Ten artykuł podkreśla skuteczność techniki optycznej elastografii koherentnej (OCE) w szybkim i nieniszczącym charakteryzowaniu elastycznych właściwości biofilmu. Wyjaśniamy krytyczne procedury wdrażania OCE w celu uzyskania dokładnych pomiarów i przedstawiamy wartości modułu Younga dla dwóch ziarnistych biofilmów.
Artykuł metodologiczny
Kwantyfikacja właściwości elastycznych biofilmów środowiskowych za pomocą optycznej elastografii koherentnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Biofilmy to złożone biomateriały składające się z dobrze zorganizowanej sieci komórek mikrobiologicznych zamkniętych w samodzielnie wytworzonych zewnątrzkomórkowych substancjach polimerowych (EPS). W artykule przedstawiono szczegółowe informacje na temat realizacji pomiarów optycznej elastografii koherentnej (OCE) dostosowanych do charakterystyki sprężystości biofilmów. OCE to nieniszcząca technika optyczna, która umożliwia lokalne mapowanie mikrostruktury, morfologii i właściwości lepkosprężystych częściowo przezroczystych materiałów miękkich o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej. Udostępniamy obszerny przewodnik szczegółowo opisujący podstawowe procedury prawidłowego wdrożenia tej techniki, wraz z metodologią szacowania masowego modułu Younga ziarnistych biofilmów na podstawie zebranych pomiarów. Składają się one z konfiguracji systemu, akwizycji danych i przetwarzania końcowego. W dyskusji zagłębimy się w fizykę leżącą u podstaw czujników stosowanych w OCE i zbadamy podstawowe ograniczenia dotyczące skal przestrzennych i czasowych pomiarów OCE. Kończymy z potencjalnymi przyszłymi kierunkami rozwoju techniki OCE w celu ułatwienia pomiarów sprężystych biofilmów środowiskowych.
Wprowadzenie
W oczyszczaniu ścieków i odzyskiwaniu zasobów wodnych, korzystne biofilmy w dołączonych reaktorach wzrostowych są coraz częściej wykorzystywane, aby umożliwić mikrobom przekształcanie niepożądanych zanieczyszczeń, takich jak materia organiczna, azot i fosforany, w stabilizowane formy, które można łatwo usunąć z wody1. W tych systemach emergentna funkcja biofilmu, a mianowicie przemiany biochemiczne, jest ściśle związana z różnorodnością zamieszkujących w nim mikroorganizmów i składnikami odżywczymi, które te drobnoustroje otrzymują2. W związku z tym ciągły wzrost biofilmu może stanowić wyzwanie dla utrzymania stałej funkcjonalności reaktora, ponieważ wzrost nowego biofilmu może zmienić ogólne procesy metaboliczne biofilmu, charakterystykę przenoszenia masy i skład zbiorowiska. Stabilizacja środowiska biofilmu w jak największym stopniu może uchronić przed takimi zmianami3. Obejmuje to zapewnienie stałego przepływu składników odżywczych i utrzymanie stabilnej struktury biofilmu o stałej grubości4. Monitorowanie sztywności i struktury fizycznej biofilmu umożliwiłoby naukowcom uzyskanie wglądu w ogólny stan zdrowia i funkcjonowanie biofilmu.
Biofilmy wykazują właściwości lepkosprężyste5,6,7. Ta lepkosprężysta natura powoduje połączenie chwilowego i powolnego, zależnego od czasu odkształcenia w odpowiedzi na zewnętrzne siły mechaniczne. Jednym z unikalnych aspektów biofilmów jest to, że gdy są poddawane znacznej deformacji, reagują jak lepkie ciecze. I odwrotnie, gdy są poddawane niewielkim odkształceniom, ich reakcja jest porównywalna z ciałem stałym5. Co więcej, w tym obszarze o małych odkształceniach istnieje zakres deformacji, w którym biofilmy wykazują liniową zależność siła-przemieszczenie5,6,7. Deformacje w tym zakresie liniowym są optymalne do oceny właściwości mechanicznych biofilmu, ponieważ dają powtarzalne pomiary. Kilka technik może określić ilościowo odpowiedź elastyczną w tym zakresie. Optyczna elastografia koherentna (OCE) to nowa technika, która jest dostosowywana do analizy biofilmów w tym zakresie liniowym (szczepy rzędu 10-4-10-5)8,9.
Najbardziej znanym zastosowaniem OCE do tej pory jest dziedzina biomedyczna, gdzie technika ta została zastosowana do scharakteryzowania tkanek biologicznych, które wymagają jedynie powierzchownego dostępu optycznego. Na przykład, Li et al. użyli OCE do scharakteryzowania elastycznych właściwości tkanki skórnej10. Inni autorzy scharakteryzowali anizotropowe właściwości elastyczne świńskich i ludzkich tkanek rogówki oraz ich wpływ na ciśnienie wewnątrzgałkowe11,12,13,14,15,16. Niektóre zalety metody OCE do badania biofilmów to to, że jest ona nieniszcząca i zapewnia mezoskalową rozdzielczość przestrzenną, nie wymaga żadnego przygotowania próbki, a sama metoda jest szybka; Zapewnia współrejestrowane pomiary struktury fizycznej i właściwości sprężystych (np. porowatości, chropowatości powierzchni i morfologii)8,9,17,18.
Metoda OCE mierzy lokalne przemieszczenie rozchodzących się fal sprężystych w próbce za pomocą czułej fazowo optycznej tomografii koherentnej (OCT). OCT to interferometr optyczny o niskiej koherencji, który przekształca lokalne zmiany w przemieszczeniu próbki w zmianę intensywności, która jest rejestrowana za pomocą spektrometru optycznego. Technika OCT została również wykorzystana w badaniach nad biofilmem do scharakteryzowania struktury mezoskalowej, rozkładu porowatości w trzech wymiarach i deformacji biofilmu17,19,20,21. Ponadto Picioreanu i in. oszacowali właściwości mechaniczne biofilmu za pomocą odwrotnego modelowania interakcji płyn-struktura obrazów deformacji przekroju poprzecznego OCT22.
Z drugiej strony, pomiary OCE, w połączeniu z odwrotnym modelowaniem fal elastodynamicznych, dają prędkość fal sprężystych w próbce, co umożliwia scharakteryzowanie właściwości sprężystych i lepkosprężystych próbki. Nasza grupa dostosowała technikę OCE do ilościowego pomiaru właściwości elastycznych i lepkosprężystych biofilmu8,9,18 i zweryfikowała technikę pod kątem pomiarów reometrii ścinania w próbkach płytek żelu agarozowego18. Podejście OCE zapewnia precyzyjne i wiarygodne oszacowanie właściwości biofilmu, ponieważ zmierzona prędkość fali sprężystej jest skorelowana z właściwościami sprężystymi próbki. Ponadto przestrzenny zanik amplitudy fali sprężystej może być bezpośrednio skorelowany z właściwościami lepkosprężystymi ze względu na efekty lepkości w materiale. Przedstawiliśmy pomiary OCE właściwości lepkosprężystych biofilmów bakteryjnych z kultur mieszanych hodowanych na kuponach w obrotowym reaktorze pierścieniowym (RAR) oraz biofilmów ziarnistych o złożonej geometrii przy użyciu elastodynamicznych modeli falowych18.
Technika OCE jest również potężną alternatywą dla tradycyjnej reometrii18, która jest używana do charakterystyki lepkosprężystości. Metody reometryczne najlepiej nadają się do próbek o geometrii płaskiej. W związku z tym ziarniste biofilmy, które mają dowolne kształty i morfologie powierzchni, nie mogą być dokładnie scharakteryzowane na reometrze8,23. Ponadto, w przeciwieństwie do OCE, metody reometryczne mogą być trudne do dostosowania do pomiarów w czasie rzeczywistym, na przykład podczas wzrostu biofilmu w komórkach przepływowych24,25.
W tym artykule pokazujemy, że pomiary OCE niezależnej od częstotliwości prędkości fal powierzchniowych mogą być wykorzystane do scharakteryzowania właściwości elastycznych biofilmu bez potrzeby tworzenia skomplikowanych modeli. Osiągnięcie to sprawi, że podejście OCE stanie się bardziej dostępne dla szerszej społeczności zajmującej się badaniem właściwości mechanicznych biofilmu.
Rysunek 1 przedstawia schematyczną ilustrację systemu OCT użytego w tym badaniu. System składa się z kilku instrumentów, w tym komercyjnego systemu OCT czułego na fazę w domenie spektralnej, generatora opóźnień, generatora funkcyjnego i przetwornika piezoelektrycznego. System OCT działa na zasadzie interferometrii poprzez zastosowanie szerokopasmowego źródła światła o środkowej długości fali 930 nm. Zebrane natężenie światła, które jest skorelowane ze skomplikowanymi szczegółami strukturalnymi w próbce, jest analizowane w jednostce postprocessingu, a następnie przekształcane w obraz przekrojowy próbki - powszechnie określany jako obraz OCT. Głębokość obrazowania OCT zależy od nasilenia rozpraszania optycznego w próbce, które wynika z lokalnej zmienności współczynnika załamania światła i jest ograniczone do 1-3 mm w tkankach biologicznych i biofilmach. Ponieważ faza optyczna w próbce i intensywność zakłóceń są modulowane przez ruch, OCT może być używany do wykrywania lokalnego przemieszczenia próbki. Wykorzystujemy czułość przemieszczenia OCT w metodzie OCE do śledzenia pola przemieszczenia w stanie ustalonym fal sprężystych w próbce. W szczególności generator funkcyjny wyprowadza napięcie sinusoidalne do sterowania przetwornikiem piezoelektrycznym. Przetwornik z kolei rozciąga się i kurczy z oscylacyjną historią czasową. Oscylacyjne przemieszczenie przetwornika nadaje sinusoidalną siłę na powierzchni próbki przez wydrukowaną w 3D końcówkę klinową na wierzchołku przetwornika, co prowadzi do generowania harmonicznych fal sprężystych w próbce. Końcówka klina lekko styka się z próbką, tak że próbka pozostaje nienaruszona po wycofaniu siłownika z powierzchni próbki. Aby zarejestrować lokalne przemieszczenie w próbce, dla każdego piksela w próbce rejestrowane są sąsiednie skany głębokości oddzielone stałym opóźnieniem czasowym. Optyczna różnica fazowa między kolejnymi skanami w każdym punkcie piksela jest proporcjonalna do lokalnego przemieszczenia pionowego w tym samym punkcie. Synchronizacja między przemieszczeniem przetwornika a optyką skanującą w systemie OCT odbywa się poprzez impuls wyzwalający, który pochodzi z generatora funkcyjnego i jest opóźniony w generatorze opóźniającym. Ten etap synchronizacji ułatwia uzyskanie spójnych obrazów przekroju poprzecznego lokalnego rozkładu faz optycznych w próbce. Obrazy te są wprost proporcjonalne do lokalnego pionowego przemieszczenia harmonicznego w próbce i są znane jako obraz OCE. Obrazy OCE są pozyskiwane przy różnych częstotliwościach uruchamiania przetwornika w celu uzyskania elastycznej długości fali i prędkości fali w funkcji częstotliwości. Zmierzone prędkości fal są analizowane za pomocą modelu elastodynamicznego w celu określenia właściwości sprężystych próbki.
Protokół
1. Ustawienia systemu
- Zbierz elementy systemu, które obejmują komercyjny system OCT (jednostka bazowa, podstawa, głowica obrazująca i komputer), generator przebiegów, przetwornik, generator opóźnień/impulsów, przełącznik ze złączami BNC, i adaptery BNC, słupki optyczne i zaciski.
- Podłącz sygnał synchronizacji z generatora funkcyjnego do przełącznika. Podłącz drugi port przełącznika do generatora opóźnienia.
- Podłączyć wyjście generatora funkcyjnego do przewodów przetwornika.
- Podłącz wyjścia generatora opóźnienia do kanału wyzwalającego z tyłu jednostki bazowej OCT. Sygnałem wyjściowym z generatora opóźniającego jest impuls wyzwalający inicjujący ruch optyki skanującej w systemie OCT.
- Włącz komponenty systemu (jednostkę bazową OCT, komputer, generator funkcyjny i generator opóźnienia) i uruchom oprogramowanie OCT.
- Skonfiguruj generator opóźnienia, aby wysyłał logiczny sygnał wyzwalający tranzystor-tranzystor do jednostki bazowej OCT. Zapoznaj się z instrukcją systemu OCT, aby zapoznać się z wymaganiami dotyczącymi sygnału wyzwalającego.
- Umieść przetwornik pod soczewką OCT. Przetwornik ma wydrukowaną w 3D końcówkę klinową przyklejoną do jednego z jego końców, która służy jako źródło linii dla fal sprężystych.
2. Akwizycja obrazu
- W oprogramowaniu OCT wybierz tryb akwizycji Dopplera i włącz wyzwalacz zewnętrzny.
- Umieść ziarnisty biofilm pod soczewką w uchwycie na próbkę i przesuń go w kierunku końcówki przetwornika za pomocą stolika translacyjnego. Upewnij się, że przetwornik delikatnie styka się z powierzchnią próbki, jak pokazano na Rysunek 2. Użyliśmy dwóch granulowanych biofilmów (znanych również jako osad granulowany) o różnych średnicach nominalnych (4,3 mm i 3,3 mm). Selekcji tej dokonano w celu zbadania wpływu wielkości biofilmu na jego właściwości mechaniczne. Zostały one uzyskane komercyjnie.
UWAGA: Uchwyt na próbkę zastosowany w tym badaniu składa się z wydrukowanej w 3D plastikowej płyty z wieloma półkulistymi wgłębieniami. Ten uchwyt nie pozwala na pomiary w warunkach natywnych. W związku z tym podczas pomiarów wprowadziliśmy wodę ze środowiska naturalnego, aby zapobiec wysychaniu próbki. - Określ region skanowania, klikając pozycję Początek i Punkt końcowy linii zainteresowania (ścieżka propagacji fali) w oknie przykładowego monitora. Wyśrodkuj tę linię w stosunku do końcówki przetwornika i upewnij się, że jest prostopadła do krawędzi końcówki.
- Określ liczbę pikseli wzdłuż obszaru skanowania i głębokość próbki oraz zwiększ liczbę skanów B (obrazów przekroju poprzecznego 2D), które mają być rejestrowane, aby poprawić stosunek sygnału do szumu obrazów OCE. Prezentowane wyniki uzyskano przy użyciu 1523 pikseli wzdłuż ścieżki skanowania i 1024 pikseli wzdłuż głębokości. Łącznie wykonano 50 skanów B.
- Kliknij przycisk Skanuj i włącz przełącznik. Na ekranie powinny pojawić się obrazy OCT i OCE. Aktywuj przełącznik w ciągu limitu czasu wyzwalania i czasu przygotowania skanowania.
- Upewnij się, że intensywność referencyjna mieści się w optymalnym zakresie i umieść próbkę w obszarze ogniskowym obiektywu mikroskopu OCT. Prawidłowo zogniskowana próbka powinna mieć górną krawędź blisko górnej krawędzi obrazu.
- Dostosuj kontur fazowy na obrazie OCE na pasku narzędzi wyświetlacza, zwiększając wyższą wartość paska kolorów po lewej stronie i zmniejszając dolną wartość paska kolorów po prawej stronie. Zwiększy to kontrast frędzli.
- Skonfiguruj generator funkcyjny tak, aby wytwarzał napięcie sinusoidalne o pojedynczej częstotliwości, naciskając przycisk sinusoidalny na panelu przednim i określ początkową częstotliwość wzbudzenia dla pomiarów. Pomiary w tym badaniu rozpoczynają się od 4 kHz i kończą na 9,6 kHz. Włącz złącze wyjściowe, naciskając Wyjście.
- Ustaw dopuszczalne napięcie dla pomiaru. Ta wartość powinna zmaksymalizować widoczność prążków, ale także uniknąć zawijania fazy. W przypadku biofilmów w tym badaniu i zakresu częstotliwości pomiarów, napięcie między 5 a 10 V zwykle daje mapę fazową o dobrym kontraście.
- Uzyskaj obrazy OCT i OCE, klikając przycisk Nagraj.
- Powtórz pomiary przy różnych częstotliwościach, aby uzyskać przekrojowe obrazy pola fali sprężystej o różnych długościach fal (lub okresach prążków).
3. Analiza obrazu
- Uzyskaj fizyczny rozmiar pikseli. Fizyczny rozmiar piksela w x uzyskuje się przez podzielenie pola widzenia w kierunku x przez rozmiar obrazu w kierunku x, a następnie pomnożenie przez współczynnik dwa. Fizyczny rozmiar piksela w z uzyskuje się przez podzielenie pola widzenia w kierunku z przez rozmiar obrazu w kierunku z. Wartości pola widzenia i rozmiaru obrazu są przechowywane w tablicy struktury z informacjami o obrazie, do których można uzyskać dostęp za pomocą funkcji OCTFileOpen dostępnej w MATLAB SDK w pakiecie ThorImageOCT.
- Uzyskaj macierze OCT i OCE za pomocą funkcji OCTFileGetIntensity i OCTFileGetPhase, odpowiednio, a następnie weź średnią z zarejestrowanych klatek. Te funkcje są dostępne w MATLAB SDK w pakiecie ThorImageOCT.
- Uzyskaj lokalizacje pikseli górnej krawędzi próbki, binaryzując obraz i wykrywając białe piksele od góry do dołu dla każdej kolumny.
- Wyodrębnij rozkład fazowy obrazu OCE wzdłuż tej krawędzi za pomocą funkcji improfile i oblicz skumulowaną długość łuku w rzeczywistych wymiarach. Oblicz długość łuku, biorąc skumulowaną sumę normy skalowanych różnic między kolejnymi punktami w kierunkach x i z.
- Oblicz przestrzenną szybką transformację Fouriera zmierzonego rozkładu faz OCT (tj. na podstawie obrazów OCE) w odniesieniu do skumulowanej długości łuku za pomocą funkcji plomb.
- Określ lokalizację piku w widmie. To położenie reprezentuje częstotliwość przestrzenną fali. Obliczyć prędkość fali (lub prędkość fazową) ze stosunku częstotliwości wzbudzenia przetwornika (jednostki Hz) do częstotliwości przestrzennej (jednostka odwrotnej długości).
Wyniki
W niniejszym badaniu wykorzystano biofilmy granularne (znane również jako osad granularny), które zostały pozyskane komercyjnie. Granule są sferycznymi biofilmami powstającymi w wyniku samoagregacji, co oznacza, że nie wymagają one nośnika ani powierzchni do wzrostu26. Rysunek 3A przedstawia reprezentatywny obraz OCT w przekroju poprzecznym, który powstaje w wyniku przestrzennych zmienności lokalnego współczynnika załamania światła w biofilmie granularnym. Biofilm ma nominalną średnicę 3 mm. Na obrazie widoczne są niektóre cechy wewnętrzne, w tym pory i pustki znajdujące się blisko powierzchni próbki. Zwiększone rozproszenie optyczne wzdłuż głębokości próbki uniemożliwia dotarcie źródła światła OCT do centrum próbki, przez co obszar centralny jest pozbawiony jakichkolwiek rozpoznawalnych informacji. Rysunek 3B przedstawia obraz OCE próbki w przekroju poprzecznym dla częstotliwości wzbudzenia przetwornika wynoszącej 5,1 kHz. Lokalny kontrast na obrazie jest skorelowany z lokalnym przemieszczeniem pionowym wywołanym przez rozprzestrzeniającą się w próbce falę sprężystą. Fizyczny odstęp między prążkami wzdłuż drogi propagacji odpowiada długości fali sprężystej powierzchniowej. Fala powierzchniowa rozprzestrzenia się w pobliżu powierzchni próbki i posiada głębokość penetracji bliską długości fali. Zakres przestrzenny przemieszczenia fali powierzchniowej nie jest widoczny na obrazie ze względu na ograniczoną penetrację optyczną źródła światła OCT w próbce. Rozkład fazy optycznej wzdłuż drogi propagacji fali sprężystej (Rysunek 4A) jest wykorzystywany do określenia częstotliwości przestrzennej fali powierzchniowej. Częstotliwość przestrzenną uzyskuje się poprzez wykonanie szybkiej transformaty Fouriera (FFT; Rysunek 4B) danych i wybranie częstotliwości, przy której amplituda widma FFT jest największa.
Kluczowe jest wybranie napięcia generatora funkcji o wystarczającej wartości, aby uzyskać prążki wykazujące optymalny kontrast na obrazie OCE. Należy jednak unikać nadmiernie wysokich napięć, ponieważ może to doprowadzić do zjawiska zawijania fazy (phase wrapping) na obrazie OCE, co zilustrowano na Rysunku 5A. Zawijanie fazy wynika z faktu, że różnica fazy optycznej w pomiarze jest ograniczona do przedziału od -π do π. Gdy faza przekroczy jedną z tych granic, zostaje ona „zagięta” do przeciwległej granicy, tworząc nieciągły rozkład fazy. W konsekwencji pojawia się potrzeba rozwinięcia fazy (phase unwrapping), co stanowi wyzwanie i może wprowadzać potencjalne nieścisłości. Kolejnym czynnikiem istotnym dla dokładnych pomiarów fal jest liczba prążków obecnych na obrazie OCE. Przy niskich częstotliwościach przetwornika, przedstawionych na Rysunku 5B, pełny cykl oscylacji fali powierzchniowej może nie zostać w pełni uchwycony ze względu na niewielki rozmiar granulatu, a widmo FFT może dostarczyć błędnych oszacowań częstotliwości przestrzennej (lub odwrotności długości fali). Innym źródłem błędu w oszacowaniu częstotliwości przestrzennej jest obecność nakładających się przestrzennie modów fal sprężystych, takich jak fale powierzchniowe i objętościowe fale ścinające, na obrazie OCT. Mody te mieszają się, tworząc złożone wzory interferencyjne, które mogą być trudne do analizy. Obecność różnych modów fal poza falami powierzchniowymi może wprowadzać efekty interferencyjne w pobliżu przetwornika, w zależności od konkretnej próbki, częstotliwości wzbudzenia i amplitudy. Rysunek 6 przedstawia przykład obrazu OCE uzyskanego przy częstotliwości wzbudzenia 5,5 kHz, w którym objętościowa fala ścinająca w pobliżu lokalnego punktu wzbudzenia interferuje z polem fali powierzchniowej. Rysunek 7A ukazuje rozkład fazy, który odbiega od wzorca zanikającej fali sinusoidalnej zaobserwowanego na Rysunku 4A, co przypisuje się kombinacji modów falowych. W rezultacie uzyskane FFT wykazuje szerszy pik, jak pokazano na Rysunku 7B. To samo zjawisko może wystąpić w pobliżu defektów, takich jak pustki lub obszary o wyraźnych różnicach w właściwościach sprężystych/lepko-sprężystych. W tych obszarach lokalne pole przemieszczeń ulega modyfikacji z powodu interferencji fali padającej lub powierzchniowej z falami rozproszonymi przez defekt.
Obliczyliśmy prędkość fali dla fali powierzchniowej przy częstotliwościach od 4,0 do 9,6 kHz dla dwóch granulowanych biofilmów o różnych średnicach nominalnych (4,3 mm i 3,3 mm). Wykresy prędkości fali nazywane są krzywymi dyspersyjnymi. Przy zastosowanych ustawieniach każdy pomiar dyspersji trwał około 15 min. W wybranym przedziale częstotliwości w obrazach OCE obecnych jest wiele cykli sinusoidalnego profilu przemieszczenia, co umożliwia precyzyjne wyznaczenie częstotliwości przestrzennej przy znacznym kontraście fazowym. Rycina 8 przedstawia uzyskane krzywe dyspersyjne. Krzywe te reprezentują średnie krzywe dyspersyjne dla trzech lokalizacji w każdej próbce. Prędkości fal powierzchniowych dążą do wartości stałej, zwanej prędkością fali Rayleigha, cR, która jest powiązana z modułem ścinania próbki za pomocą zależności,
cR = ((0.862 + 1.14ν)/ (1 + ν)) x (G/r)1/2
gdzie G to moduł ścinania, r to gęstość masy, a ν to współczynnik Poissona27,28. Jest on stały, ponieważ głębokość penetracji fali sprężystej jest mniejsza niż średnica próbki. W zasadzie fala sprężysta przemieszcza się blisko powierzchni próbki z prędkością fali bezpośrednio proporcjonalną do kwadratu modułu Younga28. Jednak ze względu na szum pomiarowy prędkość fali nie jest całkowicie stała w tym zakresie częstotliwości. Obliczamy średnią prędkości fal dla częstotliwości między 6.0 a 9.6 kHz dla mniejszej próbki oraz między 4.0 a 9.6 kHz dla większej próbki. Ta średnia prędkość fali jest następnie wykorzystywana do oszacowania modułu Younga próbki.
Zakładamy, że próbka jest nieściśliwa ze względu na wysoką zawartość wody. W związku z tym ν = 0.5. Zatem cR jest bezpośrednio powiązane z E = 3G w przypadku ciała stałego nieściśliwego, gdzie E oznacza moduł Younga próbki27,28. Linie przerywane na Rysunku 8 przedstawiają prędkości fal Rayleigha dla różnych próbek. Przyjmujemy, że skład biofilmu składa się głównie z wody, co daje gęstość 1000 kg/m3. W konsekwencji obliczony moduł Younga biofilmów ziarnistych wynosi odpowiednio 85 kPa i 205 kPa dla biofilmów ziarnistych o średnicach nominalnych 4,3 mm i 3,3 mm. Pomiar ten potwierdza zdolność tej techniki do rozróżniania różnic we właściwościach mechanicznych między biofilmami.
Rysunek 1: Układ optycznej koherentnej elastografii. Na rysunku przedstawiono schemat zastosowanego tutaj systemu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: Zamocowana próbka. Granulowany biofilm jest umieszczony na uchwycie do próbek, a przetwornik delikatnie z nim styka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Obrazy OCT i OCE ziarnistego biofilmu. (A) Obraz OCT. (B) Obraz OCE dla fali powierzchniowej rozprzestrzeniającej się z częstotliwością 5,1 kHz, wykazujący dobry kontrast prążków. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 4: Rozkład fazy i FFT. Dla obrazu przedstawionego na Rycini 3B, (A) rozkład różnicy faz wzdłuż górnej krawędzi próbki oraz (B) FFT rozkładu różnicy faz wykazujące wąski pik. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 5: Obrazy OCT i OCE granulowanego biofilmu. (A) Obraz OCE dla fali powierzchniowej propagującej się z częstotliwością 5,1 kHz wykazujący zawijanie fazy. (B) Obraz OCE dla fali powierzchniowej propagującej się z częstotliwością 1,3 kHz bez pełnego cyklu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 6: Obraz OCE pokazujący kombinację modów. Obraz ten pochodzi z innego miejsca próbki i ilustruje kombinację modów dla fali propagującej się z częstotliwością 5,5 kHz. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 7: Rozkład fazy i FFT. Dla obrazu przedstawionego na rysunku 6, (A) rozkład różnic fazowych wzdłuż górnej krawędzi próbki oraz (B) FFT rozkładu różnic fazowych wykazujące szerszy szczyt. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 8: Krzywe dyspersyjne. Prędkość fali w dwóch próbkach o różnych rozmiarach przedstawiono w funkcji różnych częstotliwości wraz z słupkami odchylenia standardowego. Na górze naniesiono odpowiadającą im prędkość fali Rayleigha dla płaskiej części krzywych. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
Dyskusja
Osiągalna głębokość obrazowania w systemie OCT zależy od stopnia przenikania światła ze źródła światła, który zależy od długości fali źródła. Co więcej, długość fali określa rozdzielczość osiową. Dłuższe fale mogą wnikać głębiej w próbkę, ale kosztem zmniejszonej rozdzielczości osiowej w porównaniu z krótszymi falami. Z drugiej strony rozdzielczość poprzeczna zależy zarówno od apertury numerycznej systemu, jak i długości fali, przy czym krótsze fale zapewniają wyższą rozdzielczość. Zwiększenie przysłony numerycznej wprowadza kompromis polegający na ograniczeniu głębi ostrości29. Rozdzielczość przestrzenna jest ograniczona do najkrótszej elastycznej długości fali, którą można wykryć przy wystarczającym stosunku sygnału do szumu. Obecna metodologia OCE jest ograniczona do 0,5 mm 9,30. Chociaż technika ta jest ograniczona wielkością próbki, powinna mieć zastosowanie do różnych rodzajów biofilmu. Kształt biofilmu, ziarnisty lub płaski, nie będzie hamował techniki. Przezroczystość próbki również odgrywa rolę w określaniu głębokości penetracji. Materiały o wysokiej przezroczystości umożliwiają przenikanie światła przez całą próbkę, czyniąc ją niezauważalną dla obserwacji, podczas gdy próbki nieprzezroczyste utrudniają przenikanie światła, dostarczając minimalnych szczegółów na temat ich wewnętrznej struktury 9,28. W kontekście tego badania wystarcza głębokość penetracji w zakresie milimetrów.
Innym możliwym problemem dla tych pomiarów jest to, że w większych próbkach, w których wielkość nie ogranicza liczby cykli fali sprężystej, pole widzenia (FOV) mikroskopu OCT może być czynnikiem ograniczającym liczbę mierzonych cykli. W przypadku pomiarów tutaj pole widzenia jest ograniczone do 9 mm na 9 mm; w związku z tym fale sprężyste dłuższe niż 9 mm nie mogą być rozdzielone w tym mikroskopie OCT. Wykorzystanie soczewki o szerszym polu widzenia umożliwiłoby obrazowanie większych próbek, uzyskując więcej prążków przy tych niższych częstotliwościach. Wyzwania pojawiają się również przy wyższych częstotliwościach. W przypadku próbek w tym badaniu, powyżej 10 kHz, fala doświadcza znacznego tłumienia, zmniejszając wielkość rozkładu różnicy faz i komplikując określenie częstotliwości przestrzennej. Problem ten można złagodzić, zwiększając napięcie generatora funkcyjnego, zwiększając w ten sposób przemieszczenie przetwornika. Jednak zwiększenie przemieszczenia jest przydatne tylko do pewnego momentu, ponieważ ostatecznie skończy się to zawijaniem fazy9. Alternatywnie, zwiększenie czułości systemu poprzez zastosowanie źródła światła o większej mocy może przeciwdziałać zawijaniu fazowemu spowodowanemu większymi przemieszczeniami i ułatwić wykrywanie dynamicznej odpowiedzi na mniejsze wzbudzenia. Wyższa czułość ułatwia wdrożenie metod akustycznych OCE, które oferują korzyści w postaci obciążenia bezdotykowego, ale są głębiej dotknięte wysokim tłumieniem31.
Podczas przeprowadzania tych pomiarów na biofilmach ważne jest, aby próbki były nawodnione. Suszenie prowadzi do niepożądanego wzrostu sztywności, co nie ma znaczenia, ponieważ nacisk kładziony jest na ocenę właściwości próbki w jej naturalnym środowisku. Nie badaliśmy suszenia wywołanego oświetleniem. Zwracamy jednak uwagę, że woda ze środowiska naturalnego była okresowo dodawana przez cały czas trwania pomiaru, a w tym czasie morfologia próbki była monitorowana za pomocą obrazów OCT i nie zaobserwowano żadnych dostrzegalnych zmian w morfologii. Dodatkowo, podczas ustawiania przetwornika i przechwytywania obrazów OCE, ważne jest, aby uwzględnić cechy dostrzegane na obrazie OCT. Niejednorodności wzdłuż drogi rozchodzenia się fal mogą zniekształcać pole fal i dlatego należy ich unikać9. Ponadto kluczowe znaczenie ma utrzymywanie delikatnego kontaktu z biofilmem, ponieważ nadmierny nacisk na próbkę, oprócz potencjalnej modyfikacji jej właściwości mechanicznych, może również prowadzić do zniekształcenia pola falowego. Wreszcie, obszar skanowania musi być prostopadły do czoła fali, aby zapewnić, że częstotliwość przestrzenna fali harmonicznej jest dokładnie określona na podstawie pomiaru.
W przypadku niektórych częstotliwości zaobserwowano znaczne różnice w prędkościach fal w obu próbkach, co można przypisać ich nieodłącznym niejednorodnościom, polu falowemu o tej określonej częstotliwości i morfologii ścieżek propagacji. Wcześniej wykazaliśmy, że zmierzony profil prędkości fali na przekrojonym ziarnistym biofilmie jest niejednorodny ze względu na niejednorodną mikrostrukturę9. W związku z tym, stosując tę technikę na ziarnistych biofilmach, konieczne jest przeprowadzenie pomiarów w wielu miejscach w próbce, aby uzyskać uśrednioną reprezentację.
Ważną obserwacją dotyczącą krzywych dyspersji jest to, że wykazują one różne zachowania dla różnych wielkości próby. W przypadku większej próbki krzywa pozostaje względnie stała w całym mierzonym zakresie. Jednak w przypadku mniejszej próbki występuje tendencja wzrostowa prędkości fal wraz ze wzrostem częstotliwości, szczególnie w dolnej części zakresu. Zjawisko to można przypisać obecności efektów lepkosprężystych przy niższych częstotliwościach i generowaniu elastycznych modów falowodu. Uwzględniliśmy te efekty w naszej poprzedniej pracy, używając bardziej wyrafinowanych modeli odwrotnych 8,9,18.
Należy zauważyć, że w tlenowych systemach granularnych biomasa nie jest równomiernie rozprowadzana na całej wysokości reaktora. Podczas faz bez napowietrzania większe granulki mają tendencję do osiadania na dnie reaktora. Ten nierównomierny rozkład powoduje, że agregaty o różnych rozmiarach mają dostęp do różnych ilości substratu. W rezultacie, agregaty o różnych rozmiarach wykazują wyraźny skład zbiorowiska. Dodatkowo, ponieważ nadmiar szlamu jest usuwany selektywnie, większe granulki mają tendencję do zatrzymywania w reaktorze przez dłuższy czas, podczas gdy mniejsze są łatwiejsze do usunięcia32. Zauważalna różnica w module Younga sugeruje potencjalny związek między składem biofilmu, wiekiem i właściwościami mechanicznymi.
Podsumowując, metoda optycznej elastografii koherentnej (OCE) oferuje szybki i nieniszczący sposób oceny prędkości fali sprężystej w biofilmach. Metoda ta pozwala przezwyciężyć ograniczenia związane z pomiarami reologicznymi i wykazuje ulepszone atrybuty w porównaniu z alternatywnymi technikami elastografii 8,18. Co więcej, jego zastosowanie wykracza poza ziarniste biofilmy, obejmując każdą częściowo przezroczystą próbkę o odpowiedniej głębokości penetracji optycznej i rozmiarze wystarczająco dużym, aby mogła zostać rozdzielona przez system, w tym przykłady takie jak hydrożele33, rogówka34 i skóra35. Przyszłe postępy w tej metodzie obejmują kilka kluczowych aspektów. Po pierwsze, zwiększenie częstotliwości harmonicznych fal sprężystych do zakresu setek kHz pozwoli na uzyskanie długości fal rzędu kilku mikrometrów, osiągając tym samym rozdzielczość przestrzenną w podobnej skali. Po drugie, stosunek sygnału do szumu optycznego systemu detekcji zostanie zwiększony poprzez zwiększenie mocy optycznej systemu OCT z 2 mW (prąd) do 20 mW. Na koniec wymienimy siłownik harmonicznych kontaktowych na bezdotykowe źródło ciśnienia promieniowania akustycznego. Dodatek ten ułatwi nieinwazyjną i nieniszczącą operację oraz pozwoli na badanie próbek biofilmu w ich naturalnym środowisku.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Autorzy dziękują firmie Aqua-Aerobic Systems, Inc. (Rockford, IL, USA) za dostarczenie granularnych biofilmów badanych w tej pracy. Autorzy dziękują również za wsparcie Narodowej Fundacji Nauki poprzez nagrody #210047 i #193729.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Wydrukowany w 3D uchwyt | |||
| Wydrukowana w 3D końcówka | |||
| BNC | Dowolna marka | ||
| Generator opóźnienia | Stanford Research Systems | DG535 | DG535 Cyfrowy generator opóźnień / impulsów |
| Generator funkcyjny | Agilent Technologies | 33250A 80 MHz Generator funkcji / przebiegów arbitralnych | |
| Ziarnisty biofilm | wodno-tlenowe | Otrzymywane z reaktora tlenowego osadu granulowanego (Aqua-Aerobic Systems, Inc.) | |
| MATLAB | MathWorks | Release 2022a (MATLAB 9.12) | |
| Przetwornik piezoelektryczny | Thorlabs | PK2JUP1 | dyskretnym stosem piezoelektrycznym, 75 V, 30,0 i mikro; m Przemieszczenie |
| SD-OCT System | Thorlabs | Ganimedes II, soczewka skanująca LSM03 | |
| ThorImageOCT | Thorlabs | Wersja: 5.5.5 |
Bibliografia
- Mahto, K. U., Das, S. Bacterial biofilm and extracellular polymeric substances in the moving bed biofilm reactor for wastewater treatment: A review. Bioresour Technol. 345, 126476(2022).
- Pholchan, M. K., Baptista, J. deC., Davenport, R. J., Curtis, T. P. Systematic study of the effect of operating variables on reactor performance and microbial diversity in laboratory-scale activated sludge reactors. Water Res. 44 (5), 1341-1352 (2010).
- Briones, A., Raskin, L. Diversity and dynamics of microbial communities in engineered environments and their implications for process stability. Curr Opin in Biotechnol. 14 (3), 270-276 (2003).
- Sanchez-Huerta, C., Sanchez Medina, J., Wang, C., Fortunato, L., Hong, P. Understanding the role of sorption and biodegradation in the removal of organic micropollutants by membrane aerated biofilm reactor (MABR) with different biofilm thickness. Water Res. 236, 119935(2023).
- Wang, H. F., Hu, H., Yang, H. Y., Zeng, R. J. Characterization of anaerobic granular sludge using a rheological approach. Water Res. 106, 116-125 (2016).
- Ma, Y. J., Xia, C. W., Yang, H. Y., Zeng, R. J. A rheological approach to analyze aerobic granular sludge. Water Res. 50, 171-178 (2014).
- Lin, X., Wang, Y. Microstructure of anammox granules and mechanisms endowing their intensity revealed by microscopic inspection and rheometry. Water Res. 120, 22-31 (2017).
- Liou, H. C., et al. Towards mechanical characterization of granular biofilms by optical coherence elastography measurements of circumferential elastic waves. Soft Matter. 15 (28), 5562-5573 (2019).
- Liou, H. C., Sabba, F., Wang, Z., Wells, G., Balogun, O. Layered viscoelastic properties of granular biofilms. Water Res. 202, 117394(2021).
- Li, C., Guan, G., Reif, R., Huang, Z., Wang, R. K. Determining elastic properties of skin by measuring surface waves from an impulse mechanical stimulus using phase-sensitive optical coherence tomography. J R Soc Interface. 9, 831-841 (2012).
- Ramier, A., et al. In vivo measurement of shear modulus of the human cornea using optical coherence elastography. Sci Rep. 10, 17366(2020).
- Ramier, A., Tavakol, B., Yin, S. H. Measuring mechanical wave speed, dispersion, and viscoelastic modulus of cornea using optical coherence elastography. Optics Express. 27 (12), 16635(2019).
- Crespo, M. A., et al. In vivo determination of human corneal elastic modulus using vibrational optical coherence tomography. Cornea Ext Dis. 11 (7), 1-11 (2022).
- Ambrozinski, L., et al. Acoustic micro-tapping for non-contact 4D imaging of tissue elasticity. Sci Rep. 6 (38967), 1-11 (2016).
- Pitre, J. J. Jr, et al. Nearly-incompressible transverse isotropy (NITI) of cornea elasticity: model and experiments with acoustic micro-tapping OCE. Sci Rep. 10 (12983), 1-14 (2020).
- Lan, G., Aglyamov, S. R., Larin, K. V., Twa, M. D. In vivo human corneal shear wave optical coherence elastography. Optom Vis Sci. 98, 58-63 (2021).
- Rosenthal, A., et al. Morphological analysis of pore size and connectivity in a thick mixed-cultured biofilm. Biotechnol Bioeng. 115, 2268-2279 (2018).
- Liou, H. C., Sabba, F. I., Packman, A., Wells, G., Balogun, O. Nondestructive characterization of soft materials and biofilms by measurement of guided elastic wave propagation using optical coherence elastography. Soft Matter. 15, 575-586 (2019).
- Wagner, M., Taherzadeh, D., Haisch, C., Horn, H. Investigation of the mesoscale structure and volumetric features of biofilms using optical coherence tomography. Biotechnol Bioeng. 107 (5), 844-853 (2010).
- Leite-Andrade, M. C., et al. A new approach by optical coherence tomography for elucidating biofilm formation by emergent Candida species. PLoS ONE. 12 (11), e0188020(2017).
- Blauert, F., Horn, H., Wagner, M. Time-resolved biofilm deformation measurements using optical coherence tomography. Biotechnol Bioeng. 112 (9), 1893-1905 (2015).
- Picioreanu, C., Blauert, F., Horn, H., Wagner, M. Determination of mechanical properties of biofilms by modeling the deformation measured using optical coherence tomography. Water Res. 145, 588-598 (2018).
- Li, M., Nahum, Y., Matouš, K., Stoodley, P., Nerenberg, R. Effects of biofilm heterogeneity on the apparent mechanical properties obtained by shear rheometry. Biotechnol Bioeng. 120, 553-561 (2023).
- Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).
- Geisel, S., Secchi, E., Vermant, J. Experimental challenges in determining the rheological properties of bacterial biofilms. Interface Focus. 12 (6), 20220032(2022).
- Winkler, M. K. H., van Loosdrecht, M. C. M. Intensifying existing urban wastewater. Science. 375 (6579), 377-378 (2022).
- Graff, K. F. Wave motion in elastic solids. , Dover Publications. (1991).
- Kennedy, B. F., Kennedy, K. M., Sampson, D. D. A review of optical coherence elastography: Fundamentals, techniques and prospects. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 20 (2), 272-288 (2014).
- Ang, M., et al. Anterior segment optical coherence tomography. Prog Retin Eye Res. 66, 132-156 (2018).
- Kirby, M. A., et al. Spatial resolution in dynamic optical coherence elastography. J Biomed Opt. 24 (9), 1-16 (2019).
- Larin, K. V., Sampson, D. D. Optical coherence elastography - OCT at work in tissue biomechanics. Biomed Opt Express. 8, 1172-1202 (2017).
- Muhammad, A., et al. Importance of species sorting and immigration on the bacterial assembly of different-sized aggregates in a full-scale aerobic granular sludge. Environ Sci Technol. 53 (14), 8291-8301 (2019).
- Candry, P., et al. Tailoring polyvinyl alcohol-sodium alginate (PVA-SA) hydrogel beads by controlling crosslinking pH and time. Sci Rep. 12 (1), 20822(2022).
- Kirby, M. A., et al. Optical coherence elastography in ophthalmology. J Biomed Opt. 22 (12), 1-28 (2017).
- Liang, X., Boppart, S. A. Biomechanical properties of in vivo human skin from dynamic optical coherence elastography. IEEE Trans Biomed Eng. 57 (4), 953-959 (2010).
Przedruki i uprawnienia
