Method Article

Wizualizacja białek o niskiej liczebności i modyfikacji potranslacyjnych w żywych zarodkach Drosophila poprzez wstrzyknięcie przeciwciał fluorescencyjnych

DOI:

10.3791/66080

⸱

January 19th, 2024

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, SUSTech University, 2Shenzhen PKU-HKUST Medical Center, 3Division of Life Science, Hong Kong University of Science and Technology

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje spersonalizowane znakowanie fluorescencyjne oparte na przeciwciałach i wstrzykiwanie do wczesnych zarodków Drosophila, aby umożliwić obrazowanie na żywo białek o niskiej obfitości lub modyfikacji potranslacyjnych, które są trudne do wykrycia przy użyciu tradycyjnych metod GFP/mCherry-tag.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wizualizacja białek w żywych komórkach za pomocą GFP (Zielone Białko Fluorescencyjne) i innych znaczników fluorescencyjnych znacznie poprawiła zrozumienie lokalizacji, dynamiki i funkcji białek. W porównaniu z immunofluorescencją, obrazowanie na żywo dokładniej odzwierciedla lokalizację białka bez potencjalnych artefaktów wynikających z utrwalenia tkanki. Co ważne, obrazowanie na żywo umożliwia ilościową i czasową charakterystykę poziomów i lokalizacji białek, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia dynamicznych procesów biologicznych, takich jak ruch lub podział komórek. Jednak głównym ograniczeniem metod znakowania fluorescencyjnego jest potrzeba wystarczająco wysokich poziomów ekspresji białek, aby osiągnąć udaną wizualizację. W związku z tym nie można wykryć wielu endogennie znakowanych białek fluorescencyjnych o stosunkowo niskich poziomach ekspresji. Z drugiej strony, ekspresja ektopowa przy użyciu promotorów wirusowych może czasami prowadzić do błędnej lokalizacji białek lub zmian funkcjonalnych w kontekstach fizjologicznych. Aby rozwiązać te problemy, przedstawiono podejście, które wykorzystuje wysoce czułe wykrywanie białek za pośrednictwem przeciwciał w żywych zarodkach, zasadniczo przeprowadzając immunofluorescencję bez konieczności fiksacji tkanek. Jako dowód zasady, endogenny receptor Notch znakowany GFP, który jest ledwo wykrywalny w żywych zarodkach, może być z powodzeniem uwidoczniony po wstrzyknięciu przeciwciała. Co więcej, podejście to zostało zaadaptowane do wizualizacji modyfikacji potranslacyjnych (PTM) w żywych zarodkach, co umożliwiło wykrycie czasowych zmian we wzorcach fosforylacji tyrozyny podczas wczesnej embriogenezy i ujawniło nową subpopulację fosfotyrozyny (p-Tyr) pod błonami wierzchołkowymi. Podejście to można zmodyfikować w celu uwzględnienia innych przeciwciał specyficznych dla białka, specyficznych dla znacznika lub specyficznych dla PTM i powinno być kompatybilne z innymi organizmami modelowymi lub liniami komórkowymi podatnymi na wstrzyknięcie. Protokół ten otwiera nowe możliwości obrazowania na żywo białek o niskiej liczebności lub PTM, które wcześniej były trudne do wykrycia przy użyciu tradycyjnych metod znakowania fluorescencyjnego.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunofluorescencja to podstawowa technika współczesnej biologii komórki, pierwotnie opracowana przez Alberta Coonsa, która umożliwia wykrywanie cząsteczek w ich natywnych przedziałach komórkowych i charakteryzowanie składu molekularnego subkomórkowych organelli lub maszynerii1. W połączeniu z manipulacjami genetycznymi, immunofluorescencja pomaga ugruntować obecnie dobrze akceptowaną koncepcję, że lokalizacja białka jest niezbędna dla jego funkcji2. Oprócz specyficznych przeciwciał pierwotnych i jasnych barwników fluorescencyjnych, sukces tej techniki opiera się na wstępnym procesie zwanym utrwalaniem i przepuszczalnością, który zachowuje morfologię komórkową, unieruchamia antygeny i zwiększa dostępność przeciwciał w przedziałach wewnątrzkomórkowych. Nieuchronnie proces fiksacji i przepuszczalności zabiłby komórki i zakończyłby wszystkie procesy biologiczne3. Dlatego immunofluorescencja dostarcza jedynie migawki z podróży życiowej białek. Jednak wiele procesów biologicznych, takich jak migracja i podziały komórek, ma charakter dynamiczny, co wymaga zbadania zachowań białek w sposób przestrzenno-czasowo rozwiązany4,5.

Aby zbadać dynamikę białek w organizmach żywych, opracowano metody obrazowania na żywo oparte na genetycznie kodowanych białkach fluorescencyjnych, takich jak zielone białko fluorescencyjne (GFP)6 oraz szybkie mikroskopy konfokalne. Krótko mówiąc, interesujące białko może być genetycznie manipulowane w celu fuzji z GFP7, a następnie ektopowo eksprymowane z promotorów wirusa lub drożdży, takich jak wirus cytomegalii (CMV)8 lub sekwencja aktywacji upstream (UAS)9. Ponieważ GFP ma charakter autofluorescencyjny, nie są wymagane przeciwciała sprzężone z fluoroforem, aby ujawnić lokalizację docelowych białek, co omija konieczność wstępnych procesów utrwalania lub przenikania. W ciągu ostatnich dwóch dekad opracowano znaczniki fluorescencyjne obejmujące całe spektrum długości fal10, umożliwiające wielokolorowe obrazowanie na żywo kilku docelowych białek w tym samym czasie. Jednak w porównaniu z chemicznie modyfikowanymi barwnikami fluorescencyjnymi, takimi jak AlexaFluor lub ATTO, autofluorescencja tych genetycznie kodowanych białek fluorescencyjnych jest stosunkowo słaba i niestabilna, gdy ulega ekspresji z endogennych promotorów, zwłaszcza podczas obrazowania na żywo w dłuższych skalach czasowych10. Chociaż niedobór ten można złagodzić poprzez nadmierną ekspresję znakowanych fluorescencyjnie białek docelowych, wiele z nich o aktywności enzymatycznej, takich jak kinazy i fosfatazy, poważnie zakłóca normalne procesy biologiczne, jeśli nie ulega ekspresji na poziomie fizjologicznym.

Ten protokół przedstawia metodę, która umożliwia fotostabilne oświetlenie celu na podstawie przeciwciał w konfiguracji obrazu na żywo, zasadniczo umożliwiając immunofluorescencję bez procesu fiksacji lub przenikania (Rysunek 1). Za pomocą prostej reakcji aminowej opartej na NHS11, można sprzęgnąć barwniki fluorescencyjne, takie jak AlexaFluor 488 lub 594, z zasadniczo dowolnym przeciwciałem pierwszorzędowym lub nanociałem GFP/HA/Myc12. Wykorzystując cechę rozwojową polegającą na tym, że wszystkie komórki embrionalne Drosophila mają wspólną cytoplazmę podczas etapu syncytium13, można uzyskać wiązanie antygenu i oświetlenie całych zarodków po wstrzyknięciu przeciwciał sprzężonych z barwnikiem. Dzięki rozszerzającym się bibliotekom endogennie znakowanych białek dostępnych w Drosophila i innych systemach modelowych14, metoda ta może potencjalnie poszerzyć zastosowania tych bibliotek, ujawniając dynamikę białek znakowanych fluorescencyjnie o niskiej liczebności i innych białek nieznakowanych fluorescencyjnie (HA/Myc) w żywych tkankach.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i zgodą Szkoły Nauk Przyrodniczych Uniwersytetu SUSTech. Użyty organizm to Drosophila melanogaster, a genotypy to Notch-Knockin-GFP (chromosom X) i Sqh-sqh-GFP (chromosom II), hojnie dostarczone przez laboratoria odpowiednio dr Francois Schweisguth (Instytut Pasteura) i dr Jennifer Zallen (Instytut Sloan Kettering). Chociaż protokół ten koncentruje się głównie na aspektach znakowania przeciwciał i obrazowania na żywo, zapoznaj się z opublikowanymi raportami, aby uzyskać bardziej szczegółowe opisy pobierania i wstrzykiwania zarodków Drosophila15,16.

1. Fluorescencyjne znakowanie przeciwciał

  1. Najlepiej stosować przeciwciała monoklonalne lub nanociała dla białka będącego przedmiotem zainteresowania. Przygotować podstawowe stężenie przeciwciał na poziomie 1 mg/ml lub wyższym.
    UWAGA: W tym badaniu jako przykład użyto GFP nanobody (patrz Tabela materiałów). Dostępny na rynku GFP nanobody jest pakowany w stężeniu 1,0 mg/ml i objętości 250 μl. Dodatkowo stosuje się dostępny na rynku zestaw do znakowania przeciwciał (patrz Tabela materiałów), który sprzęga Alexa Fluor 594 z pierwszorzędowymi aminami białek poprzez reakcję estru sukcynimidylu11. Co ważne, ten proces znakowania nie zmienia znacząco stężenia przeciwciał.
  2. Przygotować 1 M roztwór wodorowęglanu sodu, ponownie zawieszając składnik B (dostarczony w zestawie do znakowania przeciwciał) w 1 ml wody dejonizowanej.
  3. Dostosować stężenie przeciwciał do 1,0 mg/ml, a następnie dodać 1/10objętości (10 μl na 100 μl nanociała GFP) 1 M roztworu wodorowęglanu sodu.
  4. Dodać 110 μl mieszaniny przeciwciał (z kroku 1.3) bezpośrednio do probówki zawierającej barwnik Alexa Fluor 594. Odwrócić do mieszania (nie wirować) i inkubować na rotatorze przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  5. Zmontuj kolumnę oczyszczającą z zestawu do koniugacji (patrz Tabela materiałów). Przygotować złoże żywicy o pojemności 1,5 ml (dostarczone w zestawie do znakowania przeciwciał) i odwirować kolumnę przy 1100 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej (RT), aby usunąć nadmiar płynu z żywicy.
  6. Dodać mieszaninę reakcyjną (z kroku 1.4) kroplami na górę kolumny z żywicą i odwirować przy 1100 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu zebrania znakowanego przeciwciała. Pobrane przeciwciało powinno mieć różowy kolor, a objętość powinna być nieco mniejsza niż 100 μl. Przechowywać w owiniętych folią lub ciemnych probówkach w temperaturze 4 °C.

2. Przygotowanie zarodków Drosophila

  1. Umieść 200 nowo wyklutych dorosłych Drosophila w plastikowej klatce w kształcie cylindra (średnica = 5 cm, wysokość = 8 cm) ze stosunkiem samców do samic 1: 10. Uszczelnij jedną stronę porowatą metalową siatką do wentylacji, a drugą stronę płytką agarową z sokiem owocowym/pastą drożdżową.
  2. Zmieniaj płytkę co 12 godzin przez trzy dni przed pobraniem zarodków. Pozwala to na synchronizację składania jaj przez Drosophila i poprawia wydajność zbierania.
  3. W dniu wstrzyknięcia należy zmienić klatkę na talerz z sokiem owocowym z minimalną ilością pasty drożdżowej i zbierać zarodki w temperaturze 25 °C przez 1 godzinę. Jeżeli pierwsza runda pobierania nie daje wystarczającej liczby zarodków (<50 zarodków), należy wyrzucić pierwszą płytkę i powtarzać ten krok w drugiej rundzie pobierania, aż w ciągu 1 godziny zostanie złożonych więcej niż 100 zarodków.
  4. Wyjąć płytkę z klatki, aby zatrzymać składanie jaj i inkubować w temperaturze 25 °C przez kolejne 2 godziny, aby uzyskać zarodki w wieku 2-3 godzin. Prawidłowy etap rozwoju zarodków ma kluczowe znaczenie dla powodzenia wstrzyknięcia przeciwciał.
  5. Aby usunąć skorupkę zarodków, dodaj 2 ml 50% wybielacza do talerza z sokiem owocowym i delikatnie usuń zarodki z płytki za pomocą pędzla (Rysunek 2A-4). Często zarodki są układane bezpośrednio na paście drożdżowej. W takim przypadku dopuszczalne jest wcieranie pasty drożdżowej w roztwór wybielacza, aby zebrać wszystkie zarodki.
  6. Inkubuj pływające zarodki w 50% wybielaczu przez 2 minuty i obracaj talerz z sokiem owocowym co 30 sekund, aby poprawić skuteczność usuwania skorupek jaj.
  7. Przenieś mieszankę zarodków i wybielaczy, wlewając ją do sitka do komórek nylonowych o średnicy 70 μm (Rysunek 2A-7). Dokładnie umyj zarodki za pomocą butelki z wodą, aby usunąć resztki wybielacza i pasty drożdżowej. Całkowicie osusz sitko do komórek ręcznikami papierowymi, upewniając się, że nadmiar wody wokół zarodków został usunięty.

3. Wyrównanie i wysuszenie zarodka

  1. Przygotuj żel 4% agarozowy o wymiarach 5 cm x 5 cm x 0,5 cm (szerokość, długość, wysokość) (Rysunek 2A-9) i pozwól żelowi ostygnąć do temperatury pokojowej. Wytnij blok agarozy o wymiarach 1 cm x 3 cm x 0,5 cm (szerokość, długość, wysokość) za pomocą czystej żyletki i umieść klocek na szkiełku podstawowym (Rysunek 2A-2). Sprawdź blok żelu pod lunetą preparacyjną, aby upewnić się, że krawędzie są przycięte prosto, a powierzchnia jest płaska i sucha.
  2. Przenieś zarodki z sitka na blok żelowy za pomocą pędzla. Rozłóż zarodki równomiernie wzdłuż linii środkowej bloku, delikatnie szczotkując. Idealnie, skupiska zarodków są rozdzielane na pojedyncze lub dublety, nie stykając się ze sobą.
  3. Przygotuj pęsetę z dwiema nogami ściśle sklejonymi ze sobą, aby utworzyć jedną cienką końcówkę (Rysunek 2A-5). Pod lunetą sekcyjną podnieś pojedyncze zarodki za pomocą pęsety i umieść je wzdłuż dłuższej krawędzi bloku żelu. Wyrównaj 20-30 zarodków, upewniając się, że ich oś przednio-tylna jest równoległa do krawędzi (Rysunek 2C).
  4. Odpipetuj 10 μl kleju heptanowego (patrz Tabela materiałów) na środku szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 mm x 50 mm (Rysunek 2A-1) i rozprowadź klej na prostokątnym obszarze o wymiarach 0,5 cm x 3 cm za pomocą końcówki do pipety. Przed użyciem poczekaj, aż klej całkowicie wyschnie.
  5. Umieść szkiełko podstawowe z blokiem żelowym na krawędzi biurka, tak aby zarodki były skierowane na zewnątrz. Podnieś szkiełko nakrywkowe za pomocą kleju za pomocą pęsety z płaską końcówką (Ryc. 2A-6) i przytrzymaj je nieruchomo na zarodkach, stroną kleju skierowaną w stronę zarodków pod kątem około 45 stopni.
    UWAGA: Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do bloku żelu, aby zarodki miały kontakt z klejem, a następnie szybko zwolnij nacisk i podnieś szkiełko nakrywkowe. Wielkość zastosowanego naprężenia ma kluczowe znaczenie, aby zarodki mogły być stabilnie przymocowane do kleju bez zbyt mocnego nacisku i pękania.
  6. Odpipetować 10 μl wody na środek nowego szkiełka podstawowego i umieścić szkiełko nakrywkowe z zarodkami na wierzchu, stroną zarodka skierowaną do góry (Rysunek 2B). Upewnij się, że używasz wody zamiast lakieru do paznokci lub innego kleju do mocowania szkiełka nakrywkowego do szkiełka podstawowego, ponieważ ta strona szkiełka nakrywkowego zostanie umieszczona bezpośrednio na soczewce konfokalnej w celu obrazowania na żywo.
  7. Suszyć zarodki w komorze suszącej (Rysunek 2A-3) (patrz Tabela Materiałów) przez 10-15 minut, aż błona witelinowa zacznie się marszczyć (Rysunek 2E). Wymagany czas może się różnić w zależności od wilgotności w pomieszczeniu i powinien być testowany doświadczalnie dla każdych warunków laboratoryjnych.
  8. Odmierzyć pipetą 40 μl oleju halowęglowego (mieszanina typu 27 i typu 700 w stosunku objętościowym 1:1, patrz tabela materiałów) na jednym końcu paska zarodkowego. Przechyl szkiełko, aż olej halowęglowy pokryje całą powierzchnię zarodków.

4. Wstrzykiwanie przeciwciał i obrazowanie

  1. Przygotować kilka szklanych igieł do wstrzykiwań za pomocą ściągacza do mikropipet (ustawienia parametrów znajdują się w Tabeli materiałów) i załadować do każdej igły 5 μl roztworu przeciwciał znakowanych AlexaFluor (od kroku 1.6).
  2. Umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 25 mm x 25 mm na szkiełku podstawowym na szkiełku podstawowym . Odpipetować 40 μl oleju halowęglowego i rozprowadzić go wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego.
  3. Pod zakresem iniekcji wyrównać końcówkę igły z krawędzią szkiełka nakrywkowego pod olejem. Wyregulować ciśnienie powietrza wtryskowego pikopompy (patrz Tabela Materiałów) tak, aby jedna pompa wytworzyła jeden pęcherzyk wypełniony przeciwciałami. Średnica pęcherzyka powinna być ograniczona do 20-50 μm (Rysunek 2F).
  4. Zastąp puste szkiełko szkiełkowe szkiełkiem podstawowym zawierającym zarodki pod olejem. Ustawić końcówkę igły do wstrzykiwań prostopadle do osi przednio-tylnej zarodków (Rysunek 2D,G).
  5. Sprawdź stadium zarodków, aby upewnić się, że większość z nich rozpoczęła celularyzację, ale jeszcze nie rozpoczęła gastrulacji (etap 4 i etap 5), pozostając jako syncytium (Rysunek 2F,G).
    UWAGA: Cechą charakterystyczną tego etapu jest brak jakichkolwiek rowków lub fałd oraz obecność owalnej, ciemnej torebki żółtkowej widocznej w środku zarodka. Charakterystyka morfologiczna stadium zarodkowego pod olejem opiera się na rozdziale książki "Stages of Drosophila Embryogenesis" autorstwa Volkera Hartensteina17.
  6. Użyj manipulatora etapu X-Y, aby przesunąć zarodki w kierunku igły, aż końcówka dotrze do środka żółtka. Pompuj dwa do trzech razy, aby wstrzyknąć przeciwciała do żółtka. Na udane wstrzyknięcie wskazuje szybkie zaniknięcie zmarszczki błony witelinowej w miarę jak zarodki zyskują objętość z roztworu przeciwciała (Ryc. 2G).
  7. Użyj manipulatora stopnia X-Y, aby odsunąć zarodki od igły po wstrzyknięciu i przejść w dół do następnego zarodka. Powtarzaj krok 6, aż wszystkie zarodki znajdujące się na szkiełku zostaną wstrzyknięte.
  8. Przenieś szkiełko podstawowe z wstrzykniętymi zarodkami do komory wilgotnościowej (Ryc. 2A-8). Inkubować w temperaturze 25 °C aż do osiągnięcia pożądanego etapu rozwoju zarodka.
  9. Zdejmij szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 mm x 50 mm ze szkiełka podstawowego i umieść je bezpośrednio w uchwycie szkiełka mikroskopowego. Strona, która nie ma zarodków, będzie zmierzona z celami. Zlokalizuj zarodki za pomocą soczewki o małym powiększeniu w jasnym oświetleniu pola i przełącz się na obiektyw 40x lub 63x, aby uzyskać fluorescencyjne obrazowanie na żywo o wysokiej rozdzielczości.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zademonstrować zalety metody wstrzykiwania przeciwciał w porównaniu z obrazowaniem na żywo opartym na znacznikach fluorescencyjnych lub immunofluorescencji, przedstawiono dwa studia przypadków, które charakteryzują dynamiczną lokalizację receptora transbłonowego o niskiej liczebności, Notch, oraz rodzaj modyfikacji potranslacyjnej zwanej fosforylacją tyrozyny w żywych zarodkach.

Aktywność sygnalizacyjna Notch odgrywa główną rolę w określaniu losu komórki podczas embriogenezy i homeostazy dorosłych organów18,19. Po aktywacji przez jego ligandy Delta/Jagged20, wewnątrzkomórkowa domena transbłonowego receptora Notch jest rozszczepiana i uwalniana do jądra21, inicjując dalsze programy transkrypcyjne w celu sterowania zmianami losu komórki22. Statyczna lokalizacja receptora Notch została dobrze scharakteryzowana przez immunofluorescencję w tkankach utrwalonych formaldehydem. Jednak dynamiczna lokalizacja Notch podczas wiązania liganda lub procesu rozszczepienia wewnątrzkomórkowego pozostaje w dużej mierze nieznana23, ze względu na brak metody obrazowania na żywo tego stosunkowo niskiego białka w szybki sposób. Tutaj wstrzyknęliśmy koniugowaną z AlexaFluor nanobody GFP do embrionów eksprymujących znakowany GFP Notch z endogennego locus20. Bez iniekcji Notch-GFP jest ledwo wykrywalny w standardowych warunkach obrazowania na żywo, a sygnał fluorescencyjny szybko blednie podczas obrazowania poklatkowego. Po wstrzyknięciu stosunek sygnału do szumu receptora Notch znacznie się poprawia, porównywalny z jakością sygnału immunofluorescencji (Rysunek 3A). Co więcej, wstrzyknięcie przeciwciała pozwala na czasową charakterystykę lokalizacji Notch w odstępach 45 s, bez widocznej utraty intensywności sygnału w ciągu 5-minutowego okna obrazowania (Figura 3B).

Fosforylacja tyrozyny to główny rodzaj potranslacyjnej modyfikacji białka, która pośredniczy w transdukcji sygnału w wielu szlakach biologicznych24. Wysoce specyficzne przeciwciała monoklonalne (takie jak PY20 i 4G10) przeciwko fosfotyrozynie (p-Tyr) zostały opracowane w celu scharakteryzowania lokalizacji i poziomów ogólnej fosforylacji tyrozyny za pomocą immunofluorescencji i Western Blots25. Chociaż żadne znaczniki fluorescencyjne nie mogą śledzić zmian fosforylacji, tkanki lub komórki muszą być utrwalone i wybarwione lub zlizowane i osuszone w różnych punktach czasowych, aby zapewnić migawki stanu fosforylacji w czasie, aby zbadać kinetykę fosforylacji tyrozyny po aktywacji sygnału26 (np. leczenie czynnikiem wzrostu). Przedział czasowy tego podejścia jest co najmniej kilkuminutowy i z natury niedokładny ze względu na zmienny czas wymagany do procedur takich jak utrwalanie lub liza komórek.

Tutaj przedstawiono dowody na to, że metoda wstrzykiwania przeciwciał umożliwia bezpośrednią wizualizację stanu fosforylacji w żywych zarodkach, śledząc lokalizację i intensywność zmian fosforylacji tyrozyny w regularnych, sekundowych odstępach czasu. Przeciwciało PY20 sprzężone z AlexaFluor wstrzyknięto do zarodków eksprymujących łańcuch świetlny miozyny znakowany GFP i przeprowadzono dwukolorowe obrazowanie na żywo w odstępach 45 sekund. Jak wykazano wcześniej, fosforylacja tyrozyny jest wysoce wzbogacona w połączeniach trójkomórkowych27, wzór, który jest również rekapitulowany przez immunofluorescencję (Rysunek 4A). Co ciekawe, obrazowanie na żywo ujawniło również nową, drugą populację sygnału p-Tyr pod środkiem błony wierzchołkowej, która nie jest obserwowana za pomocą immunofluorescencji (Figura 4B). Dzięki dwukolorowemu obrazowaniu stwierdzono, że ta populacja sygnału p-Tyr znajduje się w bliskim sąsiedztwie przyśrodkowej miozyny (Rysunek 4B, zbliżenia), subpopulacji miozyny28, która jest podobnie wyraźna tylko w warunkach obrazowania na żywo, ale ledwo wykrywalna za pomocą immunofluorescencji. Ponadto, medialna populacja p-Tyr wykazuje podobne pulsacyjne wzorce koalescencji i dyssypacji (Rysunek 4C), jak wcześniej pokazano dla przyśrodkowej miozyny 28. Tożsamość i funkcja subpopulacji przyśrodkowej p-Tyr są nadal nieznane. Łącznie wyniki te pokazują, że metoda wstrzykiwania przeciwciał może znacznie uzupełnić tradycyjne podejścia do charakteryzowania zachowań białek o niskiej liczebności i ujawnić nowe wzorce lokalizacji, które mogły zostać zakłócone podczas procesu immunofluorescencji.

figure-results-1
Rysunek 1: Przebieg pracy z wstrzykiwaniem przeciwciał. Schematyczny przebieg pracy ilustrujący etapy związane z metodą wstrzykiwania przeciwciał. Cały proces, od pobrania zarodka do wstrzyknięcia przeciwciał, trwa zwykle około 4-5 godzin. Po wstrzyknięciu przeciwciał zarodki mogą być inkubowane w komorze wilgotnościowej do pożądanego etapu rozwoju przed obrazowaniem na żywo. AEL, po złożeniu jaj; RT, temperatura pokojowa; Ab, przeciwciało. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Wyrównanie i wstrzyknięcie zarodka. (A) Przegląd przedmiotów wymaganych przed wstrzyknięciem, w tym szkiełko nakrywkowe, szkiełko podstawowe, pudełko do suszenia, pędzel, pęseta, sitko do komórek, komora wilgotnościowa i żel agarozowy. (B) Wyrównane zarodki przymocowane do kleju heptanowego w środku szkiełka nakrywkowego i umieszczone na wierzchu koralików wysuszających. (C) Wyrównanie osi przednio-tylnej zarodków równolegle do krawędzi żelu agarozowego. (D) Przegląd konfiguracji wtrysku. (E) Porównanie morfologii zarodka przed i po procesie wysuszenia, ze szczególnym uwzględnieniem zmarszczek błony witelowej po wysuszeniu. (F) Wielkość pęcherzyka iniekcyjnego po pojedynczym naciśnięciu pikopompy. (G) Porównanie morfologii zarodka przed i po wstrzyknięciu przeciwciała, ze szczególnym uwzględnieniem zaniku zmarszczek błonowych po wstrzyknięciu. (E-G) zostały uchwycone pod soczewką obiektywu o powiększeniu 10x przy użyciu mikroskopii jasnego pola. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Obrazowanie na żywo receptora Notch we wczesnych zarodkach. (A) Lokalizacja endogennego receptora Notch znakowanego GFP poprzez immunofluorescencję (po lewej), bezpośrednie obrazowanie na żywo oparte na autofluorescencji GFP (w środku) i wstrzyknięcie nanonoma GFP sprzężonego z AlexaFluor 594 (po prawej). (B) Dynamiczna lokalizacja Notch-GFP obrazowana w odstępach 45 s po wstrzyknięciu przeciwciała. Wszystkie obrazy zostały uzyskane z przednią częścią zarodków po lewej stronie i stroną brzuszną skierowaną w dół. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Obrazowanie na żywo embrionalnych wzorców fosfotyrozyny. (A) Lokalizacja fosforylowanej tyrozyny (p-Tyr) w utrwalonych zarodkach poprzez immunofluorescencję. (B) Lokalizacja p-Tyr (magenta) w żywych zarodkach wykazujących ekspresję łańcucha świetlnego miozyny znakowanej GFP (zielony). Białe przerywane pole wskazuje zbliżenia na populację medialną fosfotyrozyny i miozyny pod błoną wierzchołkową. Podziałka = 10 μm. (C) Lokalizacja p-Tyr i GFP-miozyny obrazowana co 45 s w żywych zarodkach. Białe strzałki wskazują populację środkową p-Tyr i miozyny. Wszystkie obrazy zostały wykonane z przednią częścią zarodków po lewej stronie i stroną brzuszną skierowaną w dół. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona procedura przedstawia specjalistyczną metodę znakowania fluorescencyjnego za pomocą niestandardowych przeciwciał, a następnie wstrzykiwania do zarodków Drosophila we wczesnym stadium rozwoju. Technika ta ułatwia wizualizację w czasie rzeczywistym białek lub modyfikacji potranslacyjnych, które występują w małych ilościach i są zazwyczaj trudne do zaobserwowania za pomocą konwencjonalnych metod znakowania GFP/mCherry.

Należy zachować ostrożność przy rozszerzaniu tej metody w celu dokonania porównań ilościowych między zarodkami typu dzikiego i zmutowanymi. Podczas gdy stężenie przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych może być utrzymywane na tym samym poziomie między grupą kontrolną i eksperymentalną w immunofluorescencji, ilość wstrzykniętego przeciwciała i skuteczność znakowania mogą się różnić w zależności od zarodka. Dlatego analiza ilościowa powinna ograniczać się do śledzenia zmian intensywności fluorescencji w czasie lub przeprowadzania analizy korelacji z sygnałami innych kanałów w tym samym zarodku podczas wykonywania wielokolorowego obrazowania na żywo. Na przykład analizę kolokalizacji i korelacji można przeprowadzić przy użyciu intensywności p-Tyr i miozyny27, podczas gdy intensywności p-Tyr nie można bezpośrednio porównać między zarodkami typu dzikiego i genem X knockdown przy użyciu metody wstrzykiwania przeciwciał.

Podobnie jak w przypadku innych podejść opartych na znacznikach fluorescencyjnych do badania dynamiki białek, wiązanie przeciwciał może potencjalnie zmienić aktywność, transport lub lokalizację docelowych białek. Dlatego przeciwciała monoklonalne lub nanociała są preferowane w stosunku do przeciwciał poliklonalnych do wstrzykiwań. Ponieważ epitopy przeciwciał monoklonalnych lub nanociał są dobrze zdefiniowane, to, czy blokowanie tych epitopów przeciwciałami zmienia aktywność białka, można modelować na podstawie struktur alfa-krotnych12,25. Z drugiej strony, epitopy przeciwciał poliklonalnych nie są precyzyjnie określone, a ich wiązanie może potencjalnie zmienić lokalizację lub aktywność białka, jeśli kieszenie katalityczne lub peptydy sygnałowe docelowych białek są zablokowane. Po drugie, przeciwciała mogą rozpoznawać niespecyficzne epitopy inne niż białka docelowe, zwłaszcza biorąc pod uwagę, że nie ma tutaj etapów "wypłukiwania", jak w przypadku immunofluorescencji, w celu usunięcia niespecyficznych wiązań o niższym powinowactwie. Dlatego ważne jest, aby mieć grupy kontrolne, takie jak wstrzykiwanie przeciwciał do komórek pozbawionych epitopu, aby sprawdzić, czy obserwowany sygnał naprawdę odzwierciedla białka docelowe lub inne niespecyficzne epitopy.

Wstrzyknięcie przeciwciał nie różni się od wstrzykiwania siRNA lub gRNA CRISPR pod względem konfiguracji eksperymentalnej. Dlatego większość układów komórkowych, które są podatne na zastrzyki, powinna być kompatybilna z metodą wstrzykiwania przeciwciał. W zarodkach Drosophila przeciwciała sprzężone z fluorem Alexa są stabilne podczas rozwoju, a sygnały fluorescencyjne pozostają wykrywalne po kilku godzinach embriogenezy. W przypadku innych systemów, takich jak zarodki Xenopus lub Danio pręgowany, stężenie i objętość wstrzykniętych przeciwciał powinny być empirycznie testowane poprzez seryjne rozcieńczenia, aby osiągnąć idealną skuteczność znakowania. Ponadto alternatywne barwniki fluorescencyjne, takie jak ATTO10 , mogą potencjalnie oferować lepszy stosunek sygnału do szumu i rozpuszczalność w wodzie.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować dr Jennifer A. Zallen za dostarczenie linii Sqh-GFP Drosophila i wsparcie dla początkowego rozwoju tej techniki, oraz dr Francois Schweisguth za dostarczenie linii Notch-GFP Drosophila. Praca ta była wspierana przez fundusze z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (32270809) dla H.H.Yu, hojne wsparcie finansowe i kadrowe ze Szkoły Nauk Przyrodniczych, SUSTech oraz fundusze dla Y. Yana z Shenzhen Science and Technology Innovation Commission/JCYJ20200109140201722.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgarozaSangon Biotechnologia  A620014 
Zestaw do znakowania przeciwciał Alexa Fluor 594Invitrogen A20185Kolumna oczyszczająca z kroku 1.6 jest zawarta w tym zestawie
Mikroskop biologicznySOPTOPEX20Soczewka okularu: PL 10X/20. Soczewka obiektywu: 10x/0,25
BleachClorox®
Kapilary ze szkła borokrzemianowegoWorld Precision InstrumentsWirówka TW100F-4
Eppendorf5245
Sitko do komórekFALCON352350
Komora suszenia ZAMEK& LOCKHSM8200320ml
Mikroskop preparacyjnyMshotMZ62Soczewka okularu: WF10X/22mm.
Taśma dwustronnaScotch665
Drobna super pęsetaVETUSST-14
Fisherbrand™ Okulary nakrywkowe: ProstokątyFisherbrand12-545F
Fisherbrand™ Superfrost i handel; Szkiełka mikroskopowe PlusFisherbrand12-550-15
KleszczVETUS33A-SA
Olej halowęglowy 27Sigma-AldrichH8773-100ML
Olej halowęglowy 700Sigma-AldrichH8898-100ML
HeptaneSigma-AldrichH2198-1LKlej heptanowy wykonany jest z dwustronnej taśmy zanurzonej w heptanie
Odczynnik do odwadniania TOKAI1-7315-01Napełnij do 90% objętości komory osuszania
Ręczny mikromanipulatorWorld Precision InstrumentsM3301R
Ściągacz do mikropipetWorld Precision InstrumentsPUL-1000Procedura: krok 1, Ciepło: 290, siła: 300, odległość: 1.00, opóźnienie: 50,
Krok 2, ciepło: 290, siła: 300, odległość: 2.21, opóźnienie: 50 
Pneumatyczna pompa picopumpWorld Precision InstrumentsPV 830Wyrzut: 20 psi;   Zasięg: 100ms; Czas trwania: czasowy
PY20Santa CruzSC-508
Kwadratowe szalki PetriegoBiosharpBS-100-SD
GFP nanobodyChromotekgt

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Coons, A. H. The beginnings of immunofluorescence. Journal of Immunology (Baltimore, Md). 87, 499-503 (1961).
  2. Arthur, G., et al. Harnessing the power of the antibody. The Lancet Respiratory Medicine. 4 (3), 181-182 (2016).
  3. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. Biobanking, methods and protocols. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2018).
  4. Ragkousi, K., Gibson, M. C. Epithelial integrity and cell division: Concerted cell cycle control. Cell Cycle. 17 (4), 399-400 (2018).
  5. Herszterg, S., Leibfried, A., Bosveld, F., Martin, C., Bellaiche, Y. Interplay between the dividing cell and its neighbors regulates adherens junction formation during cytokinesis in epithelial tissue. Developmental Cell. 24 (3), 256-270 (2013).
  6. Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, aequorea. Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).
  7. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  8. Boshart, M., et al. A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. Cell. 41 (2), 521-530 (1985).
  9. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  10. Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2016).
  11. Berg, E. A., Fishman, J. B. Labeling antibodies using N -Hydroxysuccinimide (NHS)-fluorescein. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (3), (2019).
  12. Saerens, D., et al. Identification of a universal VHH framework to graft non-canonical antigen-binding loops of camel single-domain antibodies. Journal of Molecular Biology. 352 (3), 597-607 (2005).
  13. Loncar, D., Singer, S. J. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (6), 2199-2203 (1995).
  14. Lye, C. M., Naylor, H. W., Sanson, B. Subcellular localisations of the CPTI collection of YFP-tagged proteins in Drosophila embryos. Development. 141 (20), 4006-4017 (2014).
  15. Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 50, e2477(2011).
  16. Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 49, e2503(2011).
  17. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , 9-102 (1997).
  18. Ho, D. M., Artavanis-Tsakonas, S. The Notch-mediated proliferation circuitry. Current Topics in Developmental Biology. 116, 17-33 (2016).
  19. Kopan, R., Ilagan,, Ma, X. G. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
  20. Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
  21. Struhl, G., Greenwald, I. Presenilin is required for activity and nuclear access of Notch in Drosophila. Nature. 398 (6727), 522-525 (1999).
  22. Henrique, D., Schweisguth, F. Mechanisms of Notch signaling: a simple logic deployed in time and space. Development. 146 (3), dev172148(2019).
  23. Trylinski, M., Mazouni, K., Schweisguth, F. Intra-lineage fate decisions involve of notch receptors basal to the midbody in drosophila sensory organ precursor cells. Current Biology. 27 (15), 2239.e3-2247.e3 (2017).
  24. Hunter, T. Protein kinases and phosphatases: The Yin and Yang of protein phosphorylation and signaling. Cell. 80 (2), 225-236 (1995).
  25. Glenney, J. R., Zokas, L., Kamps, M. P. Monoclonal antibodies to phosphotyrosine. Journal of Immunological Methods. 109 (2), 277-285 (1988).
  26. Hunter, T., Cooper, J. A. Epidermal growth factor induces rapid tyrosine phosphorylation of proteins in A431 human tumor cells. Cell. 24 (3), 741-752 (1981).
  27. Yu, H. H., Zallen, J. A. Abl and Canoe/Afadin mediate mechanotransduction at tricellular junctions. Science. 370 (6520), eaba5528(2020).
  28. Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin–myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescent Antibody InjectionLive Protein ImagingDrosophila EmbryosLow Abundance ProteinsPost Translational ModificationsTyrosine PhosphorylationGFP NanobodyNotch Receptor LocalizationEmbryo MicroinjectionFluorescent Live Imaging

Related Articles