Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Uzyskanie wysokiej jakości kriosekcji całego oka królika

3.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66115

⸱

10 listopada 2023

 ,  , 
1Keck School of Medicine, University of Southern California, 2The Vision Center, Department of Surgery, Children’s Hospital Los Angeles, 3The Saban Research Institute, Children’s Hospital Los Angeles, 4USC Roski Eye Institute, Department of Ophthalmology, Keck School of Medicine, University of Southern California, 5Eli and Edythe Broad CIRM Center for Regenerative Medicine and Stem Cell Research, University of Southern California, 6Tina and Rick Caruso Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, University of Southern California

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje niezawodną metodę uzyskiwania wysokiej jakości kriosekcji całych oczu królika. Szczegółowo opisuje procedury sekcji, fiksacji, osadzania i cięcia oczu królika, które można łatwo dostosować do użycia w dowolnym badaniu wykorzystującym immunohistochemię w większych oczach.

Streszczenie

Ten protokół opisuje, jak uzyskać wysokiej jakości kriosekcje siatkówki u większych zwierząt, takich jak króliki. Po enukleacji oko jest na krótko zanurzane w utrwalaczu. Następnie usuwa się rogówkę i tęczówkę, a oko pozostawia się na noc w celu dodatkowego ustabilizowania w temperaturze 4 °C. Po utrwaleniu soczewka jest usuwana. Oko jest następnie umieszczane w kriomold i wypełniane podłożem do zatapiania. Po usunięciu soczewki podłoże osadzające ma lepszy dostęp do ciała szklistego i prowadzi do lepszej stabilności siatkówki. Co ważne, oko powinno być inkubowane w pożywce przez noc, aby umożliwić pełną infiltrację w całym ciele szklistym. Po całonocnej inkubacji oko zamraża się na suchym lodzie i poddaje sekcji. Można uzyskać całe skrawki siatkówki do wykorzystania w immunohistochemii. Standardowe protokoły barwienia mogą być wykorzystane do badania lokalizacji antygenów w tkance siatkówki. Przestrzeganie tego protokołu skutkuje wysokiej jakości kriosekcjami siatkówki, które mogą być stosowane w każdym eksperymencie z wykorzystaniem immunohistochemii.

Wprowadzenie

Siatkówka składa się z kilku warstw wyspecjalizowanych komórek w oku, które razem pracują nad przekształcaniem światła w sygnały neuronowe. Ponieważ siatkówka odgrywa kluczową rolę w widzeniu, zrozumienie jej struktury i funkcji może dostarczyć cennych informacji na temat niektórych z najczęstszych przyczyn utraty wzroku, takich jak między innymi zwyrodnienie plamki żółtej i retinopatia cukrzycowa.

Króliki służą jako wygodny model zwierzęcy w badaniach siatkówki, ponieważ oferują kilka zalet w porównaniu z innymi modelami. Oczy królika są stosunkowo podobne anatomicznie do oczu ludzkich1,2. Na przykład króliki mają obszar o zwiększonej gęstości fotoreceptorów, znany jako pozioma smuga wzrokowa, która jest analogiczna do dołka środkowego u ludzi. Inne powszechnie używane modele zwierzęce, takie jak gryzonie, nie mają odpowiednika anatomicznego. Ponadto, w porównaniu z gryzoniami, unaczynienie siatkówki u królików jest dość podobne do tego u ludzi. Oczy królika są również stosunkowo duże. To sprawia, że są one szczególnie przydatne w badaniach, które obejmują podawanie leków lub interwencję chirurgiczną w obrębie ciała szklistego lub siatkówki, które w przeciwnym razie mogą być trudne lub niemożliwe w przypadku mniejszego oka3.

Immunohistochemia (IHC) jest szeroko stosowaną techniką do badania lokalizacji antygenów w tkance i ma szerokie zastosowanie w badaniach siatkówki4,5,6. Ponieważ siatkówka jest delikatną strukturą, uzyskanie użytecznych wyników za pomocą IHC wymaga starannego przetwarzania tkanek. Odwarstwienie siatkówki i inne artefakty tkankowe, takie jak pęknięcia lub fałdy siatkówki, często występują podczas przetwarzania i mogą zakłócać interpretację wyników. Pomyślne przetwarzanie zależy od wielu czynników, w tym manipulacji tkankami, rodzaju i czasu utrwalania, rodzaju podłoża do zatapiania i technik sekcji7,8,9,10. Pomimo zalet wykorzystania królików jako modelu zwierzęcego w badaniach siatkówki, istnieje bardzo niewiele protokołów opisujących skuteczne przetwarzanie tkankowe siatkówki królika. W artykule opisano wiarygodną metodę uzyskiwania wysokiej jakości wycinków siatkówki z całych oczu królika do zastosowania w IHC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Południowej Kalifornii. Do opracowania tego protokołu wykorzystano czternaście (n = 14) królików z pasami holenderskimi w wieku od 4 do 6 miesięcy. Wykorzystano zarówno samce, jak i samice. Wszystkie zwierzęta ważyły od 2,0 do 2,5 kg. Wszystkie zwierzęta trzymano pojedynczo. Lista zalecanych materiałów i wyposażenia znajduje się w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie

  1. Preparat utrwalający.
    1. Przygotować 4% paraformaldehydu (PFA) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Wymagane jest co najmniej 50 ml utrwalacza na oko.
  2. Przygotowanie środka krioprotekcyjnego.
    1. Przygotować 30% wagowo (w/v) sacharozy w PBS. Umieścić na shakerze na co najmniej 15 minut, aby upewnić się, że sacharoza jest całkowicie rozpuszczona. Wymagane jest co najmniej 50 ml środka krioprotekcyjnego na oko.
  3. Przygotowanie narzędzia do preparacji.
    1. Zbierz dwie pary kleszczy, jedną parę zakrzywionych nożyczek, jedno ostrze skalpela i naczynie do preparacji 100 mm i umieść je w pobliżu mikroskopu preparacyjnego. Przykładowa konfiguracja jest pokazana w Rysunek 1A.

2. Początkowa fiksacja

  1. Po enukleacji przezspojówkowej11, natychmiast umieść oko w co najmniej 50 ml 4% PFA w PBS na lodzie. Upewnij się, że oko jest całkowicie zanurzone. Jeśli pęcherzyki powietrza gromadzą się na zewnętrznej powierzchni oka, usuń je, delikatnie potrząsając.

3. Usuwanie rogówki i tęczówki

  1. Po 15 minutach usunąć oko z 4% PFA w PBS i umieścić je w naczyniu preparacyjnym o średnicy 100 mm pod mikroskopem preparacyjnym. Napełnij naczynie PBS, aby zapobiec wysuszeniu oka.
  2. Usuń rogówkę.
    1. Zacznij od wykonania nacięcia ostrzem chirurgicznym 1 mm przed rąbkiem, równolegle do płaszczyzny tęczówki, aby uniknąć przypadkowego przebicia leżących poniżej struktur (Rysunek 1B).
    2. Włóż zakrzywione nożyczki do początkowego nacięcia i kontynuuj cięcie obwodowe, pozostając 1 mm od rąbka. Użyj kleszczyków, aby ustabilizować oko podczas cięcia (Rysunek 1C).
    3. Po zakończeniu cięcia obwodowego usuń rogówkę kleszczami i delikatnie zetrzyj nadmiar PBS chusteczką laboratoryjną. Umieść rogówkę w 30% roztworze sacharozy w temperaturze pokojowej (RT) w celu krioochrony lub wyrzuć. Krioprotekcja jest zakończona, gdy rogówka opada, co zwykle trwa mniej niż 1 godzinę.
  3. Usuń tęczówkę.
    1. Zacznij od wykonania wstępnego cięcia zakrzywionymi nożyczkami przez tęczówkę. Całkowicie oddziel tęczówkę od reszty tkanki, przecinając obwodowo, podobnie jak w przypadku usuwania rogówki (Rysunek 1D).
    2. Po zakończeniu cięcia obwodowego usuń tęczówkę kleszczami i delikatnie zetrzyj nadmiar PBS chusteczką laboratoryjną. Umieść tęczówkę w 30% roztworze sacharozy w temperaturze pokojowej w celu krioochrony lub wyrzuć jak powyżej. Krioochrona jest zakończona, gdy tęczówka opada, co zwykle zajmuje mniej niż 30 minut.

4. Zakończenie fiksacji

  1. Po usunięciu rogówki i tęczówki umieść oko w co najmniej 50 ml świeżo przygotowanego 4% PFA w PBS i umieść je na shakerze w celu delikatnego poruszenia. Upewnij się, że oko pozostaje zanurzone podczas mieszania.
  2. Utrzymywać oko w 4% PFA w PBS w temperaturze 4 °C przez noc.
    UWAGA: Odkryliśmy, że 4% PFA zapewnia doskonałe barwienie IHC, jeśli jest używane między 16 h a 24 h w temperaturze 4 °C, z dłuższymi czasami utrwalenia, co skutkuje zwiększonym niespecyficznym barwieniem tła i maskowaniem epitopów.

5. Zdejmowanie soczewek

  1. Następnego ranka usuń oko z 4% PFA w PBS i umieść je w naczyniu preparacyjnym o średnicy 100 mm pod mikroskopem preparacyjnym. Napełnij naczynie PBS, aby zapobiec wysuszeniu oka.
  2. Zdejmij obiektyw.
    1. Zacznij od ostrożnego uchwycenia torebki przedniej soczewki kleszczami.
      UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie naciskać ani nie ciągnąć soczewki kleszczami na siłę, ponieważ może to spowodować odwarstwienie siatkówki.
    2. Ostrożnie włóż nożyczki do tylnej komory z ostrzami zakrzywionymi do tyłu wzdłuż soczewki. Wykonaj wstępne cięcie przez zonule soczewek za pomocą zakrzywionych nożyczek.
      UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie naciskać ani nie ciągnąć na siłę zonuli nożyczkami, ponieważ może to spowodować odwarstwienie siatkówki (Rysunek 1E).
    3. Kontynuuj wykonywanie małych nacięć przez zonule soczewek w obwodzie. Wykonaj od trzech do pięciu cięć na godzinę zegarową.
    4. Aby sprawdzić, czy soczewka jest oddzielona od reszty tkanki, delikatnie chwyć przednią torebkę soczewki kleszczami i spróbuj delikatnie ją podnieść. Jeśli soczewka nie podnosi się natychmiast, nie próbuj ciągnąć więcej, ponieważ może to spowodować odwarstwienie siatkówki. Zamiast tego wykonaj więcej cięć przez pozostałe strefy soczewek i spróbuj ponownie.
    5. Po oddzieleniu od reszty tkanki umieść soczewkę w 30% roztworze sacharozy w temperaturze pokojowej w celu krioprotekcji lub wyrzuć jak powyżej. Krioochrona jest zakończona, gdy soczewka opada, co zwykle trwa kilka godzin.
  3. Umieścić oko w co najmniej 50 ml 30% sacharozy w PBS w temperaturze 4 °C w celu krioprotekcji. Krioprotekcja jest zakończona, gdy oko opadnie, co zwykle trwa 24-48 godzin. Aby przyspieszyć krioprotekcję, po 8-12 godzinach należy wymienić początkowy roztwór sacharozy na świeży i/lub trzymać oko w roztworze sacharozy w temperaturze pokojowej.

6. Osadzanie

  1. Po zakończeniu krioprotekcji wyjmij oko z 30% roztworu sacharozy i umieść je w naczyniu separacyjnym o średnicy 100 mm pod mikroskopem preparacyjnym. Ostrożnie obróć oko tak, aby było skierowane w dół, aby usunąć nadmiar roztworu sacharozy z wewnętrznej części oka.
    UWAGA: Nie próbuj usuwać nadmiaru roztworu z wewnętrznej części oka chusteczką laboratoryjną, ponieważ chusteczka może przykleić się do ciała szklistego i spowodować odwarstwienie siatkówki.
  2. Trzymając oko skierowane w dół, delikatnie zetrzyj nadmiar roztworu sacharozy z zewnętrznej części oka za pomocą chusteczki.
  3. Napełnij jednorazową formę do zatapiania związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) na głębokość 0,5-1,0 cm.
    UWAGA: Ta podstawa zapewnia, że oko nie dotknie dna formy, co przeszkadza w późniejszej kriosekcji.
  4. Umieść oko w jednorazowej formie do zatapiania skierowaną do góry. Powoli wypełnij wewnętrzną część oka OCT, zwracając szczególną uwagę, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków w oku. Jeśli utworzą się bąbelki, ostrożnie je usuń lub dociśnij do krawędzi formy za pomocą kleszczy.
  5. Zakończ napełnianie jednorazowej formy do zatapiania za pomocą OCT. Upewnij się, że oko jest całkowicie zanurzone w OCT i nie dotyka wewnętrznych powierzchni formy ani nie jest wystawione na działanie powietrza. Owiń jednorazową formę do zatapiania zawierającą oko w OCT w parafilm; umieścić w temperaturze 4 °C na noc.
    UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że krótsze okresy inkubacji nie pozwalają na całkowitą infiltrację OCT do ciała szklistego. W rezultacie warstwa sacharozy często pozostaje między siatkówką a OCT. Kiedy tak się dzieje, siatkówka często odrywa się lub całkowicie odrywa od reszty tkanki podczas kriosekcji, ponieważ zamrożona sacharoza prawdopodobnie zapewnia mniejsze wsparcie strukturalne niż zamrożony OCT, co utrudnia lub nawet uniemożliwia uzyskanie wysokiej jakości skrawków.
  6. Następnego ranka umieść formę do osadzania zawierającą oko w OCT w naczyniu preparacyjnym o średnicy 100 mm pod mikroskopem preparacyjnym. Upewnij się, że tylna błona szklista wydaje się być uniesiona do góry od wewnętrznej siatkówki.
    UWAGA: To uniesienie do góry może zasłaniać widok siatkówki, utrudniając określenie orientacji.
  7. Aby lepiej określić orientację oka, ostrożnie chwyć tylną błonę szklistą z przodu i spróbuj odkleić ją kleszczami, aby odsłonić leżącą pod spodem siatkówkę podczas pobytu w OCT.
    UWAGA: Czasami może być widoczny kanał hialoidalny, który przyczepia się do głowy nerwu wzrokowego i może być używany do celów orientacyjnych, ponieważ głowa nerwu wzrokowego znajduje się w górnej części siatkówki (Rysunek 2A). Nie jest konieczne całkowite usunięcie tylnej błony szklistej, ponieważ OCT już naciekł ciało szkliste, aby wyściełać wewnętrzną siatkówkę, a pozostała błona nie wpłynie na kriosekcję (Rysunek 2B). Tylną błonę szklistą należy usunąć tylko w celu orientacji, jeśli to konieczne. Inne opcje określania orientacji obejmują założenie szwu lub innego rodzaju znaku przed enukleacją.
  8. Przenieś oko do nowej formy do zatapiania z nowym OCT wypełnionym na głębokość 0,5-1,0 cm, a następnie wypełnij nowym OCT, jak w krokach 6.3-6,5, aby upewnić się, że końcowe podłoże do zatapiania jest wolne od zanieczyszczeń i/lub innych niedoskonałości, które mogły nagromadzić się w ciągu nocy. Jeśli to możliwe, delikatnie usuń OCT chusteczką również od wewnętrznej strony oka, chociaż nie jest to konieczne.
  9. Oznacz formę w celach orientacyjnych ( Rysunek 2C). Zorientowanie oka z okiem skierowanym do góry w formie kriogenicznej zapewnia, że OCT wyścieli wewnętrzną siatkówkę. Kanał szklisty, który przyczepia się do głowy nerwu wzrokowego, jest ważnym punktem orientacyjnym dla określenia górnej części oka (Rysunek 2A).
  10. Umieść oznaczoną formę do zatapiania zawierającą oko w OCT na wierzchu suchego lodu. Upewnij się, że oko nie dotyka żadnej z wewnętrznych powierzchni formy do zatapiania ani nie jest wystawione na działanie powietrza. Upewnij się, że forma bezpośrednio dotyka suchego lodu, aby przyspieszyć proces zamrażania (Rysunek 2D).
  11. Przenieść osadzone oko do zamrażarki o temperaturze -80 °C lub bezpośrednio do kriostatu w celu przekroju (Rysunek 2E).

7. Kriosekcja

  1. Zamontuj blok tak, aby górna część oka była skierowana wyżej, a dolna część oka była skierowana niżej, z pozostałą rogówką i tęczówką skierowaną w prawo (jak w Rysunek 2E) lub w lewo (nie pokazano). Alternatywnie zamontuj blok w innej orientacji, zgodnie z potrzebami. W razie potrzeby rozbij formę, aby zmobilizować blok, ostrożnie odłamując każdą stronę formy pojedynczo i oznaczając blok bezpośrednio, aby nie stracić orientacji oka.
  2. Pozwól, aby blok zrównoważył się do temperatury w kriostacie przez 30-60 minut; -20 °C jest dobrym punktem wyjścia.
  3. Po zamontowaniu umieść świeże ostrze pod żądanym kątem, zwykle równolegle do pionowej osi oka.
  4. Ustaw grubość przekroju zgodnie z potrzebami: Dobrym punktem wyjścia są sekcje o grubości 10-20 μm. Przykład przekroju o grubości 14 μm jest pokazany w Rysunek 3A-C.
    1. W powolny i kontrolowany sposób rozpocznij przecinanie bloku. Upewnij się, że ostrze tnie blok równolegle do pionowej osi oka. Jeśli nie, dostosuj kąt, pod jakim ostrze styka się z blokiem lub odpowiednio orientacją stage.
    2. Podczas krojenia bloku zapobiegaj marszczeniu lub zwijaniu się sekcji za pomocą szczotki. Szybko odwróć sekcję i delikatnie dociśnij ją w dół szczotką z długim włosiem, aby spłaszczyć sekcję i zminimalizować zmarszczki lub zwijanie się. Ułóż osobną szczotkę ze spiczastą końcówką, aby pomóc w manipulacji sekcją.
  5. Przymocuj sekcję do naładowanego szkiełka, powoli przesuwając suwak skierowany w dół w kierunku sekcji. Zapobiegaj składaniu się sekcji lub zniekształcaniu się w inny sposób podczas mocowania, delikatnie przesuwając szklaną prowadnicę po sekcji.
    UWAGA: Nie najeżdżaj suwakiem bezpośrednio na sekcję ani nie dociskaj go do sekcji, ponieważ może to spowodować uszkodzenie lub zniekształcenie sekcji.
  6. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na noc przed przeniesieniem do zamrażarki w temperaturze -80 °C lub bezpośrednim zastosowaniem standardowego protokołu immunofluorescencji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po obróbce tkanki można zastosować standardowy protokół immunofluorescencji w celu zbadania dowolnej liczby procesów biologicznych w siatkówce. Rysunek 3A-C przedstawia reprezentatywne obrazy fluorescencyjne przekroju siatkówki uzyskane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Przekrój siatkówki poddano barwieniu immunocytochemicznemu zgodnie z wcześniej opisanym protokołem12.

Reprezentatywne przekroje siatkówki ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przed wdrożeniem powyższego protokołu stale napotykaliśmy trudności z przetwarzaniem tkanek oczu królika pod kątem IHC. Dostosowaliśmy kilka protokołów z oczu mniejszych zwierząt, takich jak myszy, ale stwierdziliśmy, że prowadzą one do nieodpowiedniego utrwalenia i trudności z sekcją tkanek. Istnieje kilka ważnych czynników, które pozwalają na uzyskanie spójnych, wysokiej jakości odcinków siatkówki królika.

Jedną z kwestii jest duży rozmiar kuli królika w porównaniu z innymi powszechnie używa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Podziękowania dla Rosanny Calderon, Dominica Shaylera i Rosy Sierry za porady techniczne. Badanie to było częściowo wspierane przez nieograniczony grant dla Wydziału Okulistyki USC Keck School of Medicine z Research to Prevent Blindness (AN), NIH K08EY030924 (AN), Las Madrinas Endowment in Experimental Therapeutics for Ophthalmology (AN), Research to Prevent Blindness Career Development Award (AN), Knights Templar Eye Foundation Endowment (AN), oraz Fundacja Pamięci Edwarda N. i Delli L. Thome (AN, KG).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Naczynie hodowlane 100 mmCorning353025Używane do preparacji (kroki 1.3, 3 i 5)
Probówka 50 mlGenesee Scientific28-106Do utrwalania i krioochrony (krok 1)
KriostatLeicaCM1850Do kriosekcji (krok 7)
Zakrzywione nożyczkiFine Science Tools91500-09Używany do preparacji (kroki 1.3, 3 i 5)
DAPIFisher ScientificD3571Rozcieńczony 1:1,000 w buforze blokującym
Mikroskop preparacyjnyZeissStemi 2000-CUżywany do preparacji (kroki 1.3, 3 i 5)
Anty-Koza osła 488Fisher ScientificA-11055Rozcieńczony 1:1,000 w buforze blokującym
Osioł anty-mysz 555Fisher ScientificA-31570Rozcieńczony 1:1,000 w buforze blokującym
KleszczeFine Science Tools91150-20Używane do preparacji (kroki 1.3, 3 i 5)
Szklana osłona prowadnicyVWR48404-453Do kriosekcji (krok 7)
Kozioł anty-SOX2R& D SystemsAF2018Rozcieńczony w stosunku 1:100 w buforze blokującym
Wysokoprofilowe jednorazowe ostrza kriostatuLeica Microsystems Inc.14035838926Do kriosekcji (krok 7)
KimwipeFisher Scientific06-666-ASłuży do usuwania nadmiaru PBS lub OCT (kroki 3 i 6)
Mysz anty-RPE65Novus BioNB100-355SSRozcieńczony w stosunku 1:100 w buforze blokującym
OmniPur SacharozaMillipore167117Stosowany jako krioprotektant (krok 1.2)
Paraformaldehyd 20% roztwórMikroskopia elektronowa Sciences15713Stosowany jako utrwalacz tkanek (rozcieńczony do 4% w kroku 1.1)
Jednorazowa forma do zatapiania Peel-A-Away (głębokość 22x22x20 mm)Polysciences, Inc.18646AUżywany jako forma do zatapiania (krok 6)
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 1xCorning21-030-CVUżywany do przygotowania utrwalacza (krok 1.1) i krioprotektantu (krok 1.2)
Ostrze skalpela nr 15Pióro08-916-5DUżywany do rozwarstwiania (kroki 1.3, 3 i 5)
Szkiełka mikroskopowe Superfrost PlusFisher Scientific12-550-15Do kriosekcji (krok 7)
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura4583Używany jako podłoże do zatapiania (krok 6)

Bibliografia

  1. Peiffer, R. L. Jr, Pohm-Thorsen, L., Corcoran, K. Chapter 19-Models in ophthalmology and vision research. American College of Laboratory Animal Medicine, The Biology of the Laboratory Rabbit. Manning, P. J., Ringler, D. H., Newcomer, C. E. , Academic Press. 409-433 (1994).
  2. Davis, F. A. The anatomy and histology of the eye and orbit of the rabbit. Trans Am Ophthalmol Soc. 27, 400.2-441 (1929).
  3. Zernii, E. Y., et al. Rabbit models of ocular diseases: New relevance for classical approaches. CNS & Neurological Disorders Drug Targets. 15 (3), 267-291 (2016).
  4. Coons, A. H. Labelled antigens and antibodies. Annu Rev Microbiol. 8, 333-352 (1954).
  5. Coons, A. H. Fluorescent antibodies as histochemical tools. Fed Proc. 10 (2), 558-559 (1951).
  6. Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. J Exp Med. 91 (1), 1-13 (1950).
  7. Pang, J., et al. Step-by-step preparation of mouse eye sections for routine histology, immunofluorescence, and RNA in situ hybridization multiplexing. STAR Protoc. 2 (4), 100879(2021).
  8. Sorden, S. D., et al. Spontaneous background and procedure-related microscopic findings and common artifacts in ocular tissues of laboratory animals in ocular studies. Toxicol Pathol. 49 (3), 569-580 (2021).
  9. Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 233 (6), 366-370 (1995).
  10. Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. J Oral Maxillofac Pathol. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).
  11. Mitchell, N. Enucleation in companion animals. Ir Vet J. 61 (2), 108-114 (2008).
  12. Kastan, N. R., et al. Development of an improved inhibitor of Lats kinases to promote regeneration of mammalian organs. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (28), e2206113119(2022).
  13. Baiza-Durán, L., et al. Safety and tolerability evaluation after repeated intravitreal injections of a humanized anti-VEGF-A monoclonal antibody (PRO-169) versus ranibizumab in New Zealand white rabbits. Int J Retina Vitreous. 6, 32(2020).
  14. Yu, D. Y., Cringle, S. J., Su, E., Yu, P. K., Humayun, M. S., Dorin, G. Laser-induced changes in intraretinal oxygen distribution in pigmented rabbits. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 988-999 (2005).
  15. Faude, F., et al. Facilitation of artificial retinal detachment for macular translocation surgery tested in rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (6), 1328-1337 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kriosekcja oka królikakriosekcja siatkówkiimmunohistochemianabłonek pigmentowy siatkówkiutrwalanie tkanekkrioprotekcjazatapianie w OCTmorfologia siatkówkimikroskop sekcyjnypreparatyka tkanki siatkówki
Uzyskanie wysokiej jakości kriosekcji całego oka królika
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.