Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Różnicowanie linii jelitowego układu nerwowego od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

2.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66133

⸱

17 maja 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Pharmacology, University of California, San Francisco, 2Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research, University of California, San Francisco, 3Program in Craniofacial Biology, University of California, San Francisco

W tym artykule

Podsumowanie

Wywodzenie linii jelitowego układu nerwowego (ENS) z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) stanowi skalowalne źródło komórek do badania rozwoju i chorób ENS oraz do wykorzystania w medycynie regeneracyjnej. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół in vitro do wyprowadzania neuronów jelitowych z hPSC przy użyciu chemicznie zdefiniowanych warunków hodowli.

Streszczenie

Ludzki jelitowy układ nerwowy, ENS, to duża sieć typów komórek glejowych i nerwowych z niezwykłą różnorodnością neuroprzekaźników. ENS kontroluje perystaltykę jelit, wydzielanie enzymów i wchłanianie składników odżywczych oraz współdziała z układem odpornościowym i mikrobiomem jelitowym. W związku z tym wady rozwojowe i nabyte ENS są odpowiedzialne za wiele chorób człowieka i mogą przyczyniać się do objawów choroby Parkinsona. Ograniczenia w systemach modeli zwierzęcych i dostęp do tkanek pierwotnych stanowią poważne wyzwanie eksperymentalne w badaniach nad ludzkim ENS. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół skutecznego wyprowadzania in vitro linii ENS z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, hPSC, przy użyciu określonych warunków hodowli. Nasz protokół rozpoczyna się od ukierunkowanego różnicowania hPSC do jelitowych komórek grzebienia nerwowego w ciągu 15 dni i daje różne podtypy funkcjonalnych neuronów jelitowych w ciągu 30 dni. Platforma ta zapewnia skalowalne zasoby do badań rozwojowych, modelowania chorób, odkrywania leków i zastosowań regeneracyjnych.

Wprowadzenie

Jelitowy układ nerwowy (ENS) jest największym składnikiem obwodowego układu nerwowego. ENS zawiera ponad 400 milionów neuronów, które znajdują się w przewodzie pokarmowym i kontrolują prawie wszystkie funkcje jelita1. Molekularne zrozumienie rozwoju i funkcji ENS oraz jego defektów w neuropatiach jelitowych wymaga dostępu do wiarygodnego i autentycznego źródła neuronów jelitowych. Dostęp do pierwotnej tkanki ludzkiej jest ograniczony, a modele zwierzęce nie są w stanie podsumować kluczowych fenotypów choroby w wielu neuropatiach jelitowych. Technologia ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) okazała się niezwykle korzystna w dostarczaniu nieograniczonego źródła pożądanych typów komórek, zwłaszcza tych, które są trudne do wyizolowania od pierwotnych źródeł2,3,4,5,6,7. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe informacje na temat etapowej i solidnej metody in vitro do uzyskiwania kultur ENS z hPSC. Te skalowalne kultury pochodzące z hPSC otwierają drogę do badań rozwojowych, modelowania chorób i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, a także mogą dostarczyć komórek do przeszczepu dla medycyny regeneracyjnej.

Linie neuronów jelitowych wywodzą się z komórek grzebienia nerwowego (NC) podążających ścieżką rozwoju ENS podczas embriogenezy. W zarodkach komórki NC wyłaniają się wzdłuż brzegów składanej płytki nerwowej. Namnażają się, migrują i dają początek wielu różnym typom komórek, w tym neuronom czuciowym, komórkom Schwanna, melanocytom, szkieletowi twarzoczaszki i neuronom jelitowym oraz glejowi8,9,10. Decyzja o losie komórki zależy od odrębnego obszaru wzdłuż osi przednio-tylnej, z którego wyłaniają się komórki NC, tj. NC czaszki, NC błędnego, NC tułowia i NC krzyżowego. ENS rozwija się z komórek NC nerwu błędnego i krzyżowego, przy czym te pierwsze dominują w populacji neuronów jelitowych ze względu na rozległą migrację wzdłuż jelita i kolonizację jelita11.

Wyprowadzanie komórek NC z PSC zwykle wiąże się z kombinacją podwójnej inhibicji SMAD i aktywacji szlaku WNT12,13. Do niedawna wszystkie protokoły indukcji NC obejmowały surowicę i inne dodatki do produktów pochodzenia zwierzęcego w warunkach hodowli. Niezdefiniowane chemicznie podłoża nie tylko obniżają odtwarzalność indukcji NC, ale także stanowią wyzwanie dla mechanistycznych badań rozwojowych. Aby sprostać tym wyzwaniom, Barber i in14 opracowali protokół indukcji NC przy użyciu chemicznie zdefiniowanych warunków hodowli, dzięki czemu był lepszy od alternatywnych metod, które opierają się na czynnikach zastępujących surowicę (np. KSR)13,14. Uzyskano to poprzez wymianę pożywki podstawowej i optymalizację protokołu pierwotnie przedstawionego przez Fattahi i wsp. w celu uzyskania jelitowych komórek NC z hPSC. Ten ulepszony system jest podstawą protokołu różnicowania hPSC, który jest tutaj przedstawiony. Rozpoczyna się od indukcji komórek jelitowego grzebienia nerwowego (ENC) w ciągu 15 dni poprzez precyzyjną modulację sygnalizacji BMP, FGF, WNT i TGFβ oprócz kwasu retinowego (RA). Następnie wyprowadzamy linie ENS, traktując komórki czynnikiem neurotroficznym pochodzącym z linii komórek glejowych (GDNF). Wszystkie składy pożywek są zdefiniowane chemicznie i dają solidne hodowle neuronów jelitowych w ciągu 30-40 dni.

Oprócz opisanego tutaj systemu hodowli komórek jednowarstwowych, opracowano alternatywne metody indukcji NC, które wykorzystują swobodnie pływające ciała embrionalne15,16. Wykazano, że komórki migrujące w tych kulturach wykazują ekspresję markerów NC z podzbiorem reprezentującym NC błędne. Kokultury z pierwotną tkanką jelitową wykorzystano do wzbogacenia jelitowych prekursorów NC w tych kulturach. Składy pożywek w tych badaniach zawierają kombinację różnych czynników, takich jak czynnik wzrostu nerwów, NT3 i czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego. Na tym etapie nie jest do końca jasne, w jaki sposób czynniki te mogą wpływać na tożsamość zaangażowania prekursorów neuronów jelitowych. Do skutecznego porównania indukcji NC jelitowej w hodowlach jednowarstwowych i opartych na ciele zarodka potrzeba więcej danych. Biorąc pod uwagę różne układy kultur w tych strategiach, użycie każdej metody powinno być przemyślane i zoptymalizowane zgodnie z konkretnym zastosowaniem.

Przedstawiony tutaj protokół jest powtarzalny i został pomyślnie przetestowany przez nas i innych przy użyciu różnych linii hPSC (indukowanych i embrionalnych)8,14,16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie mediów

UWAGA: Stężenia wymienione w protokole są końcowymi stężeniami składników mediów. Przygotować wszystkie podłoża w sterylnych warunkach w okapie z przepływem laminarnym i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności. Zużyć w ciągu 2 tygodni.

  1. Pożywka konserwacyjna hPSC: Wymieszać suplement pożywki podtrzymującej hPSC bez podawania (20 μl/ml) z pożywką podstawową.
  2. Pożywka A: Dodać białko morfogenetyczne kości 4 (BMP4; 1 ng/ml), SB431542 (10 μM) i CHIR99021 (600 nM) do podłoża różnicującego.
  3. Podłoże B: Dodać SB431542 (10 μM) i CHIR99021 (1,5 μM) do podłoża bazowego do różnicowania.
  4. Pożywka C: Dodać SB431542 (10 μM), CHIR99021 (1,5 μM) i RA (1 μM) do podłoża bazowego do różnicowania.
  5. Kompletne podłoże dla grzebienia nerwowego (NCC): Dodaj FGF2 (10 ng / ml), CHIR99021 (3 μM), suplement N2 (10 μl / ml), suplement B27 (20 μl / ml), suplement L-glutaminy (10 μl / ml) i MEM NEAA (10 μl / ml) do podłoża neuropodstawnego.
  6. Pożywka ENC: Dodaj GDNF (10 ng/ml), kwas askorbinowy (100 μM), suplement N2 (10 μL/ml), suplement B27 (20 μL/ml), suplement L-glutaminy (10 μL/ml) i MEM NEAAs (10 μL/ml) do podłoża neuropodstawnego.
  7. Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) 1x: Rozcieńczyć 500 mM EDTA (1000x) do końcowego stężenia 500 μM w PBS.
    UWAGA: W całym tym protokole należy używać PBS wolnych od Ca2+ i Mg2+, chyba że zaznaczono inaczej.

2. Powlekanie płytek hodowlanych

  1. Płytki pokryte matrycą membrany podstawnej: Szybko rozmrozić i rozcieńczyć 500 μl zamrożonej podwielokrotności macierzy błony podstawnej w 50 ml schłodzonego DMEM:F12 przez energiczne pipetowanie za pomocą pipety serologicznej o pojemności 50 ml. Pokryć studzienki rozcieńczonym roztworem matrycy membrany podstawnej (100 μl nacm2 powierzchni studzienki) i inkubować je przez noc w temperaturze 37 °C. Przed użyciem odessać podłoże powlekające. Aby zapobiec żelatynizacji macierzy błony podstawnej, należy wykonać ten krok tak szybko, jak to możliwe i użyć zimnego DMEM:F12 do rozpuszczenia zamrożonej podwielokrotności.
    UWAGA: Temperatura matrycy membrany podstawnej powinna być utrzymywana na niskim poziomie podczas rozmrażania (na lodzie) i porcjowania (probówki na lodzie), aby zapobiec krzepnięciu.
  2. Płytki powlekane PO/FN/lamininą: Przygotować 15 μg/ml roztworu poliornityny (PO) w PBS, rozcieńczając 1000-krotny bulion. Studzienki pokryć 100 μl roztworu PO/PBS nacm2 powierzchni studzienki i inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C. Następnego dnia odessać PO/PBS i pokryć studzienki w stężeniu 100 μl nacm2 powierzchni studzienki świeżo przygotowanym roztworem FN/lamininy/PBS zawierającym 2 μg/ml fibronektyny (FN) i 2 μg/ml lamininy. Płytki można stosować po minimum 2 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C. Przed użyciem odsysać FN/lamininę/PBS.

3. Utrzymanie hodowli hPSC

UWAGA: Wszystkie etapy inkubacji komórek odbywają się przy 5% CO2 i 37 °C w nawilżanym inkubatorze.

  1. Odessać pożywkę hPSC z kultury hPSC i dodawać świeżą pożywkę (200 μl nacm2 powierzchni studzienki) co drugi dzień, aż kolonie będą zlewać się w ~80%.
  2. Aby przejść, odessać pożywkę hPSC i przepłukać komórki 100 μl PBS nacm2 powierzchni studzienki.
    UWAGA: Ważne jest, aby do mycia komórek używać PBS wolnego od Ca2+ i Mg2+
    3. .
  3. Dodać 500 μM EDTA (100 μL nacm2 powierzchni studzienki). Załóż pokrywę talerza. Obserwuj przez odwrócony mikroskop i monitoruj komórki pod kątem oderwania się krawędzi kolonii (2-4 min).
  4. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 lub 10 ml przenieś tę samą objętość pożywki hPSC do każdej studzienki i mechanicznie zbierz komórki, pipetując kilka razy w górę i w dół.
    UWAGA: Optymalny czas inkubacji EDTA zależy od linii iPSC. Należy unikać energicznego pipetowania w celu oderwania kolonii, ponieważ może to prowadzić do nadmiernej dysocjacji kolonii i śmierci komórki. Podczas pasażu w celu rozpoczęcia płytki różnicowej, inkubuj komórki z EDTA przez 1-2 minuty dłużej.
  5. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki (2 min, 290 x g, 20-25 °C) i ostrożnie wyrzucić supernatant.
  6. Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości pożywki hPSC i przenieść do studzienek nowej płytki pokrytej matrycą błony podstawnej.
    UWAGA: Do regularnej konserwacji hPSC należy stosować współczynnik pasażowania 1:18 - 1:24 (1:18 oznacza przeniesienie jednej trzeciej komórek zdysocjowanych z pojedynczego dołka płytki 6-dołkowej do całkowicie nowej płytki). Aby rozpocząć tworzenie płytki różnicującej, należy przestrzegać współczynnika przejścia 5:6.
  7. Inkubować w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C.

4. Indukcja grzebienia nerwowego

UWAGA: Ten krok jest schematycznie przedstawiony w Rysunek 1A. Rozpocznij różnicowanie NC, gdy komórki są w około 80% zlewne. Zostanie to osiągnięte w ciągu 1-2 dni, gdy komórki zostaną przepasane w stosunku 5:6 (patrz wyżej). Rozpocznij różnicowanie NC w dniu 0 z pluripotencjalnymi i całkowicie niezróżnicowanymi komórkami hPSC. Aby uzyskać wysoką wydajność, granice kolonii powinny mieć minimalne różnicowanie komórek. Pasaż i płytka hPSC do różnicowania, gdy kolonie są duże lub środek kolonii zaczyna gęstnieć/ciemnieć podczas monitorowania za pomocą odwróconego mikroskopu. Zwracanie uwagi na konfluencję i morfologię wydaje się być bardziej wiarygodne niż liczba posianych komórek, ponieważ może się ona różnić w zależności od linii komórkowej i może wynosić od 50 000 do 200 000 na cm2.

  1. W dniu 0 zastąpić pożywkę konserwacyjną hPSC pożywką A zawierającą 1 ng/ml BMP4, 10 μM SB431542, 600 nM CHIR99021 (200 μl pożywki nacm2 powierzchni studzienki).
  2. W dniu 2 komórki powinny być w 100% zlewne. Delikatnie odessać zużyte podłoże A i nakarmić komórki pożywką B zawierającą 10 μM SB431542, 1,5 μM CHIR99021 (200 μl pożywki nacm2 powierzchni studzienki).
    UWAGA: W miarę wzrostu kultur podczas indukcji NC komórki mogą odłączyć się od leżącej pod spodem monowarstwy. Unikaj nadmiernej utraty komórek, delikatnie usuwając stare podłoże i dodając świeże podłoże z boku studzienki.
  3. W 4 dniu ponownie nakarmić komórki pożywką B (200 μl pożywki nacm2 powierzchni studzienki).
  4. W dniu 6 zastąp pożywkę B pożywką C zawierającą 10 μM SB431542, 1,5 μM CHIR99021 i 1 μM kwasu retinowego (400 μL pożywki nacm2 powierzchni studzienki).
  5. W dniach 8 i 10 karm jak w dniu 6.

5. Formacja sferoidów ENC

UWAGA: Ten krok jest schematycznie przedstawiony w Rysunek 1B.

  1. W 12 dniu delikatnie odessać pożywkę C i przemyć komórki 100 μl PBS nacm2 powierzchni studzienki. Dodać taką samą objętość roztworu oddzielającego komórki i inkubować przez 30 minut w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C.
  2. Rozcieńczyć roztwór do odrywania komórek, dodając tę samą objętość pożywki NCC zawierającej 10 ng/ml FGF2, 3 μM CHIR99021, 10 μL/ml suplementu N2, 20 μl/ml suplementu B27, 10 μL/ml suplementu L-glutaminy i 10 μL/mL MEM NEAA. Za pomocą pipety serologicznej pobrać zawiesinę jednokomórkową i dodać ją do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  3. Odwirować komórki (2 min, 290 x g, 20-25 °C) i ostrożnie wyrzucić supernatant.
  4. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml dodać 12 ml (na pełną 6-dołkową płytkę) pożywki NCC i całkowicie zawiesić komórki, pipetując mechanicznie w górę i w dół 1-2 razy. Przenieś zawiesinę ogniw na bardzo niską płytkę mocującą.
    UWAGA: Około 10cm2 komórek jednowarstwowych ENC zawiesza się ponownie w 2 ml pożywki NCC i przenosi do jednego dołka o bardzo niskiej płytce mocującej. Jest to równoznaczne z pełną 6-dołkową płytką indukcyjną NC przeniesioną do pełnej 6-dołkowej płytki mocującej o bardzo niskim nasadce.
  5. W dniu 14 delikatnie obracaj płytki, aż małe sferoidy zbiorą się na środku każdej studzienki. Za pomocą mikropipety P1000 i powolnymi ruchami okrężnymi odessać zużyte podłoże NCC na obwodzie każdej studzienki. Staraj się unikać usuwania swobodnie unoszących się sferoid.
  6. Nakarm komórki oryginalną objętością pożywki NCC.

6. Indukcja EN

UWAGA: Ten krok jest schematycznie przedstawiony w Rysunek 1B.

  1. W dniu 15 zastosuj tę samą technikę, co w dniu 14, aby delikatnie usunąć pożywkę i przemyć sferoidy PBS. Usuń jak najwięcej PBS, unikając sferoid.
  2. Dodać roztwór do oddzielania komórek (100 μl nacm2 powierzchni studzienki) i rozdzielić sferoidy na pojedyncze komórki przez inkubację przez 30 minut w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C.
  3. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml dodaj równą objętość pożywki ENC (zawierającej 10 ng/ml GDNF, 100 μM kwasu askorbinowego, 10 μl/ml suplementu N2, 20 μl/ml suplementu B27, 10 μl/ml suplementu L-glutaminy i 10 μL/mL MEM NEAA w podłożu neurobazalnym) do każdej studzienki i rozbij pozostałe sferoidy przez 2-3 rundy mechanicznego pipetowania. Przenieść komórki do probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Należy unikać nadmiernego stresu i śmierci komórek, które mogą wystąpić w wyniku wymuszonego pipetowania lub używania pipet z mniejszym otworem końcówki.
  4. Odwirować komórki (2 min, 290 x g, 20-25 °C) i ostrożnie wyrzucić supernatant. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml dodać ~ 5-10 ml pożywki ENC i całkowicie zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół 1-2 razy.
  5. Policz stężenie żywotnych komórek za pomocą błękitu trypanowego i metody liczenia komórek, takiej jak hemocytometr.
    UWAGA: Błękit trypanowy jest podejrzewany jako czynnik rakotwórczy. Obchodź się ostrożnie, zutylizuj odpowiednio.
  6. Dodaj wystarczającą objętość pożywki ENC, dążąc do pokrycia około 300 000-400 000 żywotnych komórek na cm2 powierzchni o gęstości około ~ 1 000 000 komórek na ml. Odessać roztwór FN/lamininy/PBS z dołków płytki.
    UWAGA: Należy wybrać format płytki zgodnie z testami, które są planowane dla kultur EN, ponieważ ten etap oznacza ostatni etap ponownego powlekania w protokole. Komórki progenitorowe neuronów jelitowych można zamrozić w 15 dniu. Po dysocjacji kulek roztworem do odłączania komórek, ponownie zawieś progenitory w około 5 x 106 komórek/ml w pożywce zamrażającej, takiej jak 10% DMSO lub Stem-cellbanker. W razie potrzeby rozmrozić w ciepłym podłożu ENC z inhibitorem 5 μM Y-27632 ROCK. Komórki płytowe w żądanym formacie płyty. Po kilku godzinach wymień nośnik na nowy ENC.
  7. Delikatnie dodaj komórki do studzienek pokrytych PO/FN/lamininą. Unikaj uwięzienia pęcherzyków pod zawiesiną komórkową, zapobiegając przyczepianiu się komórek do powłoki PO/FN/lamininy, szczególnie w przypadku stosowania płytek o mniejszym rozmiarze dołka, takich jak płytki 384-dołkowe. Może to prowadzić do śmierci komórki.
  8. Karmić komórki co drugi dzień pożywką ENC (200 μl nacm2 powierzchni studzienki) do 30-40 dnia, po czym zmniejsz częstotliwość karmienia (do raz lub dwa razy w tygodniu), ale podwoić objętość karmienia (do 400 μl pożywki nacm2 powierzchni studzienki).
    UWAGA: Jest to ważne, ponieważ nadmierne usuwanie i dodawanie pożywki może ułatwić oderwanie się kultury neuronalnej od powierzchni studzienek. Aby prospektywnie zapobiec oderwaniu, szczególnie w przypadku długotrwałych hodowli, uzupełnij ENC FN (2 μg/ml) i lamininę (2 μg/ml) raz w tygodniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół przedstawia metodę otrzymywania grzbietowej grzebienia neuronalnego jelit oraz neuronów jelitowych z hPSC z wykorzystaniem chemicznie zdefiniowanych warunków hodowli (Rysunek 1A-B). Generowanie wysokiej jakości neuronów zależy od etapu efektywnej indukcji grzebienia neuronalnego jelit. Można to ocenić wizualnie, sprawdzając morfologię swobodnie pływających sferoidów, które powinny mieć okrągły kształt, gładką powierzchnię i wielkość około 0,1 - 0,4 mm, co ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół różnicowania zapewnia solidną metodę in vitro do uzyskiwania neuronów jelitowych z hPSC w ciągu 30-40 dni (ryc. 1E) i gleju jelitowego z ekspresją kwaśnego białka fibrylarnego gleju, GFAP i SOX10 w starszych kulturach (> dzień 55)13,14,19,22. Te neurony i komórki glejowe są indukowane przez stopniowe różnicowanie hPSC w komórki grzeb...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Praca była wspierana przez granty z UCSF Program for Breakthrough Biomedical Research i Sandler Foundation, grant March of Dimes nr 1-FY18-394 i 1DP2NS116769-01, NIH Director's New Innovator Award (DP2NS116769) dla F.F. oraz National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK121169) dla F.F., H.M. jest wspierany przez stypendium podoktorskie Fundacji Larry'ego L. Hillbloma, Stypendium NIH T32-DK007418 oraz niezależne stypendium podoktorskie UCSF Program for Breakthrough Biomedical Research.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas askorbinowySigma-AldrichA5960
B27 suplement (bez surowicy, bez witaminy A)Gibco12587-010
Macierz błony podstawnej, GeltrexGibcoA14133-2
BMP4R& D systems314-BP
Wirówka do hodowli komórkowychEppendorf, nr modelu 5810R02262501
Roztwór do oddzielania komórek, AccutaseStemcell Technologies07920
CHIR99021Tocris4423
Probówki stożkoweUSAscientific 1475-0511, 1500-1211
Pożywka bazowa różnicowania, Essential 6Life TechnologieA1516401
DMEM/F-12 bez glutaminyLife Technologies21331020
EDTACorningMT-46034CI
Bezzasilająca pożywka konserwacyjna hPSC, zestaw Essential 8 Flex MediumLife TechnologiesA2858501
FGF2R& Systemy D233-FB/CF
FibronectinCorning356008
GDNFPeprotech450-10
HemocytometrHausser Scientific1475
Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste, H9 ESCWiCellRRID: CVCL_1240
Inkubator z kontrolowaną wilgotnością, temperaturą i CO2Thermo Fisher ScientificHerralcell 150i
Mikroskop odwróconyThermo Fisher ScientificEVOS FL
Okap z przepływem laminarnymThermo Fisher Scientific1300 seria klasa II, typ A2
LamininCultrex3400-010
Suplement L-glutaminy, GlutagroCorning25-015-CI
MEM NEAAsCorning25-025-CI
Płytki wielodołkowe, FalconBD353934, 353075
Suplement N-2CTSA1370701
Neurobasal MediumLife Technologies21103049
PBS (wolne od Ca i Mg)Life Technologies10010023
Napełniacz do pipetEppendorfZ768715-1EA
Końcówki do pipetUSA scientific1111-2830
PipetyFisherbrand13-678-11E, 13-678-11F
POSigma-AldrichP3655
polimerowe płytki obrazowe z dnem szkiełka nakrywkowego, ibidiibidi81156
RASigma-AldrichR2625
SB431542R& D systems1614
Trypan blue stain, 0,4%Thermo Fisher Scientific15250-061
Ultra-low attachment platesFisher Scientific07-200-601
Y-27632 dichlorowodorekR& Systemy D1254

Bibliografia

  1. Gershon, M. D. The enteric nervous system: a second brain. Hosp Pract. 34 (7), 35-38 (1999).
  2. Haggarty, S. J., Silva, M. C., Cross, A., Brandon, N. J., Perlis, R. H. Advancing drug discovery for neuropsychiatric disorders using patient-specific stem cell models. Mol Cell Neurosci. 73, 104-115 (2016).
  3. Bose, A., Petsko, G. A., Studer, L. Induced pluripotent stem cells: a tool for modeling Parkinson's disease. Trends Neurosci. 45 (8), 608-620 (2022).
  4. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Dev Camb Engl. 145 (5), (2018).
  5. Marchetto, M. C. N., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
  6. Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  7. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
  8. Shyamala, K., Yanduri, S., Girish, H. C., Murgod, S. Neural crest: The fourth germ layer. J Oral Maxillofac Pathol. 19 (2), 221-229 (2015).
  9. Crane, J. F., Trainor, P. A. Neural crest stem and progenitor cells. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 267-286 (2006).
  10. Thomas, S., et al. Human neural crest cells display molecular and phenotypic hallmarks of stem cells. Hum Mol Genet. 17 (21), 3411-3425 (2008).
  11. Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung's disease: advances in genetic and stem cell studies. Nat Rev Neurosci. 8, 466-479 (2007).
  12. Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3 (4), 1140-1152 (2013).
  13. Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
  14. Barber, K., Studer, L., Fattahi, F. Derivation of enteric neuron lineages from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 14 (4), 1261-1279 (2019).
  15. Li, W., et al. Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells. Mol Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).
  16. Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nat Med. 23, 49-59 (2017).
  17. Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nat Genet. 18 (1), 60-64 (1998).
  18. Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (12), 1468-1475 (2007).
  19. Majd, H., et al. hPSC-derived enteric ganglioids model human ENS development and function. BioRxiv. , (2022).
  20. Majd, H., et al. Deriving Schwann cells from hPSCs enables disease modeling and drug discovery for diabetic peripheral neuropathy. Cell Stem Cell. 30 (5), 632-647 (2023).
  21. Samuel, R. M., et al. Generation of Schwann cell derived melanocytes from hPSCs identifies pro-metastatic factors in melanoma. BioRxiv. , (2023).
  22. Richter, M. N., et al. Inhibition of muscarinic receptor signaling protects human enteric inhibitory neurons against platin chemotherapy toxicity. BioRxiv. , (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Indukcja grzebienia neuralnegoróżnicowanie neuronów jelitowychmodelowanie choróbodkrywanie lekówformowanie sferoidówmarker SOX10zawiesina komórkowadołki pokryte lamininą
Różnicowanie linii jelitowego układu nerwowego od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.