Artykuł metodologiczny

Test do wykrywania ochrony naczyń krwionośnych siatkówki przed śmiercią związaną z cukrzycą u myszy

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66123

⸱

12 stycznia 2024

 , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Illinois at Chicago, 2Department of Physiology and Biophysics, University of Illinois at Chicago

W tym artykule

Podsumowanie

Test ochronny został opracowany do monitorowania odporności układu krwionośnego siatkówki na śmierć z powodu urazów związanych z cukrzycą/retinopatią cukrzycową, takich jak stres oksydacyjny i cytokiny.

Streszczenie

Retinopatia cukrzycowa (DR) jest złożoną i postępującą chorobą oczu, charakteryzującą się dwoma odrębnymi fazami patogenezy. Pierwsza faza polega na utracie ochrony przed uszkodzeniem siatkówki wywołanym cukrzycą, podczas gdy druga faza koncentruje się na akumulacji tego uszkodzenia. Tradycyjne testy koncentrują się przede wszystkim na ocenie zwyrodnienia naczyń włosowatych, co wskazuje na stopień uszkodzenia, zasadniczo odnosząc się do drugiej fazy DR. Jednak tylko pośrednio dostarczają wglądu w to, czy mechanizmy ochronne układu krwionośnego siatkówki zostały naruszone. Aby rozwiązać ten problem, opracowano nowatorskie podejście do bezpośredniej oceny mechanizmów ochronnych siatkówki, a w szczególności jej odporności na czynniki wywołane cukrzycą, takie jak stres oksydacyjny i cytokiny. Ten test ochronny, chociaż początkowo zaprojektowany dla retinopatii cukrzycowej, ma potencjał do szerszych zastosowań zarówno w kontekście fizjologicznym, jak i patologicznym. Podsumowując, zrozumienie patogenezy retinopatii cukrzycowej wymaga rozpoznania dwóch faz utraty ochrony i akumulacji uszkodzeń, przy czym ten innowacyjny test ochrony stanowi cenne narzędzie do badań i potencjalnie rozszerza się na inne schorzenia.

Wprowadzenie

Retinopatia cukrzycowa (DR) jest jednym z mikronaczyniowych powikłań cukrzycy (DM) i główną przyczyną ślepoty u osób w wieku produkcyjnym w krajach rozwiniętych1. Głównymi czynnikami ryzyka retinopatii cukrzycowej są czas trwania i stopień hiperglikemii2,3,4. Podczas gdy DM powoduje dysfunkcję zarówno naczyniowych, jak i nerwowych komponentów siatkówki5, rozpoznanie DR opiera się na cechach morfologicznych układu naczyniowego siatkówki6.

Stres oksydacyjny wywołany hiperglikemią jest jednym z czynników powodujących patogenezę DR7. Zwiększony stres oksydacyjny powoduje rozległe uszkodzenia, które upośledzają funkcjonalność mitochondriów, a tym samym jeszcze bardziej zwiększają poziom reaktywnych form tlenu. Zdarzeniom tym towarzyszy nieszczelność naczyń siatkówki, wzrost poziomu cytokin zapalnych oraz obumarcie zarówno typów komórek nerwowych, jak i naczyniowych w obrębie siatkówki. Utrata komórek naczyniowych, a co za tym idzie funkcjonalność rozległej sieci naczyń włosowatych siatkówki, powoduje niedotlenienie, silny bodziec dla różnych reakcji5. Takie reakcje obejmują zwiększoną ekspresję czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), który napędza zarówno przepuszczalność, jak i angiogenezę, kardynalne cechy zaawansowanych, zagrażających wzrokowi stadiów DR - cukrzycowego obrzęku plamki żółtej i proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej6.

Pewne cechy DR sugerują, że organizm (zarówno pacjenci, jak i zwierzęta doświadczalne) ma wewnętrzną zdolność do opierania się temu wskazaniu. Pacjenci doświadczają kilkudziesięciu lat DM, zanim rozwiną zagrażające wzrokowi DR8,9,10,11,12,13. Podczas gdy modele DM u gryzoni nie rozwijają zaawansowanych, zagrażających wzrokowi stadiów DR14, początkowa/łagodna forma DR, która się manifestuje, pojawia się dopiero po okresie tygodni lub miesięcy DM15,16. Ponadto, zarówno u pacjentów, jak i u zwierząt doświadczalnych, DR ma charakter postępujący, a dysfunkcja/uszkodzenie siatkówki zwiększa się wraz z wydłużeniem czasu trwania cukrzycy. Wreszcie, u niektórych pacjentów z DM nigdy nie rozwija się DR. W niektórych przypadkach dzieje się tak dlatego, że takie osoby nie doświadczają cukrzycy wystarczająco długo, aby rozwinął się DR. W innych przypadkach dzieje się tak dlatego, że wykazują niezwykłą odporność na DR; tak jak ma to miejsce w przypadku uczestników badania Medalist, u których DR nie rozwija się po 50 lub więcej latach DM17. Pomimo tak przekonującego poparcia dla istnienia ochrony przed DR i jej ogromnego znaczenia translacyjnego, mechanizm leżący u podstaw ochrony nie został agresywnie zbadany.

Test ochronny opisany tutaj został opracowany w celu ułatwienia zbadania, dlaczego DR jest opóźnione od wystąpienia DM u myszy z cukrzycą. Kluczowe etapy tego testu, stosowane u myszy z cukrzycą i bez cukrzycy, obejmują (1) dostarczenie submaksymalnie powodującej śmierć zniewagi oka (ex vivo lub in vivo), (2) izolację naczyń siatkówki, (3) barwienie naczyń krwionośnych za pomocą TUNEL i DAPI, (4) fotografowanie uzyskanych obrazów i ilościowe określenie procentu gatunków podwójnie dodatnich TUNEL / DAPI.

Protokół

Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Biuro Opieki nad Zwierzętami i Instytucjonalnego Bezpieczeństwa Biologicznego na Uniwersytecie Illinois w Chicago. Siedmiotygodniowe samce myszy C57/BL6/J trzymano w klatkach grupowych w środowisku wolnym od patogenów w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności i zapewniono im bezpłatny dostęp do pożywienia i wody. Myszy zostały poddane eutanazji przez uduszenieCO2, a oczy zostały natychmiast wyłuszczone i przetworzone18. Zwierzęta zostały pozyskane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów). Podstawowe narzędzia potrzebne do badania są przedstawione w Rysunek 1.

1. Przekazanie śmiertelnej zniewagi

  1. Wykonaj stres oksydacyjny za pomocą TBH (ex vivo).
    1. Poddaj myszy eutanazji zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami i wyłuszczej ich oczy18 (Rysunek 2A).
    2. Umieścić gałki oczne bezpośrednio w indywidualnych studzienkach 24-dołkowej płytki zawierającej DMEM + 1% BSA, z lub bez 5 mM wodoronadtlenku tert-butylu (TBH) (patrz tabela materiałów); inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Próbkę kontroli dodatniej poddaje się działaniu DNazy (50 U/100 μL) przez 10 minut w celu fragmentacji DNA.
      UWAGA: Dawka TBH (czynnika wywołującego stres oksydacyjny) została dobrana tak, aby wywołać łatwo wykrywalny i submaksymalny poziom śmierci komórek w izolowanych naczyniach siatkówki18.
    3. Utrwal oczy w 10% buforowanej formalinie przez noc (minimum 16 godzin).
  2. Użyj koktajlu cytokin do wywołania stanu zapalnego (in vivo).
    1. Znieczulić myszy wstrzyknięciem dootrzewnowym 100 mg/kg ketaminy i 5 mg/kg ksylazyny.
    2. Użyj niestandardowej igły 33 G (patrz Tabela materiałów), aby wstrzyknąć 1 μl/oko koktajlu cytokin do ciała szklistego; miejsce wstrzyknięcia znajduje się 2-3 mm od rąbka (Rysunek 2B).
      UWAGA: Koktajl cytokin zawiera stosunek 1:1:1 1 μg/ml TNF-α, 1 μg/ml IL-1β i 1500 U/μL IFN-γ18 (patrz Tabela materiałów).
    3. 24 godziny po wstrzyknięciu należy poddać myszy eutanazji (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami), wyłuszczeć ich oczy i naprawić za pomocą 10% buforowanej formaliny przez noc.
      UWAGA: Eksperyment można wstrzymać po fiksacji na maksymalnie 1 tydzień, a następnie wznowić później.

2. Izolacja siatkówki

  1. Rozetnij gałkę oczną.
    1. Użyj prostych kleszczy, aby delikatnie chwycić nerw wzrokowy (Rysunek 2C). Drugą ręką przytrzymaj mikronóż, aby wykonać nacięcie 2-3 mm z tyłu rąbka.
    2. Zamień się z mikronoża na mikronożyczki, aby ciąć równolegle do rąbka, obracając gałkę oczną wraz z nerwem wzrokowym, aż gałka oczna zostanie przecięta na dwie połowy.
    3. Odrzuć przednią połowę oka, w tym soczewkę (Rysunek 2C).
  2. Usuń twardówkę.
    1. Użyj prostych kleszczy, aby delikatnie podnieść twardówkę 1-3 mm od siatkówki.
    2. Użyj mikronożyczek, aby wykonać dwa promieniste nacięcia w twardówce na drodze do nerwu wzrokowego. Unikaj przecinania leżącej pod spodem siatkówki.
    3. Użyj pary zakrzywionych kleszczy, aby chwycić płat twardówki i oderwać go od siatkówki. Warstwa RPE odpadnie wraz z twardówką.
  3. Umyj siatkówkę.
    1. Użyj mikroszpatułki, aby przenieść izolowaną siatkówkę do studzienki w 24-dołkowym naczyniu, które zostało wypełnione podwójnie destylowaną wodą.
    2. Delikatnie potrząśnij naczyniem na średnich średnich obrotach w temperaturze pokojowej. Zmieniaj wodę co 30 minut do 1 godziny, co najmniej 4-5 razy, a następnie pozostaw na noc.

3. Izolacja naczyń krwionośnych siatkówki

  1. Trawienie: Zastąp podwójnie destylowaną wodę 800 μl roztworu trypsyny YL (3% trypsyna w 0,1 M buforze Tris (pH 7,8)). Inkubować w temperaturze 37 °C z delikatnym lub zerowym wstrząsaniem przez 4 godziny 15 min19 (Rysunek 2D).
    UWAGA: Unikaj gwałtownego potrząsania, ponieważ może to uszkodzić naczynia krwionośne.
  2. Transfer: Zanurzyć szeroki koniec szklanej pipety transferowej w roztworze trypsyny YL, aby przenieść siatkówkę na szalkę Petriego o średnicy 35 mm zawierającą niestrzępiącą się, podwójnie destylowaną wodę.
  3. Usuń zewnętrzną warstwę jądrową (fotoreceptory) (Rysunek 2E).
    1. Odwróć półsferę siatkówki w dół. Użyj prostej szczotki z jednym włosiem, aby delikatnie docisnąć siatkówkę do dna naczynia.
    2. Użyj szczoteczki pętelkowej, aby delikatnie zetrzeć fotoreceptory siatkówki. Pociągnięcia pędzlem wykonuje się w kierunku od nerwu wzrokowego w kierunku obwodu siatkówki. Fotoreceptory mogą odczepiać się w dużych arkuszach, ponieważ nie są zakotwiczone w reszcie siatkówki przez naczynia krwionośne.
    3. Za pomocą pipety o pojemności 200 μl należy pobrać i wyrzucić arkusze tkanki nerwowej.
  4. Usuń ciało szkliste.
    1. Odwróć półkulę siatkówki tak, aby była skierowana do góry. Użyj pary zakrzywionych kleszczy (A), aby uchwycić ciało szkliste tak bardzo, jak to możliwe pod mikroskopem preparacyjnym.
      UWAGA: Ciało szkliste wygląda jak arkusz przezroczystej tkanki przyczepiony do nerwu wzrokowego lub siatkówki.
    2. Użyj innych zakrzywionych kleszczy (B), aby chwycić koniec ciała szklistego w miejscu, w którym łączy się z nerwem wzrokowym. Usuń ciało szkliste, odciągając kleszcze A od kleszczy B.
    3. Wyrzuć ciało szkliste. Zbadaj pozostałość ciała szklistego i powtórz ten krok, aby usunąć całe ciało szkliste, ponieważ pozostałość utrudni kolejne kroki.
  5. Usuń pozostałą tkankę nerwową i glejową (Rysunek 2F).
    1. Odwróć półkulę siatkówki tak, aby ponownie była skierowana w dół. Jeszcze raz za pomocą prostej szczoteczki delikatnie dociśnij siatkówkę do dna naczynia (nie używaj końcówki włosów).
    2. Użyj szczoteczki pętelkowej, aby delikatnie przeczesać naczynia krwionośne od głowy nerwu wzrokowego w kierunku obrzeży, aby usunąć pozostałą tkankę nerwową20.
    3. Powoli obracaj siatkówkę za pomocą prostej szczotki i użyj szczotki pętelkowej, aby usunąć wszystkie małe kawałki tkanki nerwowej na unaczynieniu siatkówki, aż sieć naczyniowa zostanie dobrze oczyszczona (Rysunek 2G, H).

4. Montaż izolowanego układu naczyniowego siatkówki na szkiełku mikroskopowym

  1. Umieść szkiełko mikroskopowe.
    1. Umieść czystą kasetę montażową (patrz Tabela materiałów) pod mikroskopem preparacyjnym. Napełnij kasetę wodą podwójnie destylowaną.
    2. Użyj czarnego tła pod mikroskopem preparacyjnym, aby wygenerować kontrast, aby zobaczyć podświetlone przezroczyste naczynia krwionośne.
    3. Za pomocą kleszczyków umieść czysty, oznakowany szkiełko mikroskopowe na dnie kasety montażowej.
  2. Przenieś unaczynienie siatkówki.
    1. Zanurzyć szeroki koniec szklanej pipety transferowej w roztworze trypsyny YL.
    2. Przenieś oczyszczone naczynia krwionośne siatkówki i delikatnie usuń naczynia krwionośne do podwójnie destylowanej wody w kasecie montażowej i nad szkiełkiem mikroskopowym.
  3. Zamontuj układ naczyniowy siatkówki.
    UWAGA: Podczas gdy układ naczyniowy unosi się nad szkiełkiem mikroskopu, izolowane naczynia krwionośne uzyskają swój normalny kształt misy.
    1. Użyj szczotki pętelkowej, aby obrócić półkulę siatkówki skierowaną do góry i delikatnie dociśnij układ naczyniowy w dół na szklane szkiełko, a następnie użyj włosów, aby przymocować otwarte naczynia krwionośne do środka szkiełka. Układ naczyniowy powinien przylegać do szkiełka, gdy się dotyka.
    2. Zamontuj płasko naczynia krwionośne, szczotkując naczynie siatkówki w kształcie misy od nerwu wzrokowego do obwodu.
    3. Powtarzaj szczotkowanie we wszystkich kierunkach, aż układ naczyniowy całkowicie przyklei się do szkiełka.
  4. Wysuszyć na powietrzu naczynia krwionośne siatkówki.
    1. Gdy całe unaczynienie siatkówki przyczepi się do zjeżdżalni, wyjmij zjeżdżalnię z wody, delikatnie podnosząc jedną krawędź lub powoli spuszczając wodę w rogu kasety, aby zminimalizować prądy, a następnie wyciągając ją (Rysunek 2I).
      UWAGA: Układ naczyniowy stanie się dobrze widoczny po wyschnięciu na powietrzu (Rysunek 2J).
    2. Zaznacz obwód układu naczyniowego siatkówki na odwrocie szkiełka markerem.
    3. Przystąp do barwienia próbki bez przerwy.

5. Wykrywanie zgonów za pomocą barwienia TUNEL

UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat tej procedury, zapoznaj się z Zheng et al.21. Reprezentatywne obrazy ciał apoptotycznych wywołanych stresem niedokrwienia +/- wołów w izolowanych naczyniach siatkówki przedstawiono na Rysunek 3.

  1. Ponownie nawodnić izolowane naczynia krwionośne za pomocą PBS. Opłucz go 3 razy w PBS, a następnie inkubuj z 1% Triton X-100 w PBS przez 2 minuty na lodzie, aby przepuszczalność izolowanego naczynia krwionośnego.
  2. Przepłukać szkiełka dwukrotnie za pomocą PBS, aby usunąć resztki Triton X-100. Osuszyć obszar wokół próbki.
  3. Dodać 50 μl mieszaniny reakcyjnej TUNEL (patrz tabela materiałów) na próbkę. Inkubować szkiełko w wilgotnej atmosferze przez 60 minut w temperaturze 37 °C w ciemności.
  4. Przepłukać szkiełko 3 razy PBS w celu usunięcia mieszaniny reakcyjnej TUNEL. Osuszyć obszar wokół próbki.
  5. Dodaj kroplę pożywki montażowej DAPI, aby wybarwić jądra DAPI i zamocuj próbkę za pomocą szkła nakrywkowego. Przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności.
    UWAGA: Protokół może zostać wstrzymany na okres do 1 tygodnia przed zrobieniem zdjęć.
  6. Sfotografuj powstałe naczynia krwionośne za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego (patrz tabela materiałów). Uchwyć sześć do ośmiu losowo wybranych pól na dalekim peryferium otaczającym nerw wzrokowy (Rysunek 4).
    UWAGA: Reprezentatywne obrazy ciał apoptotycznych indukowanych cytokinami w izolowanych naczyniach siatkówki są zilustrowane na Rysunek 5.
  7. Przeanalizuj wyniki.
    1. W przypadku próbek ex vivo poddanych działaniu TBH należy wykonać następujące czynności.
      1. Policz liczbę ciał apoptotycznych (gatunki podwójnie dodatnie TUNEL/DAPI) w każdym polu, korzystając z obrazu J (patrz tabela materiałów). Zlicz średnią ciał apoptotycznych we wszystkich polach pojedynczej próbki.
      2. Oblicz zmianę krotności liczby ciał apoptotycznych między losowo wybraną parą próbek innych niż DM i DM.
      3. Określ, czy istnieje statystycznie istotna różnica, używając dwustronnego testu t-test18.
        UWAGA: Próbki kontrolne i eksperymentalne (inne niż DM i DM) należy zabarwić przy tej samej okazji, ponieważ stopień barwienia TUNEL może się różnić, nawet jeśli jest wykonywany w ten sam sposób. Ponieważ doświadczony użytkownik może wyczyścić i zamontować do 10 siatkówek dziennie, przed rozpoczęciem tego protokołu należy zaplanować przetworzenie równej liczby siatkówek kontrolnych i eksperymentalnych.
    2. W przypadku próbek in vivo, poddanych działaniu koktajlu cytokin, należy wykonać następujące czynności.
      1. Ręcznie policz liczbę ciał apoptotycznych (gatunki podwójnie dodatnie TUNEL/DAPI) w całym unaczynieniu siatkówki.
      2. Oblicz zmianę krotności liczby ciał apoptotycznych między losowo wybraną parą próbek innych niż DM i DM.
      3. Określ, czy istnieje statystycznie istotna różnica, korzystając z dwustronnego testu t-studenta.

Wyniki

Pomyślna izolacja naczyń siatkówki pozwala na uzyskanie preparatu płaskiego całej sieci naczyń siatkówki myszy z zachowaniem nienaruszonej integralności architektonicznej (Rysunek 2J). Po barwieniu metodą okresowo-kwasowo-Schiffa z hematoksyliną (PASH) możliwe jest rozróżnienie dwóch typów komórek naczyniowych: komórek śródbłonka (ECs) oraz perycytów (PCs) (Rysunek 6). Jądra komórek śródbłonka są wydłużone, słabo wybarwione i znajdują się całkowicie w obrębie ścian naczyń. Jądra perycytów są okrągłe, gęsto wybarwione i wystają poza ściany kapilar. Próbki barwione metodą PASH ujawniają również kapilary acelularne, które są pozbawione jąder.

Podejście do indukowania śmierci komórkowej oparto na następującym uzasadnieniu. Przypuszczano, że ochrona była ograniczona, tzn. mogła zostać przełamana przez bardzo silny bodziec indukujący śmierć. W związku z tym zoptymalizowano bodźce (zarówno niedokrwienie/stres oksydacyjny, jak i cytokiny18), aby indukowaly łatwo wykrywalny wzrost, lecz wciąż podmaksymalny zakres śmierci komórkowej (Rycina 3 i Rycina 5).

Należy podkreślić, że obecność jąder dodatnich w metodzie TUNEL była zależna od konkretnego rodzaju czynnika uszkadzającego zastosowanego w celu wywołania śmierci komórek. Uszkodzenie wywołane niedokrwieniem/stresem oksydacyjnym doprowadziło do powstania wzorca apoptozy komórek w formie „torów tramwajowych”, co zilustrowano na Ryc. 3, podczas gdy uszkodzenie cytokinami zaowocowało odmiennym i wyraźnie zdefiniowanym wzorcem, przedstawionym na Ryc. 5. Oba wzorce można zaobserwować w naczyniach siatkówki pacjentów z DR22, co sugeruje, że oba rodzaje czynników indukują śmierć komórek u ludzi. Ponadto zaobserwowane różnice morfologiczne stanowią sposób oceny, czy patologia była napędzana przez stres oksydacyjny, czy przez cytokiny.

Pipety laboratoryjne, pęsety i narzędzia chirurgiczne przygotowane do przygotowania preparatów mikroskopowych.
Rycina 1: Narzędzia do izolacji naczyń siatkówki myszy. Od lewej do prawej: kaseta montażowa, dwa pędzle z pojedynczym włosiem, odwrócona pipeta transferowa, mikroszpatułka, dwie pęsety zakrzywione, nożyczki sprężynowe, mikronóż i pęseta z prostymi końcówkami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Uraz oksydacyjny ex vivo, zapalenie in vivo, układ eksperymentalny, płytka 24-dołkowa, badanie komórkowe.
Rysunek 2: Schemat przedstawiający kluczowe etapy wywołania bodźca indukującego śmierć komórek, a następnie izolacji naczyń siatkówki z oka myszy. (A) Indukcja niedokrwienia/urazu oksydacyjnego, ex vivo. Po enukleacji gałka oczna jest poddawana niedokrwieniu w obecności TBH. (B) Podanie cytokin in vivo (iniekcja do ciała szklistego). (C) Przecięcie gałki ocznej na dwie połowy. (D) Trawienie enzymatyczne siatkówki: usunięcie twardówki i płukanie siatkówki w wodzie dwukrotnie destylowanej przez noc. Inkubacja w roztworze trypsyny YL w 37 °C przez 4 h 15 min w dołku płytki 24-dołkowej. (E) Usunięcie fotoreceptorów. (F) Usunięcie pozostałej tkanki neuronalnej i glejowej. (G) Oczyszczona, miseczkowata sieć naczyniowa skierowana do góry. (H) Izolowana sieć naczyniowa w szalce 35 mm z czarnym tłem na stoliku mikroskopu stereoskopowego. (I) Retinalna sieć naczyniowa zamocowana płasko na szkiełku. (J) Retinalna sieć naczyniowa wysuszona na powietrzu na szkiełku. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Li i wsp.18. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki testu apoptozy TUNEL; obrazy mikroskopii fluorescencyjnej w niedokrwieniu, stresie oksydacyjnym, kontroli.
Rycina 3: Wykrywanie ciał apoptotycznych w naczyniach siatkówki myszy traktowanych ex vivo niedokrwieniem +/- TBH. Reprezentatywne obrazy ciał apoptotycznych indukowanych niedokrwieniem +/- stresem oksydacyjnym w izolowanych naczyniach siatkówki. Nagłówek każdej kolumny wskazuje rodzaj barwienia. (A-C) Naczynia siatkówki izolowane z gałek ocznych poddanych samej 1 h niedokrwieniu. (D-F) Tak jak w (A-C), z wyjątkiem 1 h ekspozycji na kombinację niedokrwienia i stresu oksydacyjnego (5 mM TBH). Czerwone strzałki wskazują reprezentatywne formy podwójnie dodatnie dla TUNEL/DAPI. (G-I) Kontrola dodatnia traktowana DNazą. Pasek skali = 50 µm. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Li et al.18. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat skanowania kafelkowego 5x5 tkanki nerwu wzrokowego, z zaznaczonymi sekcjami do analizy; obraz mikroskopowy.
Rycina 4: Ilustracja wyboru pól do kwantyfikacji wyników. Skan kafelkowy 5 x 5 naczyń siatkówki z nałożonym sygnałem TUNEL i DAPI. Wybór od sześciu do ośmiu pól w dalekiej peryferii otaczającej nerw wzrokowy zaznaczono czerwonymi kwadratami. Powiększenie, 200x. Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Barwienie TUNEL i DAPI w komórkach traktowanych cytokinami, analiza mikroskopowa, obrazowanie apoptozy komórek.
Rycina 5: Wykrywanie ciał apoptotycznych w naczyniach siatkówki myszy w odpowiedzi na dokrwienne wstrzyknięcie cytokin (podanie in vivo). Reprezentatywne obrazy ciał apoptotycznych indukowanych przez cytokiny w izolowanych naczyniach siatkówki. Nagłówek każdej kolumny wskazuje rodzaj barwienia. (A-C) Obrazy naczyń siatkówki izolowanych od myszy, którym wewnątrzgałkowo wstrzyknięto PBS. (D-F) Tak samo jak w (A-C), z wyjątkiem tego, że wraz z PBS wstrzyknięto koktajl cytokin. Czerwone strzałki wskazują reprezentatywne formy TUNEL-dodatnie. Paski skali = 100 µm. Rycina została zmodyfikowana na podstawie Li et al.18. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obraz mikroskopowy struktury sieci polimerowej z zaznaczonymi węzłami; skala badania adhezji komórek 50 µm.
Rycina 6: Reprezentatywny obraz naczyń siatkówki barwionych metodą PASH. Naczynia siatkówki myszy, u której wywołano cukrzycę (DM) za pomocą STZ przez 20 tygodni, wyizolowano zgodnie z opisem na Rycini 2, zabarwiono metodą PASH i obrazowano przy oświetleniu światłem widzialnym. Jądra perycytów w naczyniach włosowatych mają tendencję do bycia bardziej okrągłymi i gęściej zabarwionymi (niebieskie strzałki), podczas gdy wydłużone i mniej gęsto zabarwione jądra są charakterystyczne dla komórek śródbłonka (czerwone strzałki). Żółta strzałka wskazuje na naczynie włosowate acelularne. Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

W tym badaniu ustalono test do wykrywania oporności/podatności układu naczyniowego siatkówki na śmierć wywołaną urazami związanymi z DM/DR, takimi jak niedokrwienie/stres oksydacyjny i cytokiny. Niniejszy manuskrypt zawiera szczegółowy opis tego testu, który jest modyfikacją kilku opublikowanych protokołów 19,20,21.

Protokół obejmuje kilka kluczowych etapów. Po pierwsze, konieczne jest skrupulatne wypreparowanie siatkówki, zapewniając zachowanie sieci naczyniowej i zapobiegając znacznym rozdarciom. Można to osiągnąć, wykonując nacięcie 2-3 mm za rąbkiem, ponieważ siatkówka ściśle przylega do ora serrata, a jej oddzielenie jest trudne. Po drugie, wszystkie narzędzia, które mają kontakt z naczyniami (np. szczotki z pojedynczym włosiem, pipeta do przenoszenia i kleszcze) pokryj trypsyną, zanurzając te narzędzia w roztworze trypsyny YL przez cały zabieg. Zapobiega to przyleganiu układu krwionośnego do instrumentów, które są używane w tym protokole. Po trzecie, ponieważ mikrokrążenie jest prawie niewidoczne w normalnym świetle, wymagana jest wzmożona czujność podczas aspiracji zanieczyszczeń i przenoszenia ich do szkiełka mikroskopowego, aby zapobiec przypadkowej utracie.

Kluczowe znaczenie ma odpowiedni stopień trawienia enzymatycznego różnych warstw siatkówki; Niedostateczne trawienie uniemożliwia oddzielenie tkanki neuronalnej od sieci naczyniowej, natomiast nadmierne trawienie rozpuszcza splot naczyniowy. Zgłaszano różne czasy trawienia, od 1 h19 do nocy 23 . Na podstawie obserwacji czas trawienia wynoszący 4 godziny i 15 minut daje najkorzystniejsze wyniki w porównaniu z czasem trwania 2 godzin, 3 godzin i 4 godzin. Przedłużenie trawienia powyżej tego punktu prawdopodobnie nie poprawi tego procesu, a zamiast tego może zagrozić integralności układu krwionośnego.

W przypadkach, gdy strawiona siatkówka przylega do szczotki z jednym włosiem, zanurz włosy w roztworze trypsyny YL wiele razy. Zmniejsza to lepkie obszary pędzla. Jeśli szczotka do włosów nadal przylega do tkanki naczyniowej, sprawdź, czy nie ma w niej resztek ciał szklistych i usuń je kleszczami.

Optymalnym momentem do całkowitego usunięcia ciała szklistego jest czas po wyeliminowaniu fotoreceptorów, ale przed usunięciem pozostałej tkanki nerwowej i glejowej. Siatkówka zachowuje sztywność do momentu usunięcia fotoreceptorów. Ekstrakcja ciała szklistego na tym etapie może potencjalnie rozerwać siatkówkę/naczynia krwionośne. Delikatne warstwy resztkowej tkanki nerwowej i glejowej odgrywają kluczową rolę w zachowaniu zakrzywionej formy struktury naczyniowej. Zapobiegają rozerwaniu siatkówki w jej środku, gdy ciało szkliste jest oderwane od nerwu wzrokowego.

Jeśli izolowane naczynia w ogóle nie przylegają do szkiełka mikroskopowego, oznacza to, że odcinek szkiełka, w którym spodziewana jest adhezja, jest brudny. Spróbuj przesunąć naczynia po powierzchni szkiełka, aby zlokalizować lepkie miejsce, przełącz się na inny slajd lub skrupulatnie wyczyść szkiełko i spróbuj ponownie. Jeśli naczynia przykleją się do zjeżdżalni, zanim rozwiną się do kształtu przypominającego miskę, podnieś naczynia krwionośne ze zjeżdżalni, aby umożliwić jej ponowne swobodne unoszenie się w wodzie. Wykonaj ten krok za pomocą kleszczy, które były wielokrotnie zanurzane w roztworze trypsyny YL.

Opisano kilka alternatywnych technik izolowania naczyń krwionośnych, które nie byłyby odpowiednie dla opisanego w niniejszym dokumencie testu ochronnego. Na przykład liza osmotyczna została zastosowana do wyizolowania układu naczyniowego z nieutrwalonych próbek siatkówki, ułatwiając badania biochemiczne tkanki24,25. Jednak ta procedura może nie zachować anatomii układu naczyniowego, a także podejścia zastosowanego w tym artykule. Podobnie, podczas gdy metoda odcisku tkankowego w celu wyizolowania dużych segmentów mikrokrążenia umożliwia analizę architektury elektrotonicznej układu krwionośnego26, całe łożysko naczyniowe zwykle nie jest odzyskiwane.

Test ten został opracowany, ponieważ istniejące podejścia do monitorowania zwyrodnienia naczyń włosowatych nie rozwiązują problemu ochrony. Zwyrodnienie naczyń włosowatych, które występuje po długotrwałym zmętnieniu, wskazuje, czy rozwinął się DR. Oprócz diagnozowania DR, wynik ten jest przydatny do oceny, czy środek/terapia zapobiega DR. Jednak istniejące testy zwyrodnienia naczyń włosowatych nie mówią o podstawowym mechanizmie działania środka. Taki środek może zapobiegać zdarzeniom patologicznym, które napędzają DR, takim jak zwiększony stres oksydacyjny lub cytokiny. Alternatywnie, środek może wzmacniać ochronę poprzez zwiększanie odporności na stres oksydacyjny i cytokiny i/lub promować naprawę uszkodzeń. Ten nowy test ochronny może być wykorzystany do określenia, czy korzystny efekt danej terapii obejmuje wzmocnienie endogennego systemu, który chroni przed śmiercią związaną z cukrzycą.

Wadą tego testu ochronnego jest to, że nie rozróżnia on dwóch typów komórek w naczyniach siatkówki: komórek śródbłonka (EC) i perycytów (PC). Chociaż pojawienie się ich jąder w skrawkach wybarwionych PASH jest specyficzne dla typu komórki (ryc. 6), nie każde jądro wykazuje cechy diagnostyczne. Około 30% jąder nie może być jednoznacznie zdefiniowanych jako EC lub PC, przynajmniej częściowo, ponieważ dwuwymiarowe obrazy uzyskane z próbek barwionych PASH nie rozwiązują w pełni trójwymiarowej struktury splotu naczyniowego. Przeszkodę tę można pokonać poprzez dodatkowe analizy, takie jak barwienie immunofluorescencyjne markerami specyficznymi dla typu komórki. Takie obrazy, które odróżniają te dwa typy komórek, mogą być barwione razem z TUNEL w celu określenia odporności/wrażliwości każdego z typów komórek naczyniowych.

Ten test skoncentrowany na naczyniach nie dostarcza żadnych informacji dotyczących siatkówki nerwowej. W celu uzyskania takich informacji można opracować dodatkowe testy. Na przykład, zamiast izolować unaczynienie siatkówki, można wygenerować zawiesinę pojedynczej komórki całej siatkówki, a następnie przeanalizować (przez fluorescencyjne sortowanie aktywowane komórkami) pod kątem odporności/podatności. Włączenie markerów specyficznych dla typu komórki (zarówno neuronalnych, jak i naczyniowych) wraz ze wskaźnikami śmierci komórki zapewniłoby pełniejszy obraz typów komórek siatkówki, które mają zdolność do ochrony przed śmiercią za pośrednictwem DM/DR.

Podsumowując, opisany w niniejszym dokumencie test ochronny stanowi potężne podejście do badania mechanizmu odpowiedzialnego za opóźnienie między wystąpieniem DM a manifestacją DR u myszy.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zgłaszania konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z Illinois Society to Prevent Blindness, National Institute of Health (EY031350 i EY001792) oraz nieograniczony grant od Research to Prevent Blindness Foundation.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10% neutralna buforowana formalinaFischer ScientificSF100-4Fixation
24-dołkowe płytkiFalcon353047
33 G igłaHamiltondostosowany
wodorotlenek amonu Myszy Sigma221228-1L-PCA
C57/BL6/JKoktajl
Cytokine g/ml TNF-&alfa;, 1 &mikro; g/ml IL-1 i beta; oraz 1500 U/&mikro; LIFN- γ
preparacyjnyKażdy mikroskop, który umożliwia dobrą wizualizację siatkówki, jest wystarczający.
Kleszcze Dumont #3Narzędzia do nauki precyzyjnej (FST)11231-30Końcówki proste
Kleszcze Dumont #5 Fine Science Tools (FST)11253-25Mikro-końcówki
Easy-Grip Naczynia do hodowli tkankowychFalcon35300135 x 10 mm
Szklana pipeta transferowaFischer Scientific1367820Aodłamuje cienką końcówkę pipety Pasteura i pasuje do " zepsuty" zakończ gumową żarówką.
Hematoksylina modyfikowana przez Harrisa SigmaHHS32
Image JNIH, Bethesdahttps://imagej.nih.gov/ij/
Zestaw do wykrywania śmierci komórek in situ, mieszaninareakcyjnaFluoresceina Milipore11684795910
Mikro okulary nakrywkoweVWR48366-227mikro 22 mm x 22 mm
 Sharpoint72-1551
MikroszpatułkaFine Science Tools10091-12
Kaseta montażowa Dowolna przezroczysta kaseta, która jest nieco większa niż szkiełko mikroskopu
Kwas okresowySigma3951
kwasu okresowego35 mM kwas okresowy z 12 mM octanem sodu  w H2O 
Średni montaż Permount Fischer ScientificSP15- 100
Prism 9GraphPad
Prolog Gold z DAPIInvitrogen P36935
Rekombinowany ludzki IFN- γPeprotec300-02
Rekombinowana ludzka IL-1 i beta;Peprotec200-01B
Rekombinowany ludzki TNF-&alfa;Schiffa Peprotec300-01A
 Inkubator Sigma3952016
Shaker (wytrząsarka do pępka)IBI Scientific 
Octan soduSigma71196
Sterylna butelka próżniowa SteritopMilliporeSCGPS05RETworzenie przefiltrowanej wody
Szkiełka mikroskopowe z powłoką Superfrost Plus Fischer Scientific12-550-15użyj szkiełek z nieotwartego pudełka
Wodoronadtlenek tert-butylu (TBH)Sigma75-91-2
Baza TRIZMAFischer Scientific11-101-5522zrobić 100 mM Tris, dostosować pH do 7,8 za pomocą HCl)
Trypsyna 1:250Amresco0458-50G
Dwa " pędzle"Wykonane z pojedynczego czarnego włosa  Przyklejone do końca plastikowej rury transferowej.  Jedna szczotka z wolnym końcem. Druga szczotka z pętelką
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools (FST)15000-00
XyleneSigma65351-M
YL roztwór trypsyny 3% trypsyna w 0,1 M Tris (pH 7,8)
Mikroskop fluorescencyjny Zeiss LSM 710Mikroskopia
Jackson Laboratory Jax #000664 składał się ze stosunku 1:1:1 1 i mikro;Mikroskop TUNEL Nóż Roztwór Odczynnik przeciwblakowy Baza odczynnika BBUAAUV1S Zeiss

Bibliografia

  1. Teo, Z. L., et al. Global prevalence of diabetic retinopathy and projection of burden through 2045: Systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 128 (11), 1580-1591 (2021).
  2. Lee, R., Wong, T. Y., Sabanayagam, C. Epidemiology of diabetic retinopathy, diabetic macular edema and related vision loss. Eye Vis (Lond). 2, 21(2015).
  3. Lima, V. C., Cavalieri, G. C., Lima, M. C., Nazario, N. O., Lima, G. C. Risk factors for diabetic retinopathy: A case-control study. Int J Retina Vitreous. 2, 21(2016).
  4. Sabanayagam, C., Yip, W., Ting, D. S., Tan, G., Wong, T. Y. Ten emerging trends in the epidemiology of diabetic retinopathy. Ophthalmic Epidemiol. 23 (4), 209-222 (2016).
  5. Antonetti, D. A., Silva, P. S., Stitt, A. W. Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy. Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).
  6. Wong, T., Cheung, C., Larsen, M., Sharma, S., Simó, R. Diabetic retinopathy. Nat Rev Dis Primers. 2, 16012(2016).
  7. Wu, M. Y., Yiang, G. T., Lai, T. T., Li, C. J. The oxidative stress and mitochondrial dysfunction during the pathogenesis of diabetic retinopathy. Oxid Med Cell Longev. 2018, 3420187(2018).
  8. Hietala, K., Harjutsalo, V., Forsblom, C., Summanen, P., Groop, P. H. Age at onset and the risk of proliferative retinopathy in type 1 diabetes. Diabetes Care. 33 (6), 1315-1319 (2010).
  9. Aiello, L. P., et al. Diabetic retinopathy. Diabetes Care. 21 (1), 143-156 (1998).
  10. Klein, R., Klein, B. E., Moss, S. E., Davis, M. D., Demets, D. L. The wisconsin epidemiologic study of diabetic retinopathy. Prevalence and risk of diabetic retinopathy when age at diagnosis is less than 30 years. Arch Ophthalmol. 102 (4), 520-526 (1984).
  11. Nathan, D. M., et al. The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus. N Engl J Med. 329 (14), 977-986 (1993).
  12. Clustering of long-term complications in families with diabetes in the diabetes control and complications trial. The diabetes control and complications trial research group. Diabetes. 46 (11), 1829-1839 (1997).
  13. Cruickshanks, K. J., Moss, S. E., Klein, R., Klein, B. E. Physical activity and proliferative retinopathy in people diagnosed with diabetes before age 30 yr. Diabetes Care. 15 (10), 1267-1272 (1992).
  14. Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: From molecular approaches to mice and higher mammals. Dis Model Mech. 5 (4), 444-456 (2012).
  15. Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. J Neurophysiol. 113 (4), 1085-1099 (2015).
  16. Sergeys, J., et al. Longitudinal in vivo characterization of the streptozotocin-induced diabetic mouse model: Focus on early inner retinal responses. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (2), 807-822 (2019).
  17. Sun, J. K., et al. Protection from retinopathy and other complications in patients with type 1 diabetes of extreme duration: The joslin 50-year medalist study. Diabetes Care. 34 (4), 968-974 (2011).
  18. Li, Y., et al. The slow progression of diabetic retinopathy is associated with transient protection of retinal vessels from death. Int J Mol Sci. 24 (13), 10869(2023).
  19. Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model. J Vis Exp. 76, e50489(2013).
  20. Veenstra, A., et al. Diabetic retinopathy: Retina-specific methods for maintenance of diabetic rodents and evaluation of vascular histopathology and molecular abnormalities. Curr Protoc Mouse Biol. 5 (3), 247-270 (2015).
  21. Zheng, L., Gong, B., Hatala, D. A., Kern, T. S. Retinal ischemia and reperfusion causes capillary degeneration: Similarities to diabetes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (1), 361-367 (2007).
  22. Mizutani, M., Kern, T. S., Lorenzi, M. Accelerated death of retinal microvascular cells in human and experimental diabetic retinopathy. J Clin Invest. 97 (12), 2883-2890 (1996).
  23. Weerasekera, L. Y., Balmer, L. A., Ram, R., Morahan, G. Characterization of retinal vascular and neural damage in a novel model of diabetic retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (6), 3721-3730 (2015).
  24. Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53 (9), 2404-2411 (2004).
  25. Podestà, F., et al. Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro. Am J Pathol. 156 (3), 1025-1032 (2000).
  26. Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: New experimental approach/new insights. Prog Retin Eye Res. 31 (3), 258-270 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Retinopatia cukrzycowatest ochronnyuszkodzenia wywołane cukrzycąochrona naczyń siatkówkidegeneracja naczyń kapilarnychstres oksydacyjnykomórki śródbłonkapreparat płaski siatkówkisiatkówka myszy
Test do wykrywania ochrony naczyń krwionośnych siatkówki przed śmiercią związaną z cukrzycą u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.