Wykazano, że powiązanie podziału wątroby i podwiązania żyły wrotnej w przypadku etapowej hepatektomii (ALPPS) powoduje niezwykłą regenerację wątroby po kilku tygodniach od operacji pierwszego etapu. Modele zwierzęce, które przeszły ALPPS, zostały opracowane w celu zbadania potencjalnej zdolności regeneracji wątroby i osiągnięcia korzystnych wyników klinicznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mysi model skojarzonej partycji wątroby i podwiązania żyły wrotnej do etapowego zabiegu hepatektomii wspomaganego mikroskopią
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Hepatektomia jest powszechnie uważana za główną metodę leczenia nowotworów wątroby; jednak pooperacyjna niewydolność wątroby pozostaje główną przyczyną śmiertelności okołooperacyjnej, poważnie wpływając na wyniki pacjentów. W silnym środowisku wątrobowym przyszły pozostałość wątroby (FLR) musi przekraczać 25%, aw przypadku marskości wątroby zapotrzebowanie to wzrasta do ponad 40%. Nieadekwatność FLR jest obecnie główną przeszkodą w postępie chirurgii wątroby.
Tradycyjne metody zwiększania hipertrofii FLR koncentrują się głównie na embolizacji żyły wrotnej (PVE), ale jej skuteczność jest znacznie ograniczona. W ostatnich latach pojawiło się wiele doniesień na temat nowatorskiej metody dwufazowej hepatektomii obejmującej partycjonowanie wątroby i podwiązanie żyły wrotnej, znanej jako kojarzenie podwiązania wątroby i żyły wrotnej w przypadku etapowej hepatektomii (ALPPS). ALPPS przewyższa PVE w skutecznym i znacznym indukowaniu hipertrofii FLR. Jednak szczegółowe mechanizmy napędzające regenerację wątroby wspomaganą przez ALPPS nie są w pełni poznane. W związku z tym replikacja ALPPS w modelach zwierzęcych ma kluczowe znaczenie dla dokładnego zbadania molekularnych mechanizmów regeneracji wątroby, oferując cenne informacje teoretyczne i praktyczne.
Wprowadzenie
Wątroba posiada ogromny potencjał regeneracyjny, szybko się rozprzestrzenia i przywraca wymagania metaboliczne w ciągu zaledwie 3 miesięcy po resekcji dla różnych dolegliwości wątroby1. Jednak konieczność upewnienia się o kompletności marginesów guza wymaga nieuchronności ekspansywnego wycięcia wątroby. W związku z tym zapewnienie dużej objętości partycypacyjnego środowiska wątrobowego, znanego jako przyszła resztka wątroby (FLR), nabiera ogromnego znaczenia2. ALPPS był przełomową techniką w chirurgii wątroby w ciągu ostatnich kilku dekad, szczególnie dostosowaną do pacjentów z niewystarczającą resztkową objętością wątroby po resekcji guza, ogłoszoną jako jeden z najbardziej pomyślnych przełomów w dziedzinie chirurgii onkologicznej wątroby3.
Niezwykły postęp został osiągnięty w rozwoju modeli zwierzęcych ALPPS. Idealny model zazwyczaj wymaga niezależnego dopływu krwi (żyła wrotna i tętnica wątrobowa) i odpływu (żyła wątrobowa) w zachowanym płacie wątrobowym oraz wyraźnego oddzielenia między zachowanymi i przeznaczonymi do wycięcia płatami wątroby, aby zapobiec krążeniu obocznemu4. Chociaż ALPPS stymuluje szybką regenerację wątroby w pozostałej tkance wątroby, konkretne mechanizmy tego procesu są nadal niejasne.
Obecnie modele ALPPS dzielą się na trzy typy: duże modele zwierzęce (np. świnie i owce), modele średniej wielkości (np. króliki i gryzonie) oraz małe modele (np. myszy)5. Wykorzystanie myszy, ze względu na ich szybką hodowlę i łatwość modyfikacji genetycznej, jest szczególnie skuteczne w dogłębnych badaniach mechanizmów regeneracji wątroby6. Co więcej, budowa wątroby myszy, zwłaszcza ich środkowa żyła wątrobowa, bardzo przypomina ludzką, co czyni je wysoce odpowiednimi do rozwoju modelu ALPPS.
Ważne jest, aby zauważyć, że większość pacjentów z rakiem wątrobowokomórkowym w praktyce klinicznej ma podstawowe choroby wątroby, w przeciwieństwie do modeli zdrowej wątroby zwykle używanych w badaniach7. Tak więc, użycie myszy wstępnie kondycjonowanych zwłóknieniem wątroby lub infekcjami wirusowymi może dokładniej symulować reakcje chirurgiczne i pooperacyjną regenerację wątroby obserwowane u pacjentów z różnymi chorobami wątroby8. Takie podejście może ujawnić nowe cele terapeutyczne o znaczeniu klinicznym.
Do tej pory kilka renomowanych grup badawczych, takich jak te z Uniwersytetu w Zurychu i Uniwersytetu Tokijskiego, z powodzeniem opracowało mysie modele ALPPS9,10. Stworzenie ustandaryzowanego modelu mysiego w kontrolowanych warunkach może pogłębić naszą wiedzę na temat szybkiej regeneracji wątroby obserwowanej po zabiegach ALPPS.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty w tym protokole zostały zatwierdzone przez Władze Weterynaryjne Szpitala Ludowego Prowincji Jiangxi (numer 70/2022). Ponadto wszystkie etapy eksperymentalne zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania.
1. Rozpoczęcie operacji
UWAGA: Samce myszy C57BL/6 o wadze 20-22 g były trzymane w dobrze wentylowanej klatce, utrzymywanej w standardowym środowisku wolnym od patogenów z cyklem 12 godzin/12 godzin światła/ciemności. Zwierzętom zapewniono ad libitum dostęp do pożywienia i wody w kontrolowanej temperaturze otoczenia 22 ± 1 °C. Zabieg został przeprowadzony w dedykowanej sali mikrochirurgicznej przy użyciu mikroskopu operacyjnego (Ryc. 1). Myszy w grupie pozorowanej były operowane tylko przez laparotomię, ale nie przeprowadzono żadnej operacji na wątrobie. W grupie PVL podwiązano część gałęzi żyły wrotnej, a w grupie ALPPS przecięto środkowy płat wątroby na zasadzie podwiązania żyły wrotnej (PVL).
- Poddaj myszy 4-6 godzinnemu okresowi postu przedoperacyjnego.
UWAGA: Post jest wymagany, ponieważ jedzenie powoduje wybrzuszenie żołądka u myszy, skutkuje słabym polem operacyjnym i jest podatne na przypadkowe uszkodzenie ściany żołądka. - Ułóż sterylne narzędzia chirurgiczne, w tym mikrokleszcze, nożyczki, retraktory brzucha i wstępnie przygotowane 8-0 szwy ligaturowe żyły wrotnej, na stoliku bocznym. Materiały śródoperacyjne składające się ze sterylnej gazy i wacików namoczyć w roztworze soli fizjologicznej o temperaturze 37 °C.
- W celu indukcji należy wystawić zwierzęta na działanie 5% izofluranu v/v przez 30 s, a następnie znieczulenie podtrzymujące przy użyciu izofluranu 3% obj., aż do osiągnięcia głębokiego stanu znieczulenia. Zbadaj odruch szczypania palców u stóp, aby ustalić poziom znieczulenia. Medetomidyna należy wstrzykiwać podskórnie w dawce 5 mg/kg mc. w fazie indukcji.
- Nałożyć maść na oczy zwierząt i wstrzyknąć podskórnie 1 ml mlecznego roztworu Ringera zmieszanego z 5% glukozą, dzieląc dawkę równomiernie między dolną część brzucha z każdej strony.
- Skrupulatnie ogol okolicę brzucha za pomocą małych maszynek do strzyżenia włosów zwierzęcych, obejmujących 2 cm boczny obszar od wyrostka mieczykowatego do okolicy narządów płciowych.
- Dokładnie zdezynfekuj miejsce operacyjne 3 razy naprzemiennie jodem powidonu i alkoholem.
- Wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry o długości 2,5-3,0 cm za pomocą skalpela chirurgicznego, a następnie za pomocą nożyczek chirurgicznych delikatnie otwórz jamę brzuszną.
- Zastosuj retraktor brzuszny, aby rozszerzyć nacięcie, ułatwiając delikatną trakcję dwunastnicy i odcinka jelita cienkiego za pomocą sterylnych, wilgotnych wacików. Przykryj te struktury wstępnie przygotowaną sterylną gazą, jednocześnie odsłaniając wątrobowy odcinek żyły wrotnej.
2. Podwiązanie żyły wrotnej (PVL)
UWAGA: Upewnij się, że wszystkie działania są delikatne podczas całej procedury. Używaj zwilżonych wacików do manipulowania tkanką wątroby.
- Odklej otrzewną i przewód pokarmowy i upewnij się, że żyła wrotna jest całkowicie odsłonięta.
- W trakcie odsłaniania głównej żyły portalowej okrążaj jej odgałęzienia, wykonując powolne, celowe ruchy pchające do przodu i rozpierające się.
- Kolejno zidentyfikuj różne gałęzie żyły wrotnej w następującej kolejności: (1) prawa tylna gałąź, (2) połączone lewe boczne i lewe środkowe gałęzie oraz (3) gałąź ogoniasta (Rysunek 2A).
3. Sekcja prawej tylnej gałęzi odgałęzień żyły wrotnej
- Po przejściu przez wnękę wątroby przez główną żyłę wrotną, obserwuj rzucającą się w oczy gałąź prawego tylnego płata, która stała się widoczna.
- Użyj zwilżonych wacików jako środka foluszującego i oddziel środkowy płat wątroby od prawego tylnego płata, aby uniknąć potencjalnych obrażeń.
- Pamiętaj, aby przeprowadzić sekcję wzdłuż torebki Glissona (otrzewnej, która rozciąga się nad powierzchnią wątroby) i pociągnąć 1,5 cm jedwabiu, aby zawiązać wokół gałęzi żyły wrotnej.
- Podwiązuj prawą tylną gałąź żyły wrotnej za pomocą 8-0 szew jedwabny. Wiarygodnym wskaźnikiem udanego podwiązania żyły wrotnej jest widoczna bladość wątroby.
4. Rozwarstwienie lewej bocznej i lewej przyśrodkowej gałęzi żyły wrotnej
- Gałęzie lewego płata bocznego (LLL) i lewego płata przyśrodkowego (love my life) mają wspólną żyłę wrotną główną. Pamiętaj, aby przeanalizować wszelkie potencjalne szczeliny między LLL a płatem ogoniastym.
UWAGA: Podwiązanie gałęzi LLL i love my life żyły wrotnej jest najtrudniejsze w tym modelu chirurgicznym, ponieważ mikrokleszcze muszą przechodzić przez przestrzeń wokół żyły wrotnej i unikać uszkodzenia wątroby. - Wprowadź mikrokleszczyki przez wejście w kroku 4.1 i powoli poruszaj ręką, ponieważ nawet najmniejszy opór wskazuje na potencjalną bliskość wątroby lub naczyń krwionośnych.
- Gdy wyczujesz opór, lekko wyreguluj mikrokleszcze, aby przesunąć się do przodu i przez powierzchnię torebki Glissona prawego płata przyśrodkowego (RML) (Rysunek 3C).
- Zatrudnij przygotowane 8-0 jedwabny szew do zawiązania wokół żyły wrotnej LLL i gałęzi love my life. Szukaj uderzającego rozgraniczenia niedokrwiennego w środkowym płacie wątroby, podczas gdy lewy płat staje się blady po podwiązaniu gałęzi żyły wrotnej.
5. Rozwarstwienie gałęzi ogoniastej odgałęzień żyły wrotnej
- Wypreparuj płat ogoniastego i użyj bawełnianego wacika, aby wypełnić potencjalną przestrzeń między główną żyłą wrotną a płatem ogoniastym.
- Oderwij otrzewną płatów ogoniastych, aby uwidocznić gałęzie żyły wrotnej płata.
- Użyj szwu do zszywania zamiast wiązania, aby podwiązać gałąź ogoniastą, upewniając się, że ścieżka igły odpowiednio owija gałąź ogoniastą żyły wrotnej.
UWAGA: Trudność w podwiązaniu gałęzi ogoniastej żyły wrotnej polega na tym, że żyła wrotna płata ogoniastego otacza tkankę wątroby i znajduje się blisko głównej żyły wrotnej. Zalecana jest głębokość penetracji igły wynosząca 1 mm.
6. Przecięcie wątroby i cholecystektomia
- Obserwuj wyraźną linię demarkacyjną w środkowym płacie wątroby i wykonaj przecięcie wzdłuż tej linii (Ryc. 2B).
- Użyj pisaka do elektrokoagulacji, aby utworzyć wstępnie przyciętą linię o średnicy 0,5 mm wzdłuż linii demarkacyjnej.
- Użyj mikrokleszczyków i wstrzykiwacza do elektrokoagulacji, aby przeciąć tkankę wątroby, nakładając bawełniane waciki, aby zatrzymać krwawienie.
UWAGA: Trudność w przecięciu polega na opanowaniu głębokości. Celem jest podzielenie wątroby jak najbliżej żyły głównej. Krwawienie śródoperacyjne jest trudne do uniknięcia i wymaga powtarzalnej praktyki, aby opanować głębokość przecięcia. Gorące spalanie, waciki i gąbki żelatynowe mogą być używane do wspomagania hemostazy. - Usuń woreczek żółciowy na końcu, ponieważ zapewni to dobry punkt ciągnięcia podczas całej operacji.
- Użyj bawełnianego wacika, aby zastosować kontrolowany nacisk na hemostazę, a jeśli krwotok będzie się utrzymywać, żyła główna dolna zostanie uszkodzona, a efekt naprawy szwów będzie słaby; poddaj zwierzę eutanazji bez wahania.
7. Końcowe etapy operacji
- Upewnij się, że jelito cienkie jest dokładnie umieszczone w jamie brzusznej przed zamknięciem.
- Bezpiecznie zamknij otrzewną i ścianę brzucha za pomocą szwów wchłanialnych 6-0, a skórę za pomocą szwów wchłanialnych 4-0.
- Ponownie zdezynfekuj powierzchnię skóry, aby zapewnić optymalną czystość.
- Podskórnie podać 1 ml roztworu soli fizjologicznej i fentanylu 0,02 mg/kg mc. oraz meloksykamu 4 mg/kg w miejscu nacięcia, aby złagodzić ból pooperacyjny i zaradzić ewentualnej dodatkowej utracie płynów śródoperacyjnych.
- Umieść zwierzę na ogrzanej powierzchni, aby ułatwić naturalne przebudzenie i monitoruj dopływ krwi do jego kończyn. Następnie umieść je pojedynczo w klatkach, aby kontynuować obserwację, gdy odzyskają przytomność.
- Po wyzdrowieniu należy wstrzyknąć podskórnie medetomidynę w dawce 4 mg/kg, kontynuując przez 24 godziny po operacji.
8. Śródoperacyjny pomiar regeneracji wątroby i jej funkcji
- Poddaj myszy eutanazji i pobierz próbki wątroby oraz krwi w odstępach 1, 2, 3 i 7 dni po operacji.
- Wykonaj test barwienia HE i funkcji wątroby oraz zbadaj markery stanu zapalnego w surowicy, zapewniając w ten sposób dodatkową walidację wpływu konstrukcji modelu.
- Udokumentuj dzienne zmiany masy ciała i stosunku FLR/BW (masy ciała) myszy w ciągu 1 tygodnia po zabiegu chirurgicznym.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W przeciwieństwie do PVL (kroki protokołu 2, 3, 4 i 5), myszy poddane interwencji chirurgicznej ALPPS (kroki 2, 3, 4, 5 i 6) wykazały zwiększoną skłonność do proliferacji komórkowej. Rysunek 2 przedstawia demarkację niedokrwienną środkowego płata wątroby po podwiązaniu żyły wrotnej oraz pole widzenia podczas transekcji wątroby, co stanowi kluczową różnicę między ALPPS a PVL. Co istotne, poziomy mediatorów stanu zapalnego w tkance wątrobowej, w tym czynnika martwicy nowotworów-α (TNF-α), inte...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W pracy przedstawiono protokół początkowej fazy operacji ALPPS u myszy, obejmującej częściowe podwiązanie żyły wrotnej i podział środkowego płata wątroby. Metoda ta ściśle naśladuje ludzką procedurę ALPPS, z unikalną strukturą zrazikową wątroby myszy i podwójnym wrotnym zaopatrzeniem żylnym do płata środkowego, zapewniającym wyraźny przepływ krwi po operacji11. Warto zauważyć, że procedura ALPPS składa się z dwóch odrębnych etapów chirurgicznych. W tym badaniu przedstawiamy wyłącznie początkowy et...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 5% zastrzyk glukozy (500 ml) | Shapuaisi pharma (http://www.zjspas.com/) | H20003666 | Wydajny, tani, łatwo dostępny |
| aparat do znieczulenia | RWD (www.rwdls.com) | R500 | niska cena i cenna jakość. Nadaje się do pracy z początkującymi |
| C57 BL/6 | The Jackson Lab | 22349-2023 | Stabilność szczepów |
| izofluran | KCSW (kcsw.szqisoubao.com) | H19980141 | trwały, ekonomiczny |
| meloksykam | Boehringer-Ingelheim | H20020217 | Trwałe i wydajne |
| mikrokleszcze | mogą 60018920 | Trwałe i wydajne | |
| mikroinstrument | Fabryka narzędzi mikrochirurgicznych CH | HC-A804-1 | trwały, ekonomiczny |
| dzwonek z mleczanem sodu | Shapuaisi pharma (http://www.zjspas.com/) | H20193277 | Wydajna, tania, łatwo dostępna |
| linia do szycia | Fabryka narzędzi mikrochirurgicznych CH | 6-0 / 8-0 | wysoki stosunek wydajności do ceny |
| miejscowe przeciwciała | farmakologia chenxin ( www.cisen-pharma.com | H20020217 | Skutecznie zapobiegaj infekcji nacięcia |
Bibliografia
- Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. Liver regeneration: Biological and pathological mechanisms and implications. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 18 (1), 40-55 (2021).
- Chapelle, T., et al. Estimation of the future remnant liver function is a better tool to pr edict post-hepatectomy liver failure than platelet-based liver scores. Eur J Surg Oncol. 43 (12), 2277-2284 (2017).
- Isfordink, C. J., et al. Portal vein ligation versus portal vein embolization for induction of hypertrophy of the future liver remnant: A systematic review and meta-analysis. Surg Oncol. 26 (3), 257-267 (2017).
- Linecker, M., et al. Risk adjustment in alpps is associated with a dramatic decrease in ear ly mortality and morbidity. Ann Surg. 266 (5), 779-786 (2017).
- Darnis, B., et al. Subtotal hepatectomy in swine for studying small-for-size syndrome and portal inflow modulation: Is it reliable. HPB (Oxford). 17 (10), 881-888 (2015).
- Casellas, J. Inbred mouse strains and genetic stability: A review. Animal. 5 (1), 1-7 (2011).
- Zhang, J., et al. Evolution of associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy from 2012 to 2021: A bibliometric analysis. Review. Int J Surg. 103, 106648(2022).
- Parola, M., Pinzani, M. Liver fibrosis: Pathophysiology, pathogenetic targets and clinical iss ues. Mol Aspects Med. 65, 37-55 (2019).
- Kikuchi, Y., et al. Impact of associating liver partition and portal vein occlusion for st aged hepatectomy on tumor growth in a mouse model of liver metastasis. Eur J Surg Oncol. 44 (1), 130-138 (2018).
- Schlegel, A., et al. Alpps: From human to mice highlighting accelerated and novel mechanism s of liver regeneration. Ann Surg. 260 (5), 839-846 (2014).
- Dili, A., Lebrun, V., Bertrand, C., Leclercq, I. A. Associating liver partition and portal vein ligation for staged hepate ctomy: Establishment of an animal model with insufficient liver remnan t. Lab Invest. 99 (5), 698-707 (2019).
- Schadde, E., Hertl, M., Breitenstein, S., Beck-Schimmer, B., Schläpfer, M. Rat model of the associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy (alpps) procedure. J Vis Exp. (126), e55895(2017).
- Allaire, M., et al. New frontiers in liver resection for hepatocellular carcinoma. JHEP Rep. 2 (4), 100134(2020).
- Memi, F., Ntokou, A., Papangeli, I. Crispr/cas9 gene-editing: Research technologies, clinical applications and ethical considerations. Semin Perinatol. 42 (8), 487-500 (2018).
- Saviano, A., Henderson, N. C., Baumert, T. F. Single-cell genomics and spatial transcriptomics: Discovery of novel cell states and cellular interactions in liver physiology and disease biology. J Hepatol. 73 (5), 1219-1230 (2020).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
