Artykuł metodologiczny

Nieinwazyjny test do oznaczania kinetyki biosyntezy chlorofilu we wczesnych stadiach deetiolacji rzodkiewnika

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66087

⸱

12 stycznia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CEITEC - Central European Institute of Technology, Masaryk University, 2National Centre for Biomolecular Research, Faculty of Science, Masaryk University, 3Institute of Food Biotechnology and Genomics, National Academy of Sciences of Ukraine, 4Labdeers s.r.o, 5Photon Systems Instruments, Prumyslova

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy zaawansowane narzędzie przeznaczone do monitorowania biosyntezy chlorofilu podczas wczesnych etapów deetiolacji siewek rzodkiewnika. Nowatorska metodologia umożliwia nieinwazyjne obrazowanie fluorescencji chlorofilu w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej.

Streszczenie

Biosynteza chlorofilu jest cechą charakterystyczną deetiolacji, jednego z najbardziej dramatycznych etapów w cyklu życia rośliny. Ściśle kontrolowany i wysoce dynamiczny proces biosyntezy chlorofilu jest uruchamiany podczas przejścia z ciemności do światła u roślin kwitnących. W momencie, gdy etiolowane siewki są wystawione na pierwsze ślady światła słonecznego, w szybkim (rzędu sekund) przemianie protochlorofilu w chlorofil pośredniczą unikalne kompleksy białkowe akceptujące światło, prowadzące poprzez kolejne etapy metaboliczne do produkcji w pełni funkcjonalnego chlorofilu. Standardowe techniki analizy zawartości chlorofilu obejmują ekstrakcję pigmentu z oderwanych tkanek roślinnych, co nie ma zastosowania do badania tak szybkich procesów. Aby zbadać kinetykę chlorofilu in vivo z dużą dokładnością i rozdzielczością czasoprzestrzenną w pierwszych godzinach po deetiolacji wywołanej światłem, opracowano instrument i protokół. W tym miejscu przedstawiamy szczegółową procedurę przeznaczoną do statystycznie solidnej oceny ilościowej chlorofilu we wczesnych stadiach deetiolacji rzodkiewnika.

Wprowadzenie

Deetiolacja reprezentuje najbardziej dramatyczną fazę w cyklu życia rośliny, charakteryzującą się szeregiem zmian morfologicznych i całkowitym przegrupowaniem metabolizmu roślin (z hetero- na autotropikalny)1. Biosynteza chlorofilu jest cechą charakterystyczną deetiolacji roślin wywołanej światłem i bardzo dynamicznym procesem. Tworzenie chlorofilu z wytwarzanego w ciemności prekursora protochlorofildu musi być ściśle skoordynowane, aby uniknąć uszkodzeń spowodowanych reaktywnymi produktami ubocznymi2. Redukcja protochlorofilu do chlorofilu jest katalizowana przez zależne od światła oksydoreduktazy protochlorofilowe (POR), unikalne enzymy aktywowane bezpośrednio przez światło. Reakcja jest bardzo szybka, zachodzi w kolejności od ms do s3, prowadząc do rozpoznawalnej akumulacji chlorofilu w ciągu kilku minut po napromieniowaniu etiolowanej siewki4,5,6. Biogeneza chloroplastów potrzebuje więcej czasu (z godzin do dni), aby stworzyć w pełni funkcjonalny aparat fotosyntetyczny3.

Istnieją różne metody analizy zawartości chlorofilu, w tym wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) lub spektrofotometria. Zazwyczaj techniki te wymagają zniszczenia tkanki roślinnej4,5,6, ograniczając określanie zmian poziomu chlorofilu w czasie. Metody pozwalające na ustalenie nieinwazyjnej kinetyki chlorofilu mogą otworzyć zupełnie nową perspektywę badania roślin w różnych aspektach, począwszy od podstawowych pytań badawczych, takich jak analiza procesu syntezy chlorofilu w czasie i przestrzeni, po bardziej praktyczne zastosowania, takie jak ocena tolerancji stresu czy wpływu biostymulatorów na kinetykę chlorofilu. Biorąc to pod uwagę, wprowadziliśmy system monitorowania tworzenia się chlorofilu, iReenCAM7. Składa się z kamery CCD, filtrów emisyjnych, źródeł światła i rurociągu do automatycznej analizy fluorescencji (Rysunek 1). Główną cechą opracowanego urządzenia jest wysoka rozdzielczość przestrzenna i czasowa, przewyższająca parametry stosowane w obecnych podejściach, oraz wystarczająca czułość i swoistość w porównaniu ze standardowymi metodami analitycznymi7.

Opisana tutaj nieinwazyjna procedura wymaga minimalnej ilości odczynników i składa się z prostych kroków, pozwalających na uzyskanie profilu kinetyki chlorofilu u żywych siewek Arabidopsis podczas bardzo wczesnych etapów deetiolacji. Protokół może być przydatny do badania wysoce dynamicznego procesu syntezy chlorofilu, na który wpływa szereg czynników, zarówno egzogennych (sól, susza, biostymulanty, metale ciężkie itp.), jak i endogennych (zwykle związanych ze zmianami w aktywności genu) pochodzenia bez konieczności odrywania jakiejkolwiek tkanki roślinnej, unikając w ten sposób dodatkowego stresu.

Protokół

1. Przygotowanie podłoża

  1. Przygotować podłoże uprawowe, mieszając 0,75 g środka żelującego z 50 ml sterylnej wody dejonizowanej w szklanej butelce, aby uzyskać stężenie 1,5% (w/v) dla jednej płytki Petriego (120 x 120 x 17 mm). Delikatnie wstrząśnij mieszaniną, a następnie podgrzej ją w kuchence mikrofalowej do wrzenia, aby rozpuścić środek żelujący (roztwór stanie się klarowny).
  2. Pozostawić podłoże do ostygnięcia do temperatury 58-60 °C przed przejściem do kolejnych kroków. Wszystkie kolejne kroki muszą być wykonywane w sterylnych warunkach w okapie z przepływem laminarnym, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
  3. Używaj płytek Petriego z krawędziami szczelnymi dla światła, aby uniknąć nadmiernego odbicia światła aktynowego i wysokiej autofluorescencji tła podczas pomiarów. W tym celu nałóż czarną taśmę klejącą (lub inne dostępne środki), aby pokryć wszystkie boki pustej płytki Petriego (Rysunek 2).
  4. Przeprowadzić sterylizację płytki(ów) po nałożeniu taśmy poprzez naświetlanie bakteriobójczą lampą UV przez 20-30 min.
  5. Jeśli eksperyment obejmuje obróbkę chemiczną (tj. abiotyczne/biotyczne czynniki stresogenne, hormony roślinne i/lub regulatory wzrostu itp.), dodaj odpowiednią ilość odpowiedniej substancji chemicznej bezpośrednio do pożywki. Należy pamiętać o wybranej stabilności chemicznej dodawanej do podłoża (na przykład, jeśli substancja chemiczna nie jest termostabilna, dodaj do podłoża, gdy jest schłodzone tuż przed wlaniem go do płytki). Dokładnie wymieszaj podłoże, wstrząsając, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie substancji chemicznej.
  6. Unikaj oświetlania płytek światłem UV po nalaniu pożywki (doprowadziłoby to do produkcji rodników tlenowych, które mogłyby zakłócić eksperyment).
  7. Wlać przygotowane podłoże do kwadratowej płytki Petriego (płytek) Petriego i pozostawić pożywkę do zestalenia się w temperaturze pokojowej.

2. Sterylizacja powierzchni nasion i warunki wzrostu roślin

  1. Pobrać wymaganą ilość nasion Arabidopsis thaliana Col-0 z bulionu (10-20 mg) i dodać ją do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml.
    UWAGA: Nie są konieczne żadne szczególne modyfikacje podczas pracy z różnymi liniami Arabidopsis (linie ekotypowe/zmutowane). Rewizja siatki piłowania i etapów pomiarowych powinna być przeprowadzana dla innych gatunków roślin, biorąc pod uwagę różnice w wielkości nasion, zdolności kiełkowania i wielkości siewek.
  2. Nasiona rzodkiewnika należy sterylizować powierzchniowo, dodając 70% etanolu do probówki przez 2 minuty. Podczas sterylizacji delikatnie potrząśnij probówkami.
  3. Usunąć etanol, ostrożnie pipetując, uważając, aby nie stracić żadnych nasion. Umyj nasiona, dodając sterylną wodę do probówki przez 5 minut, aby usunąć resztki etanolu (delikatnie potrząśnij probówkami w okresie mycia).
  4. Pozwól nasionom opaść na dno rurki grawitacyjnie, usuń pozostałą wodę.
  5. Ponownie opłucz nasiona 2x sterylną wodą, jak opisano w kroku 2.3, aby upewnić się, że są wolne od jakichkolwiek cech etanolu. Pozwól nasionom opaść na dno rurki grawitacyjnie, usuń pozostałą wodę.
  6. Dodaj równą objętość sterylnej wody do probówki zawierającej nasiona, aby utworzyć zawiesinę wody z nasion.
  7. Użyj siatki wysiewającej, aby równomiernie rozprowadzić zawiesinę wodną nasion danego genotypu na wybranych obszarach płytki podłoża (Rysunek 2 i Rysunek uzupełniający 1). Rozprowadź nasiona (około 30-40) w rzędzie w każdym obszarze za pomocą szerokiej końcówki pipety.
  8. Pozostaw wodę do wyschnięcia w obszarach nasion na około 30 minut, trzymając płytkę (płytki) otwartą w okapie z przepływem laminarnym, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Uszczelnij płytkę taśmą z mikroporami i owiń ją folią aluminiową.
  9. Rozwarstwiać nasiona przez 3 dni w temperaturze 4 °C w ciemności, aby (w zależności od użytego ekotypu) przezwyciężyć spoczynek nasion i/lub zapewnić równomierne kiełkowanie.
  10. Przenieść płytkę z warstwowymi nasionami do światła białego (150 μmol/m2/s) na 1 godzinę w celu wywołania kiełkowania (odwinąć folię tylko do obróbki światłem).
  11. Po zabiegu światłem owinąć płytkę folią aluminiową, aby chronić nasiona przed światłem i umieścić ją w pozycji pionowej w komorze wzrostowej i uprawiać przez 4 dni w ciemności w temperaturze 21 °C.

3. Pomiar i analiza fluorescencji chlorofilu

  1. Włącz system iReenCAM i upewnij się, że system jest gotowy i prawidłowo skonfigurowany w automatycznie inicjowanym oprogramowaniu serwera PS (np. czy jest wystarczająco dużo miejsca na dane z eksperymentu, czy kamera fluorescencyjna jest podłączona do komputera itp.).
  2. Aktywuj oprogramowanie Scheduler, aby utworzyć plan eksperymentu dla pomiaru, klikając opcję Eksperymenty > Nowy eksperyment. Podaj opisową nazwę eksperymentu i podaj szczegóły (opis).
  3. Ustaw wymagane działania dla eksperymentu, klikając Dodaj działanie, co spowoduje wyświetlenie harmonogramu działań eksperymentalnych.
    UWAGA: Słowo działanie oznacza tutaj wykonanie pełnego eksperymentu (tj. obejmującego wszystkie kroki niezbędne do wykonania jednego pomiaru płytki).
  4. Określ warunki dla pojedynczego pomiaru rundy (tj. długość okresu światła/ciemności).
  5. Klikając Generuj listę, zdefiniuj odstępy czasowe między rundami pomiarowymi. Wybierz czas, w którym runda się rozpocznie i zakończy (łącznie 4 godziny) oraz odstępy między rundami (w obecnym ustawieniu jedna runda co 2 minuty).
  6. Kliknij Generuj i upewnij się, że ramy czasowe i odstępy między impulsami świetlnymi są prawidłowe, sprawdzając listę wygenerowaną po lewej stronie ekranu.
  7. Wybierz protokół pomiarowy (rysunek uzupełniający 2). Zapisz wszystkie modyfikacje w bazie danych do wykorzystania w przyszłości.
  8. Tuż przed rozpoczęciem pomiaru należy użyć zielonego światła o niskim natężeniu (patrz Tabela Materiałów) wewnątrz ciemnego pomieszczenia i wyregulować poziom półki wewnątrz komory pomiarowej lub wykonać inne czynności przygotowawcze przed zdjęciem folii z płytki Petriego. Następnie wyłącz światło i przenieś płytki do komory pomiarowej w całkowitej ciemności.
  9. Ostrożnie usuń folię aluminiową pokrywającą płytkę Petriego zawierającą 4-dniowe sadzonki. Umieść płytkę Petriego poziomo w komorze pomiarowej urządzenia. Wewnątrz komory indukować impulsy światła aktynicznego i wykonywać obrazowanie zgodnie z planem eksperymentu (działaniami) ustalonym w krokach 3.1-3.7.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby unikać oświetlenia płytek etiolowanymi siewkami przed umieszczeniem ich w komorze pomiarowej. Manipulacja za pomocą płytki z etiolowanymi sadzonkami musi być przeprowadzona w ciemnym pomieszczeniu/komorze (w celu zapoznania się z możliwą konfiguracją doświadczalną patrz rysunek uzupełniający 3).

4. Ekstrakcja i analiza danych

  1. Po zakończeniu pomiaru otwórz odpowiedni eksperyment w oprogramowaniu analizatora.
  2. Aby przeanalizować fluorescencję sadzonek, wygeneruj dwa rodzaje masek - maskę szorstką (tacową), która pokrywa obszar, w którym znajdują się sadzonki, oraz precyzyjną maskę (roślinną), która obejmuje tylko tkankę będącą przedmiotem zainteresowania (zwykle liścienie).
  3. Wygeneruj maskę zasobnika, klikając opcję Utwórz nowy typ zasobnika. Przypisz odpowiednie nazwy genotypów do odpowiednich obszarów na obrazie płytki.
  4. Aby przypisać genotyp, wybierz numer obrazu w Round, a następnie kliknij Załaduj obraz w górnej części ekranu. Obraz tabliczki zostanie wyświetlony na ekranie. Klikając dowolny z zestawu przycisków, które reprezentują różne narzędzia do rysowania kształtów (Rysunek uzupełniający 4), przejdź do trybu nowego kształtu, który pozwala narysować obszar zainteresowania na obrazie płyty. Wybierz niezbędne obszary (np. różne genotypy na talerzu) i nadaj im odpowiednie nazewnictwo.
  5. Kliknij Esc, aby wyjść z trybu kształtu. Zapisz wygenerowaną maskę zasobnika (po podaniu jej nazwy), klikając opcję Typ zasobnika sklepowego.
  6. Cofnij się o krok i zastosuj maskę, która została wygenerowana w poprzednich krokach, wybierając jej nazwę z opcji Zmień według typu zasobnika.
  7. Aby wygenerować maskę roślinną z dużą dokładnością, należy użyć obrazu uzyskanego po 180 minutach pomiaru (runda 91), aby ustawić minimalną wartość progową intensywności sygnału fluorescencji, umożliwiając odejmowanie szumu tła. W tym celu usuń zaznaczenie z opcji Auto Threshold (Próg automatyczny) i ustaw próg ręczny na wartość 0 (Rysunek uzupełniający 4).
  8. Kliknij przycisk Podgląd, aby upewnić się, że maska zasobnika obejmuje wszystkie niezbędne obszary (genotypy) na obrazie płytki. W tym celu wybierz rundę 91 i kliknij Odśwież podgląd.
  9. Wejdź do menu Uruchom, klikając przycisk Uruchom. Przeprowadź analizę wyłącznie dla rundy 91, zaznaczając tylko rundę 91. Następnie wybierz ścieżkę wyjściową i kliknij przycisk Rozpocznij analizę.
  10. Po zakończeniu analizy automatycznie otworzy się menu Zakończ. Wybierz wykonaną rundę (będzie to jedyna) z eksperymentów i kliknij Przełącz analizator na analizowane dane, aby wyeksportować dane dla tego konkretnego punktu czasowego (runda 91).
  11. Wyodrębnij plik .xsel z wyeksportowanego archiwum, ponieważ plik ten zawiera podstawowe informacje o masce rośliny, klikając ikonę Otwórz część eksportu.
  12. Ponownie otwórz eksperyment, klikając ikonę Otwórz część analizy lokalnej. Wejdź ponownie do menu Mask Builder, kliknij Załaduj obraz, wybierz rundę 1, a następnie Załaduj z pliku w prawym górnym rogu ekranu i załaduj wcześniej wyodrębniony plik .xsel. Obraz płyty zostanie wyświetlony z zastosowaną maską zasobnika.
  13. Zapisz maskę, klikając opcję Przechowuj typ zasobnika i zastosuj ją, wybierając jej nazwę w opcji Zmień według typu zasobnika.
  14. Wygeneruj maskę roślinną, dostosowując próg intensywności sygnału fluorescencji. Zwiększaj wartość Próg ręczny, aż maska wygenerowana w menu Podgląd będzie idealnie pasować do ROI (np. liścienie) w każdym z genotypów (Rysunek uzupełniający 4). Sprawdź, czy maska pasuje do wszystkich rund pomiarów, przewijając je w poprzek (sprawdzenie prawidłowego położenia maski w rundzie 1, 61 i 121 powinno wystarczyć) w menu Podgląd.
  15. Wykonaj analizę dla wszystkich rund pomiarowych i wyeksportuj dane.
    UWAGA: Plik wyjściowy zawiera wartości fluorescencji chlorofilu danego genotypu dla każdego punktu czasowego, co umożliwia konstruowanie wykresów wyboru i ułatwia dalszą ocenę statystyczną.

Wyniki

Typowy wynik uzyskany przy użyciu nowo opracowanej procedury w 4-dniowych odetiolowanych siewkach Arabidopsis typu dzikiego (WT), ekotyp Columbia-0 (Col-0), przedstawiono na Rysunku 3. W warunkach kontrolnych (podłoże MS z dodatkiem DMSO) krzywa biosyntezy chlorofilu rozpoczyna się od początkowego gwałtownego wzrostu syntezy chlorofilu, w którym pula protochlorofilidu zsyntetyzowana podczas fazy skotomorfogenicznej wzrostu jest szybko przekształcana w chlorofil dzięki indukowanym światłem POR7,8,9. Początkowa faza szybkiej akumulacji chlorofilu trwa około 10 min, a następnie następuje faza opóźnienia, podczas której osiągane jest minimum poziomu protochlorofilidu syntetyzowanego w ciemności (około 30 min po naświetlaniu; krzywą protochlorofilidu mierzoną metodą HPLC przedstawiono w 7). W fazie opóźnienia dochodzi do upregulacji genów biosyntezy chlorofilu10, co prowadzi do indukowanej światłem produkcji protochlorofilidu. Nowo zsyntetyzowany protochlorofilid jest niezwłocznie przekształcany w chlorofil, co objawia się jako faza wykładnicza (w przypadku WT Col-0 rozpoczynająca się około 120 min po naświetlaniu) i kończy kolejną fazą opóźnienia około 4 h po naświetleniu odetiolowanej siewki (Rysunek 3). W obecności 6-benzyloaminopuryny (BAP) pierwsze istotne różnice są zauważalne podczas fazy wykładniczej7, co sugeruje negatywny wpływ BAP na kinetykę chlorofilu w późniejszych etapach biosyntezy chlorofilu (około 2 h po rozpoczęciu naświetlania światłem aktynicznym; Rysunek 3).

W celu porównania różnych warunków i/lub genotypów konieczna jest normalizacja surowych danych. Ponieważ w etiolowanych siewkach nie wykryto chlorofilu za pomocą HPLC w różnych warunkach i/lub w różnych genotypach, wykonaliśmy normalizację (F/F0) do poziomów fluorescencji w czasie T0 (F0) zmierzonych dla odpowiedniej próby i/lub genotypu7. Aby wykazać znaczenie normalizacji, przedstawiamy zarówno surowe dane, jak i dane znormalizowane do średniej wartości fluorescencji chlorofilu kontroli mierzonej w T0 (odpowiednio F0; Rysunek 3A oraz Rysunek 3B).

figure-results-1
Rycina 1: Przegląd protokołu urządzenia pomiarowego. Schemat potoku pomiarowego i analitycznego iReenCAM. (A) Przygotowanie próbek poprzez wysiew nasion w zdefiniowanej siatce, stratyfikację, indukcję kiełkowania światłem oraz hodowlę w ciemności w szalkach Petri orientowanych pionowo. (B) Moduł sterujący do automatycznego i programowalnego pozyskiwania obrazów oraz zarządzania danymi w oparciu o zestaw narzędzi oprogramowania do fenotypowania PlantScreen organizuje pracę całego systemu poprzez sterowanie i synchronizację działania sprzętu z zdefiniowanym przez użytkownika protokołem pomiarowym i analitycznym. (C) Protokół pomiarowy został zaprojektowany do dynamicznych pomiarów fluorescencyjnych obrazów próbek w odstępach 2 min przez łącznie 4 h, czyli 120 rund pomiarowych. Rama czasowa reprezentatywnego obrazu w fałszywych kolorach 4-dniowych siewek Arabidopsis orientowanych pionowo, pozyskana w czasie 180 min, służy do generowania maski ROI. (D) Maska definiująca ROI dla interesującej tkanki (np. liścica, podkotyledon lub strefa korzeniowa) jest nakładana na ramę czasową, wykonywana jest subtrakcja tła, a następnie z wszystkich rund pomiarowych ekstrahowane są wartości fluorescencji piksel po pikselu dla każdego ROI (zdefiniowanego przez maskę rośliny). Na koniec surowe dane (fluorescencja F) są normalizowane do średniej wartości fluorescencji w czasie T0 (F0). Paski skali = 1 cm (A) i 0,25 cm (C). Rycina została zmodyfikowana na podstawie 7. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rysunek 2: Rozmieszczenie nasion. Na rysunku przedstawiono rozmieszczanie nasion Arabidopsis na szalce Petri z nieprzepuszczalnymi dla światła krawędziami przy użyciu siatki pomocniczej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Kinetyka akumulacji chlorofilu we wczesnych etapach deetyolacji Arabidopsis. Etyolowane siewki WT Col-0 hodowano na pożywkach uzupełnionych o BAP lub DMSO (kontrola). (A) Wartość średnia ± SD (obszar zacieniowany), n=9 dla surowych danych oraz (B) dane znormalizowane do średniej wartości fluorescencji w czasie T0 (F0). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek uzupełniający 1: Siatka wysiewu. Lewo: Siatka wysiewu z zaznaczonymi prostokątnymi polami do umieszczania nasion każdego genotypu w punkcie pomiarowym znajdującym się w obszarze jednorodności światła aktynicznego (natężenie światła ≥ 0,7 maksymalnego natężenia światła). Prawo: Schematyczna reprezentacja 4-dniowych, etiolowanych siewek Arabidopsis wyhodowanych do analizy. Siatka wysiewu stanowi możliwy schemat rozmieszczenia nasion Arabidopsis, zapewniający jednorodność oświetlenia i odpowiednią gęstość wysiewu (każde pole może być wykorzystane do umieszczenia nasion, ponieważ rozmiar pola, odległość między polami oraz jednorodność światła w obszarze siatki są ujednolicone). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Protokół pomiaru fluorescencji. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Konfiguracja eksperymentalna pozwalająca uniknąć niepożądanej ekspozycji na światło.(A) Urządzenie pomiarowe jest umieszczone w fitotronie typu walk-in, (B) w komorze oddzielonej szczelnymi drzwiami świetlnymi. (C) Pojemniki do hodowli in vitro (czerwona strzałka), przeznaczone do wzrostu etiolowanych siewek w określonych warunkach (temperatura i wilgotność względna), są umieszczone bezpośrednio pod urządzeniem (żółta strzałka), co zapewnia minimalne ryzyko ekspozycji na światło. Źródło słabego zielonego światła (niebieska strzałka) jest zamontowane na ścianie obok komputera sterującego (pomarańczowa strzałka). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 4: Procedura generowania masek w przepływie pracy z wykorzystaniem oprogramowania PS data analyzer. Zrzuty ekranu poszczególnych kroków, które należy wykonać w celu wygenerowania maski tacki (kroki 4.3-4.6) i maski rośliny (krok 4.12) oraz analizy danych (kroki 4.7 i 4.13). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 5: Wpływ gęstości siewu na zmienność pomiarów. Kinetyka akumulacji chlorofilu w 4-dniowych, etiolowanych siewkach Arabidopsis WT Col-0 hodowanych (A) oddzielnie (jako pojedyncze siewki, tutaj n=5) lub w grupie o (B) wysokiej gęstości (HD, n=30-40) lub (C) niskiej gęstości (LD, n=10-15). Wartość n odpowiada liczbie siewek w jednym okienku siatki siewnej, dane przedstawiają wartości średnie ± SD (obszar zacieniowany). Wysoka lub niska gęstość odpowiada wspomnianej liczbie siewek na okienko siatki siewnej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 6: Przedział czasowy uprawy i przestrzeń wymagają optymalizacji specyficznej dla gatunku. Wzrost różnych gatunków roślin z wykorzystaniem protokołu zoptymalizowanego dla Arabidopsis. (A) Rozmieszczenie nasion na siatce siewnej. (B) 4-dniowe, etiolizowane siewki (od lewej do prawej) Arabidopsis thaliana, Brassica napus oraz Crambe abyssinica. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Krytyczne kroki protokołu i rozwiązywanie problemów - brak światła i dbanie o maskę
Jak podkreślono bezpośrednio w powyższym opisie protokołu, kluczowe znaczenie ma unikanie nawet śladowych ilości światła zarówno podczas uprawy sadzonek roślin etiolowanych, jak i tuż przed rozpoczęciem stosowania protokołu11. W naszej konfiguracji używamy dedykowanej ciemnej komory umieszczonej w fitotronie typu walk-in i oddzielonej od reszty fitotronu światłoszczelnymi drzwiami obrotowymi (rysunek uzupełniający 3). Komora wyposażona jest w przestrzeń do uprawy roślin oraz stół warsztatowy pozwalający na umieszczenie urządzenia wraz z komputerem sterującym i wyciągiem. Dzięki temu możemy zarówno uprawiać rośliny w ciemności, jak i rozpocząć pomiar bez konieczności transportu płyty.

Sposób uprawy roślin i generowania masek ma kluczowe znaczenie dla późniejszej kwantyfikacji sygnału fluorescencji chlorofilu za pomocą proponowanego testu. Należy unikać gromadzenia się grudek środka żelującego lub drobnych wizualnych śmieci/kurzu w mediach, ponieważ może to spowodować odbicie światła. Ponieważ rozpoznawanie fluorescencji chlorofilu przez oprogramowanie jest ograniczone przez maskę, obszar rośliny, który nie zostanie pokryty maską, po prostu nie będzie analizowany przez oprogramowanie. Podczas 4-godzinnego pomiaru siewki nieco rosną/poruszają się, dlatego wyznaczona maska może wymagać regulacji, ponieważ może nie zmieścić się we wszystkich rundach pomiarowych w celu dokładnej kwantyfikacji intensywności sygnału. Z naszego doświadczenia wynika, że głównym źródłem zmienności wydaje się być niedoskonała definicja maski. Podczas eksperymentów optymalizacyjnych monitorowaliśmy zmiany zmienności wartości fluorescencji chlorofilu przyjętych do analizy w i) pojedynczych siewkach oraz grupie siewek o ii) wyższej (30-40 nasion) i iii) niższej (10-15 nasion) gęstości wysiewu (rysunek uzupełniający 5). Zastosowaliśmy większą gęstość wysiewu nasion, ponieważ wykazywała ona najmniejszą zmienność. Większa zmienność obserwowana w przypadku pojedynczych siewek/wysiewu o mniejszej gęstości wynika przede wszystkim z większego udziału pikseli znajdujących się na krawędzi między sygnałem a tłem oraz niewielkiego ruchu siewek w ciągu 4 godzin pomiaru.

Aby upewnićsię, że wszystkie pomiary są dokładne, sprawdź, czy maska rośliny pasuje do pierwszej rundy, a następnie do 15., 30., 45., 60. 75. i tak dalej, aż do ostatniej (wybierając numer rundy i klikając Odśwież podgląd). Zajmie to tylko kilka minut, ale zapewni, że cały obszar liścienia zostanie pokryty i oceniony. Jeśli w którejkolwiek rundzie maska roślinna nie pasuje (wymagany obszar nie jest w pełni pokryty), podziel eksperyment na kilka części. Następnie wykonaj protokół, zaczynając od kroku 4 (4.1-4.13), aby utworzyć określoną maskę osobno dla każdej części eksperymentu. Na przykład, jeśli zauważysz przemieszczenie maski roślinnej w rundzie 60-61 (lub nieco wcześniej), podziel eksperyment na dwie części - 1. część (1-60 rund) i 2. część (61-121 rund). W 1. części użyj obrazu rundy 41, aby wygenerować maskę roślinną, a w 2. części użyj rundy 91. W kroku 4.13, analizując dane, należy uważać, aby wybrać rundy zgodnie z odpowiednią częścią eksperymentu (np. rundy 1-60 dla pierwszej części i 61-121 dla drugiej, jak w powyższym przykładzie) przed kliknięciem przycisku Analizuj. Podczas pracy z Arabidopsis ruch roślin jest znikomy, ponieważ rosną one raczej wolno, ale w przypadku stosowania protokołu dla różnych gatunków (patrz poniżej) należy wziąć pod uwagę tempo wzrostu.

Modyfikacje i ograniczenia
Liczba parametrów może być modyfikowana, w tym natężenie i długość fali światła aktynicznego i/lub światła przyłożonego między interwałami stosowania światła aktynowego. Urządzenie pomiarowe zawiera zintegrowane, w pełni zmotoryzowane i sterowane programowo koło filtrujące. W związku z tym algorytm pomiarowy odpowiedni do oznaczania ilościowego innych pigmentów, zazwyczaj również produktów szlaku biosyntezy tetrapyrollu 10,12, może zostać włączony do protokołu w przypadku dodania odpowiednich filtrów.

Ponadto, jak wspomniano wcześniej, protokół może być stosowany nie tylko w przypadku roślin Arabidopsis . Jednak w przypadku pracy z innymi gatunkami roślin każdy etap protokołu powinien zostać odpowiednio zmieniony, biorąc pod uwagę cechy charakterystyczne dla danego gatunku, w tym szybkość kiełkowania i wzrostu i/lub wielkość (rysunek uzupełniający 6).

Jednym z ważnych ograniczeń protokołu jest czas, w którym można przeprowadzić analizę ilościową chlorofilu. Po zintegrowaniu chlorofilu z kompleksami fotosystemu, sygnał fluorescencyjny ulega zniekształceniu przez zużycie energii fotosyntezy (występuje tak zwana zmienna florescencja chlorofilu), jak zaobserwowano podczas późniejszych etapów deetiolacji13. Jak stwierdzono przy użyciu testu przejściowego OJIP14,15, nie wykryto żadnych oznak aktywności fotosyntetycznej przy użyciu tego zestawu doświadczalnego w ciągu pierwszych 4 godzin deetiolacji7. Jednakże, jeżeli przypuszcza się/konieczne jest zbadanie wydłużonego okresu fotomorfogenezy, należy zbadać poziom składania fotosystemów i możliwy wpływ fotosyntezy na ogólne poziomy fluorescencji.

Na koniec należy wspomnieć, że nasz protokół oparty na pomiarach fluorescencji, pozwala na względną, a nie bezwzględną kwantyfikację chlorofilu. Jeżeli wymagana jest bezwzględna ocena ilościowa, należy przeprowadzić odpowiednią kalibrację przy użyciu metody alternatywnej, np. metody HPLC.

Znaczenie w stosunku do istniejących metod - prosta, szybka i statystycznie solidna kwantyfikacja chlorofilu z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną
Opisana tutaj procedura pozwala na wykrywanie i ilościowe oznaczanie chlorofilu w czasie rzeczywistym u żywych siewek rzodkiewnika we wczesnych stadiach deetiolacji. W porównaniu z innymi podejściami opierającymi się głównie na ekstrakcji chlorofilu z oderwanego materiału roślinnego16,17 lub niedawno opracowanych metodach optycznych18,19, podejście to jest czysto nieinwazyjne, umożliwiając kwantyfikację chlorofilu poprzez pomiar intensywności fluorescencji in vivo. Nie ma również potrzeby stosowania dodatkowych odczynników niezbędnych do przygotowania próbki, jak w przypadku innych istniejących metod alternatywnych, w tym wspomnianych wcześniej podejść opartych na HPLC lub spektrofotometrii. Nowo wprowadzony protokół jest prosty, szybki i dokładny, co zostało wcześniej zweryfikowane przy użyciu HPLC5. Korzystając ze standardowych ustawień protokołu, końcowa krzywa pojedynczego powtórzenia biologicznego składa się ze 120 punktów pomiarowych (średnich intensywności fluorescencji) pobranych w ciągu 4 godzin pomiaru, z których każdy składa się z maksymalnie 15 punktów pomiarowych. Zazwyczaj końcowa krzywa zawiera dane z trzech replik biologicznych (np. trzech niezależnie przygotowanych płytek) i trzech punktów pomiarowych (trzech replik technicznych), z których każde składa się z 30-40 sadzonek. W związku z tym w każdym przedziale czasowym testuje się około 300 siewek, co zapewnia statystycznie solidny zestaw danych, pozwalający na wiarygodne wykrycie nawet niewielkich różnic, jak wykazano w przypadku mutantów dotkniętych różnymi etapami biosyntezy chlorofilu7. W tym miejscu zachęcamy użytkownika do zastosowania niedawno opracowanego podejścia statystycznego opartego na uogólnionych liniowych modelach mieszanych w połączeniu z klasycznymi modelami szeregów czasowych jako odpowiedniego narzędzia do analizy danych kinetyki chlorofilu20.

Przyszłe zastosowania tej techniki - szybkie i tanie badania przesiewowe
Wyżej wymienione cechy sprawiają, że podejście to jest użytecznym narzędziem odpowiednim do szybkich i tanich badań przesiewowych oraz wysoce precyzyjnej kwantyfikacji cech związanych (bezpośrednio lub pośrednio) z biosyntezą chlorofilu. Może to obejmować badania wykorzystujące genetyczne badania przesiewowe w celu lepszego scharakteryzowania złożonych i wielopoziomowych regulacji biosyntezy chlorofilu 10,12,21. Biorąc pod uwagę możliwość leczenia różnymi związkami, protokół jest również bardzo cenny do badania, na przykład, znaczenia regulacji hormonalnych za pośrednictwem światła22,23 lub badań przesiewowych w kierunku związków niskocząsteczkowych, które mogą mieć wpływ na kinetykę akumulacji chlorofilu.

Oświadczenia

Z.B. i K.P. są pracownikami PSI, a Martin Trtilek jest dyrektorem generalnym i właścicielem firmy PSI produkującej iReenCAM. Wszyscy ci autorzy byli zaangażowani w rozwój instrumentu, jak opisano wcześniej7.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego-Projekt SINGING PLANT (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446). Projekt ten otrzymał dofinansowanie w ramach projektu MSCA4Ukraine (ID 1233580), który jest finansowany przez Unię Europejską. Jesteśmy wdzięczni Lence Sochurkovej za projekt graficzny rysunku 1.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
6-benzyloaminopurynaDuchefa BiochemieB0904.0001
Folia aluminiowaMerckZ691577
Arabidopsis thaliana Col-0 nasionakolekcja NASCN1092
Komora uprawowaPSIna zamówienie
DimethilsulfoxidThermo Fisher Scientific042780.AK
Eppendorf jednokanałowy, zmienny (100-1000 μ L)MerckEP3123000063
GelriteDuchefa BiochemieG1101
iReenCAM urządzeniePSIwykonane na zamówienie/prototyp
Butelki laboratoryjne, z nakrętkami (Duran), 100 mlMerckZ305170-10EA
Pudełko z przepływem laminarnymUniGreenSchemeITEM-31156
Taśma do łączenia wstęg bez podkładu, szerokość 19 mm,, Szkockanauka 3M. Stosowany do Life7000006085
probówka do mikrowirówek, 2 ml z pokrywką, PPT, BRANDMerckBR780546-500EA
Taśma mikroporowa3M Science. Stosowane do Life7100225115
Płytki Osram lumilux green l18w/66Ovalamp200008833
Petriego - szalki Greinera, kwadratowe, 120 x 120 x17mm, wentylowaneMerckZ617679-240EA
, 1000 μ L, AxygenMerckAXYT1000B
oprogramowanie Plant Screen Data AnalyzerPSIdostarczone w ramach iReenCAM
Końcówki do pipet

Bibliografia

  1. Arsovski, A. A., Galstyan, A., Guseman, J. M., Nemhauser, J. L. Photomorphogenesis. Arabidopsis Book. 10, e0147(2012).
  2. Reinbothe, S., Reinbothe, C., Apel, K., Lebedev, N. Evolution of chlorophyll biosynthesis--the challenge to survive photooxidation. Cell. 86 (5), 703-705 (1996).
  3. Heyes, D. J., et al. Photocatalysis as the 'master switch' of photomorphogenesis in early plant development. Nat Plants. 7 (3), 268-276 (2021).
  4. Hu, X. Y., Tanaka, A., Tanaka, R. Simple extraction methods that prevent the artifactual conversion of chlorophyll to chlorophyllide during pigment isolation from leaf samples. Plant Methods. 9 (1), 19(2013).
  5. Chazaux, M., Schiphorst, C., Lazzari, G., Caffarri, S. Precise estimation of chlorophyll a, b and carotenoid content by deconvolution of the absorption spectrum and new simultaneous equations for chl determination. Plant J. 109 (6), 1630-1648 (2022).
  6. Marr, I. L., Suryana, N., Lukulay, P., Marr, M. I. Determination of chlorophyll-a and chlorophyll-b by simultaneous multicomponent spectrophotometry. Fresenius J Anal Chem. 352 (5), 456-460 (1995).
  7. Balakhonova, V., et al. Ireencam: Automated imaging system for kinetic analysis of photosynthetic pigment biosynthesis at high spatiotemporal resolution during early deetiolation. Front Plant Sci. 14, 1093292(2023).
  8. Virgin, H. I., Kahn, A., Vonwettstein, D. The physiology of chlorophyll formation in relation to structural changes in chloroplasts. Photochem Photobiol. 2 (2), 83-91 (1963).
  9. Reinbothe, C., et al. Chlorophyll biosynthesis: Spotlight on protochlorophyllide reduction. Trends Plant Sci. 15 (11), 614-624 (2010).
  10. Kobayashi, K., Masuda, T. Transcriptional regulation of tetrapyrrole biosynthesis in arabidopsis thaliana. Front Plant Sci. 7, 1811(2016).
  11. Wang, Y., Folta, K. M. Contributions of green light to plant growth and development. Am J Bot. 100 (1), 70-78 (2013).
  12. Brzezowski, P., Richter, A. S., Grimm, B. Regulation and function of tetrapyrrole biosynthesis in plants and algae. Biochim Biophys Acta. 1847 (9), 968-985 (2015).
  13. Pipitone, R., et al. A multifaceted analysis reveals two distinct phases of chloroplast biogenesis during de-etiolation in arabidopsis. eLife. 10, e62709(2021).
  14. Stirbet, A. G. On the relation between the kautsky effect (chlorophyll a fluorescence induction) and photosystem ii: Basics and applications of the ojip fluorescence transient. J Photochem Photobiol B-Biol. 104 (1-2), 236-257 (2011).
  15. Kupper, H., et al. Analysis of ojip chlorophyll fluorescence kinetics and q(a) reoxidation kinetics by direct fast imaging. Plant Physiol. 179 (2), 369-381 (2019).
  16. Avin-Wittenberg, T., et al. Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in arabidopsis seedlings under carbon starvation. Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).
  17. Kósa, A., Preininger, É, Böddi, B. Nitrogen deficiency hinders etioplast development in stems of dark-grown pea (pisum sativum) shoot cultures. Physiol Plant. 155 (3), 330-337 (2015).
  18. Liang, Y., et al. A nondestructive method to estimate the chlorophyll content of arabidopsis seedlings. Plant Met. 13 (1), 26(2017).
  19. Pérez-Patricio, M., et al. Optical method for estimating the chlorophyll contents in plant leaves. Sensors. 18 (2), 650(2018).
  20. Spyroglou, I., et al. Mixed models as a tool for comparing groups of time series in plant sciences. Plants (Basel). 10 (2), (2021).
  21. Tanaka, R., Kobayashi, K., Masuda, T. Tetrapyrrole metabolism in arabidopsis thaliana. The Arabidopsis book / Am Soc Plant Biol. 9. 9, e0145(2011).
  22. De Wit, M., Galvao, V. C., Fankhauser, C. Light-mediated hormonal regulation of plant growth and development. Annu Rev Plant Biol. 67, 513-537 (2016).
  23. Liu, X., Li, Y., Zhong, S. Interplay between light and plant hormones in the control of arabidopsis seedling chlorophyll biosynthesis. Front Plant Sci. 8, 1433(2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kinetyka deetiolacjisiewki Arabidopsissynteza chlorofilupomiar in vivometody optycznewysoka rozdzielczo przestrzennagenetyka w prz dindukowana wiat em deetiolacja

Powiązane artykuły