach agarowych LB uzupełnionych 100 μg / ml ampicyliny.
2. Inkubować płytki w temperaturze 37°C przez 1-2 dni, aż poszczególne kolonie będą widoczne w najbardziej rozcieńczonym miejscu na płytce.
3. Wybierz pojedynczą kolonię ze sterylną pętlą i indywidualnie dodaj każdą kolonię do 5 ml bulionu LB uzupełnionego 100 μg / ml ampicyliny do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Upewnij się, że po dodaniu pojedynczej kolonii dokładnie pipetujesz w górę i w dół, aby zapewnić homogenizację.
4. Odpowietrzyć i zakleić taśmą nakrętkę stożkowej probówki o pojemności 50 ml i inkubować w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37°C i 225 obr./min przez 8 godzin.
5. Podczas 8-godzinnej inkubacji w temperaturze 37°C dodać 40 ml bulionu LB uzupełnionego 100 μg/ml ampicyliny do każdej z czterech oddzielnych probówek stożkowych o pojemności 50 ml.
6. Po 8 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C pobrać 40 μl wyhodowanego E. kultury coli i dodać ją do wszystkich czterech stożkowych probówek o pojemności 50 ml.
7. Odpowietrzyć i zakleić taśmą nakrętki stożkowych probówek o pojemności 50 ml i inkubować je w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37°C i 225 obr./min przez 12-16 godzin.
8. Po tej inkubacji w temperaturze 37°C odwirować wszystkie probówki o stężeniu 3220 x g w obracającym się wirniku kubełkowym przez 20 minut, aby zagnieździć wyhodowane bakterie E. coli .
9. Zdekantować supernatanty do zlewki na odpady, a następnie połączyć wszystkie cztery granulki w 10 ml bulionu LB uzupełnionego 100 μg/ml ampicyliny.
10. Ponownie zakręć połączone granulki z maksymalną prędkością w wahadłowym wirniku kubełkowym przez 20 minut, aby uzyskać pojedynczy pellet.
11. Wyrzucić jak najwięcej supernatantów do zlewki na odpady i postępować zgodnie z jedną z następujących opcji: (1) Zamrozić mokry granulat w temperaturze -80° przez okres do 1 miesiąca. (2) Kontynuuj oczyszczanie plazmidu wektora lentiwirusowego.
    UWAGA: W przypadku wybrania opcji 1 protokół może zostać wstrzymany w tym miejscu.

2. Transfekcja komórek HEK293T oczyszczonym wektorem ekspresyjnym lentiwirusa CRISPR gRNA ukierunkowanym na RIP1

1. Wysiewaj HEK293T komórki przez noc w stężeniu 3 × 10⁶ do 5 × 10⁶ komórek na 10 cm płytkę zawierającą DMEM z 4,5 g/l D-glukozy, L-glutaminą, 110 mg/l pirogronianem sodu i 10 % inaktywowanym termicznie FBS.
2. Następnego dnia upewnij się, że płytki mają około 70%-90% zbieżności, a następnie postępuj zgodnie z protokołem.
3. Ustaw transfekcję komórek ze stosunkiem plazmidów 1:1:1:1 (eksperymentalny plazmid CRISPR: pLP1: pLP2: pLP/VSVG) przy użyciu odczynnika do transfekcji w stosunku 3:1 (3 części odczynnika: 1 część plazmidowego DNA), wraz ze zredukowaną pożywką surowicy.
   UWAGA: Część proporcji pLP1: pLP2: pLP/VSVG to mieszanka opakowaniowa lentiwirusów.
   1. Zrównoważyć odczynnik do transfekcji, zredukowaną pożywkę surowicy, plazmidowe DNA CRISPR i mieszankę opakowań lentiwirusowych do temperatury pokojowej przed przygotowaniem transfekcji.
   2. Wymieszać ze sobą 75 μl odczynnika do transfekcji, 2500 μl zredukowanej pożywki surowicy i 25 μg całkowitego DNA (obliczenia na podstawie analizy spektrofotometru dla plazmidowego DNA CRISPR i stosunku 1:1:1:1 z mieszanką opakowaniową lentiwirusa).
   3. Pozostaw tę mieszaninę do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 15-30 minut. Ostrożnie odpipetować całą objętość tej mieszaniny do zlewającej się płytki HEK293T komórkowej bezpośrednio do podłoża (nie ma potrzeby zmiany pożywki).
4. Delikatnie zamieszaj płytkę, aby zapewnić odpowiednią homogenizację mieszanki transfekcyjnej i podłoża płytkowego. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.

3. Transdukcja lotiwirusowa komórek U937 lub komórek docelowych

1. Po zakończeniu 48-godzinnej inkubacji w temperaturze 37^°C przenieść pożywkę z płytki HEK293T ogniwa producenta do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
2. Odwirować objętość o sile 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby rozpalić pozostałe HEK293T komórek. Usunąć cały supernatant zawierający wirusa, uważając, aby nie naruszyć granulowanych komórek HEK293T, i przechowywać go w oddzielnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Następnie należy odkazić i wyrzucić probówkę zawierającą granulki do odpowiedniego pojemnika na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne.
   UWAGA: Supernatanty lentiwirusa na bazie HIV mogą być przechowywane w temperaturze -80°C; Wiąże się to jednak z ryzykiem utraty stabilności wirusa nawet o 55% po pierwszym cyklu zamrażania/rozmrażania¹⁹.
3. Odliczyć i otrzymać osad składający się z 2 × 10⁶ komórek U937 w stożkowej probówce o pojemności 15 ml przez odwirowanie odpowiedniej objętości przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i zdekantować supernatant, pozostawiając osad komórek w probówce.
4. Zawiesić osad komórkowy U937 z całym supernatantem zawierającym wirusa, a następnie odwirować probówkę o sile 290 x g przez 60 minut.
5. Po odwirowaniu należy użyć pipety, aby ponownie zawiesić osad z supernatantem zawierającym wirusa znajdującym się już w probówce.
6. Umieść rurkę na rotatorze typu end-over-end (lub podobnym urządzeniu obrotowym) na 60 minut.
   1. Po tej inkubacji odwirować probówki o masie 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia komórek.
   2. Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą mieszaniny pożywki w stosunku 1:1 zarówno supernatantów zawierających wirusa, jak i kompletnych pożywek RPMI-1640 uzupełnionych 10% inaktywowanym termicznie FBS.
7. Przenieść mieszaninę komórek na 10-centymetrową płytkę do hodowli tkankowej i inkubować w temperaturze 37°C przez 48 godzin.
8. Po tej inkubacji odwirować komórki U937 przy 400 x g przez 10 minut i usunąć supernatant.
   1. Ponownie zawiesić osad z kompletną pożywką RPMI-1640 uzupełnioną 10% inaktywowanym termicznie FBS i 5 μg/ml puromycyny i przenieść komórki do kolby T25.
   2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C nietknięte przez 2-3 tygodnie, upewniając się, że co 1-2 dni sprawdzasz je pod kątem oznak wzrostu komórek.
      UWAGA: Gdy komórki staną się zlewające się i będą miały zdrowy czas obrotu po początkowym pasażu, można je przetestować pod kątem skuteczności zakończonego protokołu.

4. Testowanie skuteczności zrealizowanego protokołu w tworzeniu komórek z mutacją RIP1 CRISPR z wykorzystaniem analizy Western blot

1. Generuj komórkowe lizaty białkowe monocytów typu dzikiego (WT) U937, komórek CRISPR bez kierowania (NTC) i zmutowanych komórek RIP1 CRISPR 11,12,13.
2. Uruchom te lizaty na żelu SDS-PAGE i przystąp do analizy Western blot¹⁴.
   1. Najpierw znormalizuj próbki do białka porządkowego.
   2. Po normalizacji przeanalizuj próbki pod kątem poziomów ekspresji białka RIP1, aby odpowiednio określić sukces tworzenia zmutowanej linii komórkowej RIP1 CRISPR¹⁴.
3. Po konformacji w analizie western blot komórki można wykorzystać do celów eksperymentalnych.

Results

Po wytworzeniu konfluentnej populacji zmutowanych komórek U937 RIP1 CRISPR przeprowadzono analizę SDS-PAGE i Western blot. Analizę Western blot wykorzystano do określenia pomyślnego stworzenia zmutowanej linii komórkowej RIP1 CRISPR poprzez ocenę utraty poziomów ekspresji białka RIP1. Oznaczenia tego dokonano na podstawie wyniku porównawczego monocytów WT U937 i komórek NTC. Na rycinie 2 ekspresja RIP1 nie została wykryta dla zmutowanych komórek RIP1 CRISPR puromyc...

Discussion

Protokół ten ma na celu dostarczenie szczegółowych instrukcji i analizy potencjalnych pułapek w wydajności i niezawodności transfekcji i transdukcji lentiwirusa w celu stworzenia linii komórkowej U937 z nokautem RIP1. Chociaż ta metoda transfekcji i transdukcji jest pracochłonna i czasochłonna, ogólnie uważa się, że jest to skuteczny sposób na włączenie wybranego endonukleazy gRNA i Cas9 do trudnych do transfekcji linii komórkowych ^8,9,20

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Skorygowany DMEM Średni	Gibco (firma Gibco)	11995-040
Ampicyliny	Sigma	A1593 (wersja angielska)
trichlorowodorek bisBenzimide Hoechst 33342	Sigma	Zobacz materiał B2261
Kompletny RPMI-1640 Średni	Sigma	Czynnik R6504
Szczep CRISPR NTC gRNA E.coli	transOMIC (transOMICZNY)	TELA1011
Szczep CRISPR RIP1 gRNA E.coli	transOMIC (transOMICZNY)	TEVH-1162203
End-over-end Rotator	Thermo Scientific
Mikroskop fluorescencyjny EVOS FL	Technologie życiowe
Zestaw GenElute Plasmid Maxiprep	Sigma	Zobacz materiał PLX15
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG, koniugat (H+L) HRP	Sigma	AP307P (Zobacz materiał AP307P)
HEK293T komórek	Kontroler ATCC (Kontroler T
Wytrząsarka do inkubatora	Naukowy Nowy Brunszwik
LB Agar	BD	244520
Rosół LB	BD	244610
LV-MAX Lentiviral Packaging Mix	Gibco (firma Gibco)	Numer referencyjny A43237
MitoSOX Czerwony	MedChemExpress (Ekspres Medyczny)	HY-D1055 (wersja angielska)
Spektrofotometr NanoDrop	Thermo Scientific
Nekrostatyna-1	MedChemExpress (Ekspres Medyczny)	HY-14622A
OPTI-MEM	Gibco (firma Gibco)	31985-062
Puromycyna	Sigma	Zobacz materiał P7255 powiedział:
Królik anty-ludzki RIP1 mAb	Technologia sygnalizacji komórkowej	3493
SDS-PAGE i sprzęt do western blot	Przedsiębiorstwo BioRad
TNF-&alfa;	MedChemExpress (Ekspres Medyczny)	HY-P7058 (wersja angielska)
U937 Ludzkie monocyty	Kontroler ATCC (Kontroler T
System oznaczania proliferacji komórek WST-1	Takara	Zobacz materiał MK400
Odczynnik do transfekcji DNA X-tremeGENE 9	Diagnostyka Roche	6365779001
z-VAD-FMK	APExBIO	Wersja robocza A1902