Artykuł metodologiczny

Pomiar długości ogona Poly A z mózgu i linii komórkowej larwy Drosophila

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66116

⸱

12 stycznia 2024

 , 
1Department of Biology, University of Nevada, Reno

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół opisuje efektywną i niezawodną metodę ilościowego określania długości poli(A) interesującego genu z układu nerwowego Drosophila, który można łatwo dostosować do tkanek lub typów komórek innych gatunków.

Streszczenie

Poliadenylacja to kluczowa modyfikacja potranskrypcyjna, która dodaje ogony poli(A) do końca 3' cząsteczek mRNA. Długość ogona poli(A) jest ściśle regulowana przez procesy komórkowe. Rozregulowanie poliadenylacji mRNA wiąże się z nieprawidłową ekspresją genów i różnymi chorobami, w tym rakiem, zaburzeniami neurologicznymi i nieprawidłowościami rozwojowymi. Dlatego zrozumienie dynamiki poliadenylacji jest niezbędne do rozwikłania złożoności przetwarzania mRNA i potranskrypcyjnej regulacji genów.

Ten artykuł przedstawia metodę pomiaru długości ogona poli(A) w próbkach RNA wyizolowanych z mózgów larw Drosophila i komórek S2 Drosophila Schneider. Zastosowaliśmy podejście ogonowe guanozyny / inozyny (G / I), które polega na enzymatycznym dodawaniu reszt G / I na końcu 3' mRNA przy użyciu drożdżowej polimerazy poli(A). Ta modyfikacja chroni koniec 3' RNA przed degradacją enzymatyczną. Chronione ogony poli(A) na całej długości są następnie odwrotnie transkrybowane przy użyciu uniwersalnego startera antysensownego. Następnie amplifikację PCR przeprowadza się przy użyciu specyficznego dla genu oligo, który jest ukierunkowany na gen będący przedmiotem zainteresowania, wraz z uniwersalnym oligo sekwencji używanym do odwrotnej transkrypcji.

To generuje produkty PCR obejmujące ogony poli(A) interesującego genu. Ponieważ poliadenylacja nie jest jednolitą modyfikacją i powoduje powstawanie ogonków o różnej długości, produkty PCR mają różne rozmiary, co prowadzi do powstania rozmazu na żelu agarozowym. Na koniec produkty PCR są poddawane elektroforezie kapilarnej w żelu kapilarnym o wysokiej rozdzielczości, a następnie oznaczaniu ilościowemu przy użyciu rozmiarów produktów poli(A) PCR i produktu PCR specyficznego dla genu. Technika ta oferuje proste i niezawodne narzędzie do analizy długości ogona poli(A), umożliwiając nam uzyskanie głębszego wglądu w skomplikowane mechanizmy rządzące regulacją mRNA.

Wprowadzenie

Większość eukariotycznych mRNA jest potranskrypcyjnie poliadenylowana na swoim 3′ końcu w jądrze przez dodanie nieszablonowych adenozyn przez kanoniczne polimerazy poli(A). Nienaruszony ogon poli(A) ma kluczowe znaczenie w całym cyklu życia mRNA, ponieważ jest niezbędny dla eksportu jądrowego mRNA 1, ułatwia interakcję z białkami wiążącymi poli(A) w celu zwiększenia wydajności translacji2 i nadaje odporność na degradację3. W niektórych przypadkach ogon poli(A) może również ulec wydłużeniu w cytoplazmie, co jest ułatwione przez niekanoniczne polimerazy poli(A)4. W cytoplazmie długość ogona poli(A) dynamicznie się zmienia i wpływa na długość życia cząsteczki mRNA. Liczne polimerazy i deadenylazy są znane z modulowania długości ogona5,6,7. Na przykład skrócenie ogonów poli(A) koreluje z represją translacyjną, podczas gdy wydłużenie ogonów poli(A) zwiększa translację8,9.

Coraz więcej badań genomicznych wykazało fundamentalne znaczenie długości ogona poli(A) w różnych aspektach biologii eukariotycznej. Obejmuje to role w rozwoju komórek rozrodczych, wczesnym rozwoju embrionalnym, plastyczności synaptycznej neuronów w uczeniu się i pamięci oraz reakcji zapalnej10. Opracowano wiele metod i testów do pomiaru długości ogona z poli(A). Na przykład test RNazy H/oligo(dT) wykorzystuje RNazę H w obecności lub braku oligo(dT) do badania 11,12. Inne metody badania ogona poli(A) obejmują amplifikację końców 3' metodą PCR, taką jak szybka amplifikacja końców cDNA test poli(A) (RACE-PAT)12,13 oraz test poli(A) za pośrednictwem ligazy (LM-PAT)14. Dalsze modyfikacje testu PAT obejmują ePAT15 i sPAT16. Enzymatyczne G-tailing17,18 lub G/I-tailing końca 3' to inne warianty testu PAT. Dalsza modyfikacja tych technik obejmuje zastosowanie znakowanych fluorescencyjnie starterów wraz z kapilarną elektroforezą żelową do analizy w wysokiej rozdzielczości, określanej jako test poli(A) o wysokiej rozdzielczości (Hire-PAT)19. Te testy oparte na PCR umożliwiają szybkie i bardzo czułe oznaczanie ilościowe długości poli(A).

Wraz z rozwojem sekwencjonowania nowej generacji, metoda sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, taka jak PAL-seq20 i TAIL-seq21, umożliwia analizy poliadenylacji w skali całego transkryptomu. Jednak metody te zapewniają tylko krótkie odczyty sekwencjonowania 36-51 nukleotydów. Dlatego FLAM-Seq22 został opracowany do globalnego profilowania długości ogona mRNA o pełnej długości i zapewnia długie odczyty. Technologia nanoporów23 zapewnia niezależne od PCR, bezpośrednie sekwencjonowanie RNA lub bezpośrednie sekwencjonowanie cDNA w celu oszacowania długości ogona poli(A). Jednak te metody o wysokiej przepustowości nie są pozbawione ograniczeń. Wymagają dużych ilości materiałów wyjściowych, są drogie i czasochłonne. Co więcej, analiza rzadkich transkryptów może być niezwykle trudna w przypadku metod o wysokiej przepustowości, a metody oparte na PCR o niskiej przepustowości nadal zapewniają przewagę, gdy trzeba przeanalizować niewielką liczbę transkryptów, w przypadku eksperymentów pilotażowych i walidacji innych metod.

Niedawno wykazaliśmy, że mRNA Dscam1 zawierają krótkie ogony poli(A) u Drosophila, co wymaga niekanonicznego wiązania cytoplazmatycznego białka poli(A) na Dscam1 3'UTR przy użyciu metody ogonowania G/I24. Tutaj zapewniamy uproszczoną procedurę przygotowania tkanek i ilościowego określania długości poli(A) mRNA z układu nerwowego Drosophila i komórek S2 Drosophila.

Protokół

1. Hodowla i selekcja Drosophila larw

  1. Utrzymywać/hodować szczep muszek (w1118, wildtype) na standardowej pożywce dla muszek w temperaturze 25 ˚C w inkubatorze z nawilżaczem.
  2. Wybrać 10 wędrujących larw w 3rd stadium rozwoju 72 h po złożeniu jaj.
  3. Umieścić larwy w pustej szalce Petri o średnicy 35 mm i delikatnie je wypłukać, przenosząc larwy pęsetą do nowej szalki zawierającej wodę z kranu. Powtórzyć tę czynność 2x, aby usunąć resztki pożywki.

2. Izolacja mózgu z larw Drosophila (Rysunek 1)

Schemat procesu sekcji ośrodkowego układu nerwowego (OUN) larw Drosophila, kolejne kroki z użyciem szpilek, pipety, pęsety i nożyczek.
Rysunek 1Sekcjaของ Muszka owocówka mózg larwalny z 3.rd stadium wędrowne stadium larwalnego. (A) Rysunki schematyczne Muszka owocówka larwa. (B-G) Disekcja larwy. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Umieść 10 larw na szalku do preparatów zawierającym lodowaty PBS.
  2. Ułóż larwę grzbietem do góry (rozpoznawalnym po cewkach trachealnych biegnących wzdłuż ciała), przypnij każdy koniec do dna szalka, a następnie wykonaj niewielkie nacięcie ściany ciała na końcu tylnym.
  3. Przetnij ścianę ciała wzdłuż linii środkowej grzbietu w kierunku końca przedniego, używając nożyczek do mikrodysekcji.
  4. Krótko przepłucz wnętrze larwy, używając pipety Pasteura, 3x PBS znajdującym się w szalku, aby odsłonić mózg.
  5. Zlokalizuj i podnieś mózg za pomocą pęsety, a następnie ostrożnie wyizoluj go za pomocą nożyczek do mikrodysekcji.
  6. Przenieś wypreparowane mózgi do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL wypełnionej lodowatym PBS i umieść na lodzie; zbierz mózgi ze wszystkich larw. Przejdź do ekstrakcji RNA, korzystając z zestawu do mikro-preparatyki RNA, zgodnie z opisem w sekcji 4.
    UWAGA: Przeprowadź dysekcję 10 larw w ciągu 15 min, aby zapobiec uszkodzeniu tkanek i degradacji RNA.

3. Drosophila komórki S2 Schneidera

  1. Hodować komórki S2 Drosophila w medium Schneidera dla Drosophila z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w temperaturze 25 °C w inkubatorze z nawilżaczem, aż do osiągnięcia gęstości od 8 × 106 do 10 × 106 komórek/mL przy żywotności minimum 90%.
  2. W sterylnej probówce stożkowej o pojemności 50 mL rozcieńczyć komórki do stężenia 2,5 × 106 komórek/mL przy użyciu podgrzanego wcześniej do 25 °C medium Schneidera dla Drosophila z dodatkiem 10% FBS.
  3. Przenieść 8 mL zawiesiny komórkowej (20 × 106 komórek) do płytki hodowlanej o średnicy 100 mm i dodać 4 mL medium, aby uzyskać objętość 12 mL (dzień 1).
  4. Inkubować hodowlę komórkową w temperaturze 25 °C w inkubatorze z nawilżaczem.
    UWAGA: Komórki słabo przylegają do płytki po 12–16 h (dzień 2).
  5. Przeprowadzić transfekcję komórek odpowiednimi plazmidami DNA24.
  6. Inkubować przez 48 h w inkubatorze z nawilżaczem.
  7. Po inkubacji zebrać komórki, dodając 5 mL schłodzonego w lodzie PBS i delikatnie pipetując (dzień 4).
  8. Przenieść komórki do probówki o pojemności 15 mL.
  9. Z pelletować komórki poprzez wirowanie przy 1 000 × g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
  10. Przepłukać komórki 2x schłodzonym w lodzie PBS za pomocą delikatnego pipetowania i zebrać komórki poprzez wirowanie przy 1 000 × g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
  11. Przeprowadzić ekstrakcję RNA przy użyciu zestawu do minipreparatyki RNA.
    UWAGA: Następujące kroki należy wykonywać w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza.

4. Ekstrakcja całkowitego RNA z Drosophila mózgów larw i komórek S2

  1. Mózg larwy: Usuń PBS poprzez krótkie wirowanie (8 s przy 5,000 × g).
  2. Dodaj 600 µL buforu do lizy RNA i homogenizuj 10 razy plastikowym tłuczkiem. Sprawdź wizualnie próbkę pod mikroskopem stereo, aby upewnić się, że Liza przebiegła całkowicie.
  3. Wiruj przy 1,000 × g przez 5 min w temperaturze 4 °C, aby usunąć szczątki tkankowe. Przenieś klarowny supernatant do probówki do mikrocentryfugi wolnej od nukleaz.
  4. Wyizoluj RNA przy użyciu zestawu do mikroizolacji RNA zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Stosowanie zestawu do mikroizolacji RNA jest niezbędne w przypadku próbek z mózgów larw ze względu na niewielką ilość RNA obecną w próbkach.
  5. Komórki S2: Usuń PBS i wyizoluj RNA zgodnie z instrukcjami producenta.
  6. Zmierz wydajność i jakość RNA za pomocą spektrofotometrii i elektroforezy w żelu agarozowym.
    1. Określ czystość i ilość wyekstrahowanego RNA, mierząc gęstość optyczną wyekstrahowanego RNA odpowiednio przy A260 nm i A280 nm. Upewnij się, że stosunek A260 nm/A280 nm wynosi ≥2.0, a stężenie RNA jest >350 ng/µL dla dalszych zastosowań.
      UWAGA: Typowa wydajność RNA z mózgów 10 larw Drosophila wynosi ~500-800 ng/µL lub 2,5-4 µg w 5 µL. Dla komórek S2 wydajność wynosi ~2-3 µg/µL (15-30 µg w 15 µL). Wyizolowane RNA można przechowywać w temperaturze -80 °C w celu długoterminowego przechowywania.

5. Przygotowanie żelu RNA i elektroforeza

  1. 1,5% denaturujący żel do RNA (100 ml)
    UWAGA: Formaldehyd jest toksyczny w przypadku kontaktu ze skórą oraz wdychania oparów; należy go używać w dygestorium chemicznym.
    1. Rozpuścić trzy tabletki agarozy (1,5 g) w 82 ml buforu MOPS (Plik uzupełniający 1), aż tabletki całkowicie rozpadną się, tworząc drobne cząstki.
    2. Podgrzewaj zawiesinę agarozy w kuchence mikrofalowej do momentu, aż roztwór stanie się przejrzysty, a wszystkie cząstki całkowicie się rozpuszczą.
    3. Schłodzić roztwór do ~60 °C.
    4. Dodać 18 ml 37% formaldehydu, a następnie wymieszać, delikatnie zakręcając naczyniem. Przełożyć roztwór do formy odlewniczej i pozostawić do stężenia w dygestorium.
  2. Przygotowanie próbek RNA i elektroforeza
    1. Rozcień próbkę RNA do stężenia 200 ng (w 5 µL) i dodać 5 µL barwnika do ładowania RNA o stężeniu 2x.
    2. Podgrzewać próbki w temperaturze 70 ˚C przez 5 min w suchym termostacie.
    3. Załaduj 2 µL drabinki RNA w pierwszej ścieżce i 10 µL próbkami w sąsiednich ścieżkach.
    4. Przeprowadź elektroforezę w buforze MOPS przy napięciu 100 V przez 60 min dla żelu o wymiarach 5 x 6 cm.
      UWAGA: Dostosuj warunki elektroforezy w zależności od wielkości amplikonów.
    5. Wizualizuj żel na transiluminatorze UV.
      UWAGA: Obecność pojedynczego prążka o wielkości ok. 600 nukleotydów świadczy o nienaruszonej preparacji RNA (patrz Rycina 2A).

6. Pomiar długości ogona poli(A)

Schemat procesu dodawania ogona poli(A) z wykorzystaniem kapilarną elektroforezą żelową do analizy cDNA.
Rycina 2: Przygotowanie próbek RNA i test ogona poli(A). (A) Zdjęcia żelu RNA przedstawiają całkowite RNA z mózgu larwy Drosophila (lewo) oraz komórek S2 (prawo) na 1,5% żelu agarozowym z formaldehydem. Wielkości markerów jednoniciowego RNA są podane w nukleotydach w ścieżce M. Zwróć uwagę na główny prążek RNA przy ~600 nt, który pochodzi z rRNA. (B) Schematy testu ogona poli(A). Skrót: G/I = guanozyna/inozyna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Dodawanie ogonów GI (Rysunek 2B)
    1. Trzymając odczynniki w lodzie, przygotować następującą mieszaninę (20 µL): do 14 µL próbki całkowitego RNA (1 µg), 4 µL 5x Tail buffer mix oraz 2 µL 10x Tail enzyme mix.
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 min w termocyklerze.
    3. Dodać 1,5 µL roztworu stopującego reakcję dodawania ogonów (tail stop solution); trzymać w lodzie przez 2 min.
      UWAGA: Przejść do transkrypcji odwrotnej lub przechowywać próbki RNA z dodanymi ogonami GI w temperaturze -80 °C do czasu rozpoczęcia transkrypcji odwrotnej.
  2. Transkrypcja odwrotna i amplifikacja PCR
    1. Zsyntetyzować cDNA, przygotowując mieszaninę i inkubując ją w warunkach opisanych w Pliku uzupełniającym 1.
    2. Rozcieńczyć próbki cDNA i przeprowadzić reakcję PCR w celu amplifikacji DNA zgodnie z instrukcjami w Pliku uzupełniającym 1.

7. Analiza produktów PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym

  1. W celu kontroli jakości poddaj małą objętość (2-5 µL) produktów PCR z kroku 6.2.2 elektroforezie na żelu agarozowym o stężeniu 2,5% przy napięciu 100 V przez 45 min.
  2. Zweryfikuj specyficzność PCR dla reakcji genowo- i ogonowo-specyficznych poprzez sekwencjonowanie prążków PCR wyciętych z żelu.

8. Elektroforeza kapilarna

  1. Przeprowadź wysokorozdzielczą elektroforezę żelową 1 µL produktów PCR (0,5-5 ng/µL) z PCR specyficznego dla genów oraz specyficznego dla poly(A), wykorzystując analizator bioanalyzer z zestawem wysokoczułym do analizy DNA. Zwróć uwagę na dobrze rozdzielone piki, które świadczą o prawidłowym przebiegu analizy.

9. Analiza danych: pomiar długości ogona poly(A) (Rysunek 3)

Schemat analizy elektroforegramu; analiza piku i rozmycia; proces eksportu danych; narzędzia do danych laboratoryjnych.
Rysunek 3: Pomiar długości ogona Poly(A) i wartości piku. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Dostęp do danych
    1. Aby uzyskać dostęp do danych, otwórz plik xad w oprogramowaniu.
    2. W panelu widoku drzewa wybierz nazwę próbki lub marker (ladder).
      UWAGA: Spowoduje to wyświetlenie wyników w formie elektroferogramów lub obrazów przypominających żel dla wybranych próbek. Dolny marker 35 par zasad (bp) i górny marker 10 380 bp są standardami wewnętrznymi używanymi do dopasowania danych markera (50-7 000 bp) do danych z dołków z próbkami.
    3. Przybliżaj i oddalaj widok elektroferogramów oraz obrazów przypominających żel, aby wyświetlić szczegóły.
  2. Wykonanie analizy piku i smużenia
    1. Aby uzyskać wielkości pików, otwórz elektroferogram wybranej próbki.
    2. Kliknij prawym przyciskiem myszy na elektroferogramie i wybierz manual integration, aby ręcznie zaznaczyć piki poprzez przeciąganie linii poziomej.
    3. Odczytaj wartości pików w tabeli Peak table. Zidentyfikuj pik o największej wysokości (Peak Height). Jest to pik odpowiadający długości ogona poli(A) dla poszczególnej próbki. W przedstawionym przykładzie wynosi ona 346 bp.
    4. W menu górnym aktywuj ikonę Show/Hide Setpoints i poczekaj, aż po prawej stronie pojawi się nowy panel.
    5. Wybierz Advanced, przewiń w dół do opcji Perform Smear Analysis i zaznacz pole wyboru. Spowoduje to dodanie tabeli Region table do karty elektroferogramu.
    6. Wybierz elektroferogram próbki i przejdź do tabeli Region table, która zawiera menu From [bp] oraz To [bp]. Aby ustawić początkowe i końcowe wartości [bp], kliknij prawym przyciskiem myszy na elektroferogramie, wybierz Region, a następnie Add Region.
    7. Kliknij prawym przyciskiem myszy w dowolnej komórce tabeli Region table i wybierz Modify Regions, aby otworzyć małe okno, w którym można ustawić niestandardowe regiony.
      UWAGA: Na przykład w przypadku GAPDH zastosowano region od 300 bp do 550 bp. PCR specyficzny dla genu GAPDH dał pik przy 265 bp. Starter uniwersalny (Tabela 1) wydłuża produkt PCR poli(A) o 35 bp poprzez hybrydyzację z RNA z ogonem G/I. Zatem pierwszy nukleotyd adeniny w RNA GAPDH zaczyna się od 300 bp (265 + 35). Arbitralnie ograniczyliśmy maksymalną długość ogona poli(A) do 250 (300 + 250 = 550). Na podstawie tabeli regionów program wyliczył średnią wielkość w obrębie regionu jako 387 bp.
    8. Użyj równania (1), aby obliczyć długość ogona poli(A) w badanym mRNA:
      Długość ogona poli(A) = (A - B - 35) (1)
      Gdzie A to średnia liczba bp produktu PCR specyficznego dla poli(A) z elektroferogramu (np. 387 bp dla GAPDH), B to liczba bp piku produktu PCR specyficznego dla genu z elektroferogramu (np. 265 bp dla GAPDH), a „35” to długość tagu uniwersalnego startera odwrotnego.
      UWAGA: Z powyższego obliczenia wynika, że średnia długość ogona poli(A) dla GAPDH wynosi 387 - 265 - 35 = 87 bp.

10. Wizualizacja rozkładu długości ogona poli(A)

  1. Wyeksportuj dane do pliku csv, wybierając File | Export | Sample Data, aby pobrać dane próbki.
    UWAGA: Wyeksportowany plik csv wyświetla czas przebiegu (run time) zamiast bp na osi X.
  2. Przejdź do elektroferogramu próbki i zaznacz opcję Show Sizes w zakładce Electropherogram, aby automatycznie przekonwertować tabelę obszarów w Region Table z bp na czas przebiegu (run time). W przykładzie wartości od 70,39 s do 86,28 s odpowiadają przedziałowi od 300 bp do 550 bp.
  3. Otwórz plik csv i zaznacz wartości czasu przebiegu od 70,39 s do 86,28 s, aby wygenerować wykres. Aby zwizualizować wartości bp na osi X wykresu, wyeksportuj elektroferogram z rozmiarami bp jako plik obrazu i nałóż go na wykres wygenerowany w arkuszu kalkulacyjnym. Pozwoli to na właściwe dopasowanie rozmiarów bp do rozkładu ogonów poli(A).

Wyniki

W niniejszej pracy przeanalizowano długość ogona poli(A) Dscam1 oraz GAPDH w mózgach larw Drosophila (Rysunek 4). W celu kontroli jakości wyizolowane RNA zwizualizowano na żelu agarozowym. Pojedynczy prążek RNA o wielkości około 600 nukleotydów wskazuje na nienaruszoną preparację RNA (Rysunek 2A). RNA poddano procedurze G/I tailing oraz wysokorozdzielczej elektroforezie kapilarnej z użyciem bioanalizatora Agilent 2100. Obrazy żeli wyeksportowano za pomocą oprogramowania Agilent 2100 Expert Software i odpowiednio zestawiono. Produkty PCR uzyskane przy użyciu par starterów specyficznych dla genów GAPDH oraz Dscam1 wykazały wyraźny pojedynczy prążek, podczas gdy produkty z par starterów specyficznych/uniwersalnych wykazały wyraźne wzorce rozmycia (smear) (Rysunek 4A oraz Tabela 1), co wskazuje na różną długość ogonów poli(A) dla mRNA GAPDH i Dscam1. Na Rysunku 4B zastosowano analizę rozmycia w celu wyznaczenia średniej długości ogona poli(A) dla GAPDH i Dscam1. Elektroferogramy zostały wyeksportowane i zmodyfikowane, aby przedstawić długości ogonów poli(A) (Rysunek 4C).

Podobnie przeprowadzono analizę długości ogona poli(A) w komórkach S2 (Rysunek 5). Aby określić rolę 3'UTR Dscam1 w skracaniu ogonów poli(A), komórki S2 transfekowano plazmidami DNA zawierającymi region kodujący Dscam1 z 3'UTR SV40 lub 3'UTR Dscam1. Minimalny 3'UTR SV40 wybrano jako kontrolę dla 3'UTR Dscam1, ponieważ 3'UTR SV40 jest powszechnie stosowany jako minimalny sygnał terminacji transkrypcji i poliadenylacji w rekombinowanych plazmidach DNA. Całkowity RNA wyekstrahowano i poddano analizie RT-PCR, ogonowaniu G/I oraz wysokorozdzielczej elektroforezie kapilarnej (Rysunek 5). Wynik pokazuje, że rozkład długości ogona poli(A) z plazmidu z 3'UTR SV40 wykazywał wzorzec podobny do endogennego GAPDH, podczas gdy rozkład długości ogona poli(A) z plazmidu z 3'UTR Dscam1 wykazywał wzorzec podobny do endogennego mRNA Dscam1 z mózgów larwalnych.

Analiza żelu elektroforetycznego, GAPDH vs Dscam1, długość poly(A); wykres słupkowy i wykres fluorescencji.
Rycina 4: Pomiar długości ogona poly(A) dla GAPDH i Dscam1 z mózgów larwalnych. (A) Kapilarna elektroforeza żelowa rozdziela specyficzny dla genu produkt PCR w postaci pojedynczego prążka (pierwsza i druga ścieżka) dla GAPDH2 i Dscam1. Produkt PCR z zastosowaniem uniwersalnego primera odwrotnego wykazuje rozkład smugowy (trzecia i czwarta ścieżka). * prążek niespecyficzny. (B) Średnie długości ogonów poly(A) obliczono na podstawie analizy smug. (C) Rozkład długości ogona poly(A) zrekonstruowano z wyeksportowanego pliku csv. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wynik elektroforezy analizujący długość ogona Poly(A); wykresy słupkowe i liniowe przedstawiają intensywność fluorescencji.
Rysunek 5: Pomiar długości ogona Poly(A) transfekowanego plazmidu DNA Dscam1. Hodowane komórki Drosophila S2 poddano kotransfekcji konstruktami Dscam1 zawierającymi region kodujący Dscam1 oraz 3′UTR Dscam1 lub SV40. (A) Przedstawiono obrazy z kapilarnej elektroforezy żelowej dla swoistego dla genu produktu PCR jako pojedynczego prążka (pierwszy i drugi tor) dla SV40 (Dscam1-SV40 3'UTR) oraz Dscam1 (Dscam1-Dscam1 3'UTR). Produkt PCR z zastosowaniem uniwersalnego primera odwrotnego wykazuje obraz smugowy (trzeci i czwarty tor). * prążek nieswoisty. (B) Średnie długości ogonów poly(A) obliczono na podstawie analizy smug. (C) Rozkład długości ogona poly(A) zrekonstruowano z wyeksportowanego pliku csv. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dscam1
Starter forward (5’-3’) CGCAGCCACAACAATTGAATG
Primer odwrotny (5’-3’) AAATAAAATCAAAATCATATATTTAGCAACTTATGAAC
SV40
Starter bezpośredni (5’-3’) CCACAAAGGAAAAAGCTGCAC
Starter odwrotny (5’-3’) TTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTG
GAPDH
Starter bezpośredni (5’-3’) CACTTCAGAAACGGCCTGAAAATGGC
Starter odwrotny (5’-3’) AATATTTAAATGCTTATGAGTCGGCATTTTTAAAACTAC
Uniwersalny primer odwrotny
starter odwrotny (5’-3’) GGTAATACGACTCACTATAGCGAGACCCCCCCCCCTT

Tabela 1: Primery użyte w niniejszym protokole.

Plik uzupełniający 1: Skład roztworów i konfiguracja PCR. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W tym protokole opisujemy technikę preparowania mózgu larwy Drosophila z wędrującego stadium3 stadium rozwojowego, a także przygotowanie próbki z komórek Drosophila S2. Ze względu na labilny charakter mRNA, pobieranie próbek wymaga szczególnej ostrożności. W przypadku rozbioru mózgu larw, mózgi nie powinny być uszkodzone podczas izolacji i nie powinny być trzymane w roztworze przez dłuższy czas. Niezbędne jest utrzymanie czasu sekcji na poziomie 8-10 minut dla rundy sekcji. Korzystne może być również uzupełnienie roztworu preparacyjnego o inhibitory RNAazy. Jeśli chodzi o hodowlę i transfekcję komórek S2, wykonaj wszystkie kroki w okapie z przepływem laminarnym.

Etap izolacji RNA wymaga dodatkowego rozważenia. Zalecamy korzystanie z czystej przestrzeni z przepływem laminarnym, która jest wstępnie potraktowana roztworami usuwającymi RNazy. Oprócz wydajności RNA konieczne jest sprawdzenie integralności RNA, aby upewnić się, że próbka nie uległa degradacji podczas etapów sekcji i izolacji. Integralność RNA można uwidocznić poprzez denaturację elektroforezy w żelu agarozowym. Całkowite RNA z Drosophila wykazuje pojedynczy profil prążkowy, ponieważ 28S rRNA jest dysocjalizowane na dwie podjednostki o równej wielkości, co odpowiada 18S rRNA25. Można to postrzegać jako pojedyncze pasmo około 600 nukleotydów przy użyciu jednoniciowej drabinki RNA (Figura 2A).

Izolowane próbki RNA poddaje się ogonowi G/I (ryc. 2B). Reszty guanozyny i inozyny są dodawane na końcu 3′ RNA przez polimerazę poli(A) (PAP)17 drożdży, która zachowuje koniec 3′ RNA przed degradacją enzymatyczną. Nowo zsyntetyzowane RNA o pełnej długości chronione znacznikiem G / I są poddawane odwrotnej transkrypcji w celu uzyskania próbek cDNA przy użyciu uniwersalnego startera odwrotnego (C10T2 znakowanego 3'). Następnie przeprowadza się PCR ze specyficznymi dla genu starterami do przodu/do tyłu tuż przed miejscem poliadenylacji, aby wygenerować produkt PCR, który pokazuje ostre pasmo. Reakcje PCR ze specyficznych dla genu starterów do przodu i uniwersalnych starterów odwrotnych generują nieokreślone długości cząsteczek DNA jako rozmaz na żelu, który odzwierciedla różną długość ogonów poli(A). Produkty PCR były następnie analizowane za pomocą elektroforezy żelu kapilarnego.

Projektując startery, należy pamiętać, że wielkość amplikonu ze specyficznymi dla genu starterami do przodu/do tyłu powinna mieścić się w zakresie 50-300 pz. Testowanie wielu starterów do przodu daje możliwość znalezienia najlepszego startera, który sprawdzi się w ocenie ogona poli(A). Zalecamy zaprojektowanie odwróconego startera dla produktów specyficznych dla genu tuż przed przewidywanym miejscem startu poli(A), ponieważ daje to możliwość prostego obliczenia długości ogona poli(A). Podczas przeprowadzania reakcji PCR ważne jest, aby przeprowadzić "kontrolę bez odwrotnej transkryptazy", aby wykluczyć amplifikację z zanieczyszczonego genomowego DNA. Optymalizacja PCR z gradientem temperatury wyżarzania jest wysoce zalecana. Biorąc pod uwagę charakter tej metodologii, analiza długości ogona poli(A) alternatywnie poliadenylowanych gatunków mRNA wymaga dodatkowych rozważań. Na przykład wiele genów ulega alternatywnej poliadenylacji w celu wytworzenia różnych gatunków 3'UTR26. Zalecamy stosowanie różnych zestawów starterów PCR do badania poszczególnych gatunków 3'UTR.

Zdecydowanie zalecamy włączenie specyficznego dla genu produktu PCR do kapilarnej elektroforezy żelowej w każdym przebiegu, ponieważ istnieje różnica w migracji potencjału kilku nukleotydów w każdym przebiegu. Istotne jest, aby przy obliczaniu długości ogona poli(A) używać rzeczywistej wielkości pary zasad PCR specyficznej dla genu, a nie rozmiarów teoretycznych.

Niektóre RNA ulegają dodatkowym modyfikacjom potranskrypcyjnym, w tym końcowej urydylacji27. Metoda ogonowania G/I może nie być odpowiednia do pomiaru długości ogona poli(A), gdy mRNA jest oddawane moczem. Dzieje się tak, ponieważ uniwersalny starter odwrotny może nie amplifikować skutecznie gatunku mRNA, który ma nukleotydy nieadeninowe na końcu 3'. Ogonowanie G/I jest metodą opartą na PCR, która potencjalnie tworzy niepożądane odchylenie poprzez bardziej efektywne wzmacnianie krótszych fragmentów. Dlatego użytkownicy powinni zachować ostrożność podczas interpretacji wyniku.

Korzystając z przedstawionej tutaj metody, wykazaliśmy, że ogon G / I może być skutecznie wykorzystany do pomiaru długości ogona poli(A) z układu nerwowego Drosophila i komórek S2. Metoda jest wysoce ilościowa w połączeniu z elektroforezą kapilarną. Podczas gdy analizy wysokoprzepustowe zapewniają globalną analizę ogona poli(A), niskoprzepustowa metoda ogonowania G/I oparta na PCR jest nadal bardzo przydatna do analizy pojedynczej transkrypcji, eksperymentów pilotażowych i walidacji innych metod. Podsumowując, wybór metody zależy od konkretnych pytań i celów badawczych. Badacze powinni wybrać metodę, która najlepiej odpowiada ich potrzebom i zasobom eksperymentalnym.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez National Institute of Neurological Disorders and Stroke Grant R01NS116463 dla J.K. oraz Cellular and Molecular Imaging Core facility na University of Nevada, Reno, który był wspierany przez National Institutes of Health Grant P20GM103650 i wykorzystany do badań opisanych w tym badaniu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy (MOPS)Międzynarodowy Produkt Badawczy (RPI)M92020
Zestaw DNA o wysokiej czułości AgilentTechnologies  5067-4626
Oprogramowanie Agilent 2100 ekspert do pobrania za darmo demoAgilent Technologieshttps://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259
Apex 100 bp-Low DNA LadderGenesee Scientific19-109
BioanalizatorAgilent 2100 G2938C
Pirowęglan dietylu (DEPC)MiędzynarodowyInstytut Badań Produktu (RPI) D43060
Barwnik DNA (Gel Loading Dye, Fioletowy (6x)New England biolabs B7024S
Drosophila S2 linia komórkowaDrosophila Genomics Resource Center stock #181
Drosophila Schneider' s MediumThermo Fisher Scientific21720024
Bromek miduGenepatrz naukowy 20-276
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Sigma-AldrichF4135
Kleszcze Dumont 5   Narzędzia Fine Science 11254-20
Woda wolna od nukleazThermo Fisher Scientific AM9932
PBS 10xMiędzynarodowy Produkt Badawczy (RPI) P32200
Zestaw do oznaczania długości ogona Poly(A)Thermo Fisher Scientific 764551KT
RiboRuler Drabinka RNA niskiego zasięguThermo Fisher Scientific SM1833
Barwnik ładujący w żelu RNA (2x)Thermo Fisher Scientific R0641
Zestaw do mikroprzygotowania RNAZymoresearch Czynnik chłodniczy R1050 
Zestaw do minipreparatyki RNAZymoresearch R1055
Nożyczki sprężynowe Nożyczki-Vannas - 2,5 mm Krawędź tnącaNarzędzia do nauk ścisłych 15000-08
TopVision Tabletki agarozoweThermo Fisher ScientificR2802
Tris-Acetate-EDTA (TAE)Thermo Fisher ScientificB49

Bibliografia

  1. Stewart, M. Polyadenylation and nuclear export of mRNAs. Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 2977-2987 (2019).
  2. Machida, K., et al. Dynamic interaction of poly(A)-binding protein with the ribosome. Scientific Reports. 8 (1), 17435(2018).
  3. Eisen, T. J., et al. The dynamics of cytoplasmic mRNA metabolism. Molecular Cell. 77 (4), 786-799 (2020).
  4. Liudkovska, V., Dziembowski, A. Functions and mechanisms of RNA tailing by metazoan terminal nucleotidyltransferases. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 12 (2), e1622(2021).
  5. Goldstrohm, A. C., Wickens, M. Multifunctional deadenylase complexes diversify mRNA control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (4), 337-344 (2008).
  6. Schmidt, M. J., Norbury, C. J. Polyadenylation and beyond: emerging roles for noncanonical poly(A) polymerases. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 1 (1), 142-151 (2010).
  7. Laishram, R. S. Poly(A) polymerase (PAP) diversity in gene expression - Star-PAP vs canonical PAP. FEBS Letters. 588 (14), 2185-2197 (2014).
  8. Salles, F. J., Lieberfarb, M. E., Wreden, C., Gergen, J. P., Strickland, S. Coordinate initiation of Drosophila development by regulated polyadenylation of maternal messenger RNAs. Science. 266 (5193), 1996-1999 (1994).
  9. Wreden, C., Verrotti, A. C., Schisa, J. A., Lieberfarb, M. E., Strickland, S. Nanos and pumilio establish embryonic polarity in Drosophila by promoting posterior deadenylation of hunchback mRNA. Development. 124 (15), 3015-3023 (1997).
  10. Passmore, L. A., Coller, J. Roles of mRNA poly(A) tails in regulation of eukaryotic gene expression. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (2), 93-106 (2021).
  11. Murray, E. L., Schoenberg, D. R. Assays for determining poly(a) tail length and the polarity of mRNA decay in mammalian cells. Methods in Enzymology. 448, 483-504 (2008).
  12. Salles, F. J., Strickland, S. Analysis of poly(a) tail lengths by PCR: The PAT assay. Methods in Molecular Biology. 118, 441-448 (1999).
  13. Salles, F. J., Darrow, A. L., O'Connell, M. L., Strickland, S. Isolation of novel murine maternal mRNAs regulated by cytoplasmic polyadenylation. Genes and Development. 6 (7), 1202-1212 (1992).
  14. Salles, F. J., Strickland, S. Rapid and sensitive analysis of mRNA polyadenylation states by PCR. Genome Research. 4 (6), 317-321 (1995).
  15. Janicke, A., Vancuylenberg, J., Boag, P. R., Traven, A., Beilharz, T. H. ePAT: A simple method to tag adenylated RNA to measure poly(a)-tail length and other 3' RACE applications. RNA. 18 (6), 1289-1295 (2012).
  16. Minasaki, R., Rudel, D., Eckmann, C. R. Increased sensitivity and accuracy of a single-stranded DNA splint-mediated ligation assay (sPAT) reveals poly(a) tail length dynamics of developmentally regulated mRNAs. RNA Biology. 11 (2), 111-123 (2014).
  17. Martin, G., Keller, W. Tailing and 3'-end labeling of RNA with yeast poly(A) polymerase and various nucleotides. RNA. 4 (2), 226-230 (1998).
  18. Kusov, Y. Y., Shatirishvili, G., Dzagurov, G., Verena, G. M. A new G-tailing method for the determination of the poly(a) tail length applied to hepatitis a virus RNA. Nucleic Acids Research. 29 (12), 57(2001).
  19. Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
  20. Subtelny, A. O., Eichhorn, S. W., Chen, G. R., Sive, H., Bartel, D. P. Poly(a)-tail profiling reveals an embryonic switch in translational control. Nature. 508 (1), 66-71 (2014).
  21. Chang, H., Lim, J., Ha, M., Kim, V. N. TAIL-seq: Genome-wide determination of poly(a) tail length and 3' end modifications. Molecular Cell. 53 (6), 1044-1052 (2014).
  22. Legnini, I., Alles, J., Karaiskos, N., Ayoub, S., Rajewsky, N. FLAM-seq: Full-length mRNA sequencing reveals principles of poly(A) tail length control. Nature Methods. 16 (9), 879-886 (2019).
  23. Garalde, D. R., et al. Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores. Nature Methods. 15 (3), 201-206 (2018).
  24. Singh, M., Ye, B., Kim, J. H. Dual leucine zipper kinase regulates Dscam expression through a noncanonical function of the cytoplasmic poly(A)-binding protein. Journal of Neuroscience. 42 (31), 6007-6019 (2022).
  25. Macharia, R. W., Ombura, F. L., Aroko, E. O. Insects' RNA profiling reveals absence of "hidden break" in 28S ribosomal RNA molecule of onion thrips, Thrips tabaci. Journal of Nucleic Acids. 2015, 965294(2015).
  26. Miura, P., Sanfilippo, P., Shenker, S., Lai, E. C. Alternative polyadenylation in the nervous system: to what lengths will 3' UTR extensions take us. Bioessays. 36 (8), 766-777 (2014).
  27. Sement, F. M., et al. et al Uridylation prevents 3' trimming of oligoadenylated mRNAs. Nucleic Acids Research. 41 (14), 7115-7127 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza poliadenylacjim zg Drosophilakom rki Drosophila S2ogonowanie GIregulacja mRNAkapilarna elektroforeza elowaamplifikacja PCRodwrotna transkrypcjaekspresja gen w
Pomiar długości ogona Poly A z mózgu i linii komórkowej larwy Drosophila
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.