Artykuł metodologiczny

Bezpośrednia obserwacja i automatyczny pomiar reakcji aparatów szparkowych na Pseudomonas syringae pv. pomidor DC3000 w rzodkiewniku pospolitym (Arabidopsis thaliana)

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66112

⸱

9 lutego 2024

 ,  ,  , 
1Graduate School of Agriculture, Kyoto University, 2Institute of Transformative Bio-Molecules (WPI-ITbM), Nagoya University, 3Phytometrics Co., Ltd.

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy prostą metodę bezpośredniej obserwacji i automatycznego pomiaru reakcji aparatów szparkowych na inwazję bakterii u Arabidopsis thaliana. Metoda ta wykorzystuje przenośne urządzenie do obrazowania aparatów szparkowych wraz z potokiem analizy obrazu przeznaczonym do obrazów liści zarejestrowanych przez urządzenie.

Streszczenie

Aparaty szparkowe to mikroskopijne pory znajdujące się w naskórku liści roślin. Regulacja apertury aparatów szparkowych ma kluczowe znaczenie nie tylko dla zrównoważenia poboru dwutlenku węgla do fotosyntezy i transpiracyjnej utraty wody, ale także dla ograniczenia inwazji bakterii. Podczas gdy rośliny zamykają aparaty szparkowe po rozpoznaniu drobnoustrojów, bakterie chorobotwórcze, takie jak Pseudomonas syringae pv. pomidor DC3000 (WOM), ponownie otwórz zamknięte aparaty szparkowe, aby uzyskać dostęp do wnętrza skrzydła. W konwencjonalnych testach do oceny reakcji aparatów szparkowych na inwazję bakterii, skórki naskórka liści, krążki liści lub oderwane liście są unoszone na zawiesinie bakteryjnej, a następnie aparaty szparkowe są obserwowane pod mikroskopem, a następnie następuje ręczny pomiar otworu szparkowego. Jednak testy te są kłopotliwe i mogą nie odzwierciedlać reakcji szparkowych na naturalną inwazję bakterii w liściu przyczepionym do rośliny. Niedawno opracowano przenośne urządzenie do obrazowania, które może obserwować aparaty szparkowe, ściskając liść bez odrywania go od rośliny, wraz z potokiem analizy obrazu opartym na głębokim uczeniu, zaprojektowanym do automatycznego pomiaru apertury szparkowej na podstawie obrazów liści zarejestrowanych przez urządzenie. Tutaj, w oparciu o te postępy techniczne, wprowadzono nową metodę oceny reakcji aparatów szparkowych na inwazję bakterii Arabidopsis thaliana. Metoda ta składa się z trzech prostych kroków: inokulacji w sprayu Pto naśladującej naturalne procesy infekcji, bezpośredniej obserwacji aparatów szparkowych na liściu rośliny zaszczepionej Pto za pomocą przenośnego urządzenia do obrazowania oraz automatycznego pomiaru apertury szparkowej za pomocą potoku analizy obrazu. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do zademonstrowania zamykania i ponownego otwierania aparatów szparkowych podczas inwazji PTO w warunkach, które ściśle naśladują naturalną interakcję roślina-bakteria.

Wprowadzenie

Aparaty szparkowe to mikroskopijne pory otoczone parą komórek ochronnych na powierzchni liści i innych nadziemnych części roślin. W ciągle zmieniającym się środowisku regulacja otworu szparkowego ma kluczowe znaczenie dla roślin, aby kontrolować absorpcję dwutlenku węgla wymaganą do fotosyntezy kosztem utraty wody w wyniku transpiracji. W związku z tym kwantyfikacja apertury aparatów szparkowych odegrała zasadniczą rolę w zrozumieniu adaptacji roślin do środowiska. Jednak ilościowe określenie apertury aparatów szparkowych jest z natury czasochłonne i kłopotliwe, ponieważ wymaga pracy ludzkiej, aby dostrzec i zmierzyć pory szparkowe na obrazie liścia uchwyconym przez mikroskop. Aby obejść te ograniczenia, opracowano różne metody ułatwiające ilościowe określenie apertury aparatów szparkowych u Arabidopsis thaliana, roślinie modelowej szeroko wykorzystywanej do badania biologii aparatów szparkowych1,2,3,4,5,6. Na przykład porometr może być używany do pomiaru szybkości transpiracji jako metryki przewodności szparkowej. Jednak metoda ta nie dostarcza bezpośrednich informacji na temat liczby aparatów szparkowych i apertury, które określają przewodność szparkową. W niektórych badaniach wykorzystano techniki mikroskopii konfokalnej uwydatniające pory szparkowe za pomocą fluorescencyjnego markera aktynowego, barwnika fluorescencyjnego lub autofluorescencji ściany komórkowej1,2,3,4,5. Chociaż podejścia te ułatwiają wykrywanie aparatów szparkowych, koszt zarówno prowadzenia urządzenia do mikroskopii konfokalnej, jak i przygotowania próbek mikroskopowych może stanowić przeszkodę w rutynowym stosowaniu. W przełomowej pracy Sai i wsp. opracowano model głębokiej sieci neuronowej do automatycznego pomiaru apertury aparatów szparkowych na podstawie obrazów mikroskopowych w jasnym polu peelingów naskórka A. thaliana 6. Ta innowacja nie zwalnia jednak badaczy z zadania przygotowania peelingu naskórka do obserwacji mikroskopowej. Niedawno przeszkoda ta została pokonana dzięki opracowaniu przenośnego urządzenia do obrazowania, które może obserwować aparaty szparkowe, ściskając liść A. thaliana, wraz z potokiem analizy obrazu opartym na głębokim uczeniu, który automatycznie mierzy aperturę szparkową na podstawie obrazów liści zarejestrowanych przez urządzenie7.

Aparaty szparkowe przyczyniają się do wrodzonej odporności roślin na patogeny bakteryjne. Kluczem do tej odpowiedzi immunologicznej jest zamknięcie aparatów szparkowych, które ograniczają wnikanie bakterii przez mikroskopijne pory do wnętrza liścia, gdzie patogeny bakteryjne namnażają się i powodują choroby8. Zamknięcie aparatów szparkowych jest indukowane po rozpoznaniu wzorców molekularnych związanych z drobnoustrojami (MAMP), cząsteczek immunogennych, które często są wspólne dla klasy drobnoustrojów, przez receptory rozpoznawania wzorców zlokalizowanych w błonie plazmatycznej (PRR)9. 22-aminokwasowy epitop bakteryjnej flageliny znany jako flg22 jest typowym MAMP, który indukuje zamknięcie aparatów szparkowych poprzez jego rozpoznanie przez PRR FLS210. Jako środek zaradczy patogeny bakteryjne, takie jak Pseudomonas syringae pv. pomidor DC3000 (WOM) oraz Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria rozwinęły mechanizmy wirulencji, aby ponownie otworzyć aparaty szparkowe9,11,12. Te reakcje szparkowe na patogeny bakteryjne były tradycyjnie analizowane w testach, w których skórki naskórka liści, krążki liściowe lub oderwane liście są unoszone na zawiesinie bakteryjnej, a następnie aparaty szparkowe są obserwowane pod mikroskopem, a następnie ręcznie mierzone otwory szparkowe. Jednak testy te są kłopotliwe i mogą nie odzwierciedlać reakcji szparkowych na naturalną inwazję bakterii, która występuje w liściu przyczepionym do rośliny.

Tutaj przedstawiono prostą metodę badania zamykania i ponownego otwierania aparatów szparkowych podczas inwazji Pto w warunkach, które ściśle naśladują naturalną interakcję roślina-bakteria. Metoda ta wykorzystuje przenośne urządzenie do obrazowania do bezpośredniej obserwacji aparatów szparkowych A. thaliana na liściu przyczepionym do rośliny zaszczepionej Wom, wraz z potokiem analizy obrazu do automatycznego pomiaru apertury szparkowej.

Protokół

1. Uprawa roślin

  1. Aby przerwać spoczynek, ponownie zawieś nasiona A. thaliana (Col-0) w wodzie dejonizowanej i inkubuj je w temperaturze 4 °C przez 4 dni w ciemności.
  2. Zasiej nasiona na glebie i wyrośnij w komorze wyposażonej w białe światło fluorescencyjne. Utrzymuj następujące warunki wzrostu: temperaturę 22 °C, natężenie światła 6 000 luksów (ok. 100 μmol/m2/s) przez 10 godzin i wilgotność względną 60%.
  3. W razie potrzeby podlej rośliny płynnym nawozem. Powstrzymać się od podlewania od 1 tygodnia do 2 dni przed inokulacją i dobrze podlać 1 dzień przed inokulacją.

2. Przygotowanie inokulum bakteryjnego

  1. Smugę Wom z glicerolu na zestalonym podłożu King's B (KB) (20 g tryptonu, 1,5 gK2HPO4 i 15 g glicerolu na 1 l, 1,5% agaru) z 50 μg/ml ryfampicyny i inkubować w temperaturze 28 °C przez 2 dni.
  2. Zaszczepić pojedynczą kolonię w 5 ml płynnego podłoża KB z 50 μg/ml ryfampicyny i inkubować w temperaturze 28 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min aż do późnej logarytmicznej fazy wzrostu.
  3. Odwirować kulturę przy 6 000 x g przez 2 minuty, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml sterylnej wody. Powtórz ten krok jeszcze raz.
  4. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu do otwierania aparatów szparkowych (25 mM MES-KOH pH 6,15, 10 mM KCl) i zmierzyć OD600.
  5. Rozcieńczyć zawiesinę do OD600 0,2 buforem otwierającym aparaty szparkowe zawierającym 0,04% silikonowego środka powierzchniowo czynnego.

3. Inokulacja bakterii w sprayu

  1. Od 1 dnia przed inokulacją do końca doświadczenia należy wystawić rośliny na działanie światła o natężeniu około 10 000 luksów (ok. 170 μmol/m2/s).
  2. Aby upewnić się, że większość aparatów szparkowych jest otwarta, trzymaj rośliny na tacy przykrytej przezroczystą pokrywką pod światłem przez co najmniej 3 godziny przed zaszczepieniem sprayem.
  3. Zdejmij pokrywkę i za pomocą aerografu spryskaj stronę liści abaxial 2,5 ml zawiesiny bakteryjnej na trzy rośliny w jednej doniczce.
  4. Inkubuj zaszczepione rośliny na tacy przykrytej przezroczystą pokrywką, aby utrzymać wilgotność względną około 85%.
  5. Uzyskać obrazy aparatów szparkowych po 1 i 3 godzinach od inokulacji opryskiem metodą opisaną w punkcie 4.

4. Bezpośrednia obserwacja aparatów szparkowych za pomocą przenośnego urządzenia do obrazowania

UWAGA: Przenośne urządzenie do obrazowania aparatów szparkowych jest wyposażone w lampę LED oraz moduł kamery i może uzyskać od 2 592 × 1 944 (wysokość × szerokość; piksele) obrazy o rozdzielczości około 0,5 μm/piksel.

  1. Podłącz przenośne urządzenie do obrazowania szparkowego do komputera osobistego (PC) wyposażonego w oprogramowanie do akwizycji obrazu.
  2. Delikatnie, ale całkowicie usuń kropelki wody z zaszczepionych liści za pomocą kawałka papieru.
  3. Otwórz górną pokrywę urządzenia, umieść liść na stoliku i zamknij górną pokrywę (Rysunek 1).
  4. Dostosuj ostrość obrazu, manipulując śrubą regulacyjną, a następnie kliknij przycisk Zapisz obraz na ekranie komputera. Obraz zostanie uzyskany natychmiast. Zazwyczaj zogniskowany obraz zawiera około 10 aparatów szparkowych, które można przeanalizować. Aby uzyskać wiarygodne wyniki, należy uzyskać obrazy aparatów szparkowych z sześciu liści trzech różnych roślin (po dwa liście na roślinę).

5. Ręczny pomiar otworu szparkowego

UWAGA: Oprogramowanie ImageJ można pobrać na https://imagej.nih.gov/ij/download.html

  1. Otwórz plik obrazu w ImageJ.
  2. Otwórz menedżera ROI, wybierając opcję Analizuj narzędzia > > Menedżer zwrotu z inwestycji.
  3. Użyj narzędzia do zaznaczania linii prostej, aby narysować linię odpowiadającą szerokości stomii (Rysunek 2) i zarejestruj zwrot z inwestycji, klikając przycisk Dodaj w Menedżerze ROI.
  4. Narysuj linię odpowiadającą długości tej samej stomii (Rysunek 2A) i zarejestruj zwrot z inwestycji zgodnie z opisem w kroku 5.3.
  5. Kliknij opcję Zmierz w Menedżerze zwrotu z inwestycji, aby zmierzyć szerokość i długość.
  6. Podziel szerokość przez długość, aby uzyskać otwór szparkowy (stosunek). Aby uzyskać solidną ocenę ilościową, użyj 60 lub więcej aparatów szparkowych dla każdego zabiegu i punktu czasowego. Nie wybieraj przedwczesnych lub niejasnych aparatów szparkowych do analizy (Rysunek 2B, C).

6. Automatyczny pomiar apertury aparatów szparkowych

UWAGA: Potok analizy obrazu działa w Google Colaboratory, środowisku wykonywalnym języka programowania Python w chmurze. Warunkiem wstępnym jest posiadanie ważnego konta Google z działającym Dyskiem Google, przeglądarką Google Chrome i stabilnym połączeniem internetowym.

  1. Pobierz notatnik Google Colaboratory z Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) i otwórz go.
  2. Utwórz lokalną kopię notatnika na Dysku Google, wybierając pozycję Plik > Zapisz kopię na Dysku. Po wyświetleniu nowej karty bezpiecznie zamknij kartę oryginalnego notesu.
  3. Naciśnij raz przycisk Wykonaj poniżej sekcji Ustawienia środowiska w notatniku bez rozwijania bloków komórek w celu zaimportowania wymaganych bibliotek.
  4. Wykonaj sekcję Ustawienia katalogu, aby utworzyć trzy foldery używane do analizy (np. example_result, inference_results i model) na Dysku Google.
    UWAGA: W tym przypadku foldery o nazwach example_result, inference_results i model są używane jako katalog nadrzędny, przechowujący odpowiednio wyniki wnioskowania i wytrenowane modele. W tym notesie przedstawiono przykład budowy katalogu jako procedury reprezentatywnej. Aby zmienić nazwę, przepisz ścieżkę pardir, infdir lub modeldir.
  5. Zgodnie z sekcją Przygotowanie obrazów przenieś pozyskane obrazy do example_result, pogrupowane w tytuły obrazów według obróbki lub próbki (np. mock_1h_XXXXXX.jpg) w celu ostatecznego wygenerowania wykresu. Przykładowe obrazy są dostępne w Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528).
  6. Wykonaj część Pobieranie wytrenowanych modeli, aby pobrać pliki ONNX wytrenowanych modeli z Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) i umieścić je w katalogu modelu.
  7. Uruchom część Wnioskowanie i pomiar apertury szparkowej, aby określić ilościowo aperturę aparatów szparkowych na podstawie poszczególnych obrazów. Obrazy wynikowe z nałożonym wnioskowaniem i plikiem csv o nazwie example_result.csv zostaną wyeksportowane do katalogu inference_results.
  8. Wykonaj sekcję Generowanie wykresu, aby utworzyć wykres dotyczący współczynnika apertury aparatów szparkowych, wyeksportowany do katalogu inference_results.

Wyniki

Po inokulacji metodą natryskową Pto, aparaty szparkowe na liściach przymocowanych do inokulowanych roślin były bezpośrednio obserwowane za pomocą przenośnego urządzenia do obrazowania szparek. Wykorzystując pomiary ręczne i zautomatyzowane, na tych samych obrazach liści obliczono szerokość otwarcia szparek, wyznaczając stosunek szerokości do długości około 60 aparatów szparkowych. Pomiary ręczne i zautomatyzowane konsekwentnie wskazały na zmniejszenie szerokości otwarcia szparek w Pto- rośliny inokulowane w porównaniu z roślinami poddanymi inokulacji pozorowanej 1 godzinę po inokulacji (hpi) (Rycina 3A,B), co wskazuje na to, że A. thaliana rośliny zamykają aparaty szparkowe w odpowiedzi na Pto inwazji. W 3 hpi otwór szparkowy w Pto-rośliny zaszczepione i rośliny zaszczepione pozornie były niemal identyczne (Rycina 3C,D), co przypomina ponowne otwieranie aparatów szparkowych przez PtoCo godne uwagi, zautomatyzowany pomiar szerokości szpary szparkowej zajął jedynie około 5 s na przetworzenie jednego obrazu (Tabela 1), co skraca czas pomiaru o ponad 95% w porównaniu z pomiarem manualnym. Tym samym niniejszy protokół stanowi operacyjnie prosty i oszczędzający nakład pracy sposób śledzenia dynamicznych reakcji aparatów szparkowych A. thaliana do patogenu bakteryjnego.

Układ do pomiaru stresu roślin z wykorzystaniem czujnika zaciskowego do liścia w analizie fotosyntezy.
Rysunek 1: Przenośne urządzenie obrazujące. Zdjęcia przedstawiające przenośne urządzenie obrazujące z liściem umieszczonym na podstawce (po lewej) oraz z zamkniętą górną pokrywą (po prawej). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia komórek roślinnych, pomiar długości i szerokości; schemat przedstawiający analizę struktury komórkowej.
Rysunek 2: Schemat pomiaru apertury szparek stomatycznych. (A) Aperturę szparki wyznacza się obliczając stosunek szerokości do długości szparki, wskazaną białymi strzałkami. (B) Szparki niedojrzałe oraz (C) niewyraźne powinny zostać wykluczone z pomiaru. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy pudełkowe porównujące próbę mock vs Pto, wyświetlone wartości p, analiza danych statystycznych.
Rycina 3: Reakcje aparatów szparkowych na Pto w nienaruszonej całej roślinie. Rośliny A. thaliana zostały inokulowane metodą natryskową próbą mock lub Pto, a aparaty szparkowe na liściach rośliny poddanej inokulacji były bezpośrednio obserwowane w (A,B) 1 hpi oraz (C,D) 3 hpi za pomocą przenośnego urządzenia do obrazowania aparatów szparkowych. Apertura szparkowa (stosunek) została obliczona za pomocą pomiarów (A,C) ręcznych oraz (B,D) zautomatyzowanych. Wartości p obliczono za pomocą obustronnego testu t. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Czas przetwarzania (s)
MetodaŚredniaSD
Instrukcja130.148.8
Zautomatyzowany4.70.8

Tabela 1: Czas przetwarzania dla pomiarów manualnych i zautomatyzowanych szerokości szparek w jednym obrazie. Średnie i odchylenia standardowe (SD) czasu przetwarzania obliczono na podstawie pomiarów dziewięciu reprezentatywnych obrazów.

Dyskusja

W poprzednich badaniach wykorzystywano skórki naskórka, krążki liściowe lub oderwane liście do zbadania reakcji aparatów szparkowych na inwazje bakteryjne 9,11,12. W przeciwieństwie do tego, metoda zaproponowana w tym badaniu wykorzystuje przenośne urządzenie do obrazowania aparatów szparkowych do bezpośredniej obserwacji aparatów szparkowych na liściu przyczepionym do rośliny po rozpyleniu PTO, naśladując naturalne warunki inwazji bakterii. Ponadto, ponieważ metoda ta nie obejmuje destrukcyjnych procesów przygotowania próbki, takich jak odklejanie się liści, wycinanie krążka liściowego i łuszczenie się naskórka, można uniknąć zranień i utraty wody związanych z tymi procesami przygotowania próbki. Efektów tych nie należy lekceważyć, ponieważ rany i utrata wody nieuchronnie wywołują sygnały pochodzenia roślinnego, takie jak fitohormony jasmonian i kwas abscysynowy, które wpływają na ruchy aparatów szparkowych13,14.

Istnieje kilka wytycznych dotyczących optymalnego wykorzystania przenośnego urządzenia do obrazowania szparkowego. Po pierwsze, dokładne usunięcie kropelek wody z powierzchni liści ma kluczowe znaczenie dla uzyskania obrazów o optymalnej wyrazistości i ostrości. Po drugie, zaleca się wykonywanie wielu zdjęć z identycznych obszarów liści, manipulując śrubą regulacyjną w celu precyzyjnego dostrojenia ostrości. Oczekuje się, że praktyka ta zwiększy liczbę możliwych do przeanalizowania aparatów szparkowych na powierzchnię liścia, łagodząc w ten sposób potencjalne błędy systematyczne związane z pobieraniem próbek. Wreszcie, podczas ściskania liścia za pomocą urządzenia, należy obchodzić się z nim ostrożnie, aby uniknąć uszkodzenia liścia. Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ zranienie jest jedną ze wskazówek, które wywołują zamknięcie aparatów szparkowych14.

Apertura aparatów szparkowych była bardziej zmienna w pomiarze automatycznym niż w pomiarze ręcznym (ryc. 3). Istnieje kilka możliwych przyczyn takiego stanu rzeczy. Wcześniej informowano, że pory szparkowe wywnioskowane przez potok analizy obrazu często obejmują ściany komórkowe i/lub cienie komórek ochronnych otaczających pory szparkowe7, co nie ma miejsca w przypadku ręcznego pomiaru ludzkimi oczami. Aparaty szparkowe o nietypowych kształtach mogą również wpływać na różnice między pomiarami ręcznymi i automatycznymi, chociaż model wykrywania aparatów szparkowych został przeszkolony tak, aby wykluczyć takie aparaty szparkowe z analizy7. Niektórym aparatom szparkowym podano zerowe wartości apertury szparkowej w pomiarze automatycznym, ale żadna w pomiarze ręcznym z nieznanych przyczyn. Przyszłe aktualizacje modeli mogą być konieczne w celu rozwiązania tych problemów. Niemniej jednak, ponieważ zautomatyzowany pomiar apertury aparatów szparkowych zasadniczo odpowiadał pomiarowi ręcznemu, obecna wersja potoku analizy obrazu ma praktyczne zastosowanie.

Bezpośrednia obserwacja i zautomatyzowany pomiar apertury aparatów szparkowych u A. thaliana opisane w tym badaniu są obiecujące dla różnych zastosowań w celu wyjaśnienia roli aparatów szparkowych w adaptacji roślin do środowiska. Na przykład przedstawiona metoda powinna mieć szerokie zastosowanie do szybkiego ilościowego określania apertury szparkowej w nienaruszonym całym systemie roślinnym po narażeniu na stresy biotyczne, takie jak MAMP i patogeny mikrobiotyczne, a także stresy abiotyczne, takie jak susza. Na poparcie tego poprzedniego badania z powodzeniem zastosowano proces analizy obrazu w celu dokładnego określenia ilościowego otworu szparkowego "krążków liściowych" potraktowanych toksyną grzybową fusikokcyną, która indukuje otwarcie aparatów szparkowych, lub hormonem stresu, kwasem abscysynowym, który indukuje zamknięcie aparatów szparkowych7. Co więcej, w zasadzie przenośne urządzenie do obrazowania pozwala na długoterminową analizę przebiegu aparatu szparkowego na pojedynczym identycznym liściu przymocowanym do rośliny. Może to rzucić światło na nowe aspekty interakcji roślina-mikroorganizm, ponieważ większość badań koncentrowała się na reakcjach aparatów szparkowych na patogeny bakteryjne przez pierwsze kilka godzin interakcji 9,10,11. Interesujące będzie również zastosowanie i modyfikacja przedstawionej metody w celu zbadania reakcji aparatów szparkowych na inwazję bakterii w różnych warunkach środowiskowych. Jest to szczególnie istotne dla zrozumienia wpływu czynników środowiskowych, takich jak temperatura, wilgotność i dostępność wody w glebie, które wpływają na ruchy aparatów szparkowych i rozwój chorób przez patogeny bakteryjne 8,15. Podsumowując, przedstawiona metoda ma na celu przyspieszenie badań nad funkcjami aparatów szparkowych w interakcjach roślina-mikroorganizmy i poza nimi w dotychczas nieosiągalnych warunkach eksperymentalnych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy wszystkim członkom projektu badawczego 'Współtworzenie cech adaptacyjnych roślin poprzez montaż holobiontu roślinno-mikrobowego', za owocne dyskusje. Prace te były wspierane przez Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (21H05151 i 21H05149 do A.M. i 21H05152 do Y.T.) oraz Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (22K19178 do A. M.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarNakarai tesque01028-85
Zestawy aerografuANEST IWATAMX2900Zestawy akcesoriów do SPRINT JET
BiotronNippon Medical & Instrumenty chemiczneLPH-411SKomora do wzrostu roślin z białym światłem fluorescencyjnym
GlicerolWako072-00626
PółtacaSakata72000113Zestaw tacki i pokrywki
HyponexHyponexBrak dostępnego numeru katalogowegoRozcieńczyć roztwór Hyponex w stosunku 1:2000 w wodzie dejonizowanej do podlewania roślin
Obraz JNatinal Institute of ZdrowiePobierz w https://imagej.nih.gov/ij/download.htmlSłuży do ręcznego pomiaru otworu szparkowego
K2HPO4Wako164-04295
KClWako163-03545
KOHWako168-21815Dla MES-KOH
MESWako343-01621Dla MES-KOH
Przenośne urządzenie do obrazowania aparatów szparkowychZamówienie fitometrycznew https://www.phytometrics.jp/Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018.
RyfampicynaWako185-01003Rozpuszcza się w DMSO
Silwet-L77Bio medycynaBMS-SL7755silikonowy środek powierzchniowo czynny stosowany w inokulacji opryskowej
SPRINT JETANESTIWATA IS-800Aerograf używany do inokulacji w sprayu
SuperMix ANasiona Sakata72000083Wymieszaj z wermikulitem G20 w równych proporcjach do przygotowania gleby
TryptonNakarai tesque35640-95
Vermiculite G20NittaiBrak dostępnego numeru katalogowegoWymieszać z Super Mix A w równych proporcjach do przygotowania gleby
Białe światło fluorescencyjneNECFHF32EX-N-HX-Sużywane do Biotronu

Bibliografia

  1. Shimono, M., Higaki, T., Kaku, H., Shibuya, N., Hasezawa, S., Day, B. Quantitative evaluation of stomatal cytoskeletal patterns during the activation of immune signaling in Arabidopsis thaliana. PLoS One. 11, e0159291(2016).
  2. Bourdais, G., et al. The use of quantitative imaging to investigate regulators of membrane trafficking in Arabidopsis stomatal closure. Traffic. 20 (2), 168-180 (2019).
  3. Higaki, T., Kutsuna, N., Hasezawa, S. CARTA-based semi-automatic detection of stomatal regions on an Arabidopsis cotyledon surface. Plant Morphology. 26 (1), 9-12 (2014).
  4. Eisele, J. F., Fäßler, F., Bürgel, F., Chaban, C. A. A rapid and simple method for microscopy-based stomata analyses. PLoS One. 11, e0164576(2016).
  5. Chitraker, R., Melotto, M. Assessing stomatal response to live bacterial cells using whole leaf imaging. Journal of Visualized Experiments. 44, 2185(2010).
  6. Sai, N., et al. StomaAI: an efficient and user-friendly tool for measurement of stomatal pores and density using deep computer vision. New Phytologist. 238 (2), 904-915 (2023).
  7. Takagi, M., et al. Image-based quantification of Arabidopsis thaliana stomatal aperture from leaf images. Plant and Cell Physiology. pcad018, (2023).
  8. Melotto, M., Zhang, L., Oblessuc, P. R., He, S. Y. Stomatal defense a decade later. Plant Physiology. 174 (2), 561-571 (2017).
  9. Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126 (5), 969-980 (2006).
  10. Zeng, W., He, S. A prominent role of the flagellin receptor FLAGELLIN-SENSING2 in mediating stomatal response to Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 in Arabidopsis. Plant Physiology. 153 (3), 1188-1198 (2010).
  11. Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host and Microbe. 11 (6), 587-596 (2012).
  12. Raffeiner, M., et al. The Xanthomonas type-III effector XopS stabilizes CaWRKY40a to regulate defense responses and stomatal immunity in pepper (Capsicum annuum). The Plant Cell. 34 (5), 1684-1708 (2022).
  13. Munemasa, S., Hauser, F., Park, J., Waadt, R., Brandt, B., Schroeder, J. I. Mechanisms of abscisic acid-mediated control of stomatal aperture. Current Opinion in Plant Biology. 28, 154-162 (2015).
  14. Förster, S., et al. Wounding-induced stomatal closure requires jasmonate-mediated activation of GORK K+ channels by a Ca2+ sensor-kinase CBL1-CIPK5 complex. Developmental Cell. 48 (1), 87-99 (2018).
  15. Cheng, Y. T., Zhang, L., He, S. Y. Plant-microbe interactions facing environmental challenge. Cell Host and Microbe. 26 (2), 183-192 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Apertura szparyd io kowejprzeno ne urz dzenie obrazuj ceanaliza g bokiego uczeniainokulacja przez opryskepidermy li ciainterakcje bakterii z ro linami
Bezpośrednia obserwacja i automatyczny pomiar reakcji aparatów szparkowych na Pseudomonas syringae pv. pomidor DC3000 w rzodkiewniku pospolitym (Arabidopsis thaliana)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.