Różnicowanie linii jelitowego układu nerwowego od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Podsumowanie

Wywodzenie linii jelitowego układu nerwowego (ENS) z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) stanowi skalowalne źródło komórek do badania rozwoju i chorób ENS oraz do wykorzystania w medycynie regeneracyjnej. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół in vitro do wyprowadzania neuronów jelitowych z hPSC przy użyciu chemicznie zdefiniowanych warunków hodowli.

Streszczenie

Ludzki jelitowy układ nerwowy, ENS, to duża sieć typów komórek glejowych i nerwowych z niezwykłą różnorodnością neuroprzekaźników. ENS kontroluje perystaltykę jelit, wydzielanie enzymów i wchłanianie składników odżywczych oraz współdziała z układem odpornościowym i mikrobiomem jelitowym. W związku z tym wady rozwojowe i nabyte ENS są odpowiedzialne za wiele chorób człowieka i mogą przyczyniać się do objawów choroby Parkinsona. Ograniczenia w systemach modeli zwierzęcych i dostęp do tkanek pierwotnych stanowią poważne wyzwanie eksperymentalne w badaniach nad ludzkim ENS. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół skutecznego wyprowadzania in vitro linii ENS z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, hPSC, przy użyciu określonych warunków hodowli. Nasz protokół rozpoczyna się od ukierunkowanego różnicowania hPSC do jelitowych komórek grzebienia nerwowego w ciągu 15 dni i daje różne podtypy funkcjonalnych neuronów jelitowych w ciągu 30 dni. Platforma ta zapewnia skalowalne zasoby do badań rozwojowych, modelowania chorób, odkrywania leków i zastosowań regeneracyjnych.

Wprowadzenie

Jelitowy układ nerwowy (ENS) jest największym składnikiem obwodowego układu nerwowego. ENS zawiera ponad 400 milionów neuronów, które znajdują się w przewodzie pokarmowym i kontrolują prawie wszystkie funkcje jelita¹. Molekularne zrozumienie rozwoju i funkcji ENS oraz jego defektów w neuropatiach jelitowych wymaga dostępu do wiarygodnego i autentycznego źródła neuronów jelitowych. Dostęp do pierwotnej tkanki ludzkiej jest ograniczony, a modele zwierzęce nie są w stanie podsumować kluczowych fenotypów choroby w wielu neuropatiach jelitowych. Technologia ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) okazała się niezwykle korzystna w dostarczaniu nieograniczonego źródła pożądanych typów komórek, zwłaszcza tych, które są trudne do wyizolowania od pierwotnych źródeł^2,3,4,5,6,7. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe informacje na temat etapowej i solidnej metody in vitro do uzyskiwania kultur ENS z hPSC. Te skalowalne kultury pochodzące z hPSC otwierają drogę do badań rozwojowych, modelowania chorób i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, a także mogą dostarczyć komórek do przeszczepu dla medycyny regeneracyjnej.

Linie neuronów jelitowych wywodzą się z komórek grzebienia nerwowego (NC) podążających ścieżką rozwoju ENS podczas embriogenezy. W zarodkach komórki NC wyłaniają się wzdłuż brzegów składanej płytki nerwowej. Namnażają się, migrują i dają początek wielu różnym typom komórek, w tym neuronom czuciowym, komórkom Schwanna, melanocytom, szkieletowi twarzoczaszki i neuronom jelitowym oraz glejowi^8,9,10. Decyzja o losie komórki zależy od odrębnego obszaru wzdłuż osi przednio-tylnej, z którego wyłaniają się komórki NC, tj. NC czaszki, NC błędnego, NC tułowia i NC krzyżowego. ENS rozwija się z komórek NC nerwu błędnego i krzyżowego, przy czym te pierwsze dominują w populacji neuronów jelitowych ze względu na rozległą migrację wzdłuż jelita i kolonizację jelita¹¹.

Wyprowadzanie komórek NC z PSC zwykle wiąże się z kombinacją podwójnej inhibicji SMAD i aktywacji szlaku WNT^12,13. Do niedawna wszystkie protokoły indukcji NC obejmowały surowicę i inne dodatki do produktów pochodzenia zwierzęcego w warunkach hodowli. Niezdefiniowane chemicznie podłoża nie tylko obniżają odtwarzalność indukcji NC, ale także stanowią wyzwanie dla mechanistycznych badań rozwojowych. Aby sprostać tym wyzwaniom, Barber i in¹⁴ opracowali protokół indukcji NC przy użyciu chemicznie zdefiniowanych warunków hodowli, dzięki czemu był lepszy od alternatywnych metod, które opierają się na czynnikach zastępujących surowicę (np. KSR)^13,14. Uzyskano to poprzez wymianę pożywki podstawowej i optymalizację protokołu pierwotnie przedstawionego przez Fattahi i wsp. w celu uzyskania jelitowych komórek NC z hPSC. Ten ulepszony system jest podstawą protokołu różnicowania hPSC, który jest tutaj przedstawiony. Rozpoczyna się od indukcji komórek jelitowego grzebienia nerwowego (ENC) w ciągu 15 dni poprzez precyzyjną modulację sygnalizacji BMP, FGF, WNT i TGFβ oprócz kwasu retinowego (RA). Następnie wyprowadzamy linie ENS, traktując komórki czynnikiem neurotroficznym pochodzącym z linii komórek glejowych (GDNF). Wszystkie składy pożywek są zdefiniowane chemicznie i dają solidne hodowle neuronów jelitowych w ciągu 30-40 dni.

Oprócz opisanego tutaj systemu hodowli komórek jednowarstwowych, opracowano alternatywne metody indukcji NC, które wykorzystują swobodnie pływające ciała embrionalne^15,16. Wykazano, że komórki migrujące w tych kulturach wykazują ekspresję markerów NC z podzbiorem reprezentującym NC błędne. Kokultury z pierwotną tkanką jelitową wykorzystano do wzbogacenia jelitowych prekursorów NC w tych kulturach. Składy pożywek w tych badaniach zawierają kombinację różnych czynników, takich jak czynnik wzrostu nerwów, NT3 i czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego. Na tym etapie nie jest do końca jasne, w jaki sposób czynniki te mogą wpływać na tożsamość zaangażowania prekursorów neuronów jelitowych. Do skutecznego porównania indukcji NC jelitowej w hodowlach jednowarstwowych i opartych na ciele zarodka potrzeba więcej danych. Biorąc pod uwagę różne układy kultur w tych strategiach, użycie każdej metody powinno być przemyślane i zoptymalizowane zgodnie z konkretnym zastosowaniem.

Przedstawiony tutaj protokół jest powtarzalny i został pomyślnie przetestowany przez nas i innych przy użyciu różnych linii hPSC (indukowanych i embrionalnych)^8,14,16.

Protokół

1. Przygotowanie mediów

UWAGA: Stężenia wymienione w protokole są końcowymi stężeniami składników mediów. Przygotować wszystkie podłoża w sterylnych warunkach w okapie z przepływem laminarnym i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności. Zużyć w ciągu 2 tygodni.

1. Pożywka konserwacyjna hPSC: Wymieszać suplement pożywki podtrzymującej hPSC bez podawania (20 μl/ml) z pożywką podstawową.
2. Pożywka A: Dodać białko morfogenetyczne kości 4 (BMP4; 1 ng/ml), SB431542 (10 μM) i CHIR99021 (600 nM) do podłoża różnicującego.
3. Podłoże B: Dodać SB431542 (10 μM) i CHIR99021 (1,5 μM) do podłoża bazowego do różnicowania.
4. Pożywka C: Dodać SB431542 (10 μM), CHIR99021 (1,5 μM) i RA (1 μM) do podłoża bazowego do różnicowania.
5. Kompletne podłoże dla grzebienia nerwowego (NCC): Dodaj FGF2 (10 ng / ml), CHIR99021 (3 μM), suplement N2 (10 μl / ml), suplement B27 (20 μl / ml), suplement L-glutaminy (10 μl / ml) i MEM NEAA (10 μl / ml) do podłoża neuropodstawnego.
6. Pożywka ENC: Dodaj GDNF (10 ng/ml), kwas askorbinowy (100 μM), suplement N2 (10 μL/ml), suplement B27 (20 μL/ml), suplement L-glutaminy (10 μL/ml) i MEM NEAAs (10 μL/ml) do podłoża neuropodstawnego.
7. Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) 1x: Rozcieńczyć 500 mM EDTA (1000x) do końcowego stężenia 500 μM w PBS.
   UWAGA: W całym tym protokole należy używać PBS wolnych od Ca²⁺ i Mg²⁺, chyba że zaznaczono inaczej.

2. Powlekanie płytek hodowlanych

1. Płytki pokryte matrycą membrany podstawnej: Szybko rozmrozić i rozcieńczyć 500 μl zamrożonej podwielokrotności macierzy błony podstawnej w 50 ml schłodzonego DMEM:F12 przez energiczne pipetowanie za pomocą pipety serologicznej o pojemności 50 ml. Pokryć studzienki rozcieńczonym roztworem matrycy membrany podstawnej (100 μl na^cm2 powierzchni studzienki) i inkubować je przez noc w temperaturze 37 °C. Przed użyciem odessać podłoże powlekające. Aby zapobiec żelatynizacji macierzy błony podstawnej, należy wykonać ten krok tak szybko, jak to możliwe i użyć zimnego DMEM:F12 do rozpuszczenia zamrożonej podwielokrotności.
   UWAGA: Temperatura matrycy membrany podstawnej powinna być utrzymywana na niskim poziomie podczas rozmrażania (na lodzie) i porcjowania (probówki na lodzie), aby zapobiec krzepnięciu.
2. Płytki powlekane PO/FN/lamininą: Przygotować 15 μg/ml roztworu poliornityny (PO) w PBS, rozcieńczając 1000-krotny bulion. Studzienki pokryć 100 μl roztworu PO/PBS na^cm2 powierzchni studzienki i inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C. Następnego dnia odessać PO/PBS i pokryć studzienki w stężeniu 100 μl na^cm2 powierzchni studzienki świeżo przygotowanym roztworem FN/lamininy/PBS zawierającym 2 μg/ml fibronektyny (FN) i 2 μg/ml lamininy. Płytki można stosować po minimum 2 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C. Przed użyciem odsysać FN/lamininę/PBS.

3. Utrzymanie hodowli hPSC

UWAGA: Wszystkie etapy inkubacji komórek odbywają się przy 5% CO₂ i 37 °C w nawilżanym inkubatorze.

1. Odessać pożywkę hPSC z kultury hPSC i dodawać świeżą pożywkę (200 μl na^cm2 powierzchni studzienki) co drugi dzień, aż kolonie będą zlewać się w ~80%.
2. Aby przejść, odessać pożywkę hPSC i przepłukać komórki 100 μl PBS na^cm2 powierzchni studzienki.
   UWAGA: Ważne jest, aby do mycia komórek używać PBS wolnego od Ca²⁺ i Mg²⁺
.
3. Dodać 500 μM EDTA (100 μL na^cm2 powierzchni studzienki). Załóż pokrywę talerza. Obserwuj przez odwrócony mikroskop i monitoruj komórki pod kątem oderwania się krawędzi kolonii (2-4 min).
4. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 lub 10 ml przenieś tę samą objętość pożywki hPSC do każdej studzienki i mechanicznie zbierz komórki, pipetując kilka razy w górę i w dół.
   UWAGA: Optymalny czas inkubacji EDTA zależy od linii iPSC. Należy unikać energicznego pipetowania w celu oderwania kolonii, ponieważ może to prowadzić do nadmiernej dysocjacji kolonii i śmierci komórki. Podczas pasażu w celu rozpoczęcia płytki różnicowej, inkubuj komórki z EDTA przez 1-2 minuty dłużej.
5. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki (2 min, 290 x g, 20-25 °C) i ostrożnie wyrzucić supernatant.
6. Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości pożywki hPSC i przenieść do studzienek nowej płytki pokrytej matrycą błony podstawnej.
   UWAGA: Do regularnej konserwacji hPSC należy stosować współczynnik pasażowania 1:18 - 1:24 (1:18 oznacza przeniesienie jednej trzeciej komórek zdysocjowanych z pojedynczego dołka płytki 6-dołkowej do całkowicie nowej płytki). Aby rozpocząć tworzenie płytki różnicującej, należy przestrzegać współczynnika przejścia 5:6.
7. Inkubować w temperaturze 5% CO₂ i temperaturze 37 °C.

4. Indukcja grzebienia nerwowego

UWAGA: Ten krok jest schematycznie przedstawiony w Rysunek 1A. Rozpocznij różnicowanie NC, gdy komórki są w około 80% zlewne. Zostanie to osiągnięte w ciągu 1-2 dni, gdy komórki zostaną przepasane w stosunku 5:6 (patrz wyżej). Rozpocznij różnicowanie NC w dniu 0 z pluripotencjalnymi i całkowicie niezróżnicowanymi komórkami hPSC. Aby uzyskać wysoką wydajność, granice kolonii powinny mieć minimalne różnicowanie komórek. Pasaż i płytka hPSC do różnicowania, gdy kolonie są duże lub środek kolonii zaczyna gęstnieć/ciemnieć podczas monitorowania za pomocą odwróconego mikroskopu. Zwracanie uwagi na konfluencję i morfologię wydaje się być bardziej wiarygodne niż liczba posianych komórek, ponieważ może się ona różnić w zależności od linii komórkowej i może wynosić od 50 000 do 200 000 na cm².

1. W dniu 0 zastąpić pożywkę konserwacyjną hPSC pożywką A zawierającą 1 ng/ml BMP4, 10 μM SB431542, 600 nM CHIR99021 (200 μl pożywki na^cm2 powierzchni studzienki).
2. W dniu 2 komórki powinny być w 100% zlewne. Delikatnie odessać zużyte podłoże A i nakarmić komórki pożywką B zawierającą 10 μM SB431542, 1,5 μM CHIR99021 (200 μl pożywki na^cm2 powierzchni studzienki).
   UWAGA: W miarę wzrostu kultur podczas indukcji NC komórki mogą odłączyć się od leżącej pod spodem monowarstwy. Unikaj nadmiernej utraty komórek, delikatnie usuwając stare podłoże i dodając świeże podłoże z boku studzienki.
3. W 4 dniu ponownie nakarmić komórki pożywką B (200 μl pożywki na^cm2 powierzchni studzienki).
4. W dniu 6 zastąp pożywkę B pożywką C zawierającą 10 μM SB431542, 1,5 μM CHIR99021 i 1 μM kwasu retinowego (400 μL pożywki na^cm2 powierzchni studzienki).
5. W dniach 8 i 10 karm jak w dniu 6.

5. Formacja sferoidów ENC

UWAGA: Ten krok jest schematycznie przedstawiony w Rysunek 1B.

1. W 12 dniu delikatnie odessać pożywkę C i przemyć komórki 100 μl PBS na^cm2 powierzchni studzienki. Dodać taką samą objętość roztworu oddzielającego komórki i inkubować przez 30 minut w temperaturze 5% CO₂ i temperaturze 37 °C.
2. Rozcieńczyć roztwór do odrywania komórek, dodając tę samą objętość pożywki NCC zawierającej 10 ng/ml FGF2, 3 μM CHIR99021, 10 μL/ml suplementu N2, 20 μl/ml suplementu B27, 10 μL/ml suplementu L-glutaminy i 10 μL/mL MEM NEAA. Za pomocą pipety serologicznej pobrać zawiesinę jednokomórkową i dodać ją do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
3. Odwirować komórki (2 min, 290 x g, 20-25 °C) i ostrożnie wyrzucić supernatant.
4. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml dodać 12 ml (na pełną 6-dołkową płytkę) pożywki NCC i całkowicie zawiesić komórki, pipetując mechanicznie w górę i w dół 1-2 razy. Przenieś zawiesinę ogniw na bardzo niską płytkę mocującą.
   UWAGA: Około 10^cm2 komórek jednowarstwowych ENC zawiesza się ponownie w 2 ml pożywki NCC i przenosi do jednego dołka o bardzo niskiej płytce mocującej. Jest to równoznaczne z pełną 6-dołkową płytką indukcyjną NC przeniesioną do pełnej 6-dołkowej płytki mocującej o bardzo niskim nasadce.
5. W dniu 14 delikatnie obracaj płytki, aż małe sferoidy zbiorą się na środku każdej studzienki. Za pomocą mikropipety P1000 i powolnymi ruchami okrężnymi odessać zużyte podłoże NCC na obwodzie każdej studzienki. Staraj się unikać usuwania swobodnie unoszących się sferoid.
6. Nakarm komórki oryginalną objętością pożywki NCC.

6. Indukcja EN

UWAGA: Ten krok jest schematycznie przedstawiony w Rysunek 1B.

1. W dniu 15 zastosuj tę samą technikę, co w dniu 14, aby delikatnie usunąć pożywkę i przemyć sferoidy PBS. Usuń jak najwięcej PBS, unikając sferoid.
2. Dodać roztwór do oddzielania komórek (100 μl na^cm2 powierzchni studzienki) i rozdzielić sferoidy na pojedyncze komórki przez inkubację przez 30 minut w temperaturze 5% CO₂ i temperaturze 37 °C.
3. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml dodaj równą objętość pożywki ENC (zawierającej 10 ng/ml GDNF, 100 μM kwasu askorbinowego, 10 μl/ml suplementu N2, 20 μl/ml suplementu B27, 10 μl/ml suplementu L-glutaminy i 10 μL/mL MEM NEAA w podłożu neurobazalnym) do każdej studzienki i rozbij pozostałe sferoidy przez 2-3 rundy mechanicznego pipetowania. Przenieść komórki do probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
   UWAGA: Należy unikać nadmiernego stresu i śmierci komórek, które mogą wystąpić w wyniku wymuszonego pipetowania lub używania pipet z mniejszym otworem końcówki.
4. Odwirować komórki (2 min, 290 x g, 20-25 °C) i ostrożnie wyrzucić supernatant. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml dodać ~ 5-10 ml pożywki ENC i całkowicie zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół 1-2 razy.
5. Policz stężenie żywotnych komórek za pomocą błękitu trypanowego i metody liczenia komórek, takiej jak hemocytometr.
   UWAGA: Błękit trypanowy jest podejrzewany jako czynnik rakotwórczy. Obchodź się ostrożnie, zutylizuj odpowiednio.
6. Dodaj wystarczającą objętość pożywki ENC, dążąc do pokrycia około 300 000-400 000 żywotnych komórek na cm² powierzchni o gęstości około ~ 1 000 000 komórek na ml. Odessać roztwór FN/lamininy/PBS z dołków płytki.
   UWAGA: Należy wybrać format płytki zgodnie z testami, które są planowane dla kultur EN, ponieważ ten etap oznacza ostatni etap ponownego powlekania w protokole. Komórki progenitorowe neuronów jelitowych można zamrozić w 15 dniu. Po dysocjacji kulek roztworem do odłączania komórek, ponownie zawieś progenitory w około 5 x 10⁶ komórek/ml w pożywce zamrażającej, takiej jak 10% DMSO lub Stem-cellbanker. W razie potrzeby rozmrozić w ciepłym podłożu ENC z inhibitorem 5 μM Y-27632 ROCK. Komórki płytowe w żądanym formacie płyty. Po kilku godzinach wymień nośnik na nowy ENC.
7. Delikatnie dodaj komórki do studzienek pokrytych PO/FN/lamininą. Unikaj uwięzienia pęcherzyków pod zawiesiną komórkową, zapobiegając przyczepianiu się komórek do powłoki PO/FN/lamininy, szczególnie w przypadku stosowania płytek o mniejszym rozmiarze dołka, takich jak płytki 384-dołkowe. Może to prowadzić do śmierci komórki.
8. Karmić komórki co drugi dzień pożywką ENC (200 μl na^cm2 powierzchni studzienki) do 30-40 dnia, po czym zmniejsz częstotliwość karmienia (do raz lub dwa razy w tygodniu), ale podwoić objętość karmienia (do 400 μl pożywki na^cm2 powierzchni studzienki).
   UWAGA: Jest to ważne, ponieważ nadmierne usuwanie i dodawanie pożywki może ułatwić oderwanie się kultury neuronalnej od powierzchni studzienek. Aby prospektywnie zapobiec oderwaniu, szczególnie w przypadku długotrwałych hodowli, uzupełnij ENC FN (2 μg/ml) i lamininę (2 μg/ml) raz w tygodniu.

Wyniki

Ten protokół zapewnia metodę wyprowadzania grzebienia nerwowego jelitowego i neuronów jelitowych z hPSC przy użyciu chemicznie zdefiniowanych warunków hodowli (Rysunek 1A-B). Generowanie wysokiej jakości neuronów zależy od wydajnego etapu indukcji grzebienia nerwowego jelitowego. Można to wizualnie ocenić, sprawdzając morfologię swobodnie unoszących się kul, które powinny wyglądać na okrągłe z gładkimi powierzchniami o rozmiarze około 0,1 - 0,4 mm, jak widać na Rysunek 1C. Te sferoidy powinny również wyrażać marker grzebienia nerwowego SRY-Box czynnik transkrypcyjny 10 (SOX10)^17,18, jak można zobaczyć w Rysunek 1D. Podczas fazy indukcji neuronów jelitowych neuryty mogą stać się widoczne już w 25-30 dniu (Ryc. 1E). Może to być jednak opóźnione w różnicowaniu o niższej skuteczności zawierającej niepożądane zanieczyszczenia komórek mezenchymalnych. Ludzki jelitowy układ nerwowy to zbiór różnych neuronów wyrażających różne neuroprzekaźniki. Ta niejednorodność jest rekapitulowana w dostarczonym protokole in vitro, a ekspresję kluczowych markerów można ocenić za pomocą metod barwienia komórek, takich jak obrazowanie immunofluorescencyjne i cytometria przepływowa, zgodnie z wcześniej opisanymi protokołami^{13,14,19,20,21} (Rysunek 1F,G).

Rysunek 1: Wyprowadzanie ludzkich komórek ENC i podtypów neuronów jelitowych z hPSC. (A) Indukcja grzebienia nerwowego jelitowego (ENC) z hPSC. Protokół (dni 0-12) przedstawiający skład pożywki do wyprowadzania komórek ENC z hPSC. (B) Tworzenie sferoidów ENC i indukcja neuronów jelitowych z ENC. Protokół (dni 12-15) pokazujący skład pożywki do tworzenia sferoidów ENC. Następnie neurony jelitowe są generowane i dojrzewają poprzez traktowanie pożywką zawierającą GDNF i AA. (C) Reprezentatywne obrazy kontrastu fazowego różnicujących się hPSC w różnych punktach czasowych protokołu. Pasek skali: 1000 μM. (D) SOX10::GFP wyrażający sferoidy ENC pochodzące z H9 iPSC w dniu 14. Pasek skali: 1000 μm. (E) Obraz skurczu fazowego neuronów dnia 33. Pasek skali: 400 μm. (F-G) Obrazowanie immunofluorescencyjne (F) i cytometria przepływowa (G) markerów neuroprzekaźników w neuronach w 40 dniu. Podziałka: 50 μm. Skróty: BMP4 = rekombinowane ludzkie białko BMP4; RA = kwas retinowy; FGF2 = rekombinowany ludzki FGF zasadowy; GDNF = rekombinowany czynnik neurotroficzny pochodzący z ludzkiej linii komórek glejowych; AA = kwas askorbinowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół różnicowania zapewnia solidną metodę in vitro do uzyskiwania neuronów jelitowych z hPSC w ciągu 30-40 dni (ryc. 1E) i gleju jelitowego z ekspresją kwaśnego białka fibrylarnego gleju, GFAP i SOX10 w starszych kulturach (> dzień 55)13,14,19,22. Te neurony i komórki glejowe są indukowane przez stopniowe różnicowanie hPSC w komórki grzebienia nerwowego nerwu błędnego i jelitowego, a następnie neurony jelitowe i komórki progenitorowe gleju^13,14. Komórki grzebienia nerwowego wyrażają markery grzebienia nerwowego, czynnik transkrypcyjny AP-2 alfa i beta, TFAP2A i TFAP2B, odpowiednio²¹. Wcześniej wykazaliśmy, że CD49 może być używany jako marker wskazujący wydajność komórek grzebienia nerwowego pochodzących z hPSC¹⁴. Skuteczność i powodzenie tej metody zależy od kombinacji czynników. Po pierwsze, bardzo ważne jest, aby wykonać wszystkie kroki w sterylnych warunkach. Badanie kultur hPSC pod kątem zanieczyszczenia mykoplazmą jest ważne, ponieważ może ono niekorzystnie wpływać na wzrost komórek macierzystych i nie jest wykrywalne wizualnie. Po drugie, zastosowanie równomiernie i odpowiednio pokrytych płytek zmniejsza ryzyko niejednolitego wzrostu kultur hPSC i oderwania kultur NC i starszych neuronów od powierzchni studzienek. Po trzecie, aby uzyskać wysoką skuteczność różnicowania, konieczne jest rozpoczęcie od pluripotencjalnych i całkowicie niezróżnicowanych komórek hPSC. Kolonie hPSC powinny mieć minimalnie różnicujące się komórki na granicach kolonii. hPSC powinny być pasażowane lub powlekane w celu rozróżnienia, gdy kolonie są duże lub środek kolonii zaczyna gęstnieć/ciemnieć, co obserwuje się pod mikroskopem z kontrastem fazowym. Niepożądane komórki różnicujące (zwykle komórki mezenchymalne) nie tylko obniżają ogólną wydajność różnicowania, ale mogą powodować oderwanie neuronów od powierzchni studni wraz ze starzeniem się kultur. Dlatego zaleca się dokładne monitorowanie kultur ENC w ciągu pierwszych 15 dni. W efektywnych warunkach różnicowania na powierzchni kultury ~ dzień 6 pojawiają się ciemne dyski, co wskazuje na efektywne tworzenie sferoid w dniach 12-15. Ponadto w fazie sferoidalnej (dzień 12-15) kule swobodnie unoszące się powinny mieć gładkie powierzchnie (ryc. 1D). Utrzymanie fazy sferoidalnej 3D w dniach 12-15 jest na ogół wystarczające do poprawy czystości ENC w celu dalszego różnicowania kultur w linie ENS. Jednak w przypadku badań, które wymagają wczesnych i czystych populacji komórek progenitorowych ENC, zaleca się FACS przy użyciu CD49D. CD49D jest specyficznym markerem powierzchniowym dla linii NC pochodzących z SOX10: hPSC i jest z powodzeniem stosowany w liniach komórkowych ^13,14. Więcej informacji na temat izolowania komórek CD49D+ za pomocą FACS oraz zaleceń dotyczących strategii bramkowania można znaleźć w artykule Barbera i wsp., Rysunek 2D, Ramka 1 i Rysunek uzupełniający 6¹⁴. Po czwarte, aby zmaksymalizować wydajność, różnicowanie powinno rozpocząć się, gdy kultury hPSC są jednowarstwowe i ~ 80% zlewają się. Oznacza to posiadanie w pełni zlewającej się kultury w dniu 2. Mniejsza konfluencja negatywnie wpływa na wydajność, a bardzo gęste hodowle mają zwykle wyższy wskaźnik śmierci komórek i mogą potencjalnie prowadzić do pojawienia się niepożądanych zróżnicowanych komórek.

Ponowna posiew komórek w 15 dniu stanowi ważny krok w tym protokole. Jest to ostatni etap transferu komórek w jednowarstwowej hodowli neuronalnej, dlatego układ płytki powinien być wybrany zgodnie z planowanymi testami. Liczba komórek przenoszonych do każdej studzienki może znacząco wpływać na różnorodność neuronalną i starsze neurony pozostające przyczepione do powierzchni studzienek. Ogólnie rzecz biorąc, pożądana jest gęstość komórek w zakresie 250 000-350 000 komórek na^cm2 (około 75 000-100 000 komórek na dołek płytki 96-dołkowej lub 500 000-700 000 na studzienkę płytki 24-dołkowej). Począwszy od 30-40 dnia, można rozważyć dodanie fibronektyny i lamininy do pożywki (nie częściej niż raz w tygodniu), aby prospektywnie zapobiec odwarstwieniu neuronów, szczególnie w przypadku komórek planowanych do dłuższych hodowli neuronów. W tym momencie zaleca się zmniejszenie częstotliwości karmienia do raz na 5-7 dni i pozostawienie trochę podłoża w każdym dołku przed dodaniem dodatkowej świeżej pożywki. Zmniejsza to ryzyko zastosowania niepotrzebnego stresu fizycznego na projekcje neuronalne. Biorąc pod uwagę odparowanie pożywki (szczególnie w przypadku studzienek na granicy płytki), można usunąć 75 μl i dodać 100 μl świeżej pożywki do każdej studzienki. Z doświadczenia wynika, że kultury wyhodowane na polimerowych płytkach obrazowych z dnem szkiełka nakrywkowego mają tendencję do życia i pozostają przyczepione do powierzchni studni przez dłuższy czas. Dlatego zaleca się rozważenie polimerowych płytek obrazowych z dnem szkiełka nakrywkowego do eksperymentów wymagających bardzo starych kultur neuronalnych, takich jak kohodowle z innymi typami komórek. Chociaż suszone na powietrzu płytki powlekane PO/FN/lamininą mogą nadal dawać efektywne różnicowanie, nie było to systematycznie testowane na potrzeby niniejszego protokołu. Dlatego zaleca się stosowanie świeżo powlekanych talerzy.

Opisany tutaj protokół jest oparty na wcześniej opublikowanym protokole przez Barbera i wsp.¹⁴. W porównaniu ze starszymi metodami indukcji ENC, które wykorzystują pożywki zawierające czynniki zastępcze surowicy (np. KSR)^13,14, obecne warunki pożywek protokołu są zdefiniowane chemicznie. Jest to korzystne dla bardziej spójnego różnicowania i pozwala na bardziej precyzyjne badania rozwojowe poprzez manipulowanie warunkami hodowli. Ten solidny protokół w powtarzalny sposób generuje kultury neuronów jelitowych z niezależnych indukowanych i embrionalnych linii komórek macierzystych, które zostały przetestowane, takich jak H9, UCSF4 i WTC11. Potężnym aspektem prezentowanego protokołu jest jego zdolność do generowania różnorodnych podtypów neuronów ENS przypominających te, które można znaleźć w ludzkim ENS. Na przykład ekspresję specyficznych markerów dla różnych tożsamości neurochemicznych ENS można sprawdzić za pomocą cytometrii przepływowej i obrazowania fluorescencyjnego (ryc. 1F, G). Typowy zakres populacji neuronów jelitowych pochodzących z hPSC, dodatnich dla syntazy tlenku azotu 1 (NOS1), wynosi 5%-20%; O-acetylotransferaza choliny (CHAT) wynosi 40%-60%; Kwas gamma-aminomasłowy (GABA) wynosi 15%-30%, a serotonina (5-HT) 15%-30%. Jednak stopień, w jakim strukturalne i funkcjonalne połączenia in vitro między tymi podtypami dokładnie modelują sieci komórkowe in vivo, wymaga dalszych badań. Ponadto analizy pojedynczych komórek w celu rozszerzenia profilowania transkrypcyjnego poszczególnych podtypów nie tylko pomogłyby w lepszym porównaniu tożsamości komórkowych in vivo i in vitro, ale także przyniosłyby korzyści badaniom rozwojowym i molekularnym, a także przyszłym optymalizacjom protokołów w kierunku wzbogacenia określonych podtypów na potrzeby odkrywania leków i medycyny regeneracyjnej.

Pomimo tego, że kultury zawierają różne neurony, a w starszych hodowlach komórki glejowe, protokół ten nie generuje innych typów komórek naturalnie występujących w niszy in vivo ENS, takich jak komórki mięśniowe, komórki nabłonkowe i komórki odpornościowe. Badanie interakcji ENS z tymi typami komórek w kontekście zdrowia i choroby wymaga inwestycji w optymalizację kohodowli i systemów organoidów jelitowych. Ogólnie rzecz biorąc, opisano tutaj potężną metodę generowania różnych podtypów ENS z hPSC in vitro . Skalowalne kultury nadają się do badań rozwojowych ludzkiego ENS, testów toksykologicznych i eksperymentów modelowania chorób mających na celu opracowanie terapii lekowych i dostarczenie komórek do przeszczepu do leczenia neuropatii jelitowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwas askorbinowy	Sigma-Aldrich	A5960
B27 suplement (bez surowicy, bez witaminy A)	Gibco	12587-010
Macierz błony podstawnej, Geltrex	Gibco	A14133-2
BMP4	R& D systems	314-BP
Wirówka do hodowli komórkowych	Eppendorf, nr modelu 5810R	02262501
Roztwór do oddzielania komórek, Accutase	Stemcell Technologies	07920
CHIR99021	Tocris	4423
Probówki stożkowe	USA	scientific 1475-0511, 1500-1211
Pożywka bazowa różnicowania, Essential 6	Life Technologie	A1516401
DMEM/F-12 bez glutaminy	Life Technologies	21331020
EDTA	Corning	MT-46034CI
Bezzasilająca pożywka konserwacyjna hPSC, zestaw Essential 8 Flex Medium	Life Technologies	A2858501
FGF2	R& Systemy D	233-FB/CF
Fibronectin	Corning	356008
GDNF	Peprotech	450-10
Hemocytometr	Hausser Scientific	1475
Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste, H9 ESC	WiCell	RRID: CVCL_1240
Inkubator z kontrolowaną wilgotnością, temperaturą i CO2	Thermo Fisher Scientific	Herralcell 150i
Mikroskop odwrócony	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
Okap z przepływem laminarnym	Thermo Fisher Scientific	1300 seria klasa II, typ A2
Laminin	Cultrex	3400-010
Suplement L-glutaminy, Glutagro	Corning	25-015-CI
MEM NEAAs	Corning	25-025-CI
Płytki wielodołkowe, Falcon	BD	353934, 353075
Suplement N-2	CTS	A1370701
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103049
PBS (wolne od Ca i Mg)	Life Technologies	10010023
Napełniacz do pipet	Eppendorf	Z768715-1EA
Końcówki do pipet	USA scientific	1111-2830
Pipety	Fisherbrand	13-678-11E, 13-678-11F
PO	Sigma-Aldrich	P3655
polimerowe płytki obrazowe z dnem szkiełka nakrywkowego, ibidi	ibidi	81156
RA	Sigma-Aldrich	R2625
SB431542	R& D systems	1614
Trypan blue stain, 0,4%	Thermo Fisher Scientific	15250-061
Ultra-low attachment plates	Fisher Scientific	07-200-601
Y-27632 dichlorowodorek	R& Systemy D	1254