Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mysi model wzrostu naczyń wieńcowych poprzez powtarzające się niedokrwienie

496 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66127

⸱

9 maja 2025

 ,  ,  , 
1Department of Integrative Medical Sciences, Northeast Ohio Medical University, 2Department of Biological Sciences, Kent State University, 3College of Medicine, University of Arizona, Phoenix

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia metodę badania pourodzeniowego wzrostu naczyń wieńcowych wywołanego powtarzającym się niedokrwieniem u myszy, w tym chirurgiczne wszczepienie pneumatycznego okludera na lewej przedniej tętnicy zstępującej, automatyczny system nadmuchiwania dla protokołu powtarzającego się niedokrwienia oraz potencjalne metody oceny wzrostu pobocznego.

Streszczenie

Choroby około-wieńcowe są naturalnym obejściem w chorobach niedokrwiennych serca (IHD), dlatego od wielu lat wzrost naczyń wieńcowych (CCG) jest obiecującym celem terapeutycznym dla IHD, szczególnie u pacjentów z cukrzycą typu 2 lub zespołem metabolicznym, w którym CCG jest upośledzone. Jednak proces ten jest niedostatecznie zbadany, częściowo z powodu braku mysich modeli CCG, mimo że ustalono inne modele zwierzęce, takie jak świnie, psy i szczury. Model mysi może wykorzystać wiele modyfikacji genetycznych dostępnych dla tego gatunku, w tym śledzenie linii i regulację genów (nadekspresja lub nokaut), aby wyjaśnić proces i mechanizm CCG, w tym zaangażowane szlaki i typy komórek. Dlatego postanowiliśmy opracować mysi model CCG indukowany przez powtarzające się niedokrwienie (RI) poprzez przejściowe, powtarzające się zamknięcie lewej przedniej tętnicy zstępującej (LAD). Ten manuskrypt zawiera szczegóły tego mysiego modelu CCG, w tym operację RI polegającą na wszczepieniu pneumatycznego okludera na LAD, zautomatyzowany system nadmuchiwania oparty na ciśnieniu używany do kontrolowania ciśnienia i czasu inflacji oraz sekwencję protokołu RI. Metoda ta zaowocowała już jedną publikacją wyjaśniającą proces CCG indukowany przez RI, pokazując, że kiełkująca angiogeneza prowadzi do powstania dojrzałych tętnic wieńcowych w CCG w sercach dorosłych myszy.

Wprowadzenie

Choroba niedokrwienna serca (IHD) jest główną przyczyną śmiertelności w Stanach Zjednoczonych, a ponad 200 000 operacji pomostowania tętnic wieńcowych jest wykonywanych rocznie w celu leczenia choroby1. Poboczne naczynia wieńcowe, zespolenia między gałęziami drzewa tętnic wieńcowych, są naturalnym obejściem, które może dostarczyć krew do niedokrwionej tkanki poniżej zatoru2; Jednak ludzie wykazują duże zróżnicowanie w zakresie swoich natywnych sieci pobocznych3,4. Pacjenci z IHD, którzy mają bardziej rozległą kolateryzację wieńcową, mają lepsze wyniki podczas zdarzeń sercowych, w tym zmniejszony rozmiar zawału i śmiertelność. W związku z tym wzrost naczyń wieńcowych (CCG) jest celem terapeutycznym od ponad dekady5,6,7. Jest szczególnie interesujący dla rosnącej liczby pacjentów z zespołem metabolicznym8, którzy wykazują gorszą kolateryzację wieńcową9. Jednakże, dopóki proces i mechanizm CCG nie zostaną lepiej poznane, próba indukcji CCG w leczeniu IHD prawdopodobnie nie będzie owocna.

Zabezpieczenia wieńcowe były badane na dużych modelach zwierzęcych, a krótkie, powtarzające się niedrożności głównych tętnic wieńcowych zostały wykorzystane do wywołania CCG u świń10, dogs11, oraz rats12. Mysi model CCG miałby jednak więcej zalet w badaniu molekularnych i komórkowych mechanizmów CCG ze względu na wiele genetycznie zmodyfikowanych linii myszy, które są łatwo dostępne, w tym śledzenie linii, specyficzne dla genów lub komórek linie transgeniczne i knockout. Co ciekawe, w przeciwieństwie do ludzi, myszy nie mają natywnych zabezpieczeń wieńcowych13,14, co czyni je atrakcyjnym modelem do badania powstawania naczyń wieńcowych. Rzeczywiście, niedawny raport wykazał, że u pacjentów z chorobą tętnic obturacyjnych prawie połowa (47%) nie miała kolateralizacji (stopień Rentrop 0)3; w związku z tym mysi model CCG może być klinicznie istotny dla pacjentów z minimalną natywną kolateracyzacją.

Dlatego opracowaliśmy mysi model CCG wywołanego powtarzającym się niedokrwieniem, z nadmuchiwanym okluderem balonowym nad lewą przednią tętnicą zstępującą (LAD), który wykorzystuje system pompowania oparty na ciśnieniu, zautomatyzowany za pomocą timera. Protokół powtarzającego się niedokrwienia jest w stanie stymulować wzrost zabezpieczenia, jak pokazano w niedawnej publikacji14. Ten mysi model CCG dostarczy nowych informacji na temat procesu CCG na poziomie komórkowym i molekularnym i może być wykorzystany do walidacji potencjalnych celów promowania CCG.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Opisane eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Północno-Wschodnim Ohio.

1. Przygotowanie chirurgiczne

UWAGA: Do protokołu RI użyj myszy C57BL/6 obu płci o wadze co najmniej 25 g. Stosuj technikę aseptyczną podczas całej operacji.

  1. Instalacji
    1. Wysterylizuj wszystkie narzędzia w autoklawie lub sterylizatorze perełkowym. Sterylizuj delikatne materiały i implanty, takie jak okluder, linka i rurki PE, za pomocą tlenku etylenu (EtO).
    2. Oczyść obszar operacyjny, przecierając wszystkie obszary 70% etanolem. Przygotuj obszar, rozkładając wszystkie narzędzia i materiały na sterylnych zasłonach. Zobacz tabelę materiałów, aby uzyskać pełną listę materiałów eksploatacyjnych.
  2. Intubacja myszy
    1. Krótko znieczulij mysz 3% izofluranem z tlenem (przepływ 1 l/min), aż do utraty odruchu prostowania. Ogol obszar klatki piersiowej, środek pleców i za prawym uchem; Całkowicie usuń luźne włosy. Glikopirolan należy wstrzykiwać domięśniowo w dawce 0,01-0,02 mg/kg.
    2. Ponownie znieczulenie 3%-4% izofluranem przez 5 minut. Ułóż mysz na wznak na pochyłości, unieruchomionej od górnych siekaczy i użyj kleszczy, aby odsunąć język na bok. Szybko zaintubuj mysz za pomocą angiocathu 20G za pomocą światła światłowodowego i laryngoskopu powiększającego.
    3. Umieść mysz na wznak na rozgrzewającej podkładce chirurgicznej i podłącz rurkę intubacyjną do respiratora dla małych zwierząt z 3% izofluranem. Potwierdź intubację, sprawdzając, czy nie ma rytmicznego obustronnego unoszenia klatki piersiowej. Potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia poprzez brak reakcji na uszczypnięcie palca.
  3. Przygotowanie pola operacyjnego
    1. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
    2. Oczyść ogolone miejsca betadyną, a następnie 70% etanolem, wycierając raz w sposób jednokierunkowy.
    3. Nałóż krem elektrodowy na styki elektrokardiogramu (EKG) na podkładce chirurgicznej i przyklej do nich kończyny myszy. Ułóż sterylną gazę na dolnej połowie myszy.
    4. Monitoruj częstość oddechów, temperaturę i głębokość znieczulenia w trakcie operacji za pomocą interfejsu oprogramowania podkładki chirurgicznej.
  4. Torakotomia lewa i implantacja okludera
    1. Zmniejsz izofluran do 2%. Wykonaj 2-3 cm nacięcie w linii środkowej skóry na klatce piersiowej za pomocą nożyczek, a następnie użyj zakrzywionych kleszczy, aby delikatnie oddzielić warstwę skóry i mięśni po lewej stronie klatki piersiowej (Rysunek 1A).
    2. Za pomocą kleszczy delikatnie wykonaj otwór w ścianie klatki piersiowej, aby odsłonić serce, zwykle między 3. a 5. międzyżebrem.
    3. Użyj retraktora, aby delikatnie rozłożyć żebra i uwidocznić serce. Za pomocą kleszczy rozerwij osierdzie, aby odsłonić serce. Zlokalizuj lewą małżowinę uszną (Ryc. 1B) i wizualizuj podstawową część lewej przedniej tętnicy zstępującej (LAD), jeśli to możliwe.
    4. Podanie 8-0 szew polipropylenowy przez mięsień sercowy pod LAD.
      UWAGA: Odległość między wejściem a wyjściem powinna być mniej więcej równa szerokości okludera i prostopadła do LAD.
    5. Zdemontować zwijacze. Za pomocą spiczastych kleszczy wysuń koniec rurki okludera przez ścianę klatki piersiowej w drugiej dolnej przestrzeni międzyżebrowej i wyciągnij rurkę okludera przez ścianę klatki piersiowej, aż okluder znajdzie się nad sercem w jamie klatki piersiowej.
    6. Przywiąż okluder bezpiecznie do serca za pomocą węzła chirurgicznego (Rysunek 1C) tak, aby okluder leżał na sercu, ale nie wciskał się w nie.
    7. Krótko napompuj okluder (~10 s) przy 10 psi za pomocą przycisku nadmuchiwania (Rysunek 2). Sprawdź EKG, aby potwierdzić uniesienie odcinka ST podczas pompowania i, jeśli to możliwe, wizualnie potwierdź blednięcie wierzchołka serca. Dostosuj pozycję lub napięcie szwu w razie potrzeby, aby potwierdzić niedokrwienie.
  5. Zamykanie
    1. Zamknij żebra boczne szwem polipropylenowym 6-0, wkładając rurkę klatki piersiowej. Usuń powietrze i krew z klatki piersiowej, a następnie wyjmij rurkę klatki piersiowej. Nałóż 2% lidokainy na zamknięte nacięcie w ścianie klatki piersiowej.
    2. Za pomocą spiczastych kleszczy przełóż rurkę okludera pod skórą prawego ramienia, aby zewnętrznie przepuścić rurkę przez skórę za prawym uchem. Wymień mięśnie klatki piersiowej i zamknij skórę szwem poliglaktynowym 6-0 (Rysunek 1D).
    3. Przesuń mysz do pozycji leżącej. Ketoprofen należy podawać podskórnie w dawce 3 mg/kg mc. (przy użyciu rozcieńczenia 1 mg/ml w 0,9% sterylnym roztworze soli fizjologicznej) co najmniej 30 minut przed zakończeniem zabiegu.
  6. Implantacja uwięzi
    1. Za pomocą małych nożyczek wykonaj małe (1 cm) nacięcie na skórze na środku pleców i delikatnie oddziel skórę od podskórnej tkanki tłuszczowej i mięśniowej.
    2. Tunel rurki okludera do nacięcia pośrodku pleców, wyprofiluj go na zewnątrz i przeciągnij przez linkę. Użyj szwu 6-0, aby zamknąć mały otwór w pobliżu ucha.
    3. Użyj szwów polipropylenowych 6-0, aby przymocować linkę do mięśni pleców (Rysunek 1E). Zamknij skórę nad guzikiem linki za pomocą szwów 6-0.
  7. Odzyskiwania
    1. Wyjmij rurkę intubacyjną, gdy mysz będzie w stanie samodzielnie oddychać; umieść mysz w pooperacyjnej klatce RI (dla pojedynczego zwierzęcia; Rysunek 3) gdy powróci reakcja na szczypanie stopy. Monitoruj mysz w sposób ciągły, aż odzyska wystarczającą przytomność, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Umieść klatkę na poduszce grzewczej, aż mysz odzyska pełną mobilność.
    2. Następnego dnia należy podać podskórnie drugą dawkę ketoprofenu w dawce 3 mg/kg.
    3. Pozwól myszy odpocząć przez 5-7 dni przed rozpoczęciem protokołu RI. Codziennie monitoruj myszy pod kątem integralności oprzyrządowania i zmieniaj klatki w razie potrzeby. W razie potrzeby należy zapewnić odpowiednie wzbogacenie, ponieważ myszy są trzymane w pojedynczym pomieszczeniu na czas trwania protokołu RI.

2. Powtarzające się niedokrwienie

  1. Sprawdź umiejscowienie okludera za pomocą echokardiografii w dniu 0 protokołu RI, jak opisano wcześniej15. Obserwuj spadek czynności serca podczas pompowania okludera.
  2. Podłącz rurkę okludera myszy do systemu pompowania RI (Rysunek 4). System napompuje okluder do 10 psi przez 6 minut, 4 razy dziennie, z 3-godzinną przerwą między każdym napompowaniem (Rysunek 5).
  3. Po 17 dniach RI należy ponownie sprawdzić czynność serca, jak w kroku 2.1.

3. Perfuzja polimerów i pobieranie tkanek

  1. W momencie złożenia ofiary znieczulij mysz 3%-4% izofluranem i wstrzyknij heparynę (500 U/kg) dootrzewnowo. Za pomocą stożka nosowego kontynuować podawanie izofluranu w dawce 2% przez co najmniej 5 minut, a następnie potwierdzić odpowiednią głębokość znieczulenia poprzez brak reakcji na uszczypnięcie palca.
  2. Otwórz jamę klatki piersiowej, aby odsłonić serce i aortę piersiową. Kankaniuj zstępującą aortę piersiową za pomocą rurki PE20 i przeciąć żyłę główną dolną (IVC), aby umożliwić odpływ; perfuzjować serce wstecznie za pomocą 1x PBS, aż płyn wychodzący z IVC będzie czysty, a następnie 3 ml 1% lidokainy, a następnie 3 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS. Wykonaj trwałe podwiązanie LAD w dokładnej pozycji okludera.
  3. Wstecznie perfuzjuj serce odczynnikiem nieprzepuszczającym promieni rentgenowskich, aż obwód tętniczy zostanie wypełniony. Zacisnąć rurkę PE20 hemostatykami i pozostawić polimer do utwardzenia przez 90 minut. Wyobraź sobie serce pod lunetą sekcyjną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Spośród 136 myszy C57BL/6, obejmujących zarówno samce, jak i samice, przeżywalność po zabiegu RI wyniosła 93,4%, przy czym 80,9% myszy przeżyło cały 17-dniowy protokół RI.

Protokół RI u myszy został zoptymalizowany na podstawie wcześniejszych zwierzęcych modeli RI12,16, w których występują krótkie epizody niedokrwienia bez trwałego uszkodzenia mięśnia sercowego. Podczas operacji funkcjonalną ocenę okludera można przeprowadzić, obserwuj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Naczynia wieńcowe są naturalnym bypassem dla pacjentów z IHD. Po nieudanych badaniach klinicznych ukierunkowanych na angiogenezę17, promowanie rozwoju naczyń wieńcowych może być lepszym podejściem terapeutycznym dla tych pacjentów. W odróżnieniu od naczyń włosowatych pochodzących z angiogenezy, które mają tylko jedną warstwę komórek śródbłonka, naczynia poboczne są dojrzałymi tętnicami pokrytymi komórkami mięśni gładkich. Zabezpieczenia uzupełniają przepływ krwi do obszarów niedokrwienia mięśnia s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Weiguo Wanowi, Cody'emu Juguilonowi, Iyanuoluwie Ogunmiluyi i Devanowi Richardsonowi za ich wkład w omawiane tutaj metody. Prace te były wspierane przez 1R15HL115540-01 i 1 R01 HL137008-01A1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kleszcze #5/45 stopniFine Science Tools11251-35
1/4 "Zamknięty mosiężny elektryczny zawór elektromagnetycznyU.S. SolidUSS2-00054system pompowania
1/4" Otwarty mosiężny elektryczny zawór elektromagnetycznypompowaniaAceCrew
Przewody pneumatyczne 1/4"‎ Chiny SNS Pneumatic Co., Ltd‎ APU1/4-32.8ftUrządzenie przyciskowe
Złącza wtykowe 1/4" UrządzenieprzyciskoweRuoFeng543Y
Złączki mosiężne 1/8"Edge Przemysłowysystem nadmuchiwania
2-pozycyjny pneumatyczny elektryczny zawór elektromagnetycznyU.S. SolidUSS-PSV00033urządzenie przyciskowe
20G angiocathBD381703
45 stopni Uchwyty do igieł CastroviejoRobozRS-6421
6-0 nici poliglaktynoweDemeTECHG176011B13M
6-0 nici polipropylenoweAD SugicalXS-P618R11
70% etanolu
8-0 nici polipropylenoweDemeTECHPM19800, 65G0P
BetadinePurdue Produkty367618150085
Nożyczki z noskiemŚwiatowe instrumenty precyzyjne500366
trzonkiem; przycięte do 12,5 cm
Waciki bawełniane (3")Puritan872-PC DBL
Curity Gąbki z gazy (2x2)Cardinal Health2146
Dipsey Obrotowe ciężarkiGremlinwodnyklatka pooperacyjna
Krem do elektrodSignacreme17-05
GlikopirolanWestward0143-9679-01
Hemostatyki HartmanaNarzędzia Fine Science13003-10
IsofluraneCovetrus29404
Ketofen (ketoprofen)zoetis10004031
Lidokaina (2%)Covetrus14583
MICROFIL (żółty)Flow TekMV-122
Mini przyciskInteractiviaE-SWC-PBM-PBS-105z przyciskiem
Miniaturowy regulator ciśnienia powietrzaUrządzenie przyciskowePneumaticPlusPPR2-N02BG-4
Zwijacz sprężynowy Mini-ColibriFine Science Tools17000-01
Wentylator MiniVentAparat Harvarda73-0044
OkluderWykonane na zamówienie
kleszcze z ośmiokątnym uchwytemFine Science Tools11041-08
System intubacji gryzoni OhanDostawa BMR RoztwórOhan-201
4% w rurkach
PE20
PE50
Plastikowy krętlik (1 kanał)Klatka pooperacyjnaInstech375/25PS
Wstępnie zmieszany bufor PBS, 10xRoche11666789001Rozcieńczony do 1x
ManometrMierniki102D-158D-10/32z przyciskiem
Programowalny cyfrowy wyłącznik czasowyBN-LINK‎ System pompowania BND-60/SU105
Maść okulistyczna Puralube VetDechra17033-211-38
Retraktory z elastomerem 18200-07Fine Science Tools18200-10 i 18200-11
Monitor chirurgiczny dla gryzoni +Scintica900-0053-01
Kleszcze do wiązania szwów z okrągłym uchwytemFine Science Tools18026-10
Snap-lock krętlik lufy (rozmiar 5)Eagle Claw‎ 01032-005klatka pooperacyjna
Proste uchwyty na igłyFine Science Tools12060-01
UwięźInstechPS62
System Klatka pooperacyjna z strzały z włókna węglowego urządzenie paraformaldehydu PBS Santa Cruz sc-281692 Rurka urządzenie

Bibliografia

  1. Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2023 update: A report from the American heart association. Circulation. 147 (8), e93-e621 (2023).
  2. Chilian, W. M., et al. Coronary collateral growth--back to the future. J Mol Cell Cardiol. 52 (4), 905-911 (2012).
  3. Liu, Z., et al. Coronary collateralization shows sex and racial-ethnic differences in obstructive artery disease patients. PLoS One. 12 (10), e0183836(2017).
  4. Kinnaird, T., Stabile, E., Zbinden, S., Burnett, M. S., Epstein, S. E. Cardiovascular risk factors impair native collateral development and may impair efficacy of therapeutic interventions. Cardiovasc Res. 78 (2), 257-264 (2008).
  5. Traupe, T., Gloekler, S., de Marchi, S. F., Werner, G. S., Seiler, C. Assessment of the human coronary collateral circulation. Circulation. 122 (12), 1210-1220 (2010).
  6. Schaper, W. Collateral vessels reduce mortality. Eur Heart J. 33 (5), 564-566 (2012).
  7. Meier, P., et al. The impact of the coronary collateral circulation on mortality: a meta-analysis. Eur Heart J. 33 (5), 614-621 (2012).
  8. Hirode, G., Wong, R. J. Trends in the prevalence of metabolic syndrome in the United States, 2011-2016. JAMA. 323 (24), 2526-2528 (2020).
  9. Turhan, H., et al. Impaired coronary collateral vessel development in patients with metabolic syndrome. Coron Artery Dis. 16 (5), 281-285 (2005).
  10. Ishikawa, K., et al. Development of a preclinical model of ischemic cardiomyopathy in swine. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (2), H530-H537 (2011).
  11. Rys, R., et al. An automated coronary artery occlusion device for stimulating collateral development in vivo. J Pharmacol Toxicol Methods. 48 (2), 111-118 (2002).
  12. Toyota, E., et al. Vascular endothelial growth factor is required for coronary collateral growth in the rat. Circulation. 112 (14), 2108-2113 (2005).
  13. Zhang, H., Faber, J. E. De novo collateral formation following acute myocardial infarction: Dependence on CCR2⁺ bone marrow cells. J Mol Cell Cardiol. 87, 4-16 (2015).
  14. Jamaiyar, A., et al. The essential role for endothelial cell sprouting in coronary collateral growth. J Mol Cell Cardiol. 165, 158-171 (2022).
  15. Yin, L., et al. Induction of vascular progenitor cells from endothelial cells stimulates coronary collateral growth. Circ Res. 110 (2), 241-252 (2012).
  16. Lavine, K. J., Kovacs, A., Weinheimer, C., Mann, D. L. Repetitive myocardial ischemia promotes coronary growth in the adult mammalian heart. J Am Heart Assoc. 2 (5), e000343(2013).
  17. Simons, M., et al. Clinical trials in coronary angiogenesis: issues, problems, consensus: An expert panel summary. Circulation. 102 (11), E73-E86 (2000).
  18. Leavesley, S. J., Ledkins, W., Rocic, P. A device for performing automated balloon catheter inflation ischemia studies. PLoS One. 9 (4), e95823(2014).
  19. Aghajanian, A., et al. Decreased inspired oxygen stimulates de novo formation of coronary collaterals in adult heart. J Mol Cell Cardiol. 150, 1-11 (2021).
  20. He, L., et al. Genetic lineage tracing discloses arteriogenesis as the main mechanism for collateral growth in the mouse heart. Cardiovasc Res. 109 (3), 419-430 (2016).
  21. Das, S., et al. A unique collateral artery development program promotes neonatal heart regeneration. Cell. 176 (5), 1128-1142.e18 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Choroba niedokrwienna sercakrążenie oboczne w tętnicach wieńcowychprzedniatka zstępująca lewej tętnicy wieńcowejpneumatyczny okluderangiogenezaknockout genowyśledzenie linii komórkowych

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.