Ten protokół opisuje rekonfigurowalną platformę hodowli komórkowych opartą na membranie, która integruje format otwartej studni z możliwościami przepływu płynów. Platforma ta jest kompatybilna ze standardowymi protokołami i umożliwia odwracalne przejścia między trybem hodowli w studni otwartej a mikroprzepływowym, dostosowując się do potrzeb zarówno laboratoriów inżynieryjnych, jak i biologicznych.
Artykuł metodologiczny
Przekształcanie statycznych modeli tkanek barierowych w dynamiczne systemy mikrofizjologiczne
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Systemy mikrofizjologiczne to zminiaturyzowane platformy do hodowli komórkowych używane do naśladowania struktury i funkcji tkanek ludzkich w warunkach laboratoryjnych. Platformy te nie zyskały jednak powszechnego zastosowania w laboratoriach biologicznych, w których metody oparte na błonach typu open well służą jako złoty standard naśladowania barier tkankowych, pomimo braku możliwości przepływu płynów. Problem ten można przede wszystkim przypisać niekompatybilności istniejących systemów mikrofizjologicznych ze standardowymi protokołami i narzędziami opracowanymi dla systemów z otwartą studnią.
Tutaj prezentujemy protokół do tworzenia rekonfigurowalnej platformy opartej na membranie o strukturze otwartej studni, możliwości zwiększenia przepływu i kompatybilności z konwencjonalnymi protokołami. System ten wykorzystuje podejście do montażu magnetycznego, które umożliwia odwracalne przełączanie między trybami otwartej studni i mikroprzepływowymi. Dzięki takiemu podejściu użytkownicy mają możliwość rozpoczęcia eksperymentu w formacie otwartej studni przy użyciu standardowych protokołów i dodawania lub usuwania funkcji przepływu w zależności od potrzeb. Aby zademonstrować praktyczne zastosowanie tego systemu i jego kompatybilność ze standardowymi technikami, stworzono monowarstwę komórek śródbłonka w formacie otwartej studzienki. System został przekonfigurowany w celu wprowadzenia przepływu płynu, a następnie przełączono go na format otwartej studzienki w celu przeprowadzenia barwienia immunologicznego i ekstrakcji RNA. Oczekuje się, że ze względu na kompatybilność z konwencjonalnymi protokołami odwiertów otwartych i możliwość zwiększenia przepływu, ten rekonfigurowalny projekt zostanie przyjęty zarówno przez laboratoria inżynieryjne, jak i biologiczne.
Wprowadzenie
Bariery naczyniowe służą jako krytyczny interfejs, który oddziela przedział krwi od otaczającej tkanki. Odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy poprzez przyciąganie komórek odpornościowych, kontrolowanie przepuszczalności molekularnej i ochronę przed wtargnięciem patogenów do tkanki1,2. Modele hodowli in vitro zostały opracowane w celu naśladowania mikrośrodowiska in vivo, umożliwiając systematyczne badania czynników i warunków, które wpływają na właściwości bariery zarówno w stanie zdrowym, jak i chorym3,4.
Najbardziej rozpowszechnionym podejściem dla takich modeli hodowlanych jest konfiguracja "otwartej studni" podobna do Transwella5, gdzie porowata, wytrawiona ścieżka membrana hodowlana oddziela przedziały wypełnione pożywką (Rysunek 1A). W tym formacie komórki mogą być wysiewane po obu stronach błony i opracowano szeroki zakres protokołów eksperymentalnych. Jednak systemy te mają ograniczoną zdolność do dostarczania przepływów płynów niezbędnych do wspomagania dojrzewania bariery i naśladowania krążenia komórek odpornościowych obserwowanego in vivo5,6. W związku z tym nie mogą być używane do badań wymagających przepływów dynamicznych, które wprowadzają dawki leków, stymulację mechaniczną lub naprężenia ścinające wywołane płynem6,7,8.
Aby przezwyciężyć ograniczenia systemów z otwartymi studniami, opracowano platformy mikroprzepływowe, które łączą porowate membrany hodowlane z indywidualnie adresowalnymi kanałami fluidycznymi9. Platformy te oferują precyzyjną kontrolę nad kierowaniem płynów, perfuzją i wprowadzaniem związków chemicznych, kontrolowaną stymulację ścinającą oraz możliwości dynamicznego dodawania komórek7,10,11,12,13. Pomimo zaawansowanych możliwości zapewnianych przez platformy mikroprzepływowe, nie spotkały się one z powszechnym zastosowaniem w laboratoriach biologicznych ze względu na złożone protokoły mikroprzepływowe i ich niekompatybilność z ustalonymi eksperymentalnymi przepływami pracy4,10,14.
Aby wypełnić lukę między tymi technologiami, prezentujemy protokół, który wykorzystuje magnetycznie rekonfigurowalny, modułowy system. System ten można łatwo przełączać między trybem otwartym a mikroprzepływowym w zależności od konkretnych potrzeb eksperymentu. Platforma wyposażona jest w urządzenie z otwartą studnią, znane jako m-μSiM (modułowy system mikrofizjologiczny obsługiwany przez membranę krzemową), z membraną hodowlaną o grubości 100 nm (nanomembraną). Ta nanomembrana ma wysoką porowatość (15%) i przezroczystość podobną do szkła, jak pokazano na rysunku Rysunek 1B. Fizycznie oddziela górną komorę od dolnego kanału, umożliwiając transport molekularny przez fizjologiczne skale długości15. W przeciwieństwie do konwencjonalnych membran trawionych ścieżkowo, które mają znane wyzwania w obrazowaniu żywych komórek za pomocą obrazowania w jasnym polu, korzystne właściwości optyczne i fizyczne nanomembrany umożliwiają wyraźną wizualizację komórek po obu stronach powierzchni membrany15,16,17.
Obecny protokół opisuje produkcję specjalistycznych modułów do wysiewu i przepływu oraz wyjaśnia magnetyczną rekonfigurację platformy. Pokazano, w jaki sposób platforma może być wykorzystana do ustanowienia barier śródbłonka zarówno w warunkach statycznych, jak i dynamicznych. Ta demonstracja pokazuje, że komórki śródbłonka wyrównują się wzdłuż kierunku przepływu, z regulacją w górę wrażliwych na ścinanie celów genowych pod wpływem stymulacji ścinania.
Protokół
Ten projekt może być używany w różnych trybach, w zależności od wymagań eksperymentalnych i preferencji użytkownika końcowego. Przed każdym eksperymentem zapoznaj się ze schematem decyzyjnym przedstawionym w Rysunek 2, aby określić niezbędne kroki i moduły dla protokołu. Na przykład, jeśli użytkownik zamierza zachować format otwartej studni przez cały czas trwania eksperymentu, aby bezpośrednio porównać go z systemem typu Transwell, szablon wzoru nie jest wymagany do wysiewu komórek. Moduł główny jest dostępny na rynku (patrz Tabela materiałów), a ultracienka nanomembrana może być wybierana z biblioteki materiałów o różnej porowatości i wielkości porów, aby dopasować ją do potrzeb eksperymentalnych.
1. Wykonanie szablonu do tworzenia wzorów
UWAGA: Szablon do tworzenia wzorów służy do umieszczania komórek wyłącznie na porowatym obszarze chipa membranowego, zapobiegając osadzaniu się komórek na otaczającej warstwie krzemu, gdzie mogłyby potencjalnie ulec uszkodzeniu po dodaniu modułu przepływu16 (patrz Rysunek 3). Uszkodzenie monowarstwy może niekorzystnie wpłynąć na integralność bariery i zagrozić wynikom eksperymentów. Szablon nie jest potrzebny w otwartej, statycznej hodowli, ponieważ nie ma ryzyka uszkodzenia.
- Kup, obrób maszynowo lub wydrukuj formę 3D, korzystając z projektu dostarczonego w Dodatkowym pliku kodowania 1 (Rysunek 4A).
UWAGA: Ścianki szablonu są zwężane w celu zwiększenia pojemności nośnika i zminimalizowania pułapkowania pęcherzyków w porównaniu z elementami o prostych ściankach o wysokim współczynniku proporcji. - Przymocuj samoprzylepną folię samoprzylepną (PSA) o grubości 130 μm do arkusza akrylowego o grubości 3,2 mm za pomocą zimnego wałka (patrz Tabela materiałów).
- Wytnij laserowo arkusz akrylowy zgodnie z projektem dostarczonym w dodatkowym pliku kodowania 2, aby utworzyć tablicę wnęk ( Rysunek 4B).
- Zdejmij warstwę ochronną z folii PSA i przymocuj arkusz akrylowy do formy.
UWAGA: Upewnij się, że arkusz wycinany laserowo jest wyrównany z formą tak, aby elementy formy były wyśrodkowane we wnęce (Rysunek 4C). Dokładność pozycjonowania komórek na membranie zależy od tego kroku. - Dokładnie wymieszaj prepolimer PDMS (stosując stosunek zasady do katalizatora 10:1) (patrz Tabela materiałów) i odgazuj go w komorze próżniowej, aż nie pozostaną żadne widoczne pęcherzyki (5-15 min).
- Powoli wlej PDMS do wnęk formy, wyrównując ją płaską krawędzią.
UWAGA: Aby zapobiec uwięzieniu pęcherzyków, powoli wlewaj PDMS do każdej wnęki. Jeśli po nalaniu pojawią się pęcherzyki, umieść formę w komorze próżniowej i ponownie ją odgazuj. - Utwardź PDMS na płycie grzejnej w temperaturze 70 °C przez 1 godzinę, a następnie pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej.
- Wyciągnij szablony z jam formy za pomocą pęsety z płaską końcówką.
2. Wykonanie modułu przepływu
UWAGA: Moduł przepływu ma podobną powierzchnię co studnia w kształcie koniczyny modułu głównego i zawiera formowany mikrokanał (szerokość = 1,5 mm, wysokość = 0,2 mm, długość = 5 mm). Kształt koniczyny pomaga w wyrównaniu kanału nad porowatym obszarem kultury (Rysunek 5).
- Użyj standardowych technik miękkiej litografii18, aby stworzyć formę silikonową o cechach zdefiniowanych przez projekt dostarczony w Dodatkowym Pliku Kodowania 3 (Rysunek 4D).
- Przymocuj folię PSA 130 μm do arkusza akrylowego o grubości 3,2 mm.
- Wytnij laserowo arkusz akrylowy na podstawie projektu podanego w dodatkowym pliku kodowania 4, aby utworzyć tablicę wnęk w kształcie koniczyny ( Rysunek 4E).
UWAGA: Wysokość wnęki określa wysokość modułu przepływowego, który musi być nieco wyższy (o 0-0,1 mm) niż wysokość modułu rdzeniowego, aby zapewnić prawidłowe uszczelnienie. - Usuń warstwę ochronną z folii PSA, a następnie przymocuj wycięty laserowo arkusz do formy silikonowej, wyrównując trójkątne znaki wyrównania na formie silikonowej z tymi na arkuszu wycinanym laserowo.
UWAGA: Podobnie jak w kroku 1.4, upewnij się, że wycinany laserowo arkusz akrylowy jest wyrównany z formą silikonową, tak aby elementy formy były wyśrodkowane w każdej wnęce (Rysunek 4F). Ten krok określa położenie mikrokanału względem śladu. - Powoli wlej odgazowany PDMS do wnęk formy i wyrównaj go płaską krawędzią.
UWAGA: Jeśli po wylaniu pojawią się bąbelki, odgazuj formę, aż bąbelki zostaną usunięte. - Umieść formę na płycie grzejnej i piecz PDMS w temperaturze 70 °C przez 1 godzinę, a następnie pozwól foremce ostygnąć do temperatury pokojowej.
- Ostrożnie wyjmij moduły przepływowe z wnęk formy za pomocą pęsety z płaską końcówką.
- Ustaw moduł przepływu tak, aby elementy mikrokanału były skierowane do góry, a porty wlotowe i wylotowe rdzenia umieścić na końcu kanału za pomocą stempla do biopsji (patrz Tabela materiałów).
3. Wykonanie dolnych i górnych obudów akrylowych
UWAGA: Główny moduł mieści się w dolnej obudowie. Przyciąganie między magnesami osadzonymi w obudowach ściska i uszczelnia moduł przepływu do modułu głównego (Rysunek 6).
- Wytnij laserowo arkusz akrylowy o grubości 2 mm, korzystając z projektu dostarczonego w dodatkowym pliku kodowania 5, aby stworzyć górną obudowę z otworami do włożenia magnesu.
- Przymocuj folię PSA 130 μm do arkusza akrylowego o grubości 3,5 mm.
- Wytnij laserowo arkusz akrylowy na podstawie wzoru podanego w dodatkowym pliku kodowania 6, aby utworzyć dolną obudowę z otworami do włożenia magnesu.
UWAGA: Grubość dolnej obudowy jest parametrem krytycznym i musi odpowiadać całkowitej grubości modułu głównego, aby zapobiec wyciekom podczas przepływu. - Usuń warstwę ochronną PSA i przymocuj dolną obudowę do szklanego szkiełka nakrywkowego.
- Niklowane magnesy neodymowe o średnicy 4,75 mm wciskane na wcisk w laserowo wycięte otwory w obudowach.
UWAGA: Upewnij się, że magnesy w dolnej i górnej obudowie są umieszczone z przeciwną biegunowością, aby zapewnić przyciąganie magnetyczne (Rysunek 6).
4. Wykonanie obwodu przepływu
UWAGA: Obwód przepływu w pętli zamkniętej zawiera dwie fiolki do pobierania próbek jako zbiorniki (Rysunek 7). Zbiornik wlotowy jest wyposażony w filtr z polifluorku winylidenu (PVDF), który umożliwia zrównoważenie pożywki komórkowej ze stężeniem CO2 w inkubatorze.
- Użyj dziurkacza do biopsji o średnicy 1 mm, aby utworzyć dwa otwory w nakrętce fiolki do pobierania próbek.
- Za pomocą stempli biopsyjnych wykonać dwa otwory (1 mm i 4 mm) w nasadce oddzielnej fiolki do pobierania próbek, a następnie utworzyć otwór o średnicy 1 mm w dolnej części tej fiolki.
- Włóż końcówki dozujące 20 G do każdego z otworów o średnicy 1 mm i uszczelnij je gorącym klejem.
- Umieść filtr PVDF 0.22 μm (patrz Tabela materiałów) w otworze 4 mm i uszczelnij go gorącym klejem.
- Wytnij laserowo arkusz akrylowy o grubości 1,5 mm, korzystając z projektu dostarczonego w dodatkowym pliku kodowania 7, aby utworzyć stolik do przechowywania próbki.
- Umieść zbiorniki na akrylowym stoliku.
- Podłącz końcówki dozujące za pomocą rurek mikroprzepływowych (patrz Tabela materiałów).
- Połącz rurki z wlotem i wylotem modułu przepływowego za pomocą końcówek dozujących 21 G.
- Do cyrkulacji przepływu należy użyć pompy perystaltycznej (patrz tabela materiałów).
UWAGA: W razie potrzeby można również użyć pomp strzykawkowych lub pneumatycznych do wprowadzenia przepływu. Natężenie przepływu należy określić na podstawie potrzeb doświadczalnych. Obszerna tabela, pochodząca z eksperymentalnie zweryfikowanego modelu COMSOL, znajduje się w Tabeli Uzupełniającej 1, aby pomóc użytkownikom w doborze niezbędnego natężenia przepływu do osiągnięcia pożądanego naprężenia ścinającego na monowarstwie komórki16.
5. Rozsiewanie komórek
UWAGA: Podobnie jak w przypadku konwencjonalnych wkładek membranowych, na nanomembranie można hodować różne typy komórek. Wtórny typ komórki może być również hodowany wspólnie po drugiej stronie błony w dolnym kanale15.
- Pokryj membranę 5 μg/cm2 fibronektyny (patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, aby poprawić przyczepienie komórek.
UWAGA: Wybrany typ ogniwa może mieć wpływ na wymaganą powłokę i gęstość komórek. Opisana tutaj procedura dotyczy ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC, patrz tabela materiałów). - Odessać roztwór powlekający za pomocą pipety P200 i umieścić szablon do tworzenia wzorów w studzience modułu rdzeniowego.
- Dodaj nośnik komórkowy do studzienki i dolnego kanału urządzenia.
- Wysiewać HUVEC o gęstości 40 000 komórek/cm2 do dołka.
UWAGA: HUVEC o tej gęstości zazwyczaj tworzą zlewającą się monowarstwę po 24 godzinach inkubacji16,19. - Umieść urządzenie na szalce Petriego. Dodaj stożkową nakrętkę probówki o pojemności 15 ml z wodą DI do szalki Petriego, aby utrzymać lokalną wilgotność.
- Przenieść szalkę Petriego do inkubatora.
UWAGA: Media komórkowe w górnym i dolnym kanale urządzenia należy wymieniać co 24 godziny. Aby zmienić nośnik w dolnym kanale, delikatnie wstrzyknij nowy nośnik do jednego z portów, aby przemieścić stary nośnik z drugiego portu.
6. Rekonfiguracja do trybu mikroprzepływowego
- Wysterylizuj górną obudowę, dolną obudowę, moduł przepływowy, zbiorniki, probówki i końcówki dozujące, umieszczając je w komorze sterylizacyjnej UV na 30 minut przed montażem. Cyrkulacja 70% etanolu, a następnie sterylny PBS w obiegu przepływowym.
- Napełnij zbiorniki i probówki pożywką do wzrostu komórek śródbłonka (patrz tabela materiałów).
- Umieść dolną obudowę na stoliku na próbkę. Włóż moduł z rdzeniem otwartej studzienki do dolnej obudowy.
- Odessać pożywkę komórkową z dołka modułu. Umieść moduł przepływu w studni.
- Umieść górną obudowę, aby uszczelnić moduł przepływowy w studzience modułu rdzeniowego. Podłącz końcówki dozujące wlotowe i wylotowe do portów modułu przepływu.
- Uruchom pompę perystaltyczną, aby wprowadzić przepływ płynu do układu.
7. Przeprowadzanie dalszych analiz w formacie open-well po wprowadzeniu przepływu
UWAGA: Czas hodowli zależy tutaj od celów eksperymentu. Użytkownicy mogą przeprowadzać dalsze analizy (np. immunocytochemia, ekstrakcja RNA) w formacie otwartym lub mikroprzepływowym w zależności od swoich preferencji. Na przykład, jeśli preferowany jest format z otwartą studnią, system powinien zostać ponownie skonfigurowany do przeprowadzania testów w oparciu o standardowe protokoły16,19.
- Zatrzymaj pompę, gdy osiągniesz żądany czas ekspozycji na przepływ ścinający. Wyjmij końcówki dozujące wlotowe i wylotowe.
- Zdejmij górną obudowę. Delikatnie wyjmij moduł przepływu ze studni za pomocą pęsety.
- Dodaj 100 μl pożywki komórkowej do studzienki. Przeprowadzaj pożądane testy w oparciu o standardowe protokoły.
Wyniki
Moduł rdzeniowy z otwartą studnią jest początkowo umieszczany w specyficznej wnęce utworzonej przez dolną obudowę i szkiełko nakrywkowe, jak pokazano na Rysunku 6A. Następnie do studni modułu rdzeniowego wstawiany jest moduł przepływowy, który obejmuje mikrokanał i porty dostępu. Moduł przepływowy jest szczelnie dociskany do krzemowej warstwy wspierającej membranę dzięki sile przyciągania magnetycznego między magnesami osadzonymi w dolnej i górnej obudowach, co przedstawiono na Rysunku 6B. Aby ocenić skuteczność tego magnetycznego mechanizmu blokującego, przeprowadzono test ciśnienia rozrywającego, który wykazał, że system może wytrzymać ciśnienia przy zamkniętym odpływie do 38.8 ± 2.4 kPa. Tolerancja ciśnienia ta znacznie przekracza typowe ciśnienia robocze spotykane w aplikacjach hodowli komórkowych. Co więcej, system pozostaje szczelny przy przepływach do 4000 µL/min, co odpowiada naprężeniu ścinającemu wynoszącemu 74 dynes/cm2 w obszarze hodowli16.
Podczas opracowywania platformy, która może przełączać się między trybem otwartych studzienek a trybem mikroprzepływowym, należy poświęcić szczególną uwagę metodzie wysiewania komórek, co zazwyczaj nie stanowi problemu w przypadku konwencjonalnych statycznych platform z otwartymi studzienkami16. Uszkodzenie monowarstwy wokół granicy kanału mogłoby wprowadzić komplikacje w wynikach eksperymentalnych20. Aby rozwiązać ten problem, zaprojektowano usuwalny szablon, który pasuje do otwartej studzienki modułu rdzeniowego i zapewnia specyficzne okno, dzięki któremu komórki osiadają preferencyjnie na powierzchni membrany (Rysunek 3). Gdy monowarstwa komórek zostanie uformowana i osiągnie konfluencję, użytkownik ma możliwość kontynuowania eksperymentu w formacie otwartej studzienki lub przekonfigurowania platformy w tryb mikroprzepływowy, aby poddać monowarstwę komórek fizjologicznemu naprężeniu ścinającemu (Rysunek 3). Magnetyczny mechanizm zatrzaskowy umożliwia łatwe przełączanie się między formatem otwartej studzienki a formatem mikroprzepływowym w zależności od potrzeb. Przykładowo, urządzenie można przywrócić do formatu otwartej studzienki po stymulacji przepływem, co daje użytkownikom elastyczność w przeprowadzaniu różnych analiz (takich jak immunobarwienie, ekstrakcja RNA i pomiary przepuszczalności molekularnej) przy użyciu standardowych protokołów eksperymentalnych15,16.
W warunkach fizjologicznych organizmu ludzkiego bariera naczyniowa jest narażona na naprężenia ścinające indukowane przepływem, które stanowią kluczowy sygnał biofizyczny wpływający na strukturę i funkcję bariery5,21,22. Z tego względu wprowadzenie przepływu płynu w systemach mikrofizjologicznych jest kluczowym wymaganiem. Aby zademonstrować wszechstronność platformy, zgodnie ze standardowymi protokołami utworzono monowarstwę HUVEC w formacie otwartej studni. Po 24 h hodowli statycznej platformę przekonfigurowano na tryb mikrofluidyczny, aby poddać monowarstwę komórek naprężeniu ścinającemu o wartości 10.7 dynes/cm2 przez 24 h. Wyniki wykazały, że komórki hodowane w przepływie układały się wzdłuż kierunku przepływu, podczas gdy komórki hodowane bez przepływu pozostawały zorientowane losowo (Rycina 8A,B). Po stymulacji ścinaniem platformę przekonfigurowano z powrotem do formatu otwartej studni w celu wyizolowania RNA zgodnie ze standardowymi protokołami. Wyniki wskazały, że narażenie komórek na naprężenia ścinające doprowadziło do upregulacji czynnika Kruppel-like factor 2 (KLF2) oraz syntazy tlenku azotu śródbłonka (eNOS), które pełnią krytyczne role, takie jak funkcje przeciwzakrzepowe i ateroprotekcyjne w zdrowych naczyniach krwionośnych23,24(Rycina 8C).
Rycina 1: Porównanie modeli bariery naczyniowej in vitro. Schematyczne przedstawienie (A) konwencjonalnych wkładów typu Transwell oraz (B) otwartego układu m-µSiM. Obrazy w polu jasnym konfluentnej monowarstwy HUVEC podkreślają różnicę w jakości obrazowania w polu jasnym między membraną trawioną w śladach a ultracienką nanomembraną. Paski skali = 100 µm. Adaptacja z Mansouri et al.16. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Schemat podejmowania decyzji. Schemat blokowy oparty na potrzebach eksperymentalnych i preferencjach dotyczących analizy końcowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 3: Schemat przepływu eksperymentalnego platformy. (A) W celu bezpośredniego rozmieszczenia komórek na membranie porowatej, do studzienki modułu rdzeniowego wkłada się usuwalny szablon wzorujący (na wstawce przedstawiono wzorowane komórki, żółte linie wyznaczają granice mikrokanałów). (B) Szablon może pozostać w urządzeniu lub zostać z niego usunięty w celu statycznej hodowli komórek. (C) Aby przekonfigurować platformę w tryb mikrofluidyczny, szablon zastępuje się modułem przepływowym. Dzięki magnetycznemu mechanizmowi uszczelniania konfiguracja jest odwracalna; obudowy oraz moduł przepływowy można zdjąć, aby przełączyć urządzenie w tryb otwartej studzienki. Pasek skali = 200 µm. Adaptacja z Mansouri et al.16. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4: Schematyczne przedstawienie form. (A) Forma szablonu. (B) Arkusz akrylowy wycięty laserowo. (C) Widok zmontowanej formy szablonu. (D) Forma modułu przepływowego. (E) Arkusz akrylowy wycięty laserowo. (F) Widok zmontowanej formy modułu przepływowego. Elementy w kształcie trójkątów to znaczniki wyrównania ułatwiające mocowanie arkuszy akrylowych do form. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 5: Schemat modułu przepływowego w kształcie koniczyny. (A) Interfejs styku między modułem przepływowym a chipem membranowym. Porty wlotowe i wylotowe dla przepływu płynu zaznaczono na różowo. (B) Obraz 3D modułu przepływowego z PDMS. Adaptacja z Mansouri et al.16. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 6: Zestaw magnetyczny do rekonfiguracji urządzenia. (A) Schematyczne przedstawienie komponentów służących do rekonfiguracji urządzenia do trybu mikrofluidycznego. Wbudowane magnesy o przeciwnych biegunach indukują przyciąganie w celu uszczelnienia. (B) Widok przekroju zrekonfigurowanego urządzenia, gdzie kanał naczyniowy zaznaczono na różowo, a komorę tkankową na zielono. Adaptacja z Mansouri et al.16. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 7: Widok zmontowanego obwodu przepływowego. Obwód składa się z pompy perystaltycznej, dwóch zbiorników do podawania pożywki komórkowej i tłumienia fluktuacji, przewodów oraz akrylowej platformy utrzymującej komponenty na miejscu. Adaptacja z Mansouri et al.16. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 8: Porównanie HUVEC hodowanych w trybach otwartego dołka i mikrofluidycznym. Komórki zasiano i hodowano w otwartym dołku przez 24 h w celu utworzenia konfluentnej warstwy jednowarstwowej. W ciągu kolejnych 24 h jedna grupa urządzeń została przekonfigurowana na tryb mikrofluidyczny. (A) Komórki hodowane w przepływie (naprężenie ścinające 10.7 dynes.cm-2) uległy ustawieniu wzdłuż kierunku przepływu (wstawka przedstawia aktynę i jądra komórkowe odpowiednio w kolorze zielonym i niebieskim). (B) Komórki hodowane bez przepływu w formacie otwartego dołka nie wykazały ustawienia. Długość słupków na wykresach radarowych wskazuje liczbę komórek w odpowiadającym im kierunku. (C) Komórki hodowane w przepływie wykazały wyższą nadróbkę ekspresji genów KLF2 i eNOS w porównaniu do warunków bez przepływu (**p < 0.01, n = 3, średnia ± SD). Paski skali = 100 µm. Adaptowano z Mansouri et al.16. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Tabela uzupełniająca 1: Naprężenie ścinające na powierzchni nanomembrany przy różnych prędkościach przepływu. Tabela ta zawiera informacje o wartościach naprężenia ścinającego na powierzchni nanomembrany przy różnych prędkościach przepływu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik uzupełniający z kodem 1: Model CAD formy szablonu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Uzupełniający plik kodu 2: Model CAD wycinanych laserowo wgłębień dla formy szablonowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik kodowy uzupełniający 3: Model CAD modułu przepływowego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Uzupełniający plik kodowania 4: Model CAD wycinanych laserowo wgłębień dla formy modułu przepływowego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik uzupełniający z kodem 5: Model CAD górnej obudowy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik kodowania uzupełniający 6: Model CAD dolnej obudowy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Uzupełniający plik kodowy 7: Model CAD platformy akrylowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Celem tego protokołu jest opracowanie praktycznej metody włączania możliwości przepływu do platformy z otwartą studnią wyposażoną w ultracienką nanomembranę. W tej konstrukcji zastosowano metodę zatrzasku magnetycznego, co umożliwia przełączanie między trybami otwartej studni i fluidycznymi podczas eksperymentów i łączy zalety obu podejść. W przeciwieństwie do konwencjonalnych platform klejonych na stałe, zatrzask magnetyczny umożliwia demontaż platformy w dogodnych punktach podczas eksperymentalnego przepływu pracy 16,25,26,27. Na tej platformie komórki są rozsiewane, a bariera jest ustanawiana w znanym formacie studni otwartej, a następnie system jest rekonfigurowany do trybu fluidycznego, po prostu dodając moduł przepływu i uszczelniając go magnetycznie. Ta rekonfiguracja oferuje dwie kluczowe korzyści: po pierwsze, umożliwia symulację warunków fizjologicznych poprzez wystawienie monowarstwy komórki na naprężenia ścinające wywołane płynem; Po drugie, ułatwia wprowadzanie składników wtórnych, takich jak komórki odpornościowe, w warunkach przepływu16. Funkcja zatrzasku magnetycznego oferuje metodę montażu bez użycia narzędzi, umożliwiając przełączanie na żądanie między formatem otwartym a mikroprzepływowym. W związku z tym dalsze analizy, takie jak immunocytochemia i ekstrakcja RNA, mogą być przeprowadzane w znanym formacie z otwartą studnią przy użyciu standardowych technik lub przy użyciu technik mikroprzepływowych w zależności od potrzeb16.
Uszczelnienie magnetyczne jest krytycznym parametrem projektu, który umożliwia rekonfigurację platformy, a zatem w celu zapewnienia jej dokładnego działania należy wziąć pod uwagę kilka czynników: (1) Wysokość dolnej obudowy musi odpowiadać wysokości modułu głównego (tolerancja: ±0,1 mm), aby prawidłowo zamknąć moduł. (2) Wysokość modułu przepływowego musi być nieco wyższa niż studzienka modułu rdzeniowego (0-0,1 mm). (3) Ta konstrukcja można dostosować do szerokiej gamy materiałów i nie wymaga, aby moduł przepływu był zbudowany z materiałów elastomerowych. Kluczowym elementem jest zastosowanie miękkiego, przypominającego uszczelkę materiału na styku modułu przepływowego i chipa membrany, aby zapewnić niezawodne uszczelnienie. (4) Średnica wycinanych laserowo wnęk w obudowach magnesów wciskanych musi być zoptymalizowana w oparciu o zastosowany przyrząd28. Magnesy mogą się odczepić i doprowadzić do wycieku przepływu, jeśli średnica wnęki jest zbyt duża, lub obudowy mogą pęknąć podczas wkładania magnesu, jeśli wnęki są zbyt małe. Postępując zgodnie z powyższymi rozważaniami, przedstawione tutaj podejście do montażu magnetycznego można zastosować do rekonfiguracji innych systemów z otwartą studnią w tryb mikroprzepływowy.
Aby mieć możliwość rekonfiguracji, konieczne jest użycie szablonu do modelowania, który umożliwia precyzyjne pozycjonowanie komórek na powierzchni błony. Szablon zapewnia, że żadne komórki nie znajdują się poza porowatym obszarem hodowli (tj. w obszarze podparcia krzemu), który może zostać uszkodzony po włożeniu modułu przepływowego. Ten aspekt staje się szczególnie istotny w modelach kohodowlanych, ponieważ komórki przypadkowo wysiane w niezamierzonych miejscach nie mogą aktywnie uczestniczyć w rozwoju tkanki barierowej. Niemniej jednak te zagubione komórki są zwykle odzyskiwane podczas procesu lizy i mogą potencjalnie wprowadzać błąd systematyczny w badaniach ekspresji genów, które badają interakcje między komórkami przez błonę20. Wysiewanie komórek w otwartej studni za pomocą szablonu zwiększa wydajność wysiewu poprzez łagodzenie strat komórek wzdłuż ścieżki przepływu, które są nieodłącznie związane z konwencjonalnymi platformami mikroprzepływowymi 4,16. Platforma ta jest również w stanie włączyć wiele typów ogniw i materiałów ECM 15,16,17. Na przykład hydrożel wypełniony komórkami może zostać wstrzyknięty do dolnego kanału urządzenia, aby naśladować przedział tkankowy, podczas gdy śródbłonek jest tworzony na górze błony.
Chociaż moduły i komponenty magnetyczne mogą być ponownie wykorzystane, utrzymanie skutecznego uszczelnienia przez kilka zastosowań może stanowić problem ze względu na poluzowanie magnesów w obudowie i zmniejszenie siły uszczelnienia. Problem ten można złagodzić, tworząc nowe laminowane moduły dla każdego eksperymentu lub masowo produkując komponenty przy użyciu technik formowania wtryskowego lub druku 3D po ustaleniu projektów. W metodzie opisanej w tym protokole moduł przepływu jest ręcznie umieszczany w module głównym, a możliwości multipleksowania i automatyzacji systemu są ograniczone. Aby zwiększyć przepustowość eksperymentalną, moduł przepływu i górna obudowa mogą być zintegrowane w jeden moduł funkcjonalny zawierający wewnętrzne kanały prowadzące i znormalizowane połączenia rurowe, które jednocześnie łączą kilka modułów równolegle.
Elementy modułu z rdzeniem otwartym są produkowane masowo i dostępne na rynku. Inne elementy systemu, takie jak moduł przepływowy, obudowy i szablon do modelowania, mogą być również wytwarzane na dużą skalę. Co więcej, rekonfigurowalność platformy pozwala na dodanie czujników i siłowników (np. modułu przezśródbłonkowego oporu elektrycznego, modułu elektroporacji) w celu stymulacji i pomiarów w czasie rzeczywistym. Ogólnie rzecz biorąc, platforma ta łączy w sobie podejście konwencjonalne i mikroprzepływowe, aby pomóc w powszechnym zastosowaniu poza laboratoriami inżynierskimi.
Oświadczenia
J.L.M. jest współzałożycielem SiMPore, Inc. i posiada udziały w spółce. SiMPore komercjalizuje ultracienkie technologie oparte na krzemie, w tym membrany wykorzystane w tym badaniu.
Podziękowania
To badanie zostało częściowo sfinansowane przez National Institute of Health pod numerami nagród R43GM137651, R61HL154249, R16GM146687, oraz grantu NSF CBET 2150798. Autorzy dziękują warsztatowi mechanicznemu RIT za wykonanie form aluminiowych. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Rurki Micro Flow 0,5 x 0,86 | Langer Instruments | WX10-14 & | |
| 1 mm, Integra Miltex | VWR | 95039-090 | |
| 1x PBS 7,4 pH | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| 20 GAUGE IT SERIES KOŃCÓWKA DOZUJĄCA | Jensen Global | JG20-1.5X | |
| 21 GAUGE NT PREMIUM SERIES KĄTOWA KOŃCÓWKA DOZUJĄCA | Jensen Global | JG21-1.0HPX-90 | |
| 3M 467 MP Czuły na nacisk klej (PSA) | DigiKey | 3M9726-ND | |
| 3M 468 MP Klej samoprzylepny (PSA) | DigiKey | 3M9720-ND | |
| AlexaFluor 488 sprzężona falloidyna | ThermoFisher Scientific | A12379 | |
| Biosystemy stosowane TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA), frakcja V, 98%, klasa odczynnika, Alfa Aesar, Rozmiar = 10 g | VWR | AAJ64100-09 | |
| Przezroczysty, odporny na zarysowania i promieniowanie UV odlew akrylowy | McMaster-Carr | 8560K171 | 12" x 12" x 1/16" |
| Przezroczysty odlewany arkusz akrylowy odporny na zarysowania i promieniowanie UV | McMaster-Carr | 8589K31 | 12 "x 12" x 3/32 " |
| Przezroczysty, odporny na zarysowania i promieniowanie UV odlew akrylowy | McMaster-Carr | 8560K191 | 12" x 12" x 7,64" |
| Corning Fibronectin, Człowiek, 1 mg | Okulary | 47743-728 | |
| Globe Scientific, dł. x szer. = 24 x 60 mm | VWR | 10118-677 | |
| DOW SYLGARD 184 SILIKONOWA KAPSUŁKA PRZEZROCZYSTA 0,5 KG ZESTAW | Ellsworth Kleje | 4019862 | |
| EGM-2 Medium do wzrostu komórek śródbłonka-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fixture A1& A2 | SiMPore Inc. | NA | |
| Oprawa B1& B2 | SiMPore Inc. | ||
| Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności z inhibitorem RNazy | Thermo Fisher Scientific | 4374966 | |
| Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) | ThermoFisher Scientific | C0035C | |
| LIVE/DEAD (488/570) | Sondy | Scientific R37601 | |
| Hoechst 33342, trichlorowodorek, trójwodzian | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Magnesy niklowane (średnica 4,75 mm, siła ciągnięcia 0,34 kg) | K& J Magnetics | D31 | 3/16" śr. x 1/16" grubości |
| Paraformaldehyd, 4% w/v aq. Soln., bez metanolu, Alfa Aesar | Fisher Scientific | aa47392-9M | |
| Pompa perystaltyczna | Langer Instruments | BQ50-1J-A | |
| Photoresist SU-8 rozwiązanie deweloperskie | Fisher Scientific | NC9901158 | |
| Filtry strzykawkowe PVDF | PerkinElmer | 2542913 | |
| Wafel | krzemowyWafel uniwersytecki,USA | 1196 | |
| SU-8 3050 | Fisher Scientific | NC0702369 | |
| Gen docelowy: eNOS (Hs01574659_m1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Gen docelowy: GAPDH (Hs02786624_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Gen docelowy: KLF2 (Hs00360439_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352 | |
| Próbka rurki transportowej Białe nakrętki, 5 mL, sterylny | VWR | 100500-422 | |
| TRI-reagent | ThermoFisher Scientific | AM9738 | |
| Ultracienki nanoporowaty chip membranowy | SiMPore Inc. | NPSN100-1L | Konstrukcja jest kompatybilna ze wszystkimi membranami SiMPore |
| uSiM component 1 | SiMPore Inc. | NA | |
| uSiM komponent 2 | SiMPore Inc. | nie |
Bibliografia
- Claesson-Welsh, L., Dejana, E., McDonald, D. M. Permeability of the Endothelial Barrier: Identifying and Reconciling Controversies. Trends in Molecular Medicine. 27 (4), 314-331 (2021).
- Vera, D., et al. Engineering tissue barrier models on hydrogel microfluidic platforms. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (12), 13920-13933 (2021).
- Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening. Biotechnology and Bioengineering. 114 (1), 184-194 (2017).
- Sakolish, C. M., Esch, M. B., Hickman, J. J., Shuler, M. L., Mahler, G. J. Modeling barrier tissues in vitro: methods, achievements, and challenges. eBioMedicine. 5, 30-39 (2016).
- Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
- Tan, K., et al. A high-throughput microfluidic microphysiological system (PREDICT-96) to recapitulate hepatocyte function in dynamic, re-circulating flow conditions. Lab on a Chip. 19 (9), 1556-1566 (2019).
- Ayuso, J. M., Virumbrales-Muñoz, M., Lang, J. M., Beebe, D. J. A role for microfluidic systems in precision medicine. Nature Communications. 13 (1), 3086(2022).
- Katt, M. E., Shusta, E. V. In vitro models of the blood-brain barrier: building in physiological complexity. Current Opinion in Chemical Engineering. 30, 42-52 (2020).
- Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews Genetics. 23 (8), 467-491 (2022).
- Duncombe, T. A., Tentori, A. M., Herr, A. E. Microfluidics: reframing biological enquiry. Nature reviews. Molecular cell biology. 16 (9), 554-567 (2015).
- Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (rid) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360(2019).
- Ahmed, A., et al. Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), C1112-C1124 (2021).
- Ahmed, A., et al. Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality. Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186(2021).
- Łach, A., Wnuk, A., Wójtowicz, A. K. Experimental models to study the functions of the blood-brain barrier. Bioengineering. 10 (5), 519(2023).
- McCloskey, M. C., et al. The Modular µSiM: A mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro. Advanced Healthcare Materials. 11 (18), 2200804(2022).
- Mansouri, M., et al. The modular µsim reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. 11 (21), 2200802(2022).
- Hudecz, D., et al. Modelling a human blood-brain barrier co-culture using an ultrathin silicon nitride membrane-based microfluidic device. International Journal of Molecular Sciences. 24 (6), 5624(2023).
- Joshi, I. M., et al. Microengineering 3D Collagen Matrices with Tumor-Mimetic Gradients in Fiber Alignment. bioRxiv. , (2023).
- Hsu, M. C., et al. A miniaturized 3D printed pressure regulator (µPR) for microfluidic cell culture applications. Scientific Reports. 12 (1), 10769(2022).
- Rogers, M. T., et al. A high-throughput microfluidic bilayer co-culture platform to study endothelial-pericyte interactions. Scientific reports. 11 (1), 12225(2021).
- Wettschureck, N., Strilic, B., Offermanns, S. Passing the vascular barrier: endothelial signaling processes controlling extravasation. Physiological Reviews. 99 (3), 1467-1525 (2019).
- Wang, Y. I., Shuler, M. L. UniChip enables long-term recirculating unidirectional perfusion with gravity-driven flow for microphysiological systems. Lab on a Chip. 18 (17), 2563-2574 (2018).
- Nayak, L., Lin, Z., Jain, M. K. 34;Go with the flow": how Krüppel-like factor 2 regulates the vasoprotective effects of shear stress. Antioxidants & Redox Signaling. 15 (5), 1449-1461 (2011).
- Satoh, T., et al. A pneumatic pressure-driven multi-throughput microfluidic circulation culture system. Lab on a chip. 16 (12), 2339-2348 (2016).
- Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. A Reversibly sealed, easy access, modular (seam) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces. PLOS ONE. 11 (5), e0156341(2016).
- Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), 035019(2022).
- Hasan, M. R., et al. One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (2), 025015(2018).
- Ahmed, A., et al. Microengineering 3D collagen hydrogels with long-range fiber alignment. Journal of Visualized Experiments. 187, e64457(2022).
Przedruki i uprawnienia
