Method Article

Epon Post Osadzanie korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej

DOI:

10.3791/66141

⸱

January 12th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Public Technology Service Center, Fujian Medical University, 2The School of Pharmacy, Fujian Medical University, 3The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, 4College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics, Fujian Medical University, 5Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital, 6NHC Key Laboratory of Technical Evaluation of Fertility Regulation for Non-human Primate, Fujian Maternity and Child Health Hospital, 7Institute of Neuroscience, Fujian Medical University, 8Fujian Key Laboratory of Molecular Neurology, Fujian Medical University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy szczegółowy protokół dla korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej Epon po osadzeniu przy użyciu białka fluorescencyjnego o nazwie mScarlet. Ta metoda może jednocześnie utrzymać fluorescencję i ultrastrukturę. Ta technika jest podatna na szeroką gamę zastosowań biologicznych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korelacyjne światło i mikroskopia elektronowa (CLEM) to kompleksowa mikroskopia, która łączy informacje o lokalizacji dostarczone przez mikroskopię fluorescencyjną (FM) oraz kontekst ultrastruktury komórkowej uzyskany przez mikroskopię elektronową (EM). CLEM to kompromis między fluorescencją a ultrastrukturą, a zwykle ultrastruktura pogarsza fluorescencję. W porównaniu z innymi hydrofilowymi żywicami do zatapiania, takimi jak metakrylan glicydylu, HM20 lub K4M, Epon jest lepszy pod względem właściwości zachowania ultrastruktury i cięcia. Wcześniej wykazaliśmy, że mEosEM może przetrwać utrwalanie tetratlenku osmu i osadzanie eponu. Korzystając z mEosEM, po raz pierwszy uzyskaliśmy Epon po zatopieniu CLEM, który utrzymuje jednocześnie fluorescencję i ultrastrukturę. Tutaj podajemy szczegółowe informacje krok po kroku na temat przygotowania próbki EM, obrazowania FM, obrazowania EM i wyrównania obrazu. Udoskonalamy również procedury identyfikacji tej samej komórki obrazowanej za pomocą obrazowania FM podczas obrazowania EM i szczegółowo opisujemy rejestrację między obrazami FM i EM. Wierzymy, że można łatwo osiągnąć Epon po osadzeniu światła korelacyjnego i mikroskopii elektronowej zgodnie z tym nowym protokołem w tradycyjnych obiektach EM.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia fluorescencyjna (FM) może być użyta do uzyskania lokalizacji i dystrybucji docelowego białka. Jednak kontekst otaczający białko docelowe zostaje utracony, co ma kluczowe znaczenie dla dokładnego zbadania białka docelowego. Mikroskopia elektronowa (EM) ma najwyższą rozdzielczość obrazowania, dostarczając kilku szczegółów subkomórkowych. Niemniej jednak EM nie ma docelowego oznakowania. Dzięki dokładnemu połączeniu obrazu fluorescencyjnego wykonanego przez FM z szarym obrazem uzyskanym przez EM, korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa (CLEM) może połączyć informacje uzyskane przez te dwa tryby obrazowania1,2,3,4.

CLEM to kompromis między fluorescencją a ultrastrukturą1. Ze względu na ograniczenia obecnych białek fluorescencyjnych i tradycyjne procedury przygotowania próbek EM, zwłaszcza użycie kwasu osmowego (OsO4) i żywic hydrofobowych, takich jak Epon, ultrastruktura zawsze zagraża fluorescencji5. OsO4 jest niezbędnym odczynnikiem w przygotowywaniu próbek EM, który służy do poprawy kontrastu obrazów EM. W porównaniu z innymi żywicami do zatapiania, Epon jest lepszy pod względem właściwości zachowania ultrastruktury i przekroju5. Jednak żadne białka fluorescencyjne nie są w stanie zachować sygnału fluorescencji po potraktowaniu OsO4 i Epon embedding6. Aby przezwyciężyć ograniczenia białek fluorescencyjnych, opracowano wstępne osadzanie CLEM, w którym obrazowanie FM odbywa się przed przygotowaniem próbki EM6. Jednak wadą wstępnego osadzania CLEM jest nieprecyzyjna rejestracja między obrazami FM i EM5.

Wręcz przeciwnie, metoda CLEM po osadzeniu wykonuje obrazowanie FM po przygotowaniu próbki EM, której dokładność rejestracji może osiągnąć 6-7 nm5,6. Aby zachować fluorescencję białek fluorescencyjnych, zastosowano bardzo niskie stężenia OsO4 (0,001%)3 lub metody przygotowania EM zamrażane pod wysokim ciśnieniem (HPF) i zamrażające (FS)4,7 kosztem pogorszenia ultrastruktury lub kontrastu obrazu EM. Rozwój mEos4b znacznie przyspiesza postęp CLEM po zasadzeniu, chociaż metakrylan glicydylu jest używany jako żywica do zatapiania5. Wraz z opracowaniem mEosEM, który może przetrwać barwienie OsO4 i osadzanie epon, po raz pierwszy osiągnięto CLEM o wysokiej rozdzielczości Epon, zachowując jednocześnie fluorescencję i ultrastrukturę6. Po mEosEM opracowano kilka białek fluorescencyjnych, które mogą przetrwać barwienie OsO4 i osadzanie Epon8,9,10,11. To w znacznym stopniu sprzyja rozwojowi CLEM.

Istnieją trzy kluczowe aspekty CLEM po osadzeniu Epon. Pierwszym z nich jest białko fluorescencyjne, które powinno utrzymywać sygnał fluorescencyjny po przygotowaniu próbki EM. Zgodnie z naszym doświadczeniem, mScarlet jest lepszy od innych doniesień o białkach fluorescencyjnych. Drugim jest to, jak znaleźć tę samą komórkę zobrazowaną przez obrazowanie FM w obrazowaniu EM. Aby rozwiązać ten problem, ulepszamy procedurę na tym etapie, aby można było łatwo znaleźć docelową komórkę. Ostatnia to metoda wyrównywania obrazu FM z obrazem EM. W tym miejscu szczegółowo opisujemy rejestrację między obrazami FM i EM. W tym protokole wyrażamy mScarlet w neuronach VGLUT2 i wykazujemy, że mScarlet może celować w lizosomy wtórne za pomocą CLEM po osadzeniu Epon. Zapewniamy szczegółowe informacje krok po kroku dotyczące CLEM po osadzeniu Epon, bez uszczerbku dla fluorescencji i ultrastruktury.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodowla zwierząt i eksperymenty zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Centrum Medycznego Uniwersytetu Medycznego Fujian. Przebieg pracy krok po kroku bieżącego protokołu jest pokazany w Rysunek 1.

1. Przygotowanie próbki

  1. Mózg myszy
    1. Kup myszy transgeniczne (patrz Tabela materiałów) i startery oligonukleotydowe (patrz Tabela materiałów), aby genotypować te myszy.
    2. Przeprowadź fuzję i usuń nienaruszony mózg ze sklepienia czaszki zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem12,13.
    3. Utrwalić mózg myszy za pomocą 10 ml roztworu utrwalającego (patrz tabela materiałów) w temperaturze 4 °C przez noc.
    4. Płukać roztwór utrwalający przez 3 x 10 minut 0,1 M buforem fosforanowym (PB).
    5. Pokrój mózg myszy na sekcje o grubości 500 μm za pomocą oscylującego mikrotomu (patrz Tabela materiałów).
    6. Pociąć obszary fluorescencyjne na małe bloki za pomocą skalpela za pomocą mikroskopu stereoskopowego (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Objętość małych bloków nie może być większa niż 1 mm3.
  2. Hodowane komórki
    1. Wysiewaj komórki HeLa do 6-centymetrowych szalek do hodowli komórkowych i utrzymuj je w pożywce wzrostowej (zmodyfikowana pożywka Eagle [DMEM] firmy Dulbecco o niskiej zawartości glukozy, uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą [FBS]).
    2. Następnego dnia należy przeprowadzić transfekcję plazmidów zawierających mScarlet do komórek za pomocą odczynnika do transfekcji DNA (patrz Tabela Materiałów) zgodnie z instrukcją zestawu do transfekcji.
    3. Czterdzieści osiem godzin po transfekcji trypsynizować transfekowane komórki i odwirować je, aby uzyskać granulki komórek o masie 1000 × g. Granulki komórek nazywane są blokami próbek.

2. Przygotowanie próbki EM

  1. Utrwalenie
    1. Utrwalić bloki próbki za pomocą roztworu utrwalającego (patrz tabela materiałów) w temperaturze 4 °C przez noc.
    2. Usunąć roztwór utrwalający i płukać roztwór utrwalający przez 3 x 10 minut 0,1 M PB z bloków próbki.
  2. Barwienie tetratlenkiem osmu (OsO4)
    1. Utrwalić bloki próbki roztworem OsO4 (patrz tabela materiałów) w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
    2. Usunąć roztwór OsO4 i spłukać roztwór OsO4 3 x 10 min z ddH2O z bloków próbek.
  3. Barwienie octanem uranylu (UA)
    1. Bloki próbki barwić 2% roztworem UA (patrz tabela materiałów) w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
    2. Usunąć roztwór UA i przepłukać bloki próbki za pomocą ddH2O przez 3 x 10 min.
  4. Gradientowe odwodnienie
    1. Odwodnić bloki próbki gradientowym etanolem w następujący sposób: 50% przez 10 minut, 70% przez 10 minut, 80% przez 10 minut, 90% przez 10 minut i 2 x 10 minut w 100% etanolu.
    2. Odwodnić bloki próbki bezwodnym acetonem przez 3 x 10 minut.
  5. Infiltracja żywicy
    1. Naciekać bloki próbki żywicą gradientową (patrz tabela materiałów): aceton do żywicy 3:1 przez 1 h, aceton do żywicy 1:1 przez 2 godziny, aceton do żywicy 1:3 przez 3 h.
    2. Zastąp czystą żywicą na 3 x 12 godzin.
  6. Osadzanie żywicy
    1. Przenieść bloki próbki do kapsułek (patrz tabela materiałów) za pomocą wykałaczki.
    2. Dodać czystą żywicę do kapsułki zawierającej blok próbki i spolimeryzować żywicę w piecu w temperaturze 60 °C przez 14-16 godzin.

3. Pokrycie szkła nakrywkowego nanocząstkami złota

  1. Czyszczenie szkła nakrywkowego
    1. Umyć okulary korekcyjne buforem czyszczącym (patrz tabela materiałów) przez 2 godziny w temperaturze 142 °C.
    2. Spłukać bufor czyszczący 3 x 10 min za pomocą ddH2O.
    3. Ostrożnie przenieść szkła nakrywkowe do zlewki zawierającej bezwodny alkohol etylowy i inkubować przez noc.
    4. Wysuszyć okulary nakrywkowe na czystej ławce na powietrzu przez kilka minut.
  2. Pokryj okulary nakrywkowe nanocząsteczkami złota.
    1. Zamocuj szklane szkiełko w środku obrotu wirówki biurkowej (patrz Tabela materiałów) za pomocą cementu szklanego.
    2. Zamontuj szkiełko nakrywkowe na środku szkiełka za pomocą karteczek samoprzylepnych.
    3. Dodać 75 μl 1% pioloformu (patrz tabela materiałów) na szkło nakrywkowe.
      UWAGA: Przetestowaliśmy również Formvar (patrz tabela materiałów) i działa dobrze.
    4. Wiruj przez 3 minuty w temperaturze 1,360 × g (Rysunek 2A), aby uzyskać cienką warstwę pioloformu na powierzchni szkła nakrywkowego.
    5. Inkubować powierzchnię szkła nakrywkowego z 250 μl 0,1% poli-L-lizyny (patrz Tabela Materiałów) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (Rysunek 2B).
    6. Spłucz środkiemddH 2O i wysusz szkło nakrywcowe na powietrzu przez kilka minut.
    7. Rozcieńczyć nanocząstki złota o długości fali 80 nm (patrz Tabela Materiałów) za pomocą ddH2O do 25% (v/v, OD600 = 0,07) (patrz Tabela Materiałów) i poddać sonikacji przez 15 minut.
    8. Inkubuj powierzchnię szkła nakrywkowego z rozcieńczonymi nanocząstkami złota przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (Rysunek 2C).
    9. Spłucz ddH2O i wysusz szkło nakrywcowe na powietrzu przez kilka minut.
      UWAGA: Działa dobrze 2 tygodnie po pokryciu pioloformem i nanocząsteczkami złota. Zalecamy jednak użycie go natychmiast po pokryciu.

4. Ultracienkie przekroje

  1. Przyciąć powierzchnię bloku próbki do trapezu pod kątem prostym. Ciąć odcinki o grubości 100 nm za pomocą noża diamentowego (patrz tabela materiałów) za pomocą ultramikrotomu (patrz tabela materiałów). Oddziel pojedynczą sekcję od taśmy sekcji i zanurz pojedynczą sekcję w łaźni wodnej.
  2. Dodaj kroplę ddH2O na środek szkła nakrywkowego pokrytego złotymi nanocząsteczkami. Podnieś sekcję za pomocą pętli próbki i odwróć pętlę próbki na powierzchnię kropli wody. Usuń pętlę próbki, pozostawiając sekcję na powierzchni kropli wody.
  3. Suszyć nakrycie na powietrzu przez kilka minut. Narysuj pierścień wokół sekcji po przeciwnej stronie szkła nakrywkowego za pomocą markera.

5. Obrazowanie mikroskopem świetlnym

  1. Odzysk fluorescencji
    UWAGA: Przepływ pracy jest pokazany w Rysunek 3A.
    1. Dodać 10 μl bufora montażowego (patrz tabela materiałów) na ultracienką część szkła nakrywkowego. Umieść nową, czystą szklankę nakrywkową na buforze montażowym.
      UWAGA: Kluczowym składnikiem bufora montażowego jest DABCO, który służy do odzyskiwania fluorescencji białek fluorescencyjnych. Jest to bardzo ważne dla odzyskiwania fluorescencji.
    2. Umieść te dwa szkła nakrywkowe razem z ultracienką sekcją w komorze obrazowania (patrz tabela materiałów). Upewnij się, że szklanka nakrywkowa z narysowanym pierścieniem znajduje się na górze.
  2. Zbierz mapę nawigacyjną.
    1. Znajdź przekrój, używając narysowanego pierścienia jako markera w trybie obrazowania w jasnym polu odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego (patrz Tabela materiałów). Przejdź do jednego z rogów sekcji. Włącz białe światło i zrób zdjęcie w jasnym polu.
    2. Wyłącz białe światło. Włącz laser (561 nm) i wykonaj zdjęcia fluorescencyjne o tym samym polu widzenia (FOV).
    3. Wyłącz laser. Przejdź do sąsiedniego pola widzenia, upewniając się, że te dwie pola widzenia nakładają się na siebie w 10%. Zrób zdjęcie w jasnym polu i obraz fluorescencyjny drugiego pola widzenia.
    4. Powtarzaj tę operację, aż cała sekcja zostanie pokryta. Zapisz ścieżkę obrazowania, której można użyć do zszycia FOV.
      UWAGA: Aby uzyskać wyższą jakość obrazu, zalecamy użycie mikroskopu konfokalnego.
  3. Interesujące komórki obrazu.
    1. Użyj mapy nawigacji, aby łatwo wskazać interesujące komórki. Włącz laser (561 nm) i zrób 300 klatek obrazów fluorescencyjnych interesującej Cię komórki. Wyłącz laser.
    2. Włącz białe światło i rób sekwencyjne zdjęcia w jasnym polu (~100 klatek).
    3. Przechodzenie do innej interesującej Cię komórki.

6. Przygotowanie do obrazowania EM

UWAGA: Przepływ pracy jest pokazany w Rysunek 3B.

  1. Przenieś ultracienką sekcję do siatki szczeliny.
    1. Napełnij szklany słoik ddH2O.
    2. Wyjmij okulary nakrywkowe z komory i oddziel je pęsetą. Clamp szkło nakrywkowe, na którym znajduje się sekcja, zmyć bufor montażowy i wysuszyć na powietrzu.
    3. Naciąć # wokół ultracienkiego przekroju za pomocą jednostronnego ostrza i upuść 10 μl 12% kwasu fluorowodorowego (patrz Tabela materiałów) w każdym rogu #. Powoli włóż szklankę nakrywkową do wody.
      UWAGA: Kwas fluorowodorowy reaguje ze szkłem, co ułatwia usunięcie folii pioloform ze szkła nakrywkowego. Kwas fluorowodorowy jest toksyczny. Używaj go w kapturze chemicznym w rękawiczkach. Kontakt ze skórą wymaga natychmiastowej pomocy medycznej.
    4. Unieś razem folię pioloform i ultracienki odcinek na powierzchni wody. Umieść niepowlekaną siatkę szczelinową na sekcji, aby uchwycić sekcję na środku siatki.
    5. Przykryj szkiełko parafilmem (patrz tabela materiałów) i podnieś siatkę z folią pioloform. Wysuszyć siatkę na powietrzu w temperaturze pokojowej.
  2. Barwienie przekrojów
    1. Zaplam sekcję 2% UA i potrójnym prowadzeniem Sato. Aby uzyskać więcej informacji, zapoznaj się z wcześniej opublikowanym protocol2.

7. Analiza obrazu

  1. Zszyj mapę nawigacji.
    1. Znajdź lokalizację nieprzetworzonych danych. Otwórz oprogramowanie ImageJ (patrz tabela materiałów), aby zszyć mapę nawigacji.
    2. Kliknij Wtyczki | Szwy | Szwy w siatce/kolekcji | (Typ) Siatka: wąż według kolumny | (Zamówienie) Góra i lewo (zgodnie z sekwencją fotografowania) | Ustawianie rozmiaru plasterka | Wybierz ścieżkę danych | Ustawianie nazwy pliku | Zaznacz opcję Fuzja wyświetlacza. Obserwuj wynik, którym jest mapa nawigacyjna składająca się z kilku obrazów w jasnym polu o różnych polach widzenia.
    3. Użyj tej samej metody, aby zszyć mapę nawigacji fluorescencyjnej.
  2. Scal obrazy w jasnym polu z obrazami fluorescencyjnymi.
    1. W oprogramowaniu ImageJ kliknij Plik | Import | Sekwencja obrazów, aby zaimportować sekwencyjne obrazy w jasnym polu interesującej nas komórki.
    2. Kliknij na Obrazek | Stosy | Projekcja Z | Sumuj wycinki, aby uzyskać obraz projekcji sumy intensywności (SIP) sekwencyjnych obrazów w jasnym polu.
    3. Kliknij Edytuj | Odwróć, aby odwrócić obraz SIP jasnego pola, tak aby sygnały nanocząstek złota stały się jasnymi białymi kropkami.
    4. W ImageJ kliknij Plik | Import | Sekwencja obrazów, aby zaimportować sekwencyjne obrazy FM.
    5. Kliknij na Obrazek | Stosy | Projekcja Z | Sumuj wycinki, aby uzyskać obraz SIP sekwencyjnych obrazów FM.
    6. Kliknij na Obrazek | Kolor | Scal kanały , aby scalić obraz SIP brightfield z obrazem SIP FM jako obraz kompozytowy.
    7. Nanocząstki złota są zielone, a białko fluorescencyjne jest czerwone. Kliknij na Obrazek | Rodzaj | Kolor RGB, aby przekonwertować format obrazu kompozytowego na RGB.

8. Obrazowanie EM

  1. Umieść siatkę na uchwycie próbki, trzymając stronę przekroju siatki skierowaną do góry.
  2. Użyj mapy nawigacyjnej, aby z grubsza określić położenie odpowiednich komórek pod mikroskopem elektronowym na podstawie czterech względnych odległości do czterech różnych rogów prawego trapezu ultracienkiego przekroju.
  3. Potwierdź komórki za pomocą nanocząsteczek złota.
  4. Wykonuj obrazy EM przy różnych powiększeniach (4,200x, 6,000x lub 8,200x) za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) (patrz tabela materiałów).

9. Rejestracja obrazu FM z obrazem EM

  1. Otwórz oprogramowanie rejestracyjne (patrz Spis materiałów). Wpisz easyCLEMv014 w oknie wyszukiwania. Kliknij easyCLEMv0, aby otworzyć easyCLEMv0. Kliknij na Obraz/Sekwencja | Otwórz, aby zaimportować obraz EM i obraz kompozytowy do panelu oprogramowania.
  2. W oknie EasyCLEMv0 kliknij 2D (x,y,[T]), aby wybrać tryb wyrównania niesztywny (2D lub 3D).
  3. W oknie EasyCLEMv0 kliknij pole rozwijane po prawej stronie Wybierz obraz, który zostanie przekształcony i przeskalowany (prawdopodobnie FM), aby wybrać Kompozytowy (RGB)color.tif. Następnie kliknij pole rozwijane po prawej stronie Wybierz obraz, który nie będzie modyfikowany (prawdopodobnie EM), aby wybrać EMimage. tif.
  4. Kliknij Start, aby rozpocząć rejestrację.
  5. W oknie obrazu EM o nazwie EMimage. tif kliknij jedną nanocząstkę złota, aby umieścić punkt 1 na nanocząstce złota. W oknie obrazu FM o nazwie Composite (RGB)color.tif kliknij odpowiednią nanocząstkę złota, aby umieścić punkt 1 na nanocząstce złota.
  6. Kliknij Aktualizuj transformację, aby potwierdzić sygnał LM z sygnałem EM nanocząstek złota.
  7. Powtórz powyższą operację w oknie obrazu EM o nazwie EMimage. tif i dopasuj sygnał LM do sygnału EM tej samej nanocząstki złota jeden po drugim.
  8. Kliknij Zatrzymaj, aby zakończyć rejestrację.
  9. Po wyrównaniu obrazu kliknij Nałożony obraz i kliknij Obraz/Sekwencja | Zapisz jako, aby wyeksportować stos obrazów zawierający obrazy z czterech kanałów (czerwony, zielony, niebieski, szary).
  10. Otwórz ImageJ i kliknij Plik | Otwórz, aby zaimportować nałożony obraz. Kliknij na Obrazek | Stosy | Ułóż w stos z obrazami, aby rozdzielić nałożony obraz na cztery obrazy kanałów.
  11. Kliknij na Obrazek | Kolor | Scal kanały , aby scalić obrazy z trzech kanałów (czerwonego, zielonego i szarego) w obraz kompozytowy.
  12. Kliknij na Obrazek | Rodzaj | Kolor RGB, aby przekonwertować obraz kompozytowy na obraz CLEM.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poprzednie raporty wykazały, że mScarlet może celować w lizosom15. W tym protokole mScarlet z ekspresją AAV (rAAV-hSyn-DIO-mScarlet-WPRE-pA) wstrzyknięto do M1 (ML: ±1.2 AP: +1.3 DV: -1.5) mózgu myszy Vglut2-ires-cre za pomocą instrumentów stereotaktycznych. Zgodnie z protokołem opisanym powyżej, końcowy skorelowany obraz jest pokazany w Rysunek 4A. Obraz FM można dokładnie wyrównać z obrazem EM za pomocą nanocząstek złota (zielonych kropek) jako znaczników odniesienia. Jak pokazano na obrazie EM (Rysunek 4C,F), mScarlet celował w lizosom, a zawartość wewnątrz lizosomów jest niejednorodna, co jest typową cechą lizosomu wtórnego.

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczny przegląd korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej. (A) Przygotowanie mózgu myszy. Wirusy związane z adenowirusem wstrzyknięto do mózgu myszy. Po 30 dniach fluorescencyjne obszary wycinków mózgu myszy pocięto na małe bloki w celu przygotowania próbki EM. (B) Przygotowanie próbki EM. (C) Ultracienki przekrój za pomocą noża diamentowego i schematu ideowego szkła nakrywkowego. (D) Obrazowanie FM i obrazowanie TEM. Skróty: EM = mikroskopia elektronowa; FM = mikroskopia fluorescencyjna; TEM = transmisyjna mikroskopia elektronowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Powlekanie szkła nakrywkowego nanocząstkami złota. (A) Przykryj szkło nakrywkowe pioloformem przez odwirowanie. (B) Inkubować powierzchnię szkła nakrywkowego z poli-L-lizyną. (C) Inkubować powierzchnię szkła nakrywkowego z rozcieńczonymi nanocząstkami złota. (D) Schemat ideowy powlekanego szkła nakrywkowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Harmonogram przygotowań do obrazowania FM i EM. (A) Przebieg przygotowań do obrazowania FM składa się z pięciu kroków: (i) nabieranie ultracienkiego przekroju, (ii) suszenie powietrzem, (iii) umieszczanie drugiego szkła nakrywkowego po dodaniu bufora, (iv) mocowanie obu szkieł nakrywkowych w komorze oraz obrazowanie FM. (B) Przebieg przygotowań do obrazowania elektromagnetycznego również składa się z pięciu etapów: (i) oddzielenia dwóch szkieł nakrywkowych, (ii) unoszenia ultracienkiego przekroju, (iii) nabierania ultracienkiego przekroju, (iv) przesuwania ultracienkiego przekroju na siatkę szczelinową oraz (v) obrazowania EM. Skróty: EM = mikroskopia elektronowa; FM = mikroskopia fluorescencyjna; TEM = transmisyjna mikroskopia elektronowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Reprezentatywny obraz CLEM mScarlet. (A) Obraz CLEM całego neuronu. (B,E) Obrazy CLEM wstawki. (C,F) Obrazy EM wstawki. (D,G) Obrazy fluorescencyjne wstawki. Zielone kropki wskazują nanocząstki złota. Podziałka = 5 μm (A), 1 μm (obrazy wstawkowe). Skróty: EM = mikroskopia elektronowa; FM = mikroskopia fluorescencyjna; CLEM = korelacyjne światło i mikroskopia elektronowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół jest wszechstronną metodą obrazowania, która może łączyć informacje o lokalizacji białka docelowego z mikroskopii świetlnej (LM) i kontekst otaczający białko docelowe z mikroskopii elektronowej (EM)6. Ze względu na ograniczenia obecnych białek fluorescencyjnych, szeroko stosowaną metodą jest wstępne osadzanie korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM), co oznacza, że obrazowanie LM jest wykonywane przed przygotowaniem próbki EM. Prawie wszystkie istniejące białka fluorescencyjne mogą być badane w procesie wstępnego osadzania CLEM. Jednak ze względu na nieuniknione zniekształcenia i skurcze dokładne wyrównanie końcowego obrazu jest niemożliwe6. W związku z tym informacje dostarczone przez wstępne osadzenie CLEM mają na celu sprawdzenie ultrastruktur tej samej komórki zobrazowanej przez LM w obrazowaniu EM.

Metodą przewidzianą w tym badaniu jest CLEM po zatopieniu, w którym obrazowanie LM wykonuje się po przygotowaniu próbki EM. Skurcz spowodowany utrwaleniem chemicznym podczas przygotowywania próbki EM nie wpływa na dokładne wyrównanie obrazu końcowego. Ponadto, ponieważ zarówno obrazowanie LM, jak i obrazowanie elektromagnetyczne są wykonywane na tym samym odcinku i za pomocą nanocząstek złota, końcowe wyrównanie obrazu może być bardzo dokładne. CLEM po osadzeniu wymaga, aby białka fluorescencyjne zachowały sygnał fluorescencyjny po konwencjonalnym przygotowaniu próbki EM. Wcześniej informowaliśmy o pierwszym białku fluorescencyjnym o nazwie mEosEM, które może zatrzymywać sygnały fluorescencyjne przy użyciu Epon jako żywicy zatapiającej8. W porównaniu z innymi żywicami jako żywice do zatapiania, Epon ma doskonałe właściwości zachowania i cięcia ultrastruktury. Po mEosEM donoszono o innych opornych białkach fluorescencyjnych osadzających Epon, takich jak mKate211,16, mCherry210,17, mWasabi10,18, CoGFPv010,19, mEosEM-E8, mScarlet 8,20, mScarlet-I 8,20, mScarlet-H 8,20 i HfYFP9.

Z naszego doświadczenia wynika, że mScarlet jest lepszy od innych białek fluorescencyjnych. Roztwór utrwalający może wpływać na fluorescencję białek fluorescencyjnych. Ogólnie rzecz biorąc, szybkość wiązania paraformaldehydu (PFA) jest znacznie mniejsza niż aldehydu glutarowego (GA); i odwrotnie, PFA wnika do próbki szybciej niż większy GA. Mieszanina PFA i GA zapewnia równowagę między utrwalaniem próbki na tyle szybko, aby utrzymać jej jakość, ale na tyle wolno, aby nie doszło do uszkodzenia próbki, takiego jak utlenianie. Wyższe stężenie GA spowoduje wyższą autofluorescencję. Z naszego doświadczenia wynika, że fluorescencję mScarlet w bloku żywicy można wykryć 6 miesięcy po polimeryzacji. Zalecamy jednak wykonanie obrazowania CLEM natychmiast po polimeryzacji.

Innym kluczowym czynnikiem w osadzaniu CLEM po osadzeniu jest to, jak dokładnie zarejestrować obraz LM z obrazem EM. Na podstawie wcześniej zgłoszonych metod 6,21 wprowadziliśmy pewne modyfikacje do protokołu. Pierwszym z nich jest znalezienie tej samej komórki zobrazowanej przez LM w obrazowaniu EM. Wzięliśmy różne pola widzenia, aby zszyć mapę nawigacyjną całego ultracienkiego odcinka za pomocą trybu DIC i obrazowania fluorescencyjnego. Korzystając z mapy nawigacyjnej, można było łatwo zidentyfikować interesujące komórki. Kolejnym ulepszeniem jest dokładne wyrównanie obrazu. Wcześniej używaliśmy sygnału fluorescencyjnego w trybie obrazowania fluorescencyjnego i sygnału o wysokim kontraście elektronowym w trybie obrazowania EM nanocząstek złota jako znaczników wyrównania odniesienia6. Jednak podczas korzystania z mScarlet sygnał fluorescencyjny mScarlet był znacznie wyższy niż sygnał fluorescencyjny nanocząstek złota i trudno było wykryć sygnał fluorescencyjny nanocząstek złota. Aby rozwiązać ten problem, do rejestracji użyliśmy sygnału jasnego pola nanocząstek złota zamiast sygnału fluorescencyjnego. Postępując zgodnie z tym zmodyfikowanym protokołem, łatwo było przeprowadzić CLEM po osadzeniu.

Istnieją jednak pewne ograniczenia obecnego protokołu, które należy wziąć pod uwagę przed jego użyciem. Chociaż działa dobrze w systemie nadekspresji, fluorescencja jest dość słaba, jeśli białka docelowe znajdują się pod swoim natywnym promotorem22. Innym ograniczeniem jest to, że chociaż mScarlet jest najlepszym białkiem fluorescencyjnym (według naszego doświadczenia), które może zachować wystarczającą ilość sygnałów fluorescencyjnych po przygotowaniu próbki EM i działa dobrze w komórkach ssaków, będzie to problem w przypadku stosowania mScarlet jako znacznika fluorescencyjnego w neuronach, co może prowadzić do błędnej lokalizacji docelowych białek15. W takich przypadkach sugerujemy użycie oScarlet15, mutacji mScarlet, która działa dobrze w neuronach.

Potencjalne zastosowania tego zmodyfikowanego protokołu można podzielić na dwie kategorie. Pierwszym z nich jest zbliżenie się na poziom subkomórkowy, co oznacza badanie białka docelowego w kontekście subkomórkowym. W naszych wcześniej opublikowanych raportach wykorzystaliśmy CLEM po osadzeniu do zbadania tworzenia się cytoplazmatycznych przedziałów składania wirionu (cVAC) podczas infekcji γ-herpeswirusem23. W przyszłych zastosowaniach, CLEM po zatopieniu można połączyć z tomografią elektronową w celu uzyskania rozkładu 3D docelowych białek i natywnego rozwiązania struktury 3D24. Drugim rodzajem zastosowania potencjału jest pomniejszenie do poziomu komórkowego, który można wykorzystać do rysowania i analizowania obwodów neuronowych. Ze względu na swoją zdolność do wysokiej rozdzielczości, EM stał się skutecznym sposobem mapowania precyzyjnych połączeń mózgowych. Jednak EM nie może dokładnie określić tożsamości neuronów, co ogranicza dogłębną analizę obwodu neuronalnego. Epon po osadzeniu CLEM ma potencjał, aby wprowadzić tożsamość neuronów do obwodu neuronalnego bez naruszania ultrastruktur.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten projekt był wspierany przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32201235 do Zhifei Fu), Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Fujian, Chiny (2022J01287 do Zhifei Fu), Fundację Badawczą dla Zaawansowanych Talentów na Uniwersytecie Medycznym Fujian, Chiny (XRCZX2021013 do Zhifei Fu), Fundację Finansową Nauki Specjalnej Prowincji Fujian, Chiny (22SCZZX002 do Zhifei Fu), Założenie Kluczowego Laboratorium NHC ds. Technicznej Oceny Regulacji Płodności dla naczelnych innych niż człowiek oraz Szpitala Zdrowia Matki i Dziecka Fujian (2022-NHP-04 do Zhifei Fu). Dziękujemy Linying Zhou, Minxia Wu, Xi Lin i Yan Hu z Publicznego Centrum Obsługi Technologii Uniwersytetu Medycznego Fujian za wsparcie w przygotowaniu próbek EM i obrazowaniu EM.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Bufor fosforanowy 0,2 M (PB)NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O
0,2 M Tris-Cl (pH 8,5)Shanghai yuanye Bio-TechnologyR26284
25% aldehyd glutarowy (GA)Alfa AesarA17876Niebezpieczna substancja chemiczna
Abbelight 3DNanolnsights
AcetonSCR10000418
Wodorotlenek amonuJ& K Scientific335213
BioPhotometer D30eppendorf
Bufor do czyszczenia szkieł50 ml Wodorotlenek amonu, 50 ml Nadtlenek wodoru, 250 ml H2O
Szkło nakrywkoweWarner64-0715
DABCO Sigma290734Niebezpieczna substancja chemiczna
DDSASPI firmaGS02827Niebezpieczna substancja chemiczna
Wirówka biurkowaWIGGENSMINICEN 10E
Nóż diamentowyDiATOMEMX6353
DMP-30SPI firmaGS02823Niebezpieczny
chemiczny odczynnik do transfekcji DNAThermo Fisher 2696953Zestaw do transfekcji lipofekcaminy 3000
Epon 812 Firma SPIGS02659Niebezpieczna substancja chemiczna
EtanolSCR10009218
Fidżi obraz JNational Institutes of Health
Roztwór utrwalający 4% PFA+0,25% GA+0,02 M PB
FormvarSigma9823
GlicerolSCR10010618
Nanocząstki złotaKorpuskularny790120-010
ŻywicaAceton do żywicy 3:1, 1:1, 1:3
Kwas fluorowodorowySCR10011118
Nadtlenek wodoruSCR10011218
ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/)EasyCLEMv0
Plugin Komora obrazowaniaThermo Fisher A7816
Duże kapsułki żelatynoweMikroskopia elektronowa Nauki70117
Bufor montażowyMowiol 4-88, Glicerol, 0,2 M Tris-Cl (pH 8,5), DABCO
Mowiol 4-88Sigma9002-89-5
Na2HPO4  ž12H2OSCR10020318
NaH2PO4  ž2H2OSCR20040718
firma NMASPIGS02828Niebezpieczne
chemiczne startery oligonukleotydoweTakara Biomedical Technology (Pekin)Do jednoczesnego wykrywania Vglut2-ires-Cre i typu dzikiego użyto trzech starterów oligonukleotydów. Spłonki 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, i 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, miały na celu wykrycie Vglut2-ires-Cre. Podkłady  5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, i 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, miały na celu wykrycie typu dzikiego.
Mikrotom oscylacyjnyLeicaVT1000S
Tetroxide osmuSCRL01210302Niebezpieczna substancja chemiczna
OsO41% Tetroxide osmu+1,5% K4Fe (CN)6· 3H2O
ParafilmAmcorPM-996
Paraformaldehyd (PFA)SCR80096618Niebezpieczna substancja chemiczna
Bufor4% PFA+0,1 M PB
PioloformSigma63148-65-2Niebezpieczna substancja chemiczna
Poli-L-lizyna Sigma25986-63-0
Żelazocyjanek potasu (K4Fe (CN)6· 3H2O) SCR10016818
Ostrza skalpela Uchwyty skalpelaMerckS2771
MerckS2896-1EA
OLYMPUSMVX10
Myszy Jackson LaboratoryVglut2-ires-Cre (szczep: 129S6/SvEvTac) były trzymane w standardowych warunkach (25 stopni Celsjusza; C, 12-godzinny cykl światło/ciemność, z wodą i pokarmem podawanymi ad libitum. Samce i samice myszy były używane w 2– 3 miesiące, zakres wagowy 20-30 g.  
Transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM)FEITECNAL G2
UA roztwór (2% UA)Roztwór wodny
UltramikrotomLeicaLEICA EM UC6
Octan uranylu (UA)TEDPELLA 19481Niebezpieczna substancja chemiczna
nakrywkowych gradientowa Roztwór perfuzyjny Mikroskop stereoskopowy Myszy transgeniczne

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
  2. Kopek, B. G., et al. Diverse protocols for correlative super-resolution fluorescence imaging and electron microscopy of chemically fixed samples. Nat Protoc. 12 (5), 916-946 (2017).
  3. Watanabe, S., et al. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat Methods. 8 (1), 80-84 (2011).
  4. Johnson, E., et al. Correlative in-resin super-resolution and electron microscopy using standard fluorescent proteins. Sci Rep. 5 (1), 9583(2015).
  5. Paez-Segala, M. G., et al. Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM. Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).
  6. Fu, Z., et al. mEosEM withstands osmium staining and Epon embedding for super-resolution CLEM. Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).
  7. Kukulski, W., et al. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
  8. Peng, D., et al. Improved fluorescent proteins for dual-colour post-embedding CLEM. Cells. 11 (7), 1077(2022).
  9. Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy. Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).
  10. Tanida, I., et al. Two-color in-resin CLEM of Epon-embedded cells using osmium resistant green and red fluorescent proteins. Sci Rep. 10 (1), 21871(2020).
  11. Tanida, I., Kakuta, S., Oliva Trejo, J. A., Uchiyama, Y. Visualization of cytoplasmic organelles via in-resin CLEM using an osmium-resistant far-red protein. Sci Rep. 10 (1), 11314(2020).
  12. MacManus, D. B. Excision of whole intact mouse brain. MethodsX. 10, 102246(2023).
  13. Lu, X., et al. Preserving extracellular space for high-quality optical and ultrastructural studies of whole mammalian brains. Cell Rep Methods. 3 (7), 24(2023).
  14. Paul-Gilloteaux, P., et al. eC-CLEM: flexible multidimensional registration software for correlative microscopies. Nat Methods. 14 (2), 102-103 (2017).
  15. Fenno, L. E., et al. Comprehensive dual- and triple-feature intersectional single-vector delivery of diverse functional payloads to cells of behaving mammals. Neuron. 107 (5), 836-853 (2020).
  16. Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J. 418 (3), 567-574 (2009).
  17. Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity. PLoS One. 12 (2), e0171257(2017).
  18. Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging. BMC Biol. 6 (13), 1741(2008).
  19. Ogoh, K., et al. Dual-color-emitting green fluorescent protein from the sea cactus Cavernularia obesa and its use as a pH indicator for fluorescence microscopy. Luminescence. 28 (4), 582-591 (2013).
  20. Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
  21. Xu, P., Xu, T., Zhang, M., Fu, Z., He, W. A protocol for Epon-embedding-based correlative super-resolution light and electron microscopy. Research Square. , (2019).
  22. Johnson, E., Kaufmann, R. Preserving the photoswitching ability of standard fluorescent proteins for correlative in-resin super-resolution and electron microscopy. Methods Cell Biol. 140, 49-67 (2017).
  23. Zhou, S., et al. Liquid-liquid phase separation mediates the formation of herpesvirus assembly compartments. J Cell Biol. 222 (1), 17(2023).
  24. Tao, C. L., et al. Differentiation and characterization of excitatory and inhibitory synapses by cryo-electron tomography and correlative microscopy. J Neurosci. 38 (6), 1493-1510 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Correlative Light MicroscopyElectron MicroscopyEpon EmbeddingFluorescence PreservationSample PreparationMouse Brain TissueUltra Thin SectionImage RegistrationGold NanoparticlesFluorescence Imaging

Related Articles