Przedstawiamy szczegółowy protokół dla korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej Epon po osadzeniu przy użyciu białka fluorescencyjnego o nazwie mScarlet. Ta metoda może jednocześnie utrzymać fluorescencję i ultrastrukturę. Ta technika jest podatna na szeroką gamę zastosowań biologicznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Epon Post Osadzanie korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Korelacyjne światło i mikroskopia elektronowa (CLEM) to kompleksowa mikroskopia, która łączy informacje o lokalizacji dostarczone przez mikroskopię fluorescencyjną (FM) oraz kontekst ultrastruktury komórkowej uzyskany przez mikroskopię elektronową (EM). CLEM to kompromis między fluorescencją a ultrastrukturą, a zwykle ultrastruktura pogarsza fluorescencję. W porównaniu z innymi hydrofilowymi żywicami do zatapiania, takimi jak metakrylan glicydylu, HM20 lub K4M, Epon jest lepszy pod względem właściwości zachowania ultrastruktury i cięcia. Wcześniej wykazaliśmy, że mEosEM może przetrwać utrwalanie tetratlenku osmu i osadzanie eponu. Korzystając z mEosEM, po raz pierwszy uzyskaliśmy Epon po zatopieniu CLEM, który utrzymuje jednocześnie fluorescencję i ultrastrukturę. Tutaj podajemy szczegółowe informacje krok po kroku na temat przygotowania próbki EM, obrazowania FM, obrazowania EM i wyrównania obrazu. Udoskonalamy również procedury identyfikacji tej samej komórki obrazowanej za pomocą obrazowania FM podczas obrazowania EM i szczegółowo opisujemy rejestrację między obrazami FM i EM. Wierzymy, że można łatwo osiągnąć Epon po osadzeniu światła korelacyjnego i mikroskopii elektronowej zgodnie z tym nowym protokołem w tradycyjnych obiektach EM.
Wprowadzenie
Mikroskopia fluorescencyjna (FM) może być użyta do uzyskania lokalizacji i dystrybucji docelowego białka. Jednak kontekst otaczający białko docelowe zostaje utracony, co ma kluczowe znaczenie dla dokładnego zbadania białka docelowego. Mikroskopia elektronowa (EM) ma najwyższą rozdzielczość obrazowania, dostarczając kilku szczegółów subkomórkowych. Niemniej jednak EM nie ma docelowego oznakowania. Dzięki dokładnemu połączeniu obrazu fluorescencyjnego wykonanego przez FM z szarym obrazem uzyskanym przez EM, korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa (CLEM) może połączyć informacje uzyskane przez te dwa tryby obrazowania1,
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Hodowla zwierząt i eksperymenty zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Centrum Medycznego Uniwersytetu Medycznego Fujian. Przebieg pracy krok po kroku bieżącego protokołu jest pokazany w Rysunek 1.
1. Przygotowanie próbki
- Mózg myszy
- Kup myszy transgeniczne (patrz Tabela materiałów) i startery oligonukleotydowe (patrz Tabela materiałów), aby genotypować te myszy.
- Przeprowadź fuzję i usuń nienaruszony mózg ze sklepienia czaszki zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wcześniejsze doniesienia wykazały, że mScarlet może być kierowany do lizosomów15. W niniejszym protokole AAV wykazujący ekspresję mScarlet (rAAV-hSyn-DIO-mScarlet-WPRE-pA) został wstrzyknięty do obszaru M1 (ML: ±1,2 AP: +1,3 DV: -1,5) mózgu myszy Vglut2-ires-cre przy użyciu instrumentów stereotaktycznych. Zgodnie z opisanym powyżej protokołem, końcowy obraz skorelowany przedstawiono na Rysunku 4A. Obraz FM można precyzyjnie wyrównać z obrazem EM, wyko.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiony tutaj protokół jest wszechstronną metodą obrazowania, która może łączyć informacje o lokalizacji białka docelowego z mikroskopii świetlnej (LM) i kontekst otaczający białko docelowe z mikroskopii elektronowej (EM)6. Ze względu na ograniczenia obecnych białek fluorescencyjnych, szeroko stosowaną metodą jest wstępne osadzanie korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM), co oznacza, że obrazowanie LM jest wykonywane przed przygotowaniem próbki EM. Prawie wszystkie istniejąc.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
Ten projekt był wspierany przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32201235 do Zhifei Fu), Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Fujian, Chiny (2022J01287 do Zhifei Fu), Fundację Badawczą dla Zaawansowanych Talentów na Uniwersytecie Medycznym Fujian, Chiny (XRCZX2021013 do Zhifei Fu), Fundację Finansową Nauki Specjalnej Prowincji Fujian, Chiny (22SCZZX002 do Zhifei Fu), Założenie Kluczowego Laboratorium NHC ds. Technicznej Oceny Regulacji Płodności dla naczelnych innych niż człowiek oraz Szpitala Zdrowia Matki i Dziecka Fujian (2022-NHP-04 do Zhifei Fu). Dziękujemy Linying Zhou, Minxia Wu, Xi Lin i Yan Hu z Publicznego Centrum Obsługi Technologii Uniwersyte....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Bufor fosforanowy 0,2 M (PB) | NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O | ||
| 0,2 M Tris-Cl (pH 8,5) | Shanghai yuanye Bio-Technology | R26284 | |
| 25% aldehyd glutarowy (GA) | Alfa Aesar | A17876 | Niebezpieczna substancja chemiczna |
| Abbelight 3D | Nanolnsights | ||
| Aceton | SCR | 10000418 | |
| Wodorotlenek amonu | J& K Scientific | 335213 | |
| BioPhotometer D30 | eppendorf | ||
| Bufor do czyszczenia szkieł | 50 ml Wodorotlenek amonu, 50 ml Nadtlenek wodoru, 250 ml H2O | ||
| Szkło nakrywkowe | Warner | 64-0715 | |
| DABCO | Sigma | 290734 | Niebezpieczna substancja chemiczna |
| DDSA | SPI firma | GS02827 | Niebezpieczna substancja chemiczna |
| Wirówka biurkowa | WIGGENS | MINICEN 10E | |
| Nóż diamentowy | DiATOME | MX6353 | |
| DMP-30 | SPI firma | GS02823 | Niebezpieczny |
| chemiczny odczynnik do transfekcji DNA | Thermo Fisher | 2696953 | Zestaw do transfekcji lipofekcaminy 3000 |
| Epon 812 | Firma SPI | GS02659 | Niebezpieczna substancja chemiczna |
| Etanol | SCR | 10009218 | |
| Fidżi obraz J | National Institutes of Health | ||
| Roztwór utrwalający | 4% PFA+0,25% GA+0,02 M PB | ||
| Formvar | Sigma | 9823 | |
| Glicerol | SCR | 10010618 | |
| Nanocząstki złota | Korpuskularny | 790120-010 | |
| Żywica | Aceton do żywicy 3:1, 1:1, 1:3 | ||
| Kwas fluorowodorowy | SCR | 10011118 | |
| Nadtlenek wodoru | SCR | 10011218 | |
| ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/)Easy | CLEMv0 | ||
| Plugin Komora obrazowania | Thermo Fisher | A7816 | |
| Duże kapsułki żelatynowe | Mikroskopia elektronowa Nauki | 70117 | |
| Bufor montażowy | Mowiol 4-88, Glicerol, 0,2 M Tris-Cl (pH 8,5), DABCO | ||
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| Na2HPO4 ž12H2O | SCR | 10020318 | |
| NaH2PO4 ž2H2O | SCR | 20040718 | |
| firma NMA | SPI | GS02828 | Niebezpieczne |
| chemiczne startery oligonukleotydowe | Takara Biomedical Technology (Pekin) | Do jednoczesnego wykrywania Vglut2-ires-Cre i typu dzikiego użyto trzech starterów oligonukleotydów. Spłonki 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, i 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, miały na celu wykrycie Vglut2-ires-Cre. Podkłady 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, i 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, miały na celu wykrycie typu dzikiego. | |
| Mikrotom oscylacyjny | Leica | VT1000S | |
| Tetroxide osmu | SCR | L01210302 | Niebezpieczna substancja chemiczna |
| OsO4 | 1% Tetroxide osmu+1,5% K4Fe (CN)6· 3H2O | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| Paraformaldehyd (PFA) | SCR | 80096618 | Niebezpieczna substancja chemiczna |
| Bufor | 4% PFA+0,1 M PB | ||
| Pioloform | Sigma | 63148-65-2 | Niebezpieczna substancja chemiczna |
| Poli-L-lizyna | Sigma | 25986-63-0 | |
| Żelazocyjanek potasu (K4Fe (CN)6· 3H2O) | SCR | 10016818 | |
| Ostrza skalpela Uchwyty skalpela | Merck | S2771 | |
| Merck | S2896-1EA | ||
| OLYMPUS | MVX10 | ||
| Myszy Jackson Laboratory | Vglut2-ires-Cre (szczep: 129S6/SvEvTac) były trzymane w standardowych warunkach (25 stopni Celsjusza; C, 12-godzinny cykl światło/ciemność, z wodą i pokarmem podawanymi ad libitum. Samce i samice myszy były używane w 2– 3 miesiące, zakres wagowy 20-30 g. | ||
| Transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM) | FEI | TECNAL G2 | |
| UA roztwór (2% UA) | Roztwór wodny | ||
| Ultramikrotom | Leica | LEICA EM UC6 | |
| Octan uranylu (UA) | TED | PELLA 19481 | Niebezpieczna substancja chemiczna |
Bibliografia
- de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Kopek, B. G., et al. Diverse protocols for correlative super-resolu....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
