Method Article

Przekształcanie statycznych modeli tkanek barierowych w dynamiczne systemy mikrofizjologiczne

DOI:

10.3791/66090

⸱

February 16th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Rochester Institute of Technology, 2Department of Biomedical Engineering, University of Rochester

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje rekonfigurowalną platformę hodowli komórkowych opartą na membranie, która integruje format otwartej studni z możliwościami przepływu płynów. Platforma ta jest kompatybilna ze standardowymi protokołami i umożliwia odwracalne przejścia między trybem hodowli w studni otwartej a mikroprzepływowym, dostosowując się do potrzeb zarówno laboratoriów inżynieryjnych, jak i biologicznych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Systemy mikrofizjologiczne to zminiaturyzowane platformy do hodowli komórkowych używane do naśladowania struktury i funkcji tkanek ludzkich w warunkach laboratoryjnych. Platformy te nie zyskały jednak powszechnego zastosowania w laboratoriach biologicznych, w których metody oparte na błonach typu open well służą jako złoty standard naśladowania barier tkankowych, pomimo braku możliwości przepływu płynów. Problem ten można przede wszystkim przypisać niekompatybilności istniejących systemów mikrofizjologicznych ze standardowymi protokołami i narzędziami opracowanymi dla systemów z otwartą studnią.

Tutaj prezentujemy protokół do tworzenia rekonfigurowalnej platformy opartej na membranie o strukturze otwartej studni, możliwości zwiększenia przepływu i kompatybilności z konwencjonalnymi protokołami. System ten wykorzystuje podejście do montażu magnetycznego, które umożliwia odwracalne przełączanie między trybami otwartej studni i mikroprzepływowymi. Dzięki takiemu podejściu użytkownicy mają możliwość rozpoczęcia eksperymentu w formacie otwartej studni przy użyciu standardowych protokołów i dodawania lub usuwania funkcji przepływu w zależności od potrzeb. Aby zademonstrować praktyczne zastosowanie tego systemu i jego kompatybilność ze standardowymi technikami, stworzono monowarstwę komórek śródbłonka w formacie otwartej studzienki. System został przekonfigurowany w celu wprowadzenia przepływu płynu, a następnie przełączono go na format otwartej studzienki w celu przeprowadzenia barwienia immunologicznego i ekstrakcji RNA. Oczekuje się, że ze względu na kompatybilność z konwencjonalnymi protokołami odwiertów otwartych i możliwość zwiększenia przepływu, ten rekonfigurowalny projekt zostanie przyjęty zarówno przez laboratoria inżynieryjne, jak i biologiczne.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bariery naczyniowe służą jako krytyczny interfejs, który oddziela przedział krwi od otaczającej tkanki. Odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy poprzez przyciąganie komórek odpornościowych, kontrolowanie przepuszczalności molekularnej i ochronę przed wtargnięciem patogenów do tkanki1,2. Modele hodowli in vitro zostały opracowane w celu naśladowania mikrośrodowiska in vivo, umożliwiając systematyczne badania czynników i warunków, które wpływają na właściwości bariery zarówno w stanie zdrowym, jak i chorym3,4.

Najbardziej rozpowszechnionym podejściem dla takich modeli hodowlanych jest konfiguracja "otwartej studni" podobna do Transwella5, gdzie porowata, wytrawiona ścieżka membrana hodowlana oddziela przedziały wypełnione pożywką (Rysunek 1A). W tym formacie komórki mogą być wysiewane po obu stronach błony i opracowano szeroki zakres protokołów eksperymentalnych. Jednak systemy te mają ograniczoną zdolność do dostarczania przepływów płynów niezbędnych do wspomagania dojrzewania bariery i naśladowania krążenia komórek odpornościowych obserwowanego in vivo5,6. W związku z tym nie mogą być używane do badań wymagających przepływów dynamicznych, które wprowadzają dawki leków, stymulację mechaniczną lub naprężenia ścinające wywołane płynem6,7,8.

Aby przezwyciężyć ograniczenia systemów z otwartymi studniami, opracowano platformy mikroprzepływowe, które łączą porowate membrany hodowlane z indywidualnie adresowalnymi kanałami fluidycznymi9. Platformy te oferują precyzyjną kontrolę nad kierowaniem płynów, perfuzją i wprowadzaniem związków chemicznych, kontrolowaną stymulację ścinającą oraz możliwości dynamicznego dodawania komórek7,10,11,12,13. Pomimo zaawansowanych możliwości zapewnianych przez platformy mikroprzepływowe, nie spotkały się one z powszechnym zastosowaniem w laboratoriach biologicznych ze względu na złożone protokoły mikroprzepływowe i ich niekompatybilność z ustalonymi eksperymentalnymi przepływami pracy4,10,14.

Aby wypełnić lukę między tymi technologiami, prezentujemy protokół, który wykorzystuje magnetycznie rekonfigurowalny, modułowy system. System ten można łatwo przełączać między trybem otwartym a mikroprzepływowym w zależności od konkretnych potrzeb eksperymentu. Platforma wyposażona jest w urządzenie z otwartą studnią, znane jako m-μSiM (modułowy system mikrofizjologiczny obsługiwany przez membranę krzemową), z membraną hodowlaną o grubości 100 nm (nanomembraną). Ta nanomembrana ma wysoką porowatość (15%) i przezroczystość podobną do szkła, jak pokazano na rysunku Rysunek 1B. Fizycznie oddziela górną komorę od dolnego kanału, umożliwiając transport molekularny przez fizjologiczne skale długości15. W przeciwieństwie do konwencjonalnych membran trawionych ścieżkowo, które mają znane wyzwania w obrazowaniu żywych komórek za pomocą obrazowania w jasnym polu, korzystne właściwości optyczne i fizyczne nanomembrany umożliwiają wyraźną wizualizację komórek po obu stronach powierzchni membrany15,16,17.

Obecny protokół opisuje produkcję specjalistycznych modułów do wysiewu i przepływu oraz wyjaśnia magnetyczną rekonfigurację platformy. Pokazano, w jaki sposób platforma może być wykorzystana do ustanowienia barier śródbłonka zarówno w warunkach statycznych, jak i dynamicznych. Ta demonstracja pokazuje, że komórki śródbłonka wyrównują się wzdłuż kierunku przepływu, z regulacją w górę wrażliwych na ścinanie celów genowych pod wpływem stymulacji ścinania.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten projekt może być używany w różnych trybach, w zależności od wymagań eksperymentalnych i preferencji użytkownika końcowego. Przed każdym eksperymentem zapoznaj się ze schematem decyzyjnym przedstawionym w Rysunek 2, aby określić niezbędne kroki i moduły dla protokołu. Na przykład, jeśli użytkownik zamierza zachować format otwartej studni przez cały czas trwania eksperymentu, aby bezpośrednio porównać go z systemem typu Transwell, szablon wzoru nie jest wymagany do wysiewu komórek. Moduł główny jest dostępny na rynku (patrz Tabela materiałów), a ultracienka nanomembrana może być wybierana z biblioteki materiałów o różnej porowatości i wielkości porów, aby dopasować ją do potrzeb eksperymentalnych.

1. Wykonanie szablonu do tworzenia wzorów

UWAGA: Szablon do tworzenia wzorów służy do umieszczania komórek wyłącznie na porowatym obszarze chipa membranowego, zapobiegając osadzaniu się komórek na otaczającej warstwie krzemu, gdzie mogłyby potencjalnie ulec uszkodzeniu po dodaniu modułu przepływu16 (patrz Rysunek 3). Uszkodzenie monowarstwy może niekorzystnie wpłynąć na integralność bariery i zagrozić wynikom eksperymentów. Szablon nie jest potrzebny w otwartej, statycznej hodowli, ponieważ nie ma ryzyka uszkodzenia.

  1. Kup, obrób maszynowo lub wydrukuj formę 3D, korzystając z projektu dostarczonego w Dodatkowym pliku kodowania 1 (Rysunek 4A).
    UWAGA: Ścianki szablonu są zwężane w celu zwiększenia pojemności nośnika i zminimalizowania pułapkowania pęcherzyków w porównaniu z elementami o prostych ściankach o wysokim współczynniku proporcji.
  2. Przymocuj samoprzylepną folię samoprzylepną (PSA) o grubości 130 μm do arkusza akrylowego o grubości 3,2 mm za pomocą zimnego wałka (patrz Tabela materiałów).
  3. Wytnij laserowo arkusz akrylowy zgodnie z projektem dostarczonym w dodatkowym pliku kodowania 2, aby utworzyć tablicę wnęk ( Rysunek 4B).
  4. Zdejmij warstwę ochronną z folii PSA i przymocuj arkusz akrylowy do formy.
    UWAGA: Upewnij się, że arkusz wycinany laserowo jest wyrównany z formą tak, aby elementy formy były wyśrodkowane we wnęce (Rysunek 4C). Dokładność pozycjonowania komórek na membranie zależy od tego kroku.
  5. Dokładnie wymieszaj prepolimer PDMS (stosując stosunek zasady do katalizatora 10:1) (patrz Tabela materiałów) i odgazuj go w komorze próżniowej, aż nie pozostaną żadne widoczne pęcherzyki (5-15 min).
  6. Powoli wlej PDMS do wnęk formy, wyrównując ją płaską krawędzią.
    UWAGA: Aby zapobiec uwięzieniu pęcherzyków, powoli wlewaj PDMS do każdej wnęki. Jeśli po nalaniu pojawią się pęcherzyki, umieść formę w komorze próżniowej i ponownie ją odgazuj.
  7. Utwardź PDMS na płycie grzejnej w temperaturze 70 °C przez 1 godzinę, a następnie pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej.
  8. Wyciągnij szablony z jam formy za pomocą pęsety z płaską końcówką.

2. Wykonanie modułu przepływu

UWAGA: Moduł przepływu ma podobną powierzchnię co studnia w kształcie koniczyny modułu głównego i zawiera formowany mikrokanał (szerokość = 1,5 mm, wysokość = 0,2 mm, długość = 5 mm). Kształt koniczyny pomaga w wyrównaniu kanału nad porowatym obszarem kultury (Rysunek 5).

  1. Użyj standardowych technik miękkiej litografii18, aby stworzyć formę silikonową o cechach zdefiniowanych przez projekt dostarczony w Dodatkowym Pliku Kodowania 3 (Rysunek 4D).
  2. Przymocuj folię PSA 130 μm do arkusza akrylowego o grubości 3,2 mm.
  3. Wytnij laserowo arkusz akrylowy na podstawie projektu podanego w dodatkowym pliku kodowania 4, aby utworzyć tablicę wnęk w kształcie koniczyny ( Rysunek 4E).
    UWAGA: Wysokość wnęki określa wysokość modułu przepływowego, który musi być nieco wyższy (o 0-0,1 mm) niż wysokość modułu rdzeniowego, aby zapewnić prawidłowe uszczelnienie.
  4. Usuń warstwę ochronną z folii PSA, a następnie przymocuj wycięty laserowo arkusz do formy silikonowej, wyrównując trójkątne znaki wyrównania na formie silikonowej z tymi na arkuszu wycinanym laserowo.
    UWAGA: Podobnie jak w kroku 1.4, upewnij się, że wycinany laserowo arkusz akrylowy jest wyrównany z formą silikonową, tak aby elementy formy były wyśrodkowane w każdej wnęce (Rysunek 4F). Ten krok określa położenie mikrokanału względem śladu.
  5. Powoli wlej odgazowany PDMS do wnęk formy i wyrównaj go płaską krawędzią.
    UWAGA: Jeśli po wylaniu pojawią się bąbelki, odgazuj formę, aż bąbelki zostaną usunięte.
  6. Umieść formę na płycie grzejnej i piecz PDMS w temperaturze 70 °C przez 1 godzinę, a następnie pozwól foremce ostygnąć do temperatury pokojowej.
  7. Ostrożnie wyjmij moduły przepływowe z wnęk formy za pomocą pęsety z płaską końcówką.
  8. Ustaw moduł przepływu tak, aby elementy mikrokanału były skierowane do góry, a porty wlotowe i wylotowe rdzenia umieścić na końcu kanału za pomocą stempla do biopsji (patrz Tabela materiałów).

3. Wykonanie dolnych i górnych obudów akrylowych

UWAGA: Główny moduł mieści się w dolnej obudowie. Przyciąganie między magnesami osadzonymi w obudowach ściska i uszczelnia moduł przepływu do modułu głównego (Rysunek 6).

  1. Wytnij laserowo arkusz akrylowy o grubości 2 mm, korzystając z projektu dostarczonego w dodatkowym pliku kodowania 5, aby stworzyć górną obudowę z otworami do włożenia magnesu.
  2. Przymocuj folię PSA 130 μm do arkusza akrylowego o grubości 3,5 mm.
  3. Wytnij laserowo arkusz akrylowy na podstawie wzoru podanego w dodatkowym pliku kodowania 6, aby utworzyć dolną obudowę z otworami do włożenia magnesu.
    UWAGA: Grubość dolnej obudowy jest parametrem krytycznym i musi odpowiadać całkowitej grubości modułu głównego, aby zapobiec wyciekom podczas przepływu.
  4. Usuń warstwę ochronną PSA i przymocuj dolną obudowę do szklanego szkiełka nakrywkowego.
  5. Niklowane magnesy neodymowe o średnicy 4,75 mm wciskane na wcisk w laserowo wycięte otwory w obudowach.
    UWAGA: Upewnij się, że magnesy w dolnej i górnej obudowie są umieszczone z przeciwną biegunowością, aby zapewnić przyciąganie magnetyczne (Rysunek 6).

4. Wykonanie obwodu przepływu

UWAGA: Obwód przepływu w pętli zamkniętej zawiera dwie fiolki do pobierania próbek jako zbiorniki (Rysunek 7). Zbiornik wlotowy jest wyposażony w filtr z polifluorku winylidenu (PVDF), który umożliwia zrównoważenie pożywki komórkowej ze stężeniem CO2 w inkubatorze.

  1. Użyj dziurkacza do biopsji o średnicy 1 mm, aby utworzyć dwa otwory w nakrętce fiolki do pobierania próbek.
  2. Za pomocą stempli biopsyjnych wykonać dwa otwory (1 mm i 4 mm) w nasadce oddzielnej fiolki do pobierania próbek, a następnie utworzyć otwór o średnicy 1 mm w dolnej części tej fiolki.
  3. Włóż końcówki dozujące 20 G do każdego z otworów o średnicy 1 mm i uszczelnij je gorącym klejem.
  4. Umieść filtr PVDF 0.22 μm (patrz Tabela materiałów) w otworze 4 mm i uszczelnij go gorącym klejem.
  5. Wytnij laserowo arkusz akrylowy o grubości 1,5 mm, korzystając z projektu dostarczonego w dodatkowym pliku kodowania 7, aby utworzyć stolik do przechowywania próbki.
  6. Umieść zbiorniki na akrylowym stoliku.
  7. Podłącz końcówki dozujące za pomocą rurek mikroprzepływowych (patrz Tabela materiałów).
  8. Połącz rurki z wlotem i wylotem modułu przepływowego za pomocą końcówek dozujących 21 G.
  9. Do cyrkulacji przepływu należy użyć pompy perystaltycznej (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: W razie potrzeby można również użyć pomp strzykawkowych lub pneumatycznych do wprowadzenia przepływu. Natężenie przepływu należy określić na podstawie potrzeb doświadczalnych. Obszerna tabela, pochodząca z eksperymentalnie zweryfikowanego modelu COMSOL, znajduje się w Tabeli Uzupełniającej 1, aby pomóc użytkownikom w doborze niezbędnego natężenia przepływu do osiągnięcia pożądanego naprężenia ścinającego na monowarstwie komórki16.

5. Rozsiewanie komórek

UWAGA: Podobnie jak w przypadku konwencjonalnych wkładek membranowych, na nanomembranie można hodować różne typy komórek. Wtórny typ komórki może być również hodowany wspólnie po drugiej stronie błony w dolnym kanale15.

  1. Pokryj membranę 5 μg/cm2 fibronektyny (patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, aby poprawić przyczepienie komórek.
    UWAGA: Wybrany typ ogniwa może mieć wpływ na wymaganą powłokę i gęstość komórek. Opisana tutaj procedura dotyczy ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC, patrz tabela materiałów).
  2. Odessać roztwór powlekający za pomocą pipety P200 i umieścić szablon do tworzenia wzorów w studzience modułu rdzeniowego.
  3. Dodaj nośnik komórkowy do studzienki i dolnego kanału urządzenia.
  4. Wysiewać HUVEC o gęstości 40 000 komórek/cm2 do dołka.
    UWAGA: HUVEC o tej gęstości zazwyczaj tworzą zlewającą się monowarstwę po 24 godzinach inkubacji16,19.
  5. Umieść urządzenie na szalce Petriego. Dodaj stożkową nakrętkę probówki o pojemności 15 ml z wodą DI do szalki Petriego, aby utrzymać lokalną wilgotność.
  6. Przenieść szalkę Petriego do inkubatora.
    UWAGA: Media komórkowe w górnym i dolnym kanale urządzenia należy wymieniać co 24 godziny. Aby zmienić nośnik w dolnym kanale, delikatnie wstrzyknij nowy nośnik do jednego z portów, aby przemieścić stary nośnik z drugiego portu.

6. Rekonfiguracja do trybu mikroprzepływowego

  1. Wysterylizuj górną obudowę, dolną obudowę, moduł przepływowy, zbiorniki, probówki i końcówki dozujące, umieszczając je w komorze sterylizacyjnej UV na 30 minut przed montażem. Cyrkulacja 70% etanolu, a następnie sterylny PBS w obiegu przepływowym.
  2. Napełnij zbiorniki i probówki pożywką do wzrostu komórek śródbłonka (patrz tabela materiałów).
  3. Umieść dolną obudowę na stoliku na próbkę. Włóż moduł z rdzeniem otwartej studzienki do dolnej obudowy.
  4. Odessać pożywkę komórkową z dołka modułu. Umieść moduł przepływu w studni.
  5. Umieść górną obudowę, aby uszczelnić moduł przepływowy w studzience modułu rdzeniowego. Podłącz końcówki dozujące wlotowe i wylotowe do portów modułu przepływu.
  6. Uruchom pompę perystaltyczną, aby wprowadzić przepływ płynu do układu.

7. Przeprowadzanie dalszych analiz w formacie open-well po wprowadzeniu przepływu

UWAGA: Czas hodowli zależy tutaj od celów eksperymentu. Użytkownicy mogą przeprowadzać dalsze analizy (np. immunocytochemia, ekstrakcja RNA) w formacie otwartym lub mikroprzepływowym w zależności od swoich preferencji. Na przykład, jeśli preferowany jest format z otwartą studnią, system powinien zostać ponownie skonfigurowany do przeprowadzania testów w oparciu o standardowe protokoły16,19.

  1. Zatrzymaj pompę, gdy osiągniesz żądany czas ekspozycji na przepływ ścinający. Wyjmij końcówki dozujące wlotowe i wylotowe.
  2. Zdejmij górną obudowę. Delikatnie wyjmij moduł przepływu ze studni za pomocą pęsety.
  3. Dodaj 100 μl pożywki komórkowej do studzienki. Przeprowadzaj pożądane testy w oparciu o standardowe protokoły.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Moduł rdzenia z otwartą studnią jest początkowo umieszczony w specyficznej jamie utworzonej przez dolną obudowę i szkiełko nakrywkowe, jak pokazano w Rysunek 6A. Następnie moduł przepływowy, który zawiera mikrokanał i porty dostępowe, jest umieszczany w studzience modułu rdzeniowego. Moduł przepływu jest bezpiecznie uszczelniony względem silikonowej warstwy nośnej membrany dzięki sile przyciągania magnetycznego między magnesami osadzonymi w dolnej i górnej obudowie, jak pokazano na Rysunek 6B. Aby ocenić skuteczność tego magnetycznego mechanizmu blokującego, przeprowadzono test ciśnienia rozrywającego, który wykazał, że system może wytrzymać ślepe ciśnienie do 38,8 ± 2,4 kPa. Ta tolerancja ciśnienia znacznie przekracza typowe ciśnienia robocze spotykane w zastosowaniach związanych z hodowlami komórkowymi. Ponadto system pozostaje wolny od nieszczelności, gdy jest poddawany natężeniu przepływu do 4000 μl/min, co odpowiada naprężeniu ścinającemu wynoszącemu 74 dyn/cm2 w regionie hodowli16.

Podczas tworzenia platformy, która może przełączać się między trybami otwartymi i mikroprzepływowymi, należy zwrócić szczególną uwagę na podejście do rozsiewania komórek, które zazwyczaj nie jest problemem dla konwencjonalnych statycznych platform z otwartymi studniami16. Uszkodzenie monowarstwy wokół granicy kanału może spowodować komplikacje w wynikach eksperymentalnych20. Aby rozwiązać ten problem, zaprojektowano wyjmowany szablon, który mieści się w otwartej studzience modułu głównego i zapewnia specjalne okno, w którym komórki mogą osiąść preferencyjnie na powierzchni membrany (Rysunek 3). Gdy monowarstwa komórki zostanie ukształtowana i osiągnie konfluencję, użytkownik ma możliwość kontynuowania eksperymentu w formacie otwartej studni lub rekonfiguracji platformy w tryb mikroprzepływowy, aby wystawić monowarstwę komórki na fizjologiczne naprężenia ścinające (Rysunek 3). Magnetyczny mechanizm blokujący zapewnia możliwość łatwego przełączania między formatami otwartymi i mikroprzepływowymi w zależności od potrzeb. Na przykład, urządzenie można przywrócić do formatu open-well po stymulacji przepływu, oferując użytkownikom elastyczność w przeprowadzaniu różnych testów (takich jak barwienie immunologiczne, ekstrakcja RNA i pomiary przepuszczalności molekularnej) przy użyciu standardowych protokołów eksperymentalnych15,16.

W fizjologicznym otoczeniu ludzkiego ciała, bariera naczyniowa jest narażona na naprężenia ścinające wywołane przepływem, co służy jako kluczowa wskazówka biofizyczna, która wpływa na strukturę i funkcję bariery5,21,22. W związku z tym kluczowym wymogiem jest dodanie przepływu płynów w układach mikrofizjologicznych. Aby zademonstrować wszechstronność platformy, stworzono monowarstwę HUVEC w formacie otwartej studni przy użyciu standardowych protokołów. Po 24 godzinach hodowli statycznej platforma została przekonfigurowana do trybu mikroprzepływowego, aby wystawić monowarstwę komórki na naprężenie ścinające 10,7 dyn/cm2 przez 24 godziny. Wyniki wykazały, że komórki hodowane pod przepływem były wyrównane wzdłuż kierunku przepływu, podczas gdy komórki hodowane bez przepływu pozostawały losowo zorientowane (Rysunek 8A,B). Po stymulacji ścinaniem platforma została ponownie skonfigurowana do formatu otwartej studni w celu ekstrakcji RNA przy użyciu standardowych protokołów. Wyniki wskazują, że narażenie komórek na naprężenia ścinające spowodowało regulację w górę czynnika podobnego do Kruppela 2 (KLF2) i śródbłonkowej syntazy tlenku azotu (eNOS), które pełnią kluczowe role, takie jak funkcje przeciwzakrzepowe i miażdżycowe w zdrowych naczyniach krwionośnych23,24(Rysunek 8C).

figure-results-1
Rysunek 1: Porównanie modeli bariery naczyniowej in vitro. Schematyczna ilustracja (A) konwencjonalnych wkładów podobnych do Transwella i (B) m-μSiM z otwartą studnią. Obrazy w jasnym polu zlewającej się monowarstwy HUVEC podkreślają różnicę w jakości obrazowania w jasnym polu między membraną trawioną ścieżkowo a ultracienką nanomembraną. Podziałka = 100 μm. Na podstawie Mansouri et al.16. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Schemat podejmowania decyzji. Schemat blokowy oparty na potrzebach eksperymentalnych i preferencjach dotyczących dalszej analizy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Eksperymentalny przepływ pracy platformy. (A) Aby bezpośrednio umieścić komórki na porowatej membranie, do studzienki modułu głównego wkładany jest wyjmowany szablon do tworzenia wzorów (wstawka pokazuje wzorzyste komórki, żółte linie pokazują granice mikrokanałów). (B) Szablon może być przechowywany lub usuwany w urządzeniu do statycznej hodowli komórek. (C) Aby przekonfigurować platformę w tryb mikroprzepływowy, szablon jest zastępowany modułem przepływowym. Ze względu na magnetyczny mechanizm uszczelniający konfiguracja jest odwracalna; Obudowy i moduł przepływu można wyjąć, aby przełączyć się w tryb otwartej studni. Podziałka = 200 μm. Na podstawie Mansouri et al.16. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Schematyczna ilustracja form. (A) Forma szablonu. (B) Wycinany laserowo arkusz akrylowy. (C) zmontowany widok formy szablonu. (D) Forma modułu przepływu. (E) Wycinany laserowo arkusz akrylowy. (F) Zmontowany widok formy modułu przepływowego. Elementy w kształcie trójkąta to znaki wyrównania ułatwiające mocowanie arkuszy akrylowych do form. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Schemat modułu przepływu w kształcie koniczyny. (A) Interfejs kontaktowy między modułem przepływu a chipem membranowym. Porty wlotowe i wylotowe przepływu płynu są pokazane na różowo. (B) Obraz 3D modułu przepływu PDMS. Na podstawie Mansouri et al.16. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Magnetyczny zestaw do rekonfiguracji urządzenia. (A) Schematyczna demonstracja komponentów do rekonfiguracji urządzenia do trybu mikroprzepływowego. Osadzone magnesy o przeciwległych biegunach wywołują przyciąganie do uszczelnienia. (B) Przekrój poprzeczny zrekonfigurowanego urządzenia pokazujący kanał naczyniowy w kolorze różowym i przedział tkankowy w kolorze zielonym. Na podstawie Mansouri et al.16. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Widok zmontowany obwodu przepływu. Obwód składa się z pompy perystaltycznej, dwóch zbiorników do dostarczania mediów komórkowych i tłumienia wahań, rurki i akrylowego stopnia do utrzymywania komponentów na miejscu. Na podstawie Mansouri et al.16. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: Porównanie HUVEC hodowanych w trybie otwartym i mikroprzepływowym. Komórki wysiewano i hodowano w basenie otwartym przez 24 godziny w celu utworzenia zlewającej się monowarstwy. W ciągu kolejnych 24 godzin jeden zestaw urządzeń został przekonfigurowany do trybu mikroprzepływowego. (A) Komórki hodowane pod wpływem przepływu (naprężenie ścinające 10,7 dynes.cm-2) wyrównane wzdłuż kierunku przepływu (wstawka pokazuje aktynę i jądra komórek odpowiednio na zielono i niebiesko). (B) Komórki hodowane bez przepływu w formacie otwartej studzienki nie wykazywały wyrównania. Długość słupków na wykresach radarowych pokazuje liczbę komórek w odpowiednim kierunku. (C) Komórki hodowane w przepływie wykazywały wyższą regulację w górę genów KLF2 i eNOS w porównaniu z warunkami braku przepływu (**p < 0,01, n = 3, średnia ± SD). Podziałka = 100 μm. Na podstawie Mansouri et al.16. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca 1: Naprężenie ścinające na powierzchni nanomembrany przy różnych prędkościach przepływu. Poniższa tabela zawiera informacje o wartościach naprężeń ścinających na powierzchni nanomembrany przy różnych natężeniach przepływu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik kodowania 1: Model CAD formy szablonu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik kodowania 2: Model CAD laserowo wyciętych wgłębień dla formy szablonu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik kodowania 3: model CAD modułu przepływu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowe kodowanie Plik 4: Model CAD laserowo wycinanych wnęk dla formy modułu przepływowego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik kodowania 5: model CAD górnej obudowy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik kodowania 6: Model CAD dolnej obudowy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik kodowania 7: Model CAD sceny akrylowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest opracowanie praktycznej metody włączania możliwości przepływu do platformy z otwartą studnią wyposażoną w ultracienką nanomembranę. W tej konstrukcji zastosowano metodę zatrzasku magnetycznego, co umożliwia przełączanie między trybami otwartej studni i fluidycznymi podczas eksperymentów i łączy zalety obu podejść. W przeciwieństwie do konwencjonalnych platform klejonych na stałe, zatrzask magnetyczny umożliwia demontaż platformy w dogodnych punktach podczas eksperymentalnego przepływu pracy 16,25,26,27. Na tej platformie komórki są rozsiewane, a bariera jest ustanawiana w znanym formacie studni otwartej, a następnie system jest rekonfigurowany do trybu fluidycznego, po prostu dodając moduł przepływu i uszczelniając go magnetycznie. Ta rekonfiguracja oferuje dwie kluczowe korzyści: po pierwsze, umożliwia symulację warunków fizjologicznych poprzez wystawienie monowarstwy komórki na naprężenia ścinające wywołane płynem; Po drugie, ułatwia wprowadzanie składników wtórnych, takich jak komórki odpornościowe, w warunkach przepływu16. Funkcja zatrzasku magnetycznego oferuje metodę montażu bez użycia narzędzi, umożliwiając przełączanie na żądanie między formatem otwartym a mikroprzepływowym. W związku z tym dalsze analizy, takie jak immunocytochemia i ekstrakcja RNA, mogą być przeprowadzane w znanym formacie z otwartą studnią przy użyciu standardowych technik lub przy użyciu technik mikroprzepływowych w zależności od potrzeb16.

Uszczelnienie magnetyczne jest krytycznym parametrem projektu, który umożliwia rekonfigurację platformy, a zatem w celu zapewnienia jej dokładnego działania należy wziąć pod uwagę kilka czynników: (1) Wysokość dolnej obudowy musi odpowiadać wysokości modułu głównego (tolerancja: ±0,1 mm), aby prawidłowo zamknąć moduł. (2) Wysokość modułu przepływowego musi być nieco wyższa niż studzienka modułu rdzeniowego (0-0,1 mm). (3) Ta konstrukcja można dostosować do szerokiej gamy materiałów i nie wymaga, aby moduł przepływu był zbudowany z materiałów elastomerowych. Kluczowym elementem jest zastosowanie miękkiego, przypominającego uszczelkę materiału na styku modułu przepływowego i chipa membrany, aby zapewnić niezawodne uszczelnienie. (4) Średnica wycinanych laserowo wnęk w obudowach magnesów wciskanych musi być zoptymalizowana w oparciu o zastosowany przyrząd28. Magnesy mogą się odczepić i doprowadzić do wycieku przepływu, jeśli średnica wnęki jest zbyt duża, lub obudowy mogą pęknąć podczas wkładania magnesu, jeśli wnęki są zbyt małe. Postępując zgodnie z powyższymi rozważaniami, przedstawione tutaj podejście do montażu magnetycznego można zastosować do rekonfiguracji innych systemów z otwartą studnią w tryb mikroprzepływowy.

Aby mieć możliwość rekonfiguracji, konieczne jest użycie szablonu do modelowania, który umożliwia precyzyjne pozycjonowanie komórek na powierzchni błony. Szablon zapewnia, że żadne komórki nie znajdują się poza porowatym obszarem hodowli (tj. w obszarze podparcia krzemu), który może zostać uszkodzony po włożeniu modułu przepływowego. Ten aspekt staje się szczególnie istotny w modelach kohodowlanych, ponieważ komórki przypadkowo wysiane w niezamierzonych miejscach nie mogą aktywnie uczestniczyć w rozwoju tkanki barierowej. Niemniej jednak te zagubione komórki są zwykle odzyskiwane podczas procesu lizy i mogą potencjalnie wprowadzać błąd systematyczny w badaniach ekspresji genów, które badają interakcje między komórkami przez błonę20. Wysiewanie komórek w otwartej studni za pomocą szablonu zwiększa wydajność wysiewu poprzez łagodzenie strat komórek wzdłuż ścieżki przepływu, które są nieodłącznie związane z konwencjonalnymi platformami mikroprzepływowymi 4,16. Platforma ta jest również w stanie włączyć wiele typów ogniw i materiałów ECM 15,16,17. Na przykład hydrożel wypełniony komórkami może zostać wstrzyknięty do dolnego kanału urządzenia, aby naśladować przedział tkankowy, podczas gdy śródbłonek jest tworzony na górze błony.

Chociaż moduły i komponenty magnetyczne mogą być ponownie wykorzystane, utrzymanie skutecznego uszczelnienia przez kilka zastosowań może stanowić problem ze względu na poluzowanie magnesów w obudowie i zmniejszenie siły uszczelnienia. Problem ten można złagodzić, tworząc nowe laminowane moduły dla każdego eksperymentu lub masowo produkując komponenty przy użyciu technik formowania wtryskowego lub druku 3D po ustaleniu projektów. W metodzie opisanej w tym protokole moduł przepływu jest ręcznie umieszczany w module głównym, a możliwości multipleksowania i automatyzacji systemu są ograniczone. Aby zwiększyć przepustowość eksperymentalną, moduł przepływu i górna obudowa mogą być zintegrowane w jeden moduł funkcjonalny zawierający wewnętrzne kanały prowadzące i znormalizowane połączenia rurowe, które jednocześnie łączą kilka modułów równolegle.

Elementy modułu z rdzeniem otwartym są produkowane masowo i dostępne na rynku. Inne elementy systemu, takie jak moduł przepływowy, obudowy i szablon do modelowania, mogą być również wytwarzane na dużą skalę. Co więcej, rekonfigurowalność platformy pozwala na dodanie czujników i siłowników (np. modułu przezśródbłonkowego oporu elektrycznego, modułu elektroporacji) w celu stymulacji i pomiarów w czasie rzeczywistym. Ogólnie rzecz biorąc, platforma ta łączy w sobie podejście konwencjonalne i mikroprzepływowe, aby pomóc w powszechnym zastosowaniu poza laboratoriami inżynierskimi.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.L.M. jest współzałożycielem SiMPore, Inc. i posiada udziały w spółce. SiMPore komercjalizuje ultracienkie technologie oparte na krzemie, w tym membrany wykorzystane w tym badaniu.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało częściowo sfinansowane przez National Institute of Health pod numerami nagród R43GM137651, R61HL154249, R16GM146687, oraz grantu NSF CBET 2150798. Autorzy dziękują warsztatowi mechanicznemu RIT za wykonanie form aluminiowych. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Rurki Micro Flow 0,5 x 0,86Langer InstrumentsWX10-14 &
1 mm, Integra MiltexVWR95039-090
1x PBS 7,4 pHThermoFisher Scientific10010023
20 GAUGE IT SERIES KOŃCÓWKA DOZUJĄCAJensen GlobalJG20-1.5X
21 GAUGE NT PREMIUM SERIES KĄTOWA KOŃCÓWKA DOZUJĄCAJensen GlobalJG21-1.0HPX-90
3M 467 MP Czuły na nacisk klej (PSA)DigiKey3M9726-ND
3M 468 MP Klej samoprzylepny (PSA)DigiKey3M9720-ND
AlexaFluor 488 sprzężona falloidynaThermoFisher ScientificA12379 
Biosystemy stosowane  TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444556
Albumina surowicy bydlęcej (BSA), frakcja V, 98%, klasa odczynnika, Alfa Aesar, Rozmiar = 10 gVWRAAJ64100-09
Przezroczysty, odporny na zarysowania i promieniowanie UV odlew akrylowyMcMaster-Carr8560K17112" x 12" x 1/16"
Przezroczysty odlewany arkusz akrylowy odporny na zarysowania i promieniowanie UVMcMaster-Carr8589K3112 "x 12" x 3/32 "
Przezroczysty, odporny na zarysowania i promieniowanie UV odlew akrylowyMcMaster-Carr8560K19112" x 12" x 7,64"
Corning Fibronectin, Człowiek, 1 mgOkulary47743-728
Globe Scientific, dł. x szer. = 24 x 60 mmVWR10118-677
DOW SYLGARD 184 SILIKONOWA KAPSUŁKA PRZEZROCZYSTA 0,5 KG ZESTAWEllsworth Kleje4019862
EGM-2 Medium do wzrostu komórek śródbłonka-2 BulletKitLonzaCC-3162
Fixture A1& A2SiMPore Inc.NA
Oprawa B1& B2SiMPore Inc.
Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności z inhibitorem RNazyThermo Fisher Scientific4374966
Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)ThermoFisher ScientificC0035C
LIVE/DEAD (488/570)SondyScientific R37601
Hoechst 33342, trichlorowodorek, trójwodzianThermo Fisher ScientificH3570
Magnesy niklowane (średnica 4,75 mm, siła ciągnięcia 0,34 kg)K& J MagneticsD313/16" śr.  x 1/16" grubości
Paraformaldehyd, 4% w/v aq. Soln., bez metanolu, Alfa AesarFisher Scientificaa47392-9M
Pompa perystaltycznaLanger InstrumentsBQ50-1J-A
Photoresist SU-8 rozwiązanie deweloperskieFisher ScientificNC9901158
Filtry strzykawkowe PVDFPerkinElmer2542913
WafelkrzemowyWafel uniwersytecki,USA1196
SU-8 3050Fisher ScientificNC0702369
Gen docelowy: eNOS (Hs01574659_m1)ThermoFisher Scientific4331182
Gen docelowy: GAPDH (Hs02786624_g1)ThermoFisher Scientific4331182
Gen docelowy: KLF2 (Hs00360439_g1)ThermoFisher Scientific4331182
Thermo Scientific  Pierce 20x PBS Tween 20Thermo Fisher Scientific28352
Próbka rurki transportowej Białe nakrętki, 5 mL, sterylnyVWR100500-422
TRI-reagentThermoFisher ScientificAM9738
Ultracienki nanoporowaty chip membranowySiMPore Inc.NPSN100-1LKonstrukcja jest  kompatybilna ze wszystkimi membranami SiMPore
uSiM component 1SiMPore Inc.NA
uSiM komponent 2SiMPore Inc.nie
Jednorazowe stemple do biopsji DG serii nakrywkowe Corning , Zestaw do obrazowania komórek molekularne Thermo Fisher

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Claesson-Welsh, L., Dejana, E., McDonald, D. M. Permeability of the Endothelial Barrier: Identifying and Reconciling Controversies. Trends in Molecular Medicine. 27 (4), 314-331 (2021).
  2. Vera, D., et al. Engineering tissue barrier models on hydrogel microfluidic platforms. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (12), 13920-13933 (2021).
  3. Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening. Biotechnology and Bioengineering. 114 (1), 184-194 (2017).
  4. Sakolish, C. M., Esch, M. B., Hickman, J. J., Shuler, M. L., Mahler, G. J. Modeling barrier tissues in vitro: methods, achievements, and challenges. eBioMedicine. 5, 30-39 (2016).
  5. Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
  6. Tan, K., et al. A high-throughput microfluidic microphysiological system (PREDICT-96) to recapitulate hepatocyte function in dynamic, re-circulating flow conditions. Lab on a Chip. 19 (9), 1556-1566 (2019).
  7. Ayuso, J. M., Virumbrales-Muñoz, M., Lang, J. M., Beebe, D. J. A role for microfluidic systems in precision medicine. Nature Communications. 13 (1), 3086(2022).
  8. Katt, M. E., Shusta, E. V. In vitro models of the blood-brain barrier: building in physiological complexity. Current Opinion in Chemical Engineering. 30, 42-52 (2020).
  9. Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews Genetics. 23 (8), 467-491 (2022).
  10. Duncombe, T. A., Tentori, A. M., Herr, A. E. Microfluidics: reframing biological enquiry. Nature reviews. Molecular cell biology. 16 (9), 554-567 (2015).
  11. Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (rid) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360(2019).
  12. Ahmed, A., et al. Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), C1112-C1124 (2021).
  13. Ahmed, A., et al. Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality. Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186(2021).
  14. Łach, A., Wnuk, A., Wójtowicz, A. K. Experimental models to study the functions of the blood-brain barrier. Bioengineering. 10 (5), 519(2023).
  15. McCloskey, M. C., et al. The Modular µSiM: A mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro. Advanced Healthcare Materials. 11 (18), 2200804(2022).
  16. Mansouri, M., et al. The modular µsim reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. 11 (21), 2200802(2022).
  17. Hudecz, D., et al. Modelling a human blood-brain barrier co-culture using an ultrathin silicon nitride membrane-based microfluidic device. International Journal of Molecular Sciences. 24 (6), 5624(2023).
  18. Joshi, I. M., et al. Microengineering 3D Collagen Matrices with Tumor-Mimetic Gradients in Fiber Alignment. bioRxiv. , (2023).
  19. Hsu, M. C., et al. A miniaturized 3D printed pressure regulator (µPR) for microfluidic cell culture applications. Scientific Reports. 12 (1), 10769(2022).
  20. Rogers, M. T., et al. A high-throughput microfluidic bilayer co-culture platform to study endothelial-pericyte interactions. Scientific reports. 11 (1), 12225(2021).
  21. Wettschureck, N., Strilic, B., Offermanns, S. Passing the vascular barrier: endothelial signaling processes controlling extravasation. Physiological Reviews. 99 (3), 1467-1525 (2019).
  22. Wang, Y. I., Shuler, M. L. UniChip enables long-term recirculating unidirectional perfusion with gravity-driven flow for microphysiological systems. Lab on a Chip. 18 (17), 2563-2574 (2018).
  23. Nayak, L., Lin, Z., Jain, M. K. 34;Go with the flow": how Krüppel-like factor 2 regulates the vasoprotective effects of shear stress. Antioxidants & Redox Signaling. 15 (5), 1449-1461 (2011).
  24. Satoh, T., et al. A pneumatic pressure-driven multi-throughput microfluidic circulation culture system. Lab on a chip. 16 (12), 2339-2348 (2016).
  25. Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. A Reversibly sealed, easy access, modular (seam) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces. PLOS ONE. 11 (5), e0156341(2016).
  26. Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), 035019(2022).
  27. Hasan, M. R., et al. One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (2), 025015(2018).
  28. Ahmed, A., et al. Microengineering 3D collagen hydrogels with long-range fiber alignment. Journal of Visualized Experiments. 187, e64457(2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microphysiological SystemsBarrier Tissue ModelsOpen Well PlatformFlow EnhancementReconfigurable Cell CultureEndothelial Cell MonolayerMagnetic AssemblyMicrofluidic ModeShear Stress ExposureMembrane Based Culture

Related Articles