Artykuł metodologiczny

Ultra wysokosprawna chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas i samodzielna analiza bazy danych składników chińskiej medycyny ziołowej

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66091

⸱

3 listopada 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Chongqing Clinical Research Center for Dermatology, Chongqing Key Laboratory of Integrative Dermatology Research, Key Laboratory of External Therapies of Traditional Chinese Medicine in Eczema, Department of Dermatology, Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital, 2General Surgery, Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy ogólny protokół i systematyczny projekt, który mógłby być zastosowany do oddzielenia i rozpoznania złożonych składników w zielu krwawnika alpejskiego, Achillea millefolium L., chińskim ziołolecznictwie.

Streszczenie

Ziołolecznictwo chińskie jest skomplikowane i zawiera wiele nieznanych związków, co sprawia, że badania jakościowe są kluczowe. Ultra-wysokosprawna chromatografia cieczowa kwadrupolowa spektrometria mas czasu przelotu (UPLC-Q-TOF-MS) jest najczęściej stosowaną metodą w analizie jakościowej związków. Metoda obejmuje znormalizowane i zaprogramowane protokoły wstępnej obróbki próbki, dostrajania MS, akwizycji MS i przetwarzania danych. Obróbka wstępna próbki obejmuje zbieranie, proszkowanie, ekstrakcję rozpuszczalnikiem, ultradźwięki, wirowanie i filtrację. Przetwarzanie końcowe danych zostało szczegółowo opisane i obejmuje import danych, samodzielną budowę bazy danych, ustalanie metod, przetwarzanie danych i inne operacje ręczne. Nadziemna część ziela krwawnika alpejskiego, Achillea millefolium L., jest stosowana w leczeniu stanów zapalnych, zaburzeń żołądkowo-jelitowych i bólu, a jego 3-oksa-gwajanolidy mogą być użytecznymi wskazówkami w opracowywaniu leków przeciwzapalnych. Zidentyfikowano trzy reprezentatywne związki w AML, łącząc TOF-MS z samodzielnie utworzoną bazą danych. Ponadto omówiono różnice w stosunku do istniejącej literatury, optymalizację parametrów fazy ciekłej, wybór trybu skanowania, przydatność źródła jonów, regulację energii zderzeń, przesiewanie izomerów, ograniczenia metody i możliwe rozwiązania. Ta ustandaryzowana metoda analizy jest uniwersalna i może być stosowana do identyfikacji złożonych związków w chińskiej medycynie ziołowej.

Wprowadzenie

Medycyna chińska zgromadziła najbogatszą wiedzę empiryczną na świecie1. Analiza jakościowa składników chemicznych w tradycyjnej chińskiej medycynie ziołowej stała się kluczowym tematem w badaniach2. Rozróżnienie różnic chemicznych w chińskim ziołolecznictwie jest trudne ze względu na złożoność kategorii i zróżnicowanie pochodzenia3. Główne typy związków w chińskiej medycynie ziołowej obejmują alkaloidy, saponiny, flawonoidy, antrachinony, terpenoidy, kumaryny, lignany, polisacharydy, polipeptydy i białka1. Jednak rozdzielenie związków i identyfikacja izomerów utrudnia rozwój badań jakościowych nad chińskim ziołolecznictwem.

Połączenie ultra-wysokowydajnej chromatografii cieczowej (UPLC) z odpowiednimi kolumnami chromatograficznymi zapewnia silne wsparcie dla separacji złożonych związków w chińskiej medycynie ziołowej4. W ostatnich latach spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości staje się coraz bardziej popularna w analizie jakościowej chińskiej medycyny ziołowej. Powszechnie stosowane metody spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości obejmują kwadrupolową spektrometrię mas czasu przelotu (Q-TOF-MS)5, spektrometrię mas orbitrap (Orbitrap-MS)6 oraz cyklotronową spektrometrię mas z transformacją Fouriera (FT-ICR-MS)7. FT-ICR-MS ma najwyższą rozdzielczość, ale pociąga za sobą kosztowne koszty eksploatacji i konserwacji8. Orbitrap-MS ma zalety w wykrywaniu związków małocząsteczkowych, szczególnie przy masach cząsteczkowych poniżej 500 Da9. Q-TOF-MS jest najczęściej stosowaną metodą w analizie jakościowej farmakochemii surowicy10,11. W porównaniu z tradycyjną sieciową bazą danych lub komercyjną bazą danych, coraz bardziej popularna staje się wspólna analiza z samodzielnie utworzoną bazą danych do przetwarzania danych.

Ziele krwawnika alpejskiego, Achillea millefolium L. (AML), rodzaj chińskiego ziołolecznictwa, rośnie głównie w Sinciangu, Mongolii Wewnętrznej i północno-wschodnich obszarach Chin12. Nadziemna część AML jest szeroko stosowana w leczeniu stanów zapalnych, zaburzeń żołądkowo-jelitowych i bólu, w tym reumatalgii, bólu zęba i brzucha13. 3-oksa-guaianolidy z AML mają ogromny potencjał jako wiodące czynniki w opracowywaniu leków przeciwzapalnych14. Obecne badania nad składnikami chemicznymi w AML koncentrują się na seskwiterpenach, monoterpenach, flawonoidach i związkach fenolowych15. Jednak do identyfikacji związków w AML nie jest dostępny systematyczny schemat indukcji jakościowej, który można by zastosować w przypadku innych chińskich leków ziołowych. Badanie to ma na celu zapewnienie ustandaryzowanej identyfikacji składników chemicznych w chińskiej medycynie ziołowej poprzez połączenie Q-TOF-MS i samodzielnie ustalonej analizy bazy danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wstępna obróbka próbki

  1. Kolekcja chińskiej medycyny ziołowej AML
    1. Posadź nasiona krwawnika alpejskiego Herb, Achillea millefolium L. (AML) w ziemi w lutym. Zbierz naziemną część AML w lipcu tego samego roku (Rysunek 1A).
      UWAGA: AML użyty w tym artykule został zebrany w górzystym obszarze na wysokości 400 m n.p.m. w Mianyang w Syczuanie w Chinach.
  2. Zabieg suszenia
    1. Umyj wszystkie zebrane AML w czystej wodzie, aby usunąć osad i zanieczyszczenia. Suszyć AML w piekarniku w temperaturze 50 °C przez 24 godziny (Rysunek 1B).
  3. Przygotowanie proszku
    1. Po wysuszeniu zmiażdż AML na gruboziarnisty proszek za pomocą szybkoobrotowej kruszarki wielofunkcyjnej. Przepuść proszek przez sito o oczkach 50 (Rysunek 1C).
  4. Ekstrakcja rozpuszczalnikiem
    1. Umieścić 1 g dokładnie zważonej próbki AML w kolbie stożkowej z 30 ml 75% roztworu etanolu i wody (Rysunek 2A).
    2. Ekstrahować mieszaninę w kąpieli ultradźwiękowej przez 30 minut w temperaturze 25 °C (Rysunek 2B).
    3. Odwirować próbkę o masie 14 000 × g przez 5 minut (Rysunek 2C).
    4. Zamontować strzykawkę iniekcyjną z mikroporowatym filtrem membranowym (0,22 μm, tylko organiczne) i przefiltrować supernatant do butelki z próbką o pojemności 2 ml (Rysunek 2D).

2. Melodia MS

  1. Uruchom oprogramowanie sterujące LC-MS (Rysunek 3A). Otwórz moduł MS tune i dwukrotnie usuń roztwór 1 ng/μl encefaliny leucynowej (LE).
  2. W panelu sterowania przepływem LockSpray ustaw natężenie przepływu 50 μl/min i kliknij przycisk Flow, aby roztwór LE wszedł do spektrometru mas (Rysunek 3B).
  3. Kliknij przycisk LockSpray Source Setup, aby zakończyć dostrajanie MS w trybie dodatnim (Rysunek 3C). Kliknij ikonę ujemnego, aby przełączyć tryb jonowy. Kliknij przycisk LockSpray Source Setup, aby zakończyć dostrajanie MS w trybie negatywnym.

3. Przejęcie MS

  1. Ustaw tabelę sekwencji, w tym nazwę pliku, metodę MS, plik wlotowy, fiolkę i objętość. Kliknij przycisk Zapisz, aby nagrać tabelę sekwencji.
  2. Kliknij kolejno przycisk Uruchom i przycisk Start (Rysunek 3D). Wybierz opcję Pobierz tylko przykładowe dane. Kliknij przycisk OK, aby rozpocząć pobieranie danych.
  3. Kliknij przycisk Chromatogram, aby otworzyć okno chromatogramu jonów całkowitych (TIC) w czasie rzeczywistym (Rysunek 3E). Kliknij kolejno przycisk Wyświetlacz i przycisk TIC. Wybierz opcję Chromatogram BPI, a następnie kliknij przycisk OK, aby wyświetlić okno chromatogramu pików bazowych (BPI) (Rysunek 3F).

4. Przetwarzanie danych

  1. Uruchom oprogramowanie do analizy danych.
  2. Kliknij kolejno przycisk Moja praca i przycisk Importuj dane MassLynx, aby przejść do okna podrzędnego (Rysunek 4A). Wybierz pliki danych surowych i wprowadź nazwę zestawu próbnego, a następnie kliknij przycisk Utwórz zestaw próbek UNIFI, aby zaimportować surowe dane z MS spectra.
    UWAGA: Upewnij się, że dodatnie i ujemne dane pierwotne są importowane oddzielnie.
  3. Tworzenie baz danych
    1. Kliknij przycisk Administracja w oknie początkowym (Rysunek 4B). Kliknij przycisk Importuj elementy biblioteki. Wybierz plik szablonu bazy danych w formacie .xlsx ze wszystkimi oddzielonymi strukturami złożonymi w formacie mol w tym samym folderze.
    2. Wprowadź nazwę bazy danych. Kliknij przycisk Zweryfikuj, aby upewnić się, że wszystkie związki są wyświetlane. Kliknij przycisk Importuj, aby zakończyć tworzenie samodzielnie utworzonej bazy danych.
      UWAGA: Wszystkie związki w niezależnych plikach w formacie .mol, które muszą zostać zaimportowane do bazy danych, są przygotowywane na podstawie odniesień do literatury. Pliki struktur złożonych są rysowane samodzielnie za pomocą oprogramowania do rysowania.
  4. Kliknij przycisk Utwórz metodę analizy, aby otworzyć okno podrzędne. Kliknij przycisk Generuj metodę tylko procesu, aby określić metodę przetwarzania danych.
  5. analiza danych
    1. Kliknij przycisk Utwórz analizę, aby otworzyć okno podrzędne.
    2. Kliknij przycisk Utwórz analizę na podstawie istniejących danych, a następnie wybierz zaimportowane dane i ustaloną metodę.
    3. Kliknij przycisk Proces, aby rozpocząć obliczanie długich danych (Rysunek 4D).
    4. Kliknij przycisk Zbadaj, aby przejść do okna TIC.
    5. Kliknij przycisk Wybierz ślady i wybierz TOF MSE BPI. Kliknij przycisk Zamień wszystko, aby wyświetlić BPI.
  6. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Dodaj kolumnę | wyświetla informacje złożone, w tym nazwę związku, masę naturalną, obserwowane m/z, błąd masy, obserwowany czas retencji (RT), liczbę detektorów, odpowiedź, addukty, alternatywne przypisania i całkowitą liczbę znalezionych fragmentów (Rysunek 4E).
  7. Wybierz opcję Fragmenty o wysokiej energii, aby wyświetlić wtórne fragmenty widma masy wybranego związku (Rysunek 4F).
  8. Ręcznie narysuj ścieżki rozszczepienia molekularnego zgodnie z każdym fragmentem wtórnym (Rysunek 4G).
    UWAGA: Przykłady są szczegółowo opisane w sekcji dotyczącej reprezentatywnych wyników.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ziele krwawnika alpejskiego zostało użyte jako model do wyświetlenia reprezentatywnego wyniku. Jak pokazano w Rysunek 4G, kwercetyna-3'-O-glukozyd o m/z = 463.08935 przekształcony w półprodukt o m/z = 300.02828 poprzez utratę cząsteczki heksozy podczas reakcji hydrolizy. W innym szlaku zerwanie wiązania C-C w szkielecie struktury flawonoidowej doprowadziło do powstania produktu pośredniego o m/z = 223,06232, w którym hydroksymetyl i sąsiedni hydroksyhydroksy w jednostce heksozy zniknęły. Co więcej, ro...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości w połączeniu z samodzielnie utworzoną bazą danych oferuje systematyczną technologię jakościową do identyfikacji składników chemicznych w chińskiej medycynie ziołowej. W przeciwieństwie do komercyjnej bazy danych, która zawiera powszechną tradycyjną medycynę chińską, samodzielnie utworzona baza danych, która wykorzystuje związki opisane w literaturze, zapewnia większą dokładność w analizie medycyny rzadkiej lub etnicznej16. Podobne metody zastosowano w in...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez China Postdoctoral Science Foundation (2022MD713780), Zespół ds. Dziedziczenia i Innowacji TCM Treatment of Immune Diseases, Chongqing Medical Scientific Research Project (Wspólny projekt Komisji Zdrowia Chongqing oraz Biura Nauki i Technologii) (2022DBXM007) oraz Fundację Nauk Przyrodniczych Chongqing (cstc2018jcyjAX0370). Specjalny projekt motywacyjny i przewodnicki Instytutu Badań Naukowych w Chongqing (cstc2022jxjl120005, cstc2021jxjl130021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
chloroformSinopharm Chemical ReagentCo., LtdCAS 67-66-3
octan etyluChuandongChemicalCAS 141-78-6
chromatograf cieczowyWatersACQUITY Class 1 plus
MassLynxWatersV4.2MS oprogramowanie sterujące
MetanolChuandongChemicalCAS 67-56-1
Alkohol n-butylowyChuandongChemicalCAS 71-36-3
eter naftowyChuandongChemicalCAS 8032-32-4
Kwadrupolowa spektrometria mas czasu przelotuWodySYNAPT XS
UNIFIWatersOprogramowanie do analizy danych

Bibliografia

  1. Cai, Z., Lee, F., Wang, X., Yu, W. A capsule review of recent studies on the application of mass spectrometry in the analysis of chinese medicinal herbs. Journal of Mass Spectrometry. 37 (10), 1013-1024 (2002).
  2. Zhu, C., Li, X., Zhang, B., Lin, Z. Quantitative analysis of multi-components by single marker-a rational method for the internal quality of chinese herbal medicine. Integrative Medicine Research. 6 (1), 1-11 (2017).
  3. Huigens Iii, R. W., et al. A ring-distortion strategy to construct stereochemically complex and structurally diverse compounds from natural products. Nature Chemistry. 5 (3), 195-202 (2013).
  4. Wang, X., Zhang, A., Yan, G., Han, Y., Sun, H. Uhplc-ms for the analytical characterization of traditional chinese medicines. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 63, 180-187 (2014).
  5. Li, H., et al. Application of uhplc-esi-q-tof-ms to identify multiple constituents in processed products of the herbal medicine ligustri lucidi fructus. Molecules. 22 (5), 689(2017).
  6. Wang, X., et al. A novel and comprehensive strategy for quality control in complex chinese medicine formula using uhplc-q-orbitrap hrms and uhplc-ms/ms combined with network pharmacology analysis: Take tangshen formula as an example. Journal of Chromatography B. 1183, 122889(2021).
  7. Han, F., et al. A rapid and sensitive uhplc-ft-icr ms/ms method for identification of chemical constituents in rhodiola crenulata extract, rat plasma and rat brain after oral administration. Talanta. 160, 183-193 (2016).
  8. Destefani, C. A., et al. Europium-organic complex as luminescent marker for the visual identification of gunshot residue and characterization by electrospray ionization ft-icr mass spectrometry. Microchemical Journal. 116, 216-224 (2014).
  9. Huang, Q., et al. Affinity ultrafiltration and uplc-hr-orbitrap-ms based screening of thrombin-targeted small molecules with anticoagulation activity from poecilobdella manillensis. Journal of Chromatography B. 1178, 122822(2021).
  10. Broeckling, C. D., Heuberger, A. L., Prenni, J. E. Large scale non-targeted metabolomic profiling of serum by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry (uplc-ms). JoVE (Journal of Visualized Experiments. (73), e50242(2013).
  11. Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. Untargeted metabolomics from biological sources using ultraperformance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (uplc-hrms). JoVE (Journal of Visualized Experiments. (75), e50433(2013).
  12. Li, H., et al. Guaianolide sesquiterpene lactones from achillea millefolium l. Phytochemistry. 186, 112733(2021).
  13. Giorgi, A., Bononi, M., Tateo, F., Cocucci, M. Yarrow (achillea millefolium l.) growth at different altitudes in central italian alps: Biomass yield, oil content and quality. Journal of Herbs, Spices & Medicinal Plants. 11 (3), 47-58 (2005).
  14. Li, H., et al. Guaianolides from achillea millefolium l. And their anti-inflammatory activity. Phytochemistry. 210, 113647(2023).
  15. Ali, S. I., Gopalakrishnan, B., Venkatesalu, V. Pharmacognosy, phytochemistry and pharmacological properties of achillea millefolium l.: A review. Phytotherapy Research. 31 (8), 1140-1161 (2017).
  16. Zhou, Q. Y. -J., Liao, X., Kuang, H. -M., Li, J. -Y., Zhang, S. -H. Lc-ms metabolite profiling and the hypoglycemic activity of morus alba l. Extracts. Molecules. 27 (17), 5360(2022).
  17. Chen, Z., et al. Rapid characterization of chemical constituents in naoling pian by lc-ms combined with data processing techniques. Journal of Separation Science. 45 (18), 3431-3442 (2022).
  18. Guo, Y., et al. A precise self-built secondary mass database for identifying red dyes and dyeing techniques with uplc-ms/ms. Journal of Mass Spectrometry. 57 (5), 4823(2022).
  19. Zhang, Y., et al. Detection and identification of leachables in vaccine from plastic packaging materials using uplc-qtof ms with self-built polymer additives library. Analytical Chemistry. 88 (13), 6749-6757 (2016).
  20. Fan, Y. -L., et al. A database-guided integrated strategy for comprehensive chemical profiling of traditional chinese medicine. Journal of Chromatography A. 1674, 463145(2022).
  21. Liu, M., et al. Structural features guided "fishing" strategy to identification of flavonoids from lotus plumule in a self-built data "pool" by ultra-high performance liquid chromatography coupled with hybrid quadrupole-orbitrap high resolution mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 1124, 122-134 (2019).
  22. Zhang, F., et al. An integrated strategy for the comprehensive profiling of the chemical constituents of aspongopus chinensis using uplc-qtof-ms combined with molecular networking. Pharmaceutical Biology. 60 (1), 1349-1364 (2022).
  23. Fu, X., et al. Standardized identification of compound structure in tibetan medicine using ion trap mass spectrometry and multiple-stage fragmentation analysis. JoVE Journal of Visualized Experiments. (193), e65054(2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

UPLC Q TOF MSanaliza zwi zk w ro linnychprzygotowanie pr bektworzenie bazy danychskrining izomer wenergia kolizyjnazwi zki przeciwzapalne
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły