Tutaj prezentujemy prostą metodę bezpośredniej obserwacji i automatycznego pomiaru reakcji aparatów szparkowych na inwazję bakterii u Arabidopsis thaliana. Metoda ta wykorzystuje przenośne urządzenie do obrazowania aparatów szparkowych wraz z potokiem analizy obrazu przeznaczonym do obrazów liści zarejestrowanych przez urządzenie.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Bezpośrednia obserwacja i automatyczny pomiar reakcji aparatów szparkowych na Pseudomonas syringae pv. pomidor DC3000 w rzodkiewniku pospolitym (Arabidopsis thaliana)
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Aparaty szparkowe to mikroskopijne pory znajdujące się w naskórku liści roślin. Regulacja apertury aparatów szparkowych ma kluczowe znaczenie nie tylko dla zrównoważenia poboru dwutlenku węgla do fotosyntezy i transpiracyjnej utraty wody, ale także dla ograniczenia inwazji bakterii. Podczas gdy rośliny zamykają aparaty szparkowe po rozpoznaniu drobnoustrojów, bakterie chorobotwórcze, takie jak Pseudomonas syringae pv. pomidor DC3000 (WOM), ponownie otwórz zamknięte aparaty szparkowe, aby uzyskać dostęp do wnętrza skrzydła. W konwencjonalnych testach do oceny reakcji aparatów szparkowych na inwazję bakterii, skórki naskórka liści, krążki liści lub oderwane liście są unoszone na zawiesinie bakteryjnej, a następnie aparaty szparkowe są obserwowane pod mikroskopem, a następnie następuje ręczny pomiar otworu szparkowego. Jednak testy te są kłopotliwe i mogą nie odzwierciedlać reakcji szparkowych na naturalną inwazję bakterii w liściu przyczepionym do rośliny. Niedawno opracowano przenośne urządzenie do obrazowania, które może obserwować aparaty szparkowe, ściskając liść bez odrywania go od rośliny, wraz z potokiem analizy obrazu opartym na głębokim uczeniu, zaprojektowanym do automatycznego pomiaru apertury szparkowej na podstawie obrazów liści zarejestrowanych przez urządzenie. Tutaj, w oparciu o te postępy techniczne, wprowadzono nową metodę oceny reakcji aparatów szparkowych na inwazję bakterii Arabidopsis thaliana. Metoda ta składa się z trzech prostych kroków: inokulacji w sprayu Pto naśladującej naturalne procesy infekcji, bezpośredniej obserwacji aparatów szparkowych na liściu rośliny zaszczepionej Pto za pomocą przenośnego urządzenia do obrazowania oraz automatycznego pomiaru apertury szparkowej za pomocą potoku analizy obrazu. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do zademonstrowania zamykania i ponownego otwierania aparatów szparkowych podczas inwazji PTO w warunkach, które ściśle naśladują naturalną interakcję roślina-bakteria.
Wprowadzenie
Aparaty szparkowe to mikroskopijne pory otoczone parą komórek ochronnych na powierzchni liści i innych nadziemnych części roślin. W ciągle zmieniającym się środowisku regulacja otworu szparkowego ma kluczowe znaczenie dla roślin, aby kontrolować absorpcję dwutlenku węgla wymaganą do fotosyntezy kosztem utraty wody w wyniku transpiracji. W związku z tym kwantyfikacja apertury aparatów szparkowych odegrała zasadniczą rolę w zrozumieniu adaptacji roślin do środowiska. Jednak ilościowe określenie apertury aparatów szparkowych jest z natury czasochłonne i kłopotliwe, ponieważ wymaga pracy ludzkiej, aby dostrzec i zmierzyć pory szparkowe na obrazie liścia uchwyconym przez mikroskop. Aby obejść te ograniczenia, opracowano różne metody ułatwiające ilościowe określenie apertury aparatów szparkowych u Arabidopsis thaliana, roślinie modelowej szeroko wykorzystywanej do badania biologii aparatów szparkowych1,2,3,4,5,6. Na przykład porometr może być używany do pomiaru szybkości transpiracji jako metryki przewodności szparkowej. Jednak metoda ta nie dostarcza bezpośrednich informacji na temat liczby aparatów szparkowych i apertury, które określają przewodność szparkową. W niektórych badaniach wykorzystano techniki mikroskopii konfokalnej uwydatniające pory szparkowe za pomocą fluorescencyjnego markera aktynowego, barwnika fluorescencyjnego lub autofluorescencji ściany komórkowej1,2,3,4,5. Chociaż podejścia te ułatwiają wykrywanie aparatów szparkowych, koszt zarówno prowadzenia urządzenia do mikroskopii konfokalnej, jak i przygotowania próbek mikroskopowych może stanowić przeszkodę w rutynowym stosowaniu. W przełomowej pracy Sai i wsp. opracowano model głębokiej sieci neuronowej do automatycznego pomiaru apertury aparatów szparkowych na podstawie obrazów mikroskopowych w jasnym polu peelingów naskórka A. thaliana 6. Ta innowacja nie zwalnia jednak badaczy z zadania przygotowania peelingu naskórka do obserwacji mikroskopowej. Niedawno przeszkoda ta została pokonana dzięki opracowaniu przenośnego urządzenia do obrazowania, które może obserwować aparaty szparkowe, ściskając liść A. thaliana, wraz z potokiem analizy obrazu opartym na głębokim uczeniu, który automatycznie mierzy aperturę szparkową na podstawie obrazów liści zarejestrowanych przez urządzenie7.
Aparaty szparkowe przyczyniają się do wrodzonej odporności roślin na patogeny bakteryjne. Kluczem do tej odpowiedzi immunologicznej jest zamknięcie aparatów szparkowych, które ograniczają wnikanie bakterii przez mikroskopijne pory do wnętrza liścia, gdzie patogeny bakteryjne namnażają się i powodują choroby8. Zamknięcie aparatów szparkowych jest indukowane po rozpoznaniu wzorców molekularnych związanych z drobnoustrojami (MAMP), cząsteczek immunogennych, które często są wspólne dla klasy drobnoustrojów, przez receptory rozpoznawania wzorców zlokalizowanych w błonie plazmatycznej (PRR)9. 22-aminokwasowy epitop bakteryjnej flageliny znany jako flg22 jest typowym MAMP, który indukuje zamknięcie aparatów szparkowych poprzez jego rozpoznanie przez PRR FLS210. Jako środek zaradczy patogeny bakteryjne, takie jak Pseudomonas syringae pv. pomidor DC3000 (WOM) oraz Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria rozwinęły mechanizmy wirulencji, aby ponownie otworzyć aparaty szparkowe9,11,12. Te reakcje szparkowe na patogeny bakteryjne były tradycyjnie analizowane w testach, w których skórki naskórka liści, krążki liściowe lub oderwane liście są unoszone na zawiesinie bakteryjnej, a następnie aparaty szparkowe są obserwowane pod mikroskopem, a następnie ręcznie mierzone otwory szparkowe. Jednak testy te są kłopotliwe i mogą nie odzwierciedlać reakcji szparkowych na naturalną inwazję bakterii, która występuje w liściu przyczepionym do rośliny.
Tutaj przedstawiono prostą metodę badania zamykania i ponownego otwierania aparatów szparkowych podczas inwazji Pto w warunkach, które ściśle naśladują naturalną interakcję roślina-bakteria. Metoda ta wykorzystuje przenośne urządzenie do obrazowania do bezpośredniej obserwacji aparatów szparkowych A. thaliana na liściu przyczepionym do rośliny zaszczepionej Wom, wraz z potokiem analizy obrazu do automatycznego pomiaru apertury szparkowej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Uprawa roślin
- Aby przerwać spoczynek, ponownie zawieś nasiona A. thaliana (Col-0) w wodzie dejonizowanej i inkubuj je w temperaturze 4 °C przez 4 dni w ciemności.
- Zasiej nasiona na glebie i wyrośnij w komorze wyposażonej w białe światło fluorescencyjne. Utrzymuj następujące warunki wzrostu: temperaturę 22 °C, natężenie światła 6 000 luksów (ok. 100 μmol/m2/s) przez 10 godzin i wilgotność względną 60%.
- W razie potrzeby podlej rośliny płynnym nawozem. Powstrzymać się od podlewania od 1 tygodnia do 2 dni przed inokulacją i dobrze podlać 1 dzień przed inokulacją.
2. Przygotowanie inokulum bakteryjnego
- Smugę Wom z glicerolu na zestalonym podłożu King's B (KB) (20 g tryptonu, 1,5 gK2HPO4 i 15 g glicerolu na 1 l, 1,5% agaru) z 50 μg/ml ryfampicyny i inkubować w temperaturze 28 °C przez 2 dni.
- Zaszczepić pojedynczą kolonię w 5 ml płynnego podłoża KB z 50 μg/ml ryfampicyny i inkubować w temperaturze 28 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min aż do późnej logarytmicznej fazy wzrostu.
- Odwirować kulturę przy 6 000 x g przez 2 minuty, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml sterylnej wody. Powtórz ten krok jeszcze raz.
- Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu do otwierania aparatów szparkowych (25 mM MES-KOH pH 6,15, 10 mM KCl) i zmierzyć OD600.
- Rozcieńczyć zawiesinę do OD600 0,2 buforem otwierającym aparaty szparkowe zawierającym 0,04% silikonowego środka powierzchniowo czynnego.
3. Inokulacja bakterii w sprayu
- Od 1 dnia przed inokulacją do końca doświadczenia należy wystawić rośliny na działanie światła o natężeniu około 10 000 luksów (ok. 170 μmol/m2/s).
- Aby upewnić się, że większość aparatów szparkowych jest otwarta, trzymaj rośliny na tacy przykrytej przezroczystą pokrywką pod światłem przez co najmniej 3 godziny przed zaszczepieniem sprayem.
- Zdejmij pokrywkę i za pomocą aerografu spryskaj stronę liści abaxial 2,5 ml zawiesiny bakteryjnej na trzy rośliny w jednej doniczce.
- Inkubuj zaszczepione rośliny na tacy przykrytej przezroczystą pokrywką, aby utrzymać wilgotność względną około 85%.
- Uzyskać obrazy aparatów szparkowych po 1 i 3 godzinach od inokulacji opryskiem metodą opisaną w punkcie 4.
4. Bezpośrednia obserwacja aparatów szparkowych za pomocą przenośnego urządzenia do obrazowania
UWAGA: Przenośne urządzenie do obrazowania aparatów szparkowych jest wyposażone w lampę LED oraz moduł kamery i może uzyskać od 2 592 × 1 944 (wysokość × szerokość; piksele) obrazy o rozdzielczości około 0,5 μm/piksel.
- Podłącz przenośne urządzenie do obrazowania szparkowego do komputera osobistego (PC) wyposażonego w oprogramowanie do akwizycji obrazu.
- Delikatnie, ale całkowicie usuń kropelki wody z zaszczepionych liści za pomocą kawałka papieru.
- Otwórz górną pokrywę urządzenia, umieść liść na stoliku i zamknij górną pokrywę (Rysunek 1).
- Dostosuj ostrość obrazu, manipulując śrubą regulacyjną, a następnie kliknij przycisk Zapisz obraz na ekranie komputera. Obraz zostanie uzyskany natychmiast. Zazwyczaj zogniskowany obraz zawiera około 10 aparatów szparkowych, które można przeanalizować. Aby uzyskać wiarygodne wyniki, należy uzyskać obrazy aparatów szparkowych z sześciu liści trzech różnych roślin (po dwa liście na roślinę).
5. Ręczny pomiar otworu szparkowego
UWAGA: Oprogramowanie ImageJ można pobrać na https://imagej.nih.gov/ij/download.html
- Otwórz plik obrazu w ImageJ.
- Otwórz menedżera ROI, wybierając opcję Analizuj narzędzia > > Menedżer zwrotu z inwestycji.
- Użyj narzędzia do zaznaczania linii prostej, aby narysować linię odpowiadającą szerokości stomii (Rysunek 2) i zarejestruj zwrot z inwestycji, klikając przycisk Dodaj w Menedżerze ROI.
- Narysuj linię odpowiadającą długości tej samej stomii (Rysunek 2A) i zarejestruj zwrot z inwestycji zgodnie z opisem w kroku 5.3.
- Kliknij opcję Zmierz w Menedżerze zwrotu z inwestycji, aby zmierzyć szerokość i długość.
- Podziel szerokość przez długość, aby uzyskać otwór szparkowy (stosunek). Aby uzyskać solidną ocenę ilościową, użyj 60 lub więcej aparatów szparkowych dla każdego zabiegu i punktu czasowego. Nie wybieraj przedwczesnych lub niejasnych aparatów szparkowych do analizy (Rysunek 2B, C).
6. Automatyczny pomiar apertury aparatów szparkowych
UWAGA: Potok analizy obrazu działa w Google Colaboratory, środowisku wykonywalnym języka programowania Python w chmurze. Warunkiem wstępnym jest posiadanie ważnego konta Google z działającym Dyskiem Google, przeglądarką Google Chrome i stabilnym połączeniem internetowym.
- Pobierz notatnik Google Colaboratory z Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) i otwórz go.
- Utwórz lokalną kopię notatnika na Dysku Google, wybierając pozycję Plik > Zapisz kopię na Dysku. Po wyświetleniu nowej karty bezpiecznie zamknij kartę oryginalnego notesu.
- Naciśnij raz przycisk Wykonaj poniżej sekcji Ustawienia środowiska w notatniku bez rozwijania bloków komórek w celu zaimportowania wymaganych bibliotek.
- Wykonaj sekcję Ustawienia katalogu, aby utworzyć trzy foldery używane do analizy (np. example_result, inference_results i model) na Dysku Google.
UWAGA: W tym przypadku foldery o nazwach example_result, inference_results i model są używane jako katalog nadrzędny, przechowujący odpowiednio wyniki wnioskowania i wytrenowane modele. W tym notesie przedstawiono przykład budowy katalogu jako procedury reprezentatywnej. Aby zmienić nazwę, przepisz ścieżkę pardir, infdir lub modeldir. - Zgodnie z sekcją Przygotowanie obrazów przenieś pozyskane obrazy do example_result, pogrupowane w tytuły obrazów według obróbki lub próbki (np. mock_1h_XXXXXX.jpg) w celu ostatecznego wygenerowania wykresu. Przykładowe obrazy są dostępne w Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528).
- Wykonaj część Pobieranie wytrenowanych modeli, aby pobrać pliki ONNX wytrenowanych modeli z Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) i umieścić je w katalogu modelu.
- Uruchom część Wnioskowanie i pomiar apertury szparkowej, aby określić ilościowo aperturę aparatów szparkowych na podstawie poszczególnych obrazów. Obrazy wynikowe z nałożonym wnioskowaniem i plikiem csv o nazwie example_result.csv zostaną wyeksportowane do katalogu inference_results.
- Wykonaj sekcję Generowanie wykresu, aby utworzyć wykres dotyczący współczynnika apertury aparatów szparkowych, wyeksportowany do katalogu inference_results.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Po inokulacji metodą natryskową Pto, aparaty szparkowe na liściach przymocowanych do inokulowanych roślin były bezpośrednio obserwowane za pomocą przenośnego urządzenia do obrazowania szparek. Wykorzystując pomiary ręczne i zautomatyzowane, na tych samych obrazach liści obliczono szerokość otwarcia szparek, wyznaczając stosunek szerokości do długości około 60 aparatów szparkowych. Pomiary ręczne i zautomatyzowane konsekwentnie wskazały na zmniejszenie szerokości otwarcia szparek w Pto- rośliny inokulowa...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W poprzednich badaniach wykorzystywano skórki naskórka, krążki liściowe lub oderwane liście do zbadania reakcji aparatów szparkowych na inwazje bakteryjne 9,11,12. W przeciwieństwie do tego, metoda zaproponowana w tym badaniu wykorzystuje przenośne urządzenie do obrazowania aparatów szparkowych do bezpośredniej obserwacji aparatów szparkowych na liściu przyczepionym do rośliny po rozpyleniu PTO, naśladując naturalne warunki inwa...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
Dziękujemy wszystkim członkom projektu badawczego 'Współtworzenie cech adaptacyjnych roślin poprzez montaż holobiontu roślinno-mikrobowego', za owocne dyskusje. Prace te były wspierane przez Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (21H05151 i 21H05149 do A.M. i 21H05152 do Y.T.) oraz Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (22K19178 do A. M.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Agar | Nakarai tesque | 01028-85 | |
| Zestawy aerografu | ANEST IWATA | MX2900 | Zestawy akcesoriów do SPRINT JET |
| Biotron | Nippon Medical & Instrumenty chemiczne | LPH-411S | Komora do wzrostu roślin z białym światłem fluorescencyjnym |
| Glicerol | Wako | 072-00626 | |
| Półtaca | Sakata | 72000113 | Zestaw tacki i pokrywki |
| Hyponex | Hyponex | Brak dostępnego numeru katalogowego | Rozcieńczyć roztwór Hyponex w stosunku 1:2000 w wodzie dejonizowanej do podlewania roślin |
| Obraz J | Natinal Institute of Zdrowie | Pobierz w https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Służy do ręcznego pomiaru otworu szparkowego |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KCl | Wako | 163-03545 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | Dla MES-KOH |
| MES | Wako | 343-01621 | Dla MES-KOH |
| Przenośne urządzenie do obrazowania aparatów szparkowych | Zamówienie fitometryczne | w https://www.phytometrics.jp/ | Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018. |
| Ryfampicyna | Wako | 185-01003 | Rozpuszcza się w DMSO |
| Silwet-L77 | Bio medycyna | BMS-SL7755 | silikonowy środek powierzchniowo czynny stosowany w inokulacji opryskowej |
| SPRINT JET | ANEST | IWATA IS-800 | Aerograf używany do inokulacji w sprayu |
| SuperMix A | Nasiona Sakata | 72000083 | Wymieszaj z wermikulitem G20 w równych proporcjach do przygotowania gleby |
| Trypton | Nakarai tesque | 35640-95 | |
| Vermiculite G20 | Nittai | Brak dostępnego numeru katalogowego | Wymieszać z Super Mix A w równych proporcjach do przygotowania gleby |
| Białe światło fluorescencyjne | NEC | FHF32EX-N-HX-S | używane do Biotronu |
Bibliografia
- Shimono, M., Higaki, T., Kaku, H., Shibuya, N., Hasezawa, S., Day, B. Quantitative evaluation of stomatal cytoskeletal patterns during the activation of immune signaling in Arabidopsis thaliana. PLoS One. 11, e0159291(2016).
- Bourdais, G., et al. The use of quantitative imaging to investigate regulators of membrane trafficking in Arabidopsis stomatal closure. Traffic. 20 (2), 168-180 (2019).
- Higaki, T., Kutsuna, N., Hasezawa, S. CARTA-based semi-automatic detection of stomatal regions on an Arabidopsis cotyledon surface. Plant Morphology. 26 (1), 9-12 (2014).
- Eisele, J. F., Fäßler, F., Bürgel, F., Chaban, C. A. A rapid and simple method for microscopy-based stomata analyses. PLoS One. 11, e0164576(2016).
- Chitraker, R., Melotto, M. Assessing stomatal response to live bacterial cells using whole leaf imaging. Journal of Visualized Experiments. 44, 2185(2010).
- Sai, N., et al. StomaAI: an efficient and user-friendly tool for measurement of stomatal pores and density using deep computer vision. New Phytologist. 238 (2), 904-915 (2023).
- Takagi, M., et al. Image-based quantification of Arabidopsis thaliana stomatal aperture from leaf images. Plant and Cell Physiology. pcad018, (2023).
- Melotto, M., Zhang, L., Oblessuc, P. R., He, S. Y. Stomatal defense a decade later. Plant Physiology. 174 (2), 561-571 (2017).
- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126 (5), 969-980 (2006).
- Zeng, W., He, S. A prominent role of the flagellin receptor FLAGELLIN-SENSING2 in mediating stomatal response to Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 in Arabidopsis. Plant Physiology. 153 (3), 1188-1198 (2010).
- Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host and Microbe. 11 (6), 587-596 (2012).
- Raffeiner, M., et al. The Xanthomonas type-III effector XopS stabilizes CaWRKY40a to regulate defense responses and stomatal immunity in pepper (Capsicum annuum). The Plant Cell. 34 (5), 1684-1708 (2022).
- Munemasa, S., Hauser, F., Park, J., Waadt, R., Brandt, B., Schroeder, J. I. Mechanisms of abscisic acid-mediated control of stomatal aperture. Current Opinion in Plant Biology. 28, 154-162 (2015).
- Förster, S., et al. Wounding-induced stomatal closure requires jasmonate-mediated activation of GORK K+ channels by a Ca2+ sensor-kinase CBL1-CIPK5 complex. Developmental Cell. 48 (1), 87-99 (2018).
- Cheng, Y. T., Zhang, L., He, S. Y. Plant-microbe interactions facing environmental challenge. Cell Host and Microbe. 26 (2), 183-192 (2019).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
