W oczyszczaniu ścieków i odzyskiwaniu zasobów wodnych, korzystne biofilmy w dołączonych reaktorach wzrostowych są coraz częściej wykorzystywane, aby umożliwić mikrobom przekształcanie niepożądanych zanieczyszczeń, takich jak materia organiczna, azot i fosforany, w stabilizowane formy, które można łatwo usunąć z wody1. W tych systemach emergentna funkcja biofilmu, a mianowicie przemiany biochemiczne, jest ściśle związana z różnorodnością zamieszkujących w nim mikroorganizmów i składnikami odżywczymi, które te drobnoustroje otrzymują2. W związku z tym ciągły wzrost biofilmu może stanowić wyzwanie dla utrzymania stałej funkcjonalności reaktora, ponieważ wzrost nowego biofilmu może zmienić ogólne procesy metaboliczne biofilmu, charakterystykę przenoszenia masy i skład zbiorowiska. Stabilizacja środowiska biofilmu w jak największym stopniu może uchronić przed takimi zmianami3. Obejmuje to zapewnienie stałego przepływu składników odżywczych i utrzymanie stabilnej struktury biofilmu o stałej grubości4. Monitorowanie sztywności i struktury fizycznej biofilmu umożliwiłoby naukowcom uzyskanie wglądu w ogólny stan zdrowia i funkcjonowanie biofilmu.
Biofilmy wykazują właściwości lepkosprężyste5,6,7. Ta lepkosprężysta natura powoduje połączenie chwilowego i powolnego, zależnego od czasu odkształcenia w odpowiedzi na zewnętrzne siły mechaniczne. Jednym z unikalnych aspektów biofilmów jest to, że gdy są poddawane znacznej deformacji, reagują jak lepkie ciecze. I odwrotnie, gdy są poddawane niewielkim odkształceniom, ich reakcja jest porównywalna z ciałem stałym5. Co więcej, w tym obszarze o małych odkształceniach istnieje zakres deformacji, w którym biofilmy wykazują liniową zależność siła-przemieszczenie5,6,7. Deformacje w tym zakresie liniowym są optymalne do oceny właściwości mechanicznych biofilmu, ponieważ dają powtarzalne pomiary. Kilka technik może określić ilościowo odpowiedź elastyczną w tym zakresie. Optyczna elastografia koherentna (OCE) to nowa technika, która jest dostosowywana do analizy biofilmów w tym zakresie liniowym (szczepy rzędu 10-4-10-5)8,9.
Najbardziej znanym zastosowaniem OCE do tej pory jest dziedzina biomedyczna, gdzie technika ta została zastosowana do scharakteryzowania tkanek biologicznych, które wymagają jedynie powierzchownego dostępu optycznego. Na przykład, Li et al. użyli OCE do scharakteryzowania elastycznych właściwości tkanki skórnej10. Inni autorzy scharakteryzowali anizotropowe właściwości elastyczne świńskich i ludzkich tkanek rogówki oraz ich wpływ na ciśnienie wewnątrzgałkowe11,12,13,14,15,16. Niektóre zalety metody OCE do badania biofilmów to to, że jest ona nieniszcząca i zapewnia mezoskalową rozdzielczość przestrzenną, nie wymaga żadnego przygotowania próbki, a sama metoda jest szybka; Zapewnia współrejestrowane pomiary struktury fizycznej i właściwości sprężystych (np. porowatości, chropowatości powierzchni i morfologii)8,9,17,18.
Metoda OCE mierzy lokalne przemieszczenie rozchodzących się fal sprężystych w próbce za pomocą czułej fazowo optycznej tomografii koherentnej (OCT). OCT to interferometr optyczny o niskiej koherencji, który przekształca lokalne zmiany w przemieszczeniu próbki w zmianę intensywności, która jest rejestrowana za pomocą spektrometru optycznego. Technika OCT została również wykorzystana w badaniach nad biofilmem do scharakteryzowania struktury mezoskalowej, rozkładu porowatości w trzech wymiarach i deformacji biofilmu17,19,20,21. Ponadto Picioreanu i in. oszacowali właściwości mechaniczne biofilmu za pomocą odwrotnego modelowania interakcji płyn-struktura obrazów deformacji przekroju poprzecznego OCT22.
Z drugiej strony, pomiary OCE, w połączeniu z odwrotnym modelowaniem fal elastodynamicznych, dają prędkość fal sprężystych w próbce, co umożliwia scharakteryzowanie właściwości sprężystych i lepkosprężystych próbki. Nasza grupa dostosowała technikę OCE do ilościowego pomiaru właściwości elastycznych i lepkosprężystych biofilmu8,9,18 i zweryfikowała technikę pod kątem pomiarów reometrii ścinania w próbkach płytek żelu agarozowego18. Podejście OCE zapewnia precyzyjne i wiarygodne oszacowanie właściwości biofilmu, ponieważ zmierzona prędkość fali sprężystej jest skorelowana z właściwościami sprężystymi próbki. Ponadto przestrzenny zanik amplitudy fali sprężystej może być bezpośrednio skorelowany z właściwościami lepkosprężystymi ze względu na efekty lepkości w materiale. Przedstawiliśmy pomiary OCE właściwości lepkosprężystych biofilmów bakteryjnych z kultur mieszanych hodowanych na kuponach w obrotowym reaktorze pierścieniowym (RAR) oraz biofilmów ziarnistych o złożonej geometrii przy użyciu elastodynamicznych modeli falowych18.
Technika OCE jest również potężną alternatywą dla tradycyjnej reometrii18, która jest używana do charakterystyki lepkosprężystości. Metody reometryczne najlepiej nadają się do próbek o geometrii płaskiej. W związku z tym ziarniste biofilmy, które mają dowolne kształty i morfologie powierzchni, nie mogą być dokładnie scharakteryzowane na reometrze8,23. Ponadto, w przeciwieństwie do OCE, metody reometryczne mogą być trudne do dostosowania do pomiarów w czasie rzeczywistym, na przykład podczas wzrostu biofilmu w komórkach przepływowych24,25.
W tym artykule pokazujemy, że pomiary OCE niezależnej od częstotliwości prędkości fal powierzchniowych mogą być wykorzystane do scharakteryzowania właściwości elastycznych biofilmu bez potrzeby tworzenia skomplikowanych modeli. Osiągnięcie to sprawi, że podejście OCE stanie się bardziej dostępne dla szerszej społeczności zajmującej się badaniem właściwości mechanicznych biofilmu.
Rysunek 1 przedstawia schematyczną ilustrację systemu OCT użytego w tym badaniu. System składa się z kilku instrumentów, w tym komercyjnego systemu OCT czułego na fazę w domenie spektralnej, generatora opóźnień, generatora funkcyjnego i przetwornika piezoelektrycznego. System OCT działa na zasadzie interferometrii poprzez zastosowanie szerokopasmowego źródła światła o środkowej długości fali 930 nm. Zebrane natężenie światła, które jest skorelowane ze skomplikowanymi szczegółami strukturalnymi w próbce, jest analizowane w jednostce postprocessingu, a następnie przekształcane w obraz przekrojowy próbki - powszechnie określany jako obraz OCT. Głębokość obrazowania OCT zależy od nasilenia rozpraszania optycznego w próbce, które wynika z lokalnej zmienności współczynnika załamania światła i jest ograniczone do 1-3 mm w tkankach biologicznych i biofilmach. Ponieważ faza optyczna w próbce i intensywność zakłóceń są modulowane przez ruch, OCT może być używany do wykrywania lokalnego przemieszczenia próbki. Wykorzystujemy czułość przemieszczenia OCT w metodzie OCE do śledzenia pola przemieszczenia w stanie ustalonym fal sprężystych w próbce. W szczególności generator funkcyjny wyprowadza napięcie sinusoidalne do sterowania przetwornikiem piezoelektrycznym. Przetwornik z kolei rozciąga się i kurczy z oscylacyjną historią czasową. Oscylacyjne przemieszczenie przetwornika nadaje sinusoidalną siłę na powierzchni próbki przez wydrukowaną w 3D końcówkę klinową na wierzchołku przetwornika, co prowadzi do generowania harmonicznych fal sprężystych w próbce. Końcówka klina lekko styka się z próbką, tak że próbka pozostaje nienaruszona po wycofaniu siłownika z powierzchni próbki. Aby zarejestrować lokalne przemieszczenie w próbce, dla każdego piksela w próbce rejestrowane są sąsiednie skany głębokości oddzielone stałym opóźnieniem czasowym. Optyczna różnica fazowa między kolejnymi skanami w każdym punkcie piksela jest proporcjonalna do lokalnego przemieszczenia pionowego w tym samym punkcie. Synchronizacja między przemieszczeniem przetwornika a optyką skanującą w systemie OCT odbywa się poprzez impuls wyzwalający, który pochodzi z generatora funkcyjnego i jest opóźniony w generatorze opóźniającym. Ten etap synchronizacji ułatwia uzyskanie spójnych obrazów przekroju poprzecznego lokalnego rozkładu faz optycznych w próbce. Obrazy te są wprost proporcjonalne do lokalnego pionowego przemieszczenia harmonicznego w próbce i są znane jako obraz OCE. Obrazy OCE są pozyskiwane przy różnych częstotliwościach uruchamiania przetwornika w celu uzyskania elastycznej długości fali i prędkości fali w funkcji częstotliwości. Zmierzone prędkości fal są analizowane za pomocą modelu elastodynamicznego w celu określenia właściwości sprężystych próbki.