Bezpośrednia obserwacja i automatyczny pomiar reakcji aparatów szparkowych na Pseudomonas syringae pv. pomidor DC3000 w rzodkiewniku pospolitym (Arabidopsis thaliana)

Aparaty szparkowe to mikroskopijne pory otoczone parą komórek ochronnych na powierzchni liści i innych nadziemnych części roślin. W ciągle zmieniającym się środowisku regulacja otworu szparkowego ma kluczowe znaczenie dla roślin, aby kontrolować absorpcję dwutlenku węgla wymaganą do fotosyntezy kosztem utraty wody w wyniku transpiracji. W związku z tym kwantyfikacja apertury aparatów szparkowych odegrała zasadniczą rolę w zrozumieniu adaptacji roślin do środowiska. Jednak ilościowe określenie apertury aparatów szparkowych jest z natury czasochłonne i kłopotliwe, ponieważ wymaga pracy ludzkiej, aby dostrzec i zmierzyć pory szparkowe na obrazie liścia uchwyconym przez mikroskop. Aby obejść te ograniczenia, opracowano różne metody ułatwiające ilościowe określenie apertury aparatów szparkowych u Arabidopsis thaliana, roślinie modelowej szeroko wykorzystywanej do badania biologii aparatów szparkowych^1,2,3,4,5,6. Na przykład porometr może być używany do pomiaru szybkości transpiracji jako metryki przewodności szparkowej. Jednak metoda ta nie dostarcza bezpośrednich informacji na temat liczby aparatów szparkowych i apertury, które określają przewodność szparkową. W niektórych badaniach wykorzystano techniki mikroskopii konfokalnej uwydatniające pory szparkowe za pomocą fluorescencyjnego markera aktynowego, barwnika fluorescencyjnego lub autofluorescencji ściany komórkowej^1,2,3,4,5. Chociaż podejścia te ułatwiają wykrywanie aparatów szparkowych, koszt zarówno prowadzenia urządzenia do mikroskopii konfokalnej, jak i przygotowania próbek mikroskopowych może stanowić przeszkodę w rutynowym stosowaniu. W przełomowej pracy Sai i wsp. opracowano model głębokiej sieci neuronowej do automatycznego pomiaru apertury aparatów szparkowych na podstawie obrazów mikroskopowych w jasnym polu peelingów naskórka A. thaliana ⁶. Ta innowacja nie zwalnia jednak badaczy z zadania przygotowania peelingu naskórka do obserwacji mikroskopowej. Niedawno przeszkoda ta została pokonana dzięki opracowaniu przenośnego urządzenia do obrazowania, które może obserwować aparaty szparkowe, ściskając liść A. thaliana, wraz z potokiem analizy obrazu opartym na głębokim uczeniu, który automatycznie mierzy aperturę szparkową na podstawie obrazów liści zarejestrowanych przez urządzenie⁷.

Aparaty szparkowe przyczyniają się do wrodzonej odporności roślin na patogeny bakteryjne. Kluczem do tej odpowiedzi immunologicznej jest zamknięcie aparatów szparkowych, które ograniczają wnikanie bakterii przez mikroskopijne pory do wnętrza liścia, gdzie patogeny bakteryjne namnażają się i powodują choroby⁸. Zamknięcie aparatów szparkowych jest indukowane po rozpoznaniu wzorców molekularnych związanych z drobnoustrojami (MAMP), cząsteczek immunogennych, które często są wspólne dla klasy drobnoustrojów, przez receptory rozpoznawania wzorców zlokalizowanych w błonie plazmatycznej (PRR)⁹. 22-aminokwasowy epitop bakteryjnej flageliny znany jako flg22 jest typowym MAMP, który indukuje zamknięcie aparatów szparkowych poprzez jego rozpoznanie przez PRR FLS2¹⁰. Jako środek zaradczy patogeny bakteryjne, takie jak Pseudomonas syringae pv. pomidor DC3000 (WOM) oraz Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria rozwinęły mechanizmy wirulencji, aby ponownie otworzyć aparaty szparkowe^9,11,12. Te reakcje szparkowe na patogeny bakteryjne były tradycyjnie analizowane w testach, w których skórki naskórka liści, krążki liściowe lub oderwane liście są unoszone na zawiesinie bakteryjnej, a następnie aparaty szparkowe są obserwowane pod mikroskopem, a następnie ręcznie mierzone otwory szparkowe. Jednak testy te są kłopotliwe i mogą nie odzwierciedlać reakcji szparkowych na naturalną inwazję bakterii, która występuje w liściu przyczepionym do rośliny.

Tutaj przedstawiono prostą metodę badania zamykania i ponownego otwierania aparatów szparkowych podczas inwazji Pto w warunkach, które ściśle naśladują naturalną interakcję roślina-bakteria. Metoda ta wykorzystuje przenośne urządzenie do obrazowania do bezpośredniej obserwacji aparatów szparkowych A. thaliana na liściu przyczepionym do rośliny zaszczepionej Wom, wraz z potokiem analizy obrazu do automatycznego pomiaru apertury szparkowej.

1. Uprawa roślin

1. Aby przerwać spoczynek, ponownie zawieś nasiona A. thaliana (Col-0) w wodzie dejonizowanej i inkubuj je w temperaturze 4 °C przez 4 dni w ciemności.
2. Zasiej nasiona na glebie i wyrośnij w komorze wyposażonej w białe światło fluorescencyjne. Utrzymuj następujące warunki wzrostu: temperaturę 22 °C, natężenie światła 6 000 luksów (ok. 100 μmol/m²/s) przez 10 godzin i wilgotność względną 60%.
3. W razie potrzeby podlej rośliny płynnym nawozem. Powstrzymać się od podlewania od 1 tygodnia do 2 dni przed inokulacją i dobrze podlać 1 dzień przed inokulacją.

2. Przygotowanie inokulum bakteryjnego

1. Smugę Wom z glicerolu na zestalonym podłożu King's B (KB) (20 g tryptonu, 1,5 g_K2HPO₄ i 15 g glicerolu na 1 l, 1,5% agaru) z 50 μg/ml ryfampicyny i inkubować w temperaturze 28 °C przez 2 dni.
2. Zaszczepić pojedynczą kolonię w 5 ml płynnego podłoża KB z 50 μg/ml ryfampicyny i inkubować w temperaturze 28 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min aż do późnej logarytmicznej fazy wzrostu.
3. Odwirować kulturę przy 6 000 x g przez 2 minuty, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml sterylnej wody. Powtórz ten krok jeszcze raz.
4. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu do otwierania aparatów szparkowych (25 mM MES-KOH pH 6,15, 10 mM KCl) i zmierzyć OD₆₀₀.
5. Rozcieńczyć zawiesinę do OD₆₀₀ 0,2 buforem otwierającym aparaty szparkowe zawierającym 0,04% silikonowego środka powierzchniowo czynnego.

3. Inokulacja bakterii w sprayu

1. Od 1 dnia przed inokulacją do końca doświadczenia należy wystawić rośliny na działanie światła o natężeniu około 10 000 luksów (ok. 170 μmol/^m2/s).
2. Aby upewnić się, że większość aparatów szparkowych jest otwarta, trzymaj rośliny na tacy przykrytej przezroczystą pokrywką pod światłem przez co najmniej 3 godziny przed zaszczepieniem sprayem.
3. Zdejmij pokrywkę i za pomocą aerografu spryskaj stronę liści abaxial 2,5 ml zawiesiny bakteryjnej na trzy rośliny w jednej doniczce.
4. Inkubuj zaszczepione rośliny na tacy przykrytej przezroczystą pokrywką, aby utrzymać wilgotność względną około 85%.
5. Uzyskać obrazy aparatów szparkowych po 1 i 3 godzinach od inokulacji opryskiem metodą opisaną w punkcie 4.

4. Bezpośrednia obserwacja aparatów szparkowych za pomocą przenośnego urządzenia do obrazowania

UWAGA: Przenośne urządzenie do obrazowania aparatów szparkowych jest wyposażone w lampę LED oraz moduł kamery i może uzyskać od 2 592 × 1 944 (wysokość × szerokość; piksele) obrazy o rozdzielczości około 0,5 μm/piksel.

1. Podłącz przenośne urządzenie do obrazowania szparkowego do komputera osobistego (PC) wyposażonego w oprogramowanie do akwizycji obrazu.
2. Delikatnie, ale całkowicie usuń kropelki wody z zaszczepionych liści za pomocą kawałka papieru.
3. Otwórz górną pokrywę urządzenia, umieść liść na stoliku i zamknij górną pokrywę (Rysunek 1).
4. Dostosuj ostrość obrazu, manipulując śrubą regulacyjną, a następnie kliknij przycisk Zapisz obraz na ekranie komputera. Obraz zostanie uzyskany natychmiast. Zazwyczaj zogniskowany obraz zawiera około 10 aparatów szparkowych, które można przeanalizować. Aby uzyskać wiarygodne wyniki, należy uzyskać obrazy aparatów szparkowych z sześciu liści trzech różnych roślin (po dwa liście na roślinę).

5. Ręczny pomiar otworu szparkowego

UWAGA: Oprogramowanie ImageJ można pobrać na https://imagej.nih.gov/ij/download.html

1. Otwórz plik obrazu w ImageJ.
2. Otwórz menedżera ROI, wybierając opcję Analizuj narzędzia > > Menedżer zwrotu z inwestycji.
3. Użyj narzędzia do zaznaczania linii prostej, aby narysować linię odpowiadającą szerokości stomii (Rysunek 2) i zarejestruj zwrot z inwestycji, klikając przycisk Dodaj w Menedżerze ROI.
4. Narysuj linię odpowiadającą długości tej samej stomii (Rysunek 2A) i zarejestruj zwrot z inwestycji zgodnie z opisem w kroku 5.3.
5. Kliknij opcję Zmierz w Menedżerze zwrotu z inwestycji, aby zmierzyć szerokość i długość.
6. Podziel szerokość przez długość, aby uzyskać otwór szparkowy (stosunek). Aby uzyskać solidną ocenę ilościową, użyj 60 lub więcej aparatów szparkowych dla każdego zabiegu i punktu czasowego. Nie wybieraj przedwczesnych lub niejasnych aparatów szparkowych do analizy (Rysunek 2B, C).

6. Automatyczny pomiar apertury aparatów szparkowych

UWAGA: Potok analizy obrazu działa w Google Colaboratory, środowisku wykonywalnym języka programowania Python w chmurze. Warunkiem wstępnym jest posiadanie ważnego konta Google z działającym Dyskiem Google, przeglądarką Google Chrome i stabilnym połączeniem internetowym.

1. Pobierz notatnik Google Colaboratory z Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) i otwórz go.
2. Utwórz lokalną kopię notatnika na Dysku Google, wybierając pozycję Plik > Zapisz kopię na Dysku. Po wyświetleniu nowej karty bezpiecznie zamknij kartę oryginalnego notesu.
3. Naciśnij raz przycisk Wykonaj poniżej sekcji Ustawienia środowiska w notatniku bez rozwijania bloków komórek w celu zaimportowania wymaganych bibliotek.
4. Wykonaj sekcję Ustawienia katalogu, aby utworzyć trzy foldery używane do analizy (np. example_result, inference_results i model) na Dysku Google.
   UWAGA: W tym przypadku foldery o nazwach example_result, inference_results i model są używane jako katalog nadrzędny, przechowujący odpowiednio wyniki wnioskowania i wytrenowane modele. W tym notesie przedstawiono przykład budowy katalogu jako procedury reprezentatywnej. Aby zmienić nazwę, przepisz ścieżkę pardir, infdir lub modeldir.
5. Zgodnie z sekcją Przygotowanie obrazów przenieś pozyskane obrazy do example_result, pogrupowane w tytuły obrazów według obróbki lub próbki (np. mock_1h_XXXXXX.jpg) w celu ostatecznego wygenerowania wykresu. Przykładowe obrazy są dostępne w Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528).
6. Wykonaj część Pobieranie wytrenowanych modeli, aby pobrać pliki ONNX wytrenowanych modeli z Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) i umieścić je w katalogu modelu.
7. Uruchom część Wnioskowanie i pomiar apertury szparkowej, aby określić ilościowo aperturę aparatów szparkowych na podstawie poszczególnych obrazów. Obrazy wynikowe z nałożonym wnioskowaniem i plikiem csv o nazwie example_result.csv zostaną wyeksportowane do katalogu inference_results.
8. Wykonaj sekcję Generowanie wykresu, aby utworzyć wykres dotyczący współczynnika apertury aparatów szparkowych, wyeksportowany do katalogu inference_results.

Po rozpyleniu Pto, aparaty szparkowe na liściach przyczepionych do zaszczepionych roślin były bezpośrednio obserwowane przez przenośne urządzenie do obrazowania aparatów szparkowych. Korzystając z pomiarów ręcznych i automatycznych, te same obrazy liści wykorzystano do obliczenia apertury aparatów szparkowych, biorąc pod uwagę stosunek szerokości do długości około 60 aparatów szparkowych. Pomiary ręczne i automatyczne konsekwentnie wskazywały na zmniejszenie apertury aparatów szparkowych u roślin zaszczepionych Pto w porównaniu z roślinami zaszczepionymi próbnie po 1 godzinie od inokulacji (hpi) (Rysunek 3A, B), wskazując, że rośliny A thaliana zamykają aparaty szparkowe w odpowiedzi na inwazję Pto. Przy 3 hpi otwór szparkowy u roślin szczepionych Pto i roślin zaszczepionych próbnie był praktycznie taki sam (Rysunek 3C,D), przypominając ponowne otwarcie aparatów szparkowych przez Pto. Co ciekawe, automatyczny pomiar apertury aparatów szparkowych potrzebował tylko około 5 sekund, aby przetworzyć jeden obraz (Tabela 1), skracając czas pomiaru o ponad 95% w porównaniu z pomiarem ręcznym. W ten sposób protokół ten oferuje operacyjnie prosty i pracochłonny sposób śledzenia dynamicznych reakcji szparkowych A. thaliana na patogen bakteryjny.

Rysunek 1: Przenośne urządzenie do obrazowania. Zdjęcia przedstawiające przenośne urządzenie do przetwarzania obrazu z liściem ustawionym na scenie (po lewej) i z zamkniętą górną pokrywą (po prawej). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Schemat ideowy pomiaru apertury aparatów szparkowych. (A) Otwór szparkowy jest określany przez obliczenie stosunku szerokości do długości stomii, jak wskazują białe strzałki. (B) Przedwczesne i (C) niejasne aparaty szparkowe powinny być wyłączone z pomiaru. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Reakcje aparatów szparkowych na Pto w nienaruszonym całym roślinie. Rośliny A. thaliana zostały zaszczepione sprayem za pomocą mocku lub Pto, a aparaty szparkowe na liściach przyczepionych do zaszczepionych roślin były bezpośrednio obserwowane na (A,B) 1 hpi i (C,D) 3 hpi przez przenośne urządzenie do obrazowania szparkowego. Aperturę (stosunek) aparatów szparkowych obliczono za pomocą pomiarów ręcznych (A,C) i (B,D) automatycznych. Wartości P obliczono za pomocą dwustronnego testu t. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Czas przetwarzania dla ręcznych i automatycznych pomiarów apertury aparatów szparkowych na obraz. Średnie i odchylenia standardowe (SD) czasu przetwarzania obliczono na podstawie pomiarów dziewięciu reprezentatywnych obrazów.

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.