Artykuł metodologiczny

Dwuwarstwowe urządzenie mikroprzepływowe do kombinatorycznej produkcji korków

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66154

⸱

1 grudnia 2023

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Institute for Complex Molecular Systems, Eindhoven University of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentacja dwuwarstwowego urządzenia opartego na polidimetylosiloksanie (PDMS) do produkcji bibliotek kombinatorycznych w emulsjach (korkach) typu woda w oleju jest przedstawiona. Niezbędny sprzęt i oprogramowanie wymagane do automatyzacji produkcji zatyczek jest szczegółowo opisane w protokole, a także pokazano produkcję ilościowej biblioteki zatyczek fluorescencyjnych.

Streszczenie

Mikrofluidyka kropelkowa to wszechstronne narzędzie, które pozwala na przeprowadzanie dużej liczby reakcji w chemicznie odrębnych nanolitrowych komorach. Takie systemy są wykorzystywane do hermetyzacji różnych reakcji biochemicznych - od inkubacji pojedynczych komórek po realizację reakcji PCR, od genomiki po syntezę chemiczną. Sprzężenie kanałów mikroprzepływowych z zaworami regulacyjnymi umożliwia kontrolę nad ich otwieraniem i zamykaniem, umożliwiając w ten sposób szybką produkcję wielkoskalowych bibliotek kombinatorycznych składających się z populacji kropel o unikalnym składzie. W artykule przedstawiono protokoły wytwarzania i działania dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego opartego na ciśnieniu, opartego na PDMS, które można wykorzystać do generowania kombinatorycznych bibliotek emulsji typu woda w oleju zwanych korkami. Dzięki zastosowaniu programów programowych i sprzętu mikroprzepływowego, przepływ pożądanych płynów w urządzeniu może być kontrolowany i manipulowany w celu generowania kombinatorycznych bibliotek zatyczek oraz kontrolowania składu i ilości populacji zatyczek składowych. Protokoły te przyspieszą proces generowania kombinatorycznych badań przesiewowych, w szczególności w celu zbadania odpowiedzi na leki w komórkach z biopsji pacjentów z rakiem.

Wprowadzenie

Mikrofluidyka pozwala na manipulowanie małymi ilościami płynów w mikrokanałach1. Skala działania typowych urządzeń mikroprzepływowych wynosi od kilkudziesięciu do kilkuset mikrometrów, co pozwala na miniaturyzację reakcji chemicznych i biologicznych, a tym samym umożliwia przeprowadzanie takich reakcji przy użyciu stosunkowo niewielkich ilości odczynników. Początkowo urządzenia mikroprzepływowe były wytwarzane z materiałów takich jak silicon2 i glass3. Chociaż są one nadal w użyciu4, stwarzają pewne problemy, takie jak kompatybilność z rozpuszczalnikami, wysokie koszty produkcji i trudności w integracji elementów sterujących przepływem płynów5,6. Metodologie wytwarzania oparte na PDMS, określane jako miękka litografia, oferują niedrogą alternatywę dla szybkiego prototypowania urządzeń7 oraz drogę do wytwarzania złożonych urządzeń wielowarstwowych8. Dodanie zaworów i pomp do urządzeń PDMS pozwala na możliwość kontrolowania trasy i prędkości płynów w urządzeniach9,10. Opracowano kilka metod projektowania i uruchamiania mikrozaworów w sposób odwracalny lub nieodwracalny - na przykład zawory bimetaliczne wykonane z krzemu i aluminium, które są uruchamiane termicznie11 lub wykorzystujące gaz generowany w wyniku reakcji elektrochemicznej do odchylania membrany z azotku krzemu12. Gu i in. demonstrują użycie mechanicznych pinów monitora brajlowskiego do wywierania nacisku na mikrokanały w celu regulacji przepływu13. Jednym z zestawów mikrozaworów, który zyskał popularność, są pneumatyczne zawory oparte na PDMS, zapoczątkowane przez grupę Stephena Quake14. Zazwyczaj takie zawory składają się z dwóch ortogonalnych mikrokanałów - kanału przepływowego i kanału sterującego. Po zwiększeniu ciśnienia w kanale sterującym, cienka membrana PDMS odchyla się od kanału przepływowego, zamykając go, a tym samym przerywając przepływ płynu. Po rozhermetyzowaniu membrana rozluźnia się, otwierając w ten sposób kanał przepływowy i umożliwiając wznowienie przepływu płynu. Zawory PDMS umożliwiają w ten sposób regulację przepływu w solidny i odwracalny sposób, ponieważ kanał sterujący może być wielokrotnie zwiększany i rozhermetyzowany15. Dodatkowo, ponieważ takie zawory mogą być uruchamiane przez przyłożenie ciśnienia, otwierają one drogę do cyfrowego sterowania i automatyzacji16. Ponadto, ponieważ są one wykonane z tego samego materiału, można je bezproblemowo zintegrować z produkcją urządzeń opartych na PDMS przy użyciu technik miękkiej litografii8,17,18. Te cechy sprawiają, że zawory PDMS są atrakcyjnym wyborem do regulacji przepływu w urządzeniach mikroprzepływowych. Thorsen i in. wykorzystali zasadę działania takich zaworów do zaprojektowania multipleksera fluidycznego - kombinatorycznego układu zaworów pneumatycznych - do adresowania prawie tysiąca wejściowych kanałów przepływu z dwudziestoma kanałami sterującymi19. Zasada ta została rozszerzona o selektywne kierowanie płynów do mikroprzepływowych chemostatów w układzie scalonym, dzięki czemu unikalne reakcje mogą być przeprowadzane jednocześnie w każdym reaktorze20,21,22,23. Jednak takie mikroreaktory, choć przydatne w optymalizacji wykorzystania ograniczonych odczynników, nie mogą zrównoleglić wielu reakcji i nie są wystarczające do badań wysokoprzepustowych.

Mikrofluidyka kropelkowa to podkategoria mikrofluidyki, która polega na wytwarzaniu kropel poprzez manipulowanie niemieszającym się, wielofazowym przepływem cieczy w urządzeniach mikroprzepływowych24. Tworzenie kropel polega na rozbiciu płynu ciągłego przez wprowadzenie płynu niemieszającego się, co skutkuje ściśnięciem z powodu niestabilności energii międzyfazowej i powstaniem emulsji25. Środki powierzchniowo czynne pomagają w tworzeniu zaokrąglonych kropelek, gdy emulsje opuszczają mikrokanał, stabilizując energie międzyfazowe26. Większe kropelki, zwane czopami, są mniej stabilne i mogą być zbierane w komorze przechowawczej (takiej jak długość rurki) jako zestaw komór wodnych rozmieszczonych po obu stronach przez jedną lub więcej niemieszających się cieczy27. Oprócz miniaturyzacji i podziału na przedziały, mikrofluidyka kropelkowa oferuje również zwiększoną przepustowość reakcji biologicznych, ponieważ można wytworzyć dużą liczbę kropel monodyspersyjnych - każda z nich służy jako nanoreaktor28. Kropelki, raz wygenerowane, mogą być również poddawane dalszym manipulacjom, takim jak splitting29,30, fusion31,32, sorting33,34, i łączenie w struktury wyższego rzędu35,36. Mikrofluidyka kropelkowa zrewolucjonizowała kilka dziedzin i technologii naukowych - od PCR37 do transkryptomiki pojedynczych komórek38, od discovery-leku39,40 do virology41, od sekwencjonowania nowej generacji42 do syntezy chemicznej43.

Integracja miękkiej litografii opartej na PDMS i mikrozaworów z technologią kropelkową to potężna kombinacja, która pozwala na regulację przepływu płynu w mikrokanałach i późniejszą kontrolę nad zawartością kropel. W zależności od otwierania i zamykania kanałów możliwe jest wytworzenie odrębnych populacji kropel, z których każda ma określony skład. Taka platforma mogłaby miniaturyzować, dzielić i zrównoleglać reakcje biochemiczne, a tym samym być użyteczną techniką do kombinatorycznych badań przesiewowych44. Kombinatoryczne badania przesiewowe to wysokoprzepustowa metoda generowania dziesiątek tysięcy kombinacji wybranych odczynników w celu wytworzenia bibliotek składających się z poszczególnych populacji o znanym składzie. Kombinatoryczne badania przesiewowe zostały wykorzystane do odkrycia synergicznych efektów między lekami i antybiotykami w hamowaniu wzrostu bakterii45. W dziedzinie terapii nowotworów kombinatoryczne badania przesiewowe zostały wykorzystane do testowania kombinacji leków przeciwnowotworowych dla danego pacjenta, rozwijając w ten sposób spersonalizowaną terapię46,47. Mathur i in. wykorzystali tę technologię, integrując kombinatoryczne podejście do kodowania kreskowego DNA w celu oceny zmian transkryptomu w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych leków48. W związku z tym kombinatoryczne badania przesiewowe są potężną, ale dopiero powstającą technologią i istnieje potrzeba opracowania różnorodnych technologii mikroprzepływowych w celu przeprowadzenia i ułatwienia takich procedur przesiewowych.

Celem tego manuskryptu jest przedstawienie kompletnego zestawu protokołów do produkcji dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego zdolnego do generowania kombinatorycznej biblioteki korków typu woda w oleju oraz opisanie sprzętu i oprogramowania potrzebnego do działania takiego urządzenia. Przepływ płynu jest regulowany za pomocą sterowanych ciśnieniowo zaworów pneumatycznych opartych na PDMS, które z kolei są sterowane przez niestandardowy program LabVIEW. Przepływ odczynników w urządzeniu odbywa się za pomocą dostępnych na rynku pomp ciśnieniowych. Przedstawiono prototyp z ośmioma wlotami, w którym zawartość trzech wlotów, z których każdy zawiera odczynnik wodny, tworzy czop. Faza wodna spotyka się z ciągłą fazą olejową, a świece są wytwarzane na skrzyżowaniu T o częstotliwości 0,33 Hz. Działanie systemu zostało zademonstrowane poprzez stworzenie biblioteki ilościowej zawierającej trzy odrębne populacje wtyczek fluorescencyjnych. Ta technologia i zestaw protokołów pomogą przyspieszyć tworzenie bibliotek kombinatorycznych do celów badań przesiewowych o wysokiej przepustowości.

Protokół

1. Miękka litografia

UWAGA: Urządzenie mikroprzepływowe składa się z dwóch warstw, warstwy przepływowej i warstwy kontrolnej (Rysunek 1A), a każda warstwa jest formowana z indywidualnie wzorzystych płytek przy użyciu odpowiednio dodatniego i ujemnego fotorezystu (szczegóły dotyczące fotorezystu i wywoływaczy znajdują się w Tabeli Materiałów).

  1. Wykonaj wytwarzanie płytki dla warstwy przepływowej, jak opisano poniżej.
    1. Odwodnić wafel krzemowy (o średnicy 100 mm, zorientowany <1-0-0>, 525) przez noc (12-16 h) w temperaturze 250 °C.
    2. Poczekaj, aż wafel ostygnie przed przystąpieniem do wirowania. Nałóż 3-4 ml dodatniego fotorezystu na środek płytki.
    3. Wirować przez 40 s z prędkością 1400 obr./min (344 obr./min), aby uzyskać wysokość elementu 45 μm.
    4. Miękkie pieczenie na płycie grzejnej za pomocą rampy temperatury, zwiększającej się z prędkością 450 °C /h, od 35 °C do 105 °C. Ten krok można również wykonać na tkankach z mikrofibry, aby zapobiec bezpośredniemu kontaktowi i zminimalizować bulgotanie fotorezystu. Wyjmij wafel z płyty grzejnej i pozwól mu ostygnąć na chusteczkach z mikrofibry.
    5. Umieść fotomaskę (produkowaną komercyjnie) odpowiadającą warstwie przepływowej (emulsją skierowaną w dół) na płytkę krzemową pokrytą rezystancyjnie i naświetlaj ją pod lampą UV o mocy 10 mW/cm2, aż do osiągnięcia całkowitej ekspozycji 200 mJ/cm2.
    6. Użyj dwóch płyt grzewczych - jednej w temperaturze 65 °C, a drugiej w temperaturze 95 °C - aby wykonać pieczenie po ekspozycji - odpowiednio przez 1 minutę i 7 minut - na płytach.
    7. Rozwiń wafel, przenosząc go na szalkę Petriego wypełnioną wywoływaczem w celu uzyskania dodatniego fotorezystu. Mieszaj szalkę Petriego, potrząsając nią na wytrząsarce stołowej z płytką całkowicie zanurzoną i okresowo odświeżaj roztwór wywoływacza, aż płytka zostanie całkowicie rozwinięta, a cechy będą wyraźnie widoczne.
    8. Użyj wody demineralizowanej, aby spłukać resztki rezystancji z płytki i sprawdź pod mikroskopem stereoskopowym, czy nie ma żadnych pozostałości wewnątrz kanałów. Usunąć pozostałości, zwracając wafel z powrotem do roztworu wywoływacza lub ostrożnie dodając wywoływacz do płytki za pomocą mikropipety. Po zakończeniu wysusz wafel za pomocą pistoletu do natryskiwania azotu.
    9. Rozpłynąć wafel, umieszczając go na płycie grzejnej ustawionej na 110 °C na 25 minut. W wyniku tego procesu powstają zaokrąglone elementy.
    10. Przejdź do silanizacji płytki zgodnie z opisem w kroku 1.3.
      UWAGA: Osadzanie z fazy gazowej heksametyldisilazanu (HMDS) można również przeprowadzić na płytkach krzemowych przed nałożeniem rezystu w celu poprawy przyczepności między rezystantem a płytką.
  2. Wykonaj wytwarzanie wafli dla warstwy kontrolnej, jak opisano poniżej.
    1. Weź kolejną płytkę krzemową i odwadniaj, umieszczając ją na płycie grzejnej ustawionej na 110 °C na 15 minut.
    2. Wyjmij wafel i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej przed przystąpieniem do wirowania.
    3. Nałóż 5 ml negatywu fotorezystu na środek płytki.
    4. Aby uzyskać wysokość elementu 40 μm, należy użyć następującego protokołu wirowania: 5 s przy 500 obr./min (przyspieszenie 100 obr./min), 33 s przy 1400 obr./min (300 obr./min/s), a na koniec zwolnij do 0 obr./min przez 5 s przy 300 obr./min/s.
    5. Pieczenie na miękko na dwóch oddzielnych płytach grzewczych ustawionych na 65 °C i 95 °C odpowiednio przez 1 minutę i 15 minut. Wyjmij wafel z płyty grzejnej i pozwól mu ostygnąć na chusteczkach z mikrofibry.
    6. Umieść fotomaskę (produkowaną komercyjnie) odpowiadającą warstwie kontrolnej (emulsją skierowaną w dół) na płytkę pokrytą rezystancyjnie i naświetlaj płytkę pod lampą UV ustawioną na 15 mW/cm2, aż do osiągnięcia całkowitej ekspozycji 250 mJ/cm2.
    7. Użyj dwóch płyt grzewczych - jednej w temperaturze 65 °C, a drugiej w temperaturze 95 °C - i wykonaj pieczenie płytki po naświetleniu przez odpowiednio 2 minuty, a następnie 5 minut. Wyjmij wafel z płyty grzejnej i pozwól mu ostygnąć na chusteczkach z mikrofibry.
    8. Rozwiń wafel, przenosząc go na szalkę Petriego wypełnioną wywoływaczem do ujemnego fotorezystu na 4 minuty. Odśwież wywoływacz i kontynuuj proces jeszcze przez 4 minuty.
    9. Opłucz wafel izopropanolem, aby usunąć resztki fotorezystu i użyj mikroskopu stereoskopowego, aby sprawdzić, czy wafel nie ma żadnych pozostałości wewnątrz kanałów.
    10. Usunąć pozostałości, zwracając wafel z powrotem do roztworu wywoływacza lub ostrożnie dodając wywoływacz do płytki za pomocą mikropipety. Po zakończeniu wysusz wafel za pomocą pistoletu do natryskiwania azotu.
    11. Po pełnym rozwinięciu wypal fotorezystor na twardo, umieszczając wafel na płycie grzejnej ustawionej na 95 °C na 10 minut.
    12. Przejdź do silanizacji zgodnie z opisem w kroku 1.3.
  3. Przeprowadź silanizację zgodnie z poniższym opisem.
    1. Umieść wafel w eksykatorze. Umieścić szklaną butelkę w eksykatorze i dodać 4-5 kropli 1,1,3,3 tetrametylodiloksanu.
      UWAGA: 1,1,3,3 tetrametylodiloksan nie jest toksyczny, ale jest łatwopalny. Można stosować inne silany, ale mogą one być toksyczne. Zaleca się przeprowadzanie silanizacji w dygestorium przy założeniu niezbędnych środków ochrony osobistej (PPE), takich jak fartuch laboratoryjny, okulary i rękawice nitrylowe.
    2. Pociągnij próżnię na 15 minut i uszczelnij eksykator na 12-16 godzin, aby silan mógł osadzić się na płytce.
    3. Otwórz eksykator i wyrzuć szklaną butelkę. Umieść wafel na czystej szalce Petriego.
  4. Wykonaj produkcję urządzenia mikroprzepływowego zgodnie z poniższym opisem.
    UWAGA: Poniższy protokół został zaadaptowany z poprzednich prac23.
    1. Przygotuj dwa oddzielne roztwory PDMS - jeden dla warstwy przepływowej i jeden dla warstwy kontrolnej. Dla każdego roztworu wymieszać środek bazowy i utwardzacz z zestawu PDMS w zlewce i wymieszać za pomocą pręta do mieszania. Warstwa kontrolna wymaga 10 g utwardzacza i 0,5 g utwardzacza (stosunek 20:1), podczas gdy warstwa przepływowa wymaga 40 g utwardzacza i 8 g utwardzacza (stosunek 5:1).
    2. Odgazuj roztwory PDMS w eksykatorze, aż roztwory będą wolne od gazu.
    3. Umieść silanizowaną warstwę przepływową na szalce Petriego pokrytej folią i zalej płytkę odpowiednim roztworem PDMS. Umieścić szalkę Petriego z powrotem w eksykatorze i pociągnąć podciśnienie, aby dalej odgazowywać (przez około 20 minut).
    4. Odwiruj silanizowaną warstwę kontrolną płytkę odpowiednim roztworem PDMS. Wlej 3-4 ml roztworu na środek wafla i wiruj przez 20 s z prędkością 1500 obr./min z prędkością 408 obr./min. Umieść wafel na równej powierzchni na zamkniętej szalce Petriego na 20 minut.
    5. Umieść zarówno warstwę przepływową, jak i kontrolną w piecu w temperaturze 80 °C na 18-20 minut. Okresowo monitoruj obie warstwy, aby sprawdzić, czy są utwardzone. Warstwy są gotowe, gdy są wystarczająco twarde, aby były plastyczne, a jednocześnie lekko lepkie, co poprawia wiązanie między dwiema warstwami.
    6. Wytnij PDMS wokół każdego z urządzeń na płytce warstwy przepływowej za pomocą skalpela. Upewnij się, że nie przycinasz zbyt blisko elementów i pozostaw około 2 cm wolnej przestrzeni między elementem a krawędziami PDMS. Po odłączeniu od płytki krzemowej przykryj blok PDMS taśmą po stronie funkcji, aby uniknąć zanieczyszczenia pyłem.
    7. Po wycięciu wszystkich bloków PDMS umieść je jeden po drugim na odpowiedniej płytce warstwy kontrolnej, wykonując zgrubne wyrównanie na oko.
    8. Po umieszczeniu wszystkich bloków w odpowiadających im obszarach warstwy kontrolnej, dostosuj położenie każdego z bloków tak, aby zawory regulacyjne nakładały się na odpowiednie kanały przepływowe, aby zakończyć wyrównanie. Można to również przeprowadzić za pomocą mikroskopu stereoskopowego.
    9. Usuń kieszenie powietrzne między dwiema warstwami, wywierając nacisk. Jeśli kieszeń powietrzna znajduje się na elemencie lub w jego pobliżu, należy uważać, aby nie zapaść kanałów podczas wywierania nacisku.
    10. Umieść urządzenia w piekarniku o temperaturze 80 °C i pozostaw je do połączenia na 12-16 godzin. Umieść ciężarki 100 g na każdym z urządzeń, aby poprawić wiązanie między dwiema warstwami.
    11. Wyjmij wafel i wytnij każde urządzenie z osobna. Oderwij urządzenia od płytki warstwy kontrolnej i przykryj stronę funkcji taśmą.
    12. Umieść każde pojedyncze urządzenie na macie do cięcia stroną z funkcją skierowaną do góry i wybij otwór dla każdego z ośmiu wlotów warstwy przepływu, ośmiu wlotów kanałów warstwy kontrolnej, wlotów oleju i wylotu za pomocą stempla biopsyjnego o średnicy 0,75 mm stroną z funkcją skierowaną do góry.
    13. Załaduj asher plazmowy szkiełkiem mikroskopowym i pojedynczym urządzeniem z usuniętą taśmą i stroną z funkcją skierowaną do góry. Wykonaj spopielanie plazmą tlenową z mocą 30 W przez czas trwania 20 s.
    14. Wyjmij urządzenie i szklankę wysuwają się, gdy tylko spopielanie zostanie zakończone i umieść urządzenie stroną z funkcją do dołu na szkiełku. Przyczepność między PDMS a szkłem powinna być natychmiast widoczna gołym okiem. Wywieraj nacisk na wszystkie obszary z kieszeniami powietrznymi, aby wycisnąć powietrze.
    15. Umieść urządzenia na płycie grzejnej ustawionej na 110 °C na 60 minut z ciężarkiem na górze, aby poprawić przyczepność PDMS do szkła.

2. Konfiguracja sprzętu

UWAGA: Schemat połączeń z urządzeniem mikroprzepływowym jest pokazany w Rysunek 1B, a realizacja takiego schematu przy użyciu niezbędnego sprzętu jest pokazana w Rysunek 2.

  1. Ustaw zawory pneumatyczne zgodnie z poniższym opisem.
    UWAGA: Każdy kanał sterujący, który reguluje zawór PDMS na chipie, jest z kolei sterowany przez pojedynczy zawór elektromagnetyczny. Prezentowany tutaj prototyp składa się z ośmiu kanałów sterujących (Rysunek 1A), a zatem wymaganych jest osiem zaworów elektromagnetycznych.
    1. Zawory elektromagnetyczne są sterowane za pomocą niestandardowego oprogramowania LabVIEW (Main Interface Program; Rysunek 3 i Plik uzupełniający 1, Plik uzupełniający 2, Plik uzupełniający 3, Plik uzupełniający 4). Ten program wysyła polecenia MODBUS za pośrednictwem połączenia TCP (Plik uzupełniający 5, Plik uzupełniający 6) do sterownika WAGO. Podłącz urządzenie WAGO do komputera z programem LabVIEW za pomocą Ethernet. Kontynuuj sekwencyjne podłączanie zaworów elektromagnetycznych do portów w sterowniku WAGO. Bardziej szczegółowy opis można znaleźć w wcześniej opisanych protokołach23.
    2. Podłącz zestaw zaworów elektromagnetycznych do źródła sprężonego powietrza za pomocą rurki 1/4 cala i ustaw ciśnienie w układzie zaworów na 3.5 bara. W tym systemie zastosowano osiem zaworów oznaczonych 9-16.
  2. Ustaw regulatory ciśnienia zgodnie z poniższym opisem.
    UWAGA: Dostępna na rynku pompa ciśnieniowa służy do sterowania przepływem płynu (Rysunek 2). Zastosowano ośmioportowy i czteroportowy zestaw pomp, aby pomieścić osiem wlotów wodnych i dwa wloty oleju w urządzeniu. Ciśnienie w każdym porcie jest regulowane za pomocą oprogramowania dostarczonego przez producentów.
    1. Podłączyć pompę ciśnieniową do źródła sprężonego powietrza, upewniając się, że dostarczane ciśnienie nie przekracza maksymalnego ciśnienia dozwolonego przez pompę (2.2 bara zarówno dla sterowników ośmioportowych, jak i czteroportowych).
    2. Podłącz pompy ciśnieniowe do komputera za pomocą złącza USB.
    3. Po włączeniu pompy powinny być widoczne w odpowiednim oprogramowaniu. Ustaw ciśnienie na zero podczas ustawiania pomp.
    4. Podłącz męskie złącze luer do 3/32 cala z zadziorem do każdego z 12 żeńskich portów wyjściowych luer lock w sterownikach.
    5. Podłącz kawałek miękkiej rurki (OD: 3 mm, ID: 1 mm, L: 15 cm) do zadzioru. Podłącz kolejny męski luer do złącza kolczastego 3/32 cala do drugiego końca miękkiej rurki.
    6. Podłącz króciec typu luer (23 G, 0,5 cala) do złącza z zadziorem. W tym momencie regulator ciśnienia jest ustawiony i gotowy do użycia.

3. Konfiguracja urządzenia mikroprzepływowego

  1. Podłącz rurkę kanału sterującego zgodnie z poniższym opisem ( Rysunek 2).
    1. Dla każdego kanału sterującego przyciąć odcinek rurki z politetrafluoroetylenu (PTFE) (OD: 0.042 cala, ID: 0.022 cala). Włóż szpilkę króćca luer 23 G, 0.5 cala na jednym końcu.
    2. Podłącz króciec luer do męskiego luera do nylonowego złącza 3/32 cala. Włóż zadzior łącznika do rurki poliuretanowej (OD: 4 mm, ID: 2.5 mm). Podłącz drugi koniec rurki poliuretanowej bezpośrednio do zaworu elektromagnetycznego.
    3. Napełnij strzykawkę wodą i podłącz na końcu kłód luer o masie 23 G, 0,5 cala.
    4. Podłącz wolny koniec rurki PTFE do tej strzykawki i wstrzyknij wodę do mniej więcej połowy rurki.
    5. Odłącz rurkę od strzykawki i włóż wolny koniec rurki do wybitego otworu odpowiedniego kanału sterującego (Rysunek 1A-C1-8). Powtarzaj, aż każdy kanał sterujący zostanie podłączony do odpowiedniego zaworu elektromagnetycznego.
      UWAGA: W tym artykule zawory elektromagnetyczne 9-16 zostały podłączone do kanałów sterujących odpowiadających odpowiednio C1 do C8. Chociaż można je podłączyć w dowolny sposób, ważne jest, aby pamiętać o kolejności i kolejności połączeń, zwłaszcza podczas obsługi programu głównego interfejsu.
    6. Użyj programu Main Interface (Rysunek 3), aby otworzyć wszystkie zawory elektromagnetyczne (Zwiększ ciśnienie we wszystkich kanałach sterujących). Spowoduje to wypchnięcie płynu z rurki do kanałów sterujących urządzenia mikroprzepływowego, a tym samym jego napełnienie. Przykład zaworów ciśnieniowych i rozhermetyzowanych jest pokazany na Rysunek 4.
  2. Podłącz odczynniki i zalej urządzenie zgodnie z poniższym opisem.
    1. Upewnij się, że wszystkie kanały sterujące są pod ciśnieniem, naciskając przycisk Zwiększ ciśnienie we wszystkich kanałach sterujących w programie głównego interfejsu (Rysunek 3).
    2. Dla każdego z odczynników wodnych należy wyciąć odcinek rurki PTFE (OD: 0.042 cala, ID: 0.022 cala) wystarczająco długi, aby połączyć pompy z wlotami wlotów urządzenia mikroprzepływowego. Podłącz jedną z rurek do króćca luer z kroku 2.2.6.
    3. Napełnij strzykawkę wymaganym odczynnikiem i podłącz na końcu króciec luer o masie 23 G, 0,5 cala.
    4. Wstrzyknąć odczynnik do odpowiedniego przewodu PTFE, aż przewód zostanie pełny. Należy uważać, aby odczynnik nie dostał się do portu wyjściowego w zestawie pompy.
    5. Włóż wolny koniec rurki do odpowiedniego wlotu w chipie mikroprzepływowym.
    6. Zastosuj ciśnienie 400 mbar do każdego z wlotowych odczynników wodnych za pomocą dostarczonego oprogramowania.
    7. Sekwencyjnie obniżaj ciśnienie w kanałach sterujących indywidualnie za pomocą programu Main Interface (Rysunek 3), aby upewnić się, że wszystkie odczynniki dotarły do złącza T urządzenia. W razie potrzeby uruchomić poszczególne zawory, naciskając odpowiednie przyciski w programie w polu Ręczne zwiększanie ciśnienia w kanałach sterujących.
    8. Powtórzyć kroki 3.2.3 do 3.2.5 dla odczynników olejowych. Zastosuj ciśnienie 400 mbar do każdego z odczynników olejowych na wlocie.
    9. Jednocześnie rozhermetyzuj wszystkie kanały sterujące, naciskając przycisk Dehermetyzuj wszystkie kanały sterujące (Rysunek 3), aż całe powietrze zostanie usunięte z urządzenia. Można to zaobserwować gołym okiem lub pod mikroskopem.
    10. Zwiększ ciśnienie we wszystkich kanałach sterujących, naciskając przycisk Zwiększ ciśnienie we wszystkich kanałach sterujących (Rysunek 3). Na tym etapie wszystkie odczynniki zostały podłączone, a urządzenie jest zagruntowane i gotowe do użycia.
  3. Zaprogramuj i wykonaj eksperyment zgodnie z poniższym opisem.
    1. Zakoduj skład, sekwencję i repliki każdej populacji wtyczek, które mają zostać utworzone, w pliku .csv, jak pokazano w pliku uzupełniającym 7, który służy jako dane wejściowe dla automatycznego eksperymentu w programie głównego interfejsu (Rysunek 3). Oznacz niezbędne kanały sterujące cyfrą 0, jeśli odpowiadają one wlotowi, który musi być otwarty, i 1, jeśli musi być zamknięty. Każdy wiersz w pliku .csv odpowiada jednej odrębnej populacji wtyczek.
    2. Załaduj .csv do programu głównego interfejsu, klikając przycisk Folder na karcie Plik eksperymentu.
    3. Wprowadź odpowiednie pola w programie, takie jak Iteracje eksperymentu (aby określić, ile razy dana sekwencja korków jest produkowana), Czas rozhermetyzowania (aby określić, jak długo kanały wlotowe muszą być otwarte, a odpowiadający im kanał sterujący musi być rozhermetyzowany w milisekundach), Czas zwiększania ciśnienia (aby określić, jak długo wloty muszą być zamknięte między sekwencjami populacji korków w milisekundach).
    4. Wybierz kanały wejściowe odpowiadające produkcji kodów kreskowych w sekcji Wloty kodów kreskowych (do 3 kanałów) wraz z czasem, przez jaki muszą być otwarte (Czas na kodowanie kreskowe (ms)). Alternatywnie, te kody kreskowe mogą być również zakodowane na stałe w pliku wejściowym .csv, jak pokazano w pliku uzupełniającym 7.
    5. Zmniejszyć ciśnienie odczynników olejowych na wlocie do 200 mbar.
    6. Podłącz rurkę PTFE (OD: 0.042 cala, ID: 0.022 cala) o żądanej długości do gniazdka, aby zebrać wtyczki. Aby zapewnić równomierną produkcję korków, należy używać węży o długości około 100 cm wstępnie wypełnionych zatyczkami do zbierania. Ma to na celu zneutralizowanie różnicy ciśnień na wylocie, która jest wywierana przez zbieranie korków w przewodach.
    7. Naciśnij Uruchom eksperyment, aby uruchomić program i podłączyć produkcję.
  4. Wykonaj rejestrację i analizę danych zgodnie z poniższym opisem (patrz Rysunek 5).
    UWAGA: W tej sekcji szczegółowo opisano metodę analizy wtyczek fluorescencyjnych. W zależności od charakteru generowanych wtyczek, sekcja ta może być zmieniana w zależności od potrzeb.
    1. Napełnij strzykawkę olejem (olejem mineralnym lub olejem fluorowanym) i podłącz na końcu króciec luer 23 G 0,5 cala. Przymocować strzykawkę do pompy.
    2. Podłączyć jeden z końców napełnionej rurki zbiorczej do króćca luer na strzykawce. Zamocuj drugi koniec napełnionej rurki zbiorczej nad soczewką obiektywu mikroskopu.
    3. Umieść zbiornik na odpady poniżej końca rurki w pobliżu celu.
    4. Ustaw mikroskop na danym obszarze rurki i ustaw go tak, aby rejestrował fluorescencję w żądanym kanale (kanałach).
    5. Ustawić pompę na natężenie przepływu 50 μl/min.
    6. Nagraj wideo kanału fluorescencyjnego jako plik .avi.
    7. Przeanalizuj plik .avi za pomocą dostarczonego skryptu Pythona (plik uzupełniający 8), aby wyodrębnić średnią fluorescencję w predefiniowanym obszarze zainteresowania (ROI) na klatkę pliku .avi (którego przykład podano w pliku uzupełniającym 9).
    8. Użyj dostarczonego dostosowanego skryptu języka R (plik uzupełniający 10), aby wyodrębnić warunki i wykreślić nieprzetworzone dane oraz wysokości szczytów.
      UWAGA: Skrypt R w pliku uzupełniającym 10 został użyty do analizy w tym artykule. Niestandardowe funkcje języka R używane w tym skrypcie do wycinania danych, wykrywania warunków za pomocą kodów kreskowych oraz analizowania wysokości pików dla poszczególnych wtyczek i kreślenia są dostępne w pliku uzupełniającym 11.

Wyniki

Jedną z kluczowych cech chipa mikrofluidycznego są zawory PDMS, a ich zdolność do regulacji przepływu cieczy została scharakteryzowana, ponieważ wpływa ona na paradygmat operacyjny urządzenia. W tym celu rejestrowano natężenie przepływu wody destylowanej (mierzone za pomocą komercyjnego czujnika przepływu) przez kanały wlotowe jako funkcję różnych ciśnień wejściowych, przy jednoczesnym okresowym zwiększaniu ciśnienia (3,5 bar przez 2000 ms) i zmniejszaniu ciśnienia (1000 ms) w zaworach PDMS (Rysunek 6A). Zaobserwowano, że zawory były w stanie regulować przepływ cieczy do ciśnienia wejściowego wynoszącego około 800 mbar, co wskazuje spadek natężenia przepływu do zera podczas aktywacji zaworów (Rysunek 6 B-D). Potwierdza to zasadność zastosowania zaworów opartych na PDMS do regulacji przepływu odczynników wewnątrz kanałów. Ponadto przy ciśnieniu 1200 mbar ciśnienie wejściowe jest zbyt wysokie, aby zawory mogły regulować przepływ, co potwierdza fakt, że natężenie przepływu nie spada do zera (Rysunek 6E). Choć czas zwiększania i zmniejszania ciśnienia w zaworach PDMS może być modyfikowany, obliczono szybkość zmiany przepływu cieczy przy obecnych warunkach zwiększania ciśnienia (2000 ms) i zmniejszania ciśnienia (1000 ms). Dla ciśnienia wejściowego 400 mbar przepływ może być włączany i wyłączany odpowiednio z częstotliwością 1,26 Hz i 1,44 Hz (Rysunek 6C).

Poprzednie wersje podobnego kombinatorycznego wysokoprzepływowego urządzenia mikrofluidycznego również zawierały kanał odpływowy połączony z każdym kanałem przepływowym46,47. Urządzenia te były eksploatowane w reżimie stałego natężenia przepływu (gdzie odczynniki były wtryskiwane do urządzenia ze stałym natężeniem przepływu, a nie pod stałym ciśnieniem), a kanały odpływowe były programowane tak, aby otwierały się w momencie zamknięcia odpowiadających im kanałów wlotowych w celu zniwelowania wzrostu ciśnienia. Takie kanały, choć użyteczne, prowadzą do utraty odczynników, ponieważ zawartość kanału odpływowego nie przyczynia się do tworzenia wtyczek. Co więcej, do regulacji otwierania i zamykania kanałów odpływowych wymagane są dodatkowe kanały sterujące, a tym samym dodatkowe pompy. W prezentowanym tutaj prototypie usunięto kanały odpływowe i ustanowiono paradygmat operacyjny, który pozwala na zmniejszenie marnotrawstwa odczynników oraz redukcję złożoności konstrukcyjnej i operacyjnej. Polega on na wtryskiwaniu odczynników wodnych w trybie stałego ciśnienia, w przeciwieństwie do trybu stałego natężenia przepływu. Aby lepiej zrozumieć oba reżimy, w każdym przypadku oceniono zależność między ciśnieniem a natężeniem przepływu w kanałach podczas aktywacji zaworu (wykorzystując ten sam układ, który pokazano na Ryc. 6A), a wyniki przedstawiono na Ryc. 7. Na Ryc. 7A zmierzono natężenie przepływu wody destylowanej podczas wtryskiwania pod stałym ciśnieniem (300 mbar) i zaobserwowano, że podczas aktywacji zaworu natężenie przepływu spada do zera, a po odbarczeniu zaworu natężenie przepływu powraca do poziomów sprzed aktywacji. Jednak w reżimie stałego natężenia przepływu, w którym rejestrowano ciśnienie w kanałach podczas wtryskiwania wody destylowanej ze stałym natężeniem przepływu (2.5 µL/min; Ryc. 7B), aktywacja zaworu nie doprowadziła do całkowitego zamknięcia wlotu – co potwierdza fakt, że natężenie przepływu nie spadło do zera – i zaobserwowano wzrost ciśnienia w kanale. Jest to ciśnienie, które jest redukowane poprzez otwarcie kanałów odpływowych. Ponieważ reżim stałego ciśnienia wejściowego umożliwia pracę urządzenia bez przeciwciśnienia podczas aktywacji zaworu, eliminując tym samym potrzebę stosowania kanałów odpływowych, reżim ten przyjęto do eksploatacji układu mikrofluidycznego.

Aby zademonstrować funkcjonalność urządzenia mikrofluidycznego, stworzono ilościową kombinatoryczną bibliotekę fluorescencyjnych kropli. Do ośmiu wlotów urządzenia podłączono trzy odczynniki wodne – fluoresceinę (50 µM) w czterech wlotach (I1, I3, I5, I7), wodę destylowaną w trzech wlotach (I4, I6, I8) oraz jeden wlot z niebieskim barwnikiem (I2; pełniącym rolę kodu kreskowego) – oraz dwa odczynniki olejowe – olej fluorowany (FC-40) i olej mineralny (MO), odpowiednio we wlotach O1 i O2 (Rycina 1A, Rycina 8A). Olej fluorowany służy jako faza nośna, w której rozproszone są krople wodne, a olej mineralny wspomaga stabilność kropli i minimalizuje przyleganie ich zawartości do ścianek, ograniczając tym samym zanieczyszczenia krzyżowe między kroplami46. Przy trzech wlotach przyczyniających się do składu pojedynczej populacji kropli, konfiguracja ta może generować trzy odrębne populacje fluorescencyjne: FFF – składającą się z fluoresceiny z trzech kanałów, FFW – składającą się z fluoresceiny z dwóch kanałów i wody z jednego kanału, oraz FWW – składającą się z fluoresceiny z jednego kanału i wody z dwóch kanałów. W tym układzie istnieje 12 różnych warunków (populacji kropli wytworzonych z odrębnej kombinacji trzech wlotów), które mogą generować krople FWW, 18 różnych warunków dla kropli FFW oraz cztery różne warunki dla kropli FFF. W związku z tym zaprogramowano chip tak, aby wytworzył te 34 różne warunki, z pięcioma powtórzeniami kropli dla każdego z nich, wraz z pięcioma powtórzeniami kropli kodujących oddzielającymi poszczególne serie. Zaleca się przeplatanie fluorescencyjnych populacji kropli populacją kodującą, tzn. zestawem kolorowych (idealnie niefluorescencyjnych) kropli (w tym przypadku utworzonych przez otwarcie kanałów wlotowych odpowiadających niebieskiemu barwnikowi i dwóm kanałom z wodą destylowaną), które są widoczne gołym okiem. Pozwala to użytkownikowi monitorować proces produkcji kropli pod kątem takich problemów jak pękanie lub fuzja kropli i ułatwia późniejszą analizę. W rezultacie wytworzono łącznie 340 kropli – 170 kropli eksperymentalnych i 170 kropli kodujących oddzielających różne warunki – które zebrano w rurce z PTFE, której próbkę przedstawiono na Rycynie 8B. Czas dekompresji i czas kompresji ustawiono odpowiednio na 1000 ms i 2000 ms. Przeanalizowano fluorescencję kropli oraz ich zmienność w obrębie i pomiędzy różnymi warunkami eksperymentalnymi, a wyniki przedstawiono na Rycynie 8C,D. Rycina 8C przedstawia fluorescencję na klatkę pliku .avi wygenerowanego w kroku 3.4.6, co uwypukla 34 rozważane warunki eksperymentalne (wyznaczone niebieską linią). Średnia wartość fluorescencji pików w obrębie danego warunku jest zaznaczona na czerwono, a linie przerywane wskazują błąd standardowy w tym warunku. Wysokości pików wszystkich kropli w każdej populacji, uzyskane poprzez odjęcie fluorescencji tła od maksymalnej fluorescencji wykrytej w każdym piku, naniesiono na Rycynę 8D. Ostatni pik w każdym warunku pominięto w obliczeniach, ponieważ była to kropla zanieczyszczona wskutek wymieszania odczynników w złączu T (ponieważ fluorescencja kropli była rejestrowana w odwrotnej kolejności niż ich produkcja, pierwsza kropla w populacji podczas produkcji jest ostatnią kroplą w populacji podczas analizy). Wyraźnie widać, że wysokość kropli FWW wynosi około jednej trzeciej (średnia = 40,9, odchylenie standardowe = 3,1), a wysokość kropli FFW około dwóch trzecich (średnia = 78,4, odchylenie standardowe = 5) wysokości kropli FFF (średnia = 117, odchylenie standardowe = 10). Wyniki te są zgodne z oczekiwanymi proporcjami fluorescencji w różnych populacjach kropli FFF/FFW/FWW, co podkreśla niezawodność i prawidłowe funkcjonowanie urządzenia.

Schemat chipa mikroprzepływowego, warstwy sterujące i przepływowe z rurkami kanałów, mechanizm działania zaworów.
Rycina 1: Schemat konstrukcji urządzenia i układu mikroprzepływowego. (A) Warstwa przepływowa chipa zaznaczona jest na niebiesko, a warstwa sterująca na czerwono. Łącznie osiem różnych odczynników wodnych może przepływać przez wloty (I1-8) w stronę złącza T, gdzie spotykają się z fazami olejowymi z wlotów oleju (O1-2), tworząc krople zbierane na wylocie. Każdy kanał wlotowy przepływu znajduje się pod kontrolą osobnego kanału sterującego (C1-8). (B) Przedstawiono schemat chipa mikroprzepływowego wraz z połączeniami rurek do wlotów, kanałów sterujących i odczynników olejowych, a także rurką wylotową. Strzałki wskazują kierunek przepływu cieczy w rurkach. Wstawka przedstawia zasadę działania zaworów PDMS. Linie przerywane wskazują, że warstwa sterująca znajduje się pod warstwą przepływową. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Dubuc et al49. Kliknij tutaj, aby wyświetlić rycinię w większym rozmiarze.

Schemat systemu mikrofluidycznego z pompami ciśnieniowymi, zaworami elektromagnetycznymi i chipem do badań nad kontrolą cieczy.
Rysunek 2: Schemat konfiguracji sprzętowej do wytwarzania kropli (plugów). Pompy ciśnieniowe kontrolują przepływ odczynników (zarówno wodnych, jak i olejowych) w kanałach wlotowych, a zawory elektromagnetyczne sterują aktywacją zaworów z PDMS. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat interfejsu systemu sterowania mikrofluidycznego do zautomatyzowanej konfiguracji eksperymentu i nadciśnienia.
Rycina 3: Główny program interfejsu do sterowania urządzeniem mikrofluidycznym. Ten niestandardowy program umożliwia ręczne nadawanie ciśnienia poszczególnym zaworom pneumatycznym (biały panel). Pozwala on również na przeprowadzenie pełnego eksperymentu (niebieski panel), w ramach którego przyjmuje plik .csv z pożądanymi populacjami czopów oraz niezbędnymi parametrami, takimi jak czasy nadawania i zwalniania ciśnienia w zaworach, a także wyświetla w czasie rzeczywistym status realizacji eksperymentu, w tym informację o tym, które kanały sterujące są pod ciśnieniem, a które nie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat kanału mikroprzepływowego pokazujący dynamikę przepływu cieczy; układ mikroskopowy do obserwacji przepływu.
Rysunek 4: Aktywacja zaworu sterowana ciśnieniem. Obrazy z mikroskopii w polu jasnym przedstawiające (A) odbarczony zawór PDMS (poziomo) i otwarty kanał wlotowy (pionowo) oraz (B) poddany ciśnieniu zawór PDMS zamykający kanał wlotowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Układ pompy strzykawkowej do mikroskopii, przedstawiający rurkę zbiorczą z zatyczkami; schemat transportu płynu.
Rysunek 5: Schemat układu do rejestracji danych. Rurka zbiorcza jest połączona ze strzykawką z olejem, która jest przymocowana do pompy. Zatyczki są przepływane przez rurkę zbiorczą, a obrazy/filmy są rejestrowane przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza szybkości przepływu w chipie mikrofluidycznym; schemat pomp ciśnieniowych, czujnika przepływu; wykresy szybkości przepływu przy różnych wartościach mbar.
Rycina 6: Wpływ aktywacji zaworu na szybkość przepływu przy danym ciśnieniu wejściowym. (A) Schemat układu sprzętowego użytego do monitorowania szybkości przepływu w kanałach mikrofluidycznych. Odpowiedź szybkości przepływu w kanałach podczas pracy przy różnych ciśnieniach wejściowych: (B) 200 mbar, (C) 400 mbar, (D) 800 mbar oraz (E) 1200 mbar. Czas trwania aktywacji zaworu zaznaczono czerwonym obszarem zacienionym. Do wszystkich eksperymentów użyto wody destylowanej. Odchylenie standardowe z trzech niezależnych pomiarów zaznaczono zielonym obszarem zacienionym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykresy zależności przepływu od ciśnienia; analiza zależności od czasu w procesach dynamicznych, dwa wyniki porównawcze.
Rycina 7: Zależność między ciśnieniem a szybkością przepływu odczynników w kanałach wlotowych podczas aktywacji zaworu. (A) W reżimie stałego ciśnienia wlotowego (300 mbar) szybkość przepływu spada do zera po aktywacji zaworu. (B) W reżimie stałej szybkości przepływu (2,5 µL/min) aktywacja zaworu prowadzi do szybkiego wzrostu ciśnienia w kanale aż do momentu odbarczenia zaworu. Czas trwania aktywacji zaworu pokazano w obszarze zacieniowanym na czerwono. We wszystkich eksperymentach użyto wody destylowanej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat układu mikrofluidycznego, zdjęcie kolumny kulek, wykres intensywności, wykres pudełkowy warunków, analiza płynów.
Rycina 8: Produkcja populacji fluorescencyjnych zatyczek. (A) Schemat układu eksperymentalnego przedstawiający połączenie różnych odczynników z urządzeniem. Skróty: F = fluoresceina, W = woda destylowana, B = niebieski barwnik spożywczy, FC-40 = olej fluorowany oraz MO = olej mineralny. (B) Przykładowe zdjęcie rurki zbierającej zawierającej zatyczki. (C) Surowe dane uzyskane z analizy przedstawiają średnią intensywność fluorescencji mierzoną w określonym obszarze zainteresowania (ROI) w funkcji numeru klatki pliku wideo. Linie czerwone wskazują średnią wartość szczytowej fluorescencji dla każdego warunku (populacji zatyczek wytworzonych przy konkretnej kombinacji trzech wlotów), a linie przerywane wskazują odpowiadający im błąd standardowy. (D) Wykresy pudełkowe wysokości szczytów w różnych warunkach. Kropki odpowiadają poszczególnym szczytom, pudełka dla każdego warunku obejmują zakres od pierwszego do trzeciego kwartyla rozkładu odpowiadających im szczytów, a gruba linia oznacza wartość mediany. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Plik uzupełniający 1: Główny program interfejsu do obsługi urządzenia. Interfejs sterowania do ręcznego zwiększania ciśnienia w kanałach kontrolnych oraz przeprowadzania automatycznego eksperymentu w urządzeniu ośmiowlotowym. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Alternatywny główny program interfejsu do obsługi urządzenia. Interfejs sterowania do uruchamiania urządzenia z ośmioma wlotami bez funkcji kodowania kreskowego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Subprogram LabVIEW ze zmiennymi globalnymi. SubVI głównego programu interfejsu, który wylicza i wyświetla stan zmiennych globalnych w głównym programie interfejsu, a konkretnie kanałów sterujących. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: Program LabVIEW do zapisywania wartości zmiennych globalnych. SubVI głównego programu interfejsu, który zapisuje aktualny stan zaworów w postaci tablicy, co służy do utrzymania tego samego stanu zaworów w przypadku braku aktywności użytkownika przez ponad 30 sekund. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 5: Program LabVIEW dla protokołu sterowania transmisją (TCP). SubVI służący do utrzymywania połączenia TCP między głównym programem interfejsu a sterownikiem WAGO. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 6: Podprogram LabVIEW dla zmiennej globalnej TCP. Program do przechowywania zmiennej wyjściowej TCP. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 7: Dane wejściowe do automatycznego przeprowadzania eksperymentu.Plik .csv kodujący skład, sekwencję i powtórzenia populacji wtyczek (plugów) do przeprowadzania eksperymentów w celu wytworzenia ilościowych wtyczek fluorescencyjnych, zgodnie ze szczegółami opisanymi w niniejszej pracy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 8: Skrypt w języku Python do analizy populacji fluorescencyjnych czopów.Niestandardowy skrypt w języku Python służący do odczytu wartości fluorescencji z nagrań czopów (plik .avi). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 9: Wyniki analizy fluorescencji wtyczek.Wyniki ze skryptu Python zawierające wartości fluorescencji dla ROI 5x5 z nagrania wtyczek. Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.

Plik uzupełniający 10: Program R do odczytu pliku wyjściowego.Własny program wykorzystany w tej pracy do odczytu wartości fluorescencji z pliku wyjściowego oraz wykreślania surowych danych, wysokości pików i odchyleń standardowych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 11: Funkcje R do analizy i wykreślania danych fluorescencyjnych.Niestandardowe funkcje R wykorzystywane do: 1. przycinania surowych danych wartości fluorescencji, 2. definiowania różnych warunków eksperymentalnych, 3. identyfikacji pików dla określonych warunków, 4. wykreślania surowych danych z nałożonymi wykrytymi warunkami oraz 5. wykreślania zidentyfikowanych pików z nałożonymi surowymi danymi. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W artykule przedstawiono zestaw protokołów wytwarzania i działania urządzenia mikroprzepływowego opartego na PDMS do automatycznego generowania bibliotek kombinatorycznych w komorach typu woda w oleju zwanych korkami. Połączenie mikrofluidyki z technologią kropelkową zapewnia potężną technikę hermetyzacji niewielkiej ilości odczynników w dużej liczbie komór, otwierając w ten sposób drogę do kombinatorycznych badań przesiewowych na dużą skalę.

Wcześniej opisano kilka technologii generowania chemicznie odrębnych przedziałów za pomocą mikrofluidyki, z których każda ma swoje zalety i ograniczenia. Kulesa i wsp.50 opisali strategię hermetyzacji komórek z kodami kreskowymi w kropelkach za pomocą płytek mikromiareczkowych i łączenia tych kropel za pomocą pola elektrycznego w celu stworzenia biblioteki kombinatorycznej. Chociaż takie podejście może generować wiele kombinacji kropel, jest ograniczone przez konieczność ręcznej obsługi w przepływie pracy. Tomasi i wsp.51 opracowali platformę mikroprzepływową do łączenia kropelki zawierającej sferoidy (swobodnie pływające agregaty komórek) z kroplą bodźca, umożliwiając w ten sposób manipulowanie mikrośrodowiskiem sferoidalnym. Metoda ta pozwala na badanie ważnych zjawisk, takich jak interakcje komórka-komórka i działanie leków, ale jest to stosunkowo niska przepustowość. Eduati i wsp.46 oraz Utharala i wsp.47 opracowali platformę opartą na zaworach mikroprzepływowych, która może generować biblioteki kombinatoryczne o wysokiej przepustowości w sposób zautomatyzowany. Jednak w tych badaniach zawory są obsługiwane za pomocą urządzenia Braille'a, co wymaga kłopotliwych etapów wyrównania między mikrozaworem a chipem mikroprzepływowym. Kluczową cechą systemu opisanego w artykule jest implementacja pneumatycznych zaworów PDMS do regulacji przepływu płynu w kanałach wejściowych. Ponieważ zawory te są oparte na PDMS, można je dość płynnie zintegrować z etapami produkcji chipa mikroprzepływowego. Ponadto są stosunkowo prostą opcją sterowania przepływem cieczy w kanałach wlotowych, ponieważ mogą być uruchamiane poprzez wywieranie ciśnienia przez zewnętrzne źródło gazu. Wreszcie, można zaprogramować czas i sekwencję zwiększania i obniżania ciśnienia w tych zaworach, automatyzując w ten sposób produkcję różnych populacji korków w sposób wysokoprzepustowy. Inną ważną cechą jest stosowanie reżimów stałego ciśnienia do wstrzykiwania odczynników przez wlot, co pozwala zrezygnować z włączania kanałów odpływowych w celu zmniejszenia akumulacji ciśnienia, która powstaje w reżimie stałego natężenia przepływu. Upraszcza to konstrukcję urządzenia, zmniejsza potrzebę stosowania dodatkowych zaworów i sprzętu do sterowania zaworami kanału odpływowego oraz minimalizuje marnotrawstwo odczynników.

Podczas gdy produkcja urządzeń z PDMS jest stosunkowo nieskomplikowana, wdrożenie takich urządzeń wymaga użycia obszernych akcesoriów sprzętowych, takich jak pneumatyczne zawory elektromagnetyczne (do sterowania uruchamianiem zaworów PDMS), pompy ciśnieniowe (do sterowania przepływem odczynników wlotowych i olejowych) oraz programy programowe (do regulacji zaworów elektromagnetycznych). Chociaż stanowią one znaczną inwestycję, taka konfiguracja zapewnia spójność i niezawodność dla pomyślnego działania urządzenia. Ponadto komponenty sprzętowe i architektura przedstawione w tym protokole są skonfigurowane w sposób modułowy. W związku z tym w przypadku niektórych modułów można zastosować alternatywy w celu obniżenia kosztów lub dostosowania ich do konkretnej potrzeby. Na przykład istnieje wiele pomp, które mogą być używane w zależności od użyteczności, budżetu, dostępności i wygody 52,53,54. Dodatkowe komponenty, takie jak zbiorniki płynu i regulatory temperatury, mogą być wbudowane w wrażliwe odczynniki wlotowe23. Co więcej, projekt ten można skalować w górę lub w dół, aby zaspokoić określone potrzeby naukowe. Na przykład w tym artykule opisano prototyp z ośmioma wlotami, który pozwala na połączenie ośmiu unikalnych odczynników w celu wytworzenia zatyczek. Można to rozbudować do urządzenia z 16 wlotami, co pozwala na większą liczbę wlotów i większe ich kombinacje. W związku z tym będzie potrzebował dodatkowych kanałów sterujących i zaworów elektromagnetycznych do adresowania wlotów, ale taki prototyp pozwala na generowanie większych i bardziej zróżnicowanych bibliotek kombinatorycznych. Wreszcie, w tym artykule, każda populacja czopa jest wytwarzana przez otwarcie trzech z ośmiu wodnych wlotów urządzenia mikroprzepływowego. Zaobserwowano, że dla takiej konfiguracji ciśnienie około 200 mbar dla odczynników olejowych i 400 mbar dla odczynników wodnych odpowiadało reżimowi produkcji grzyba, który jest napędzany wyłącznie przez uruchamianie zaworu. Gdy do oleju (olejów) przyłożono wyższe ciśnienie, zaobserwowano rozpad korków, a zastosowanie niższych ciśnień doprowadziło do stopienia się korków. Optymalny reżim ciśnieniowy dla produkcji korków zależy od wielu czynników, takich jak liczba wlotów przyczyniających się do tworzenia korka, charakter i lepkość płynów oraz wymiary kanałów, i powinien być optymalizowany w razie potrzeby.

Jedną z wad pracy w reżimie stałego ciśnienia jest to, że płyny o różnej lepkości mają różne prędkości przepływu pod stałym ciśnieniem. Dlatego należy upewnić się, że odczynniki wodne przepływające przez wloty mają porównywalną lepkość. Stosowanie płynów o różnej lepkości wpłynie nie tylko na przepływ płynu w kanałach wlotowych, ale także na tworzenie się czopów na skrzyżowaniu T, pogarszając w ten sposób skład populacji czopów. Kolejną wadą jest zanieczyszczenie populacji czopów pozostałościami odczynników na złączu T. Gdy urządzenie przełącza się między produkcją różnych populacji czopów, pierwsza/ostatnia zatyczka w sekwencji każdej populacji ma tendencję do bycia zanieczyszczoną przez poprzednią lub następną populację. Problem ten można przezwyciężyć poprzez wyprodukowanie dodatkowych powtórzeń każdej populacji i zdyskontowanie zanieczyszczonej czopki podczas analizy. Wreszcie, istnieje również możliwość wystąpienia różnic między poszczególnymi urządzeniami wynikającymi z niespójności w produkcji i/lub źródłach zewnętrznych (wahania ciśnienia). Ten problem można złagodzić, wielokrotnie wykorzystując pojedynczy układ mikroprzepływowy i upewniając się, że cały przebieg biblioteki kombinatorycznej jest wykonywany na jednym chipie, aby zminimalizować wpływ tych niespójności.

Urządzenie mikroprzepływowe i towarzyszący mu zestaw protokołów operacyjnych przedstawionych w tym artykule zostały wykorzystane do zademonstrowania produkcji ilościowej biblioteki kombinatorycznej wtyczek. Platforma ta może zatem szybko generować biblioteki kombinatoryczne różnych populacji wtyczek w sposób wysokoprzepustowy. W rezultacie, takie technologie mogą być wykorzystywane do różnych celów przesiewowych, w tym między innymi do kombinatorycznych badań przesiewowych leków na próbkach biopsji pacjenta - dzięki czemu niewielka liczba komórek pobranych z biopsji może być rozprowadzona w dużej liczbie kropel i leczona dużą kombinacją leku przeciwnowotworowego w celu optymalizacji indywidualnej terapii dla danej próbki pacjenta - a tym samym przyspieszenia spersonalizowanej terapii raka46, Rozdział 48,55.

Oświadczenia

F. E. jest freelancerem dla TheraMe! AG. Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Stacey Martina z NanoLab TuE za pomoc w osadzaniu z fazy gazowej HMDS. Badania te zostały sfinansowane przez Instytut Złożonych Układów Molekularnych (ICMS) na Uniwersytecie Technicznym oraz przez program Grawitacyjny IMAGINE! (numer projektu 24.005.009).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,1,3,3 tetrametylodiloksanMerck Life Science NVMFCD00008256
4-kanałowy cyfrowy moduł wejść/wyjśćWAGO Kontakttechnik GmbH750-504
AcetonBoom LabsBOOMSKEUZW3
Analysis SoftwareUniwersytet Techniczny w Eindhovenhttps://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE
AZ 40XT 11DMerck Life Science NV 212299  Dodatni fotorezystor 
Deweloper AZ 726 MIFMerck Life Science NV10055824960Twórca dodatniego stempla do biopsji fotorezystu
, Rapid CoreWorld Precision Instruments Germany, GMBH5045290,75 mm ID, z
niebieskim barwnikiem spożywczymPMEFC1036
Moduł końcowy kontrolera WAGO Kontakttechnik GmbH 750-600
 WAGO Kontakttechnik GmbH 750-881
FC-40Merck MilliporeF9755-100ML
Fluigent Jednostka przepływuFluigentFLU-S-D
Fluigent system ciśnieniowy Płynny MFCS-EZ 0 - 2 bary
FluoresceinaMerck Life Science NVMFCD00005050
Płyta grzewcza Naukowy Torrey Pines HP61
 Instrumenty firmy Nikon Eclipse Ti-E
IsopropanolBoom LabsBOOMSKEUZE3
LabVIEW (wersja oprogramowania 20)Uniwersytet Techniczny w Eindhovenhttps://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE/tree/main/LabVIEW_8_inlet_device_
VERSION_1		Wszystkie pliki zostały zapisane dla LabVIEW w wersji 20. Zaleca się korzystanie z tej wersji lub nowszej do otwierania plików.
Odgałęzienia Luer Instech Laboratories, Inc. LS2323 ga, 0,5"
męskie złącza Luer do zadziorów Cole Parmer Numer katalogowy: 45505-32 3/32" ID
Rurki PTFEMasterFlex Avator/VWR48634
Szkiełka mikroskopoweVWR470150-480
  PlainCorning2947-75X50
Olej mineralnyMerck Millipore330760-1L
mr DEV 600Technologia mikrorezystuR815100Deweloper do ujemnego fotorezystu
PiekarnikThermo Scientific  Heraeus T6P 50045757
plazma tlenowa asherQuorum TechnologiesK1050X
PhotomaskCAD/Art Services, Inc.
Projekt fotomaskiUniwersytet Techniczny w Eindhoven (na podstawie Merten Lab, EPFL)https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE/blob/main/8_inlet_JoVE_device_design.dwg
Pneumatyczny układ zaworówFESTO1x 8, Zawory normalnie zamknięte
Waflekrzemowe Materiałykrzemowe< 1-0-0>, średnica 100 mm, 525 μ m grubość
Ostrza jednoostrzowe GEM Scientific
Miękkie rurkiFluigent1 mm ID, 3 mm OD
Powlekarka wirowa Korporacja Laurell Technologies WS-650MZ-23NPPB
Mikroskop stereoskopowy Korporacja Olympus SZ61
SU-8 3050Kayakli Advanced MaterialsY311075 1000L1GLUjemny fotorezystor
Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych (PDMS)Dow
B Braun Injekt - F Strzykawka do precyzyjnego dozowania10303002
system naświetlania UV-LEDIdonusUV-EXP150S-SYS Pompa próżniowa
  Vacuumbrand GmbH Wagi MD1C
 Sartorius M-prove (M dowod)
Kontroler Ethernet Mikroskop odwrócony ,Strzykawka 1317318

Bibliografia

  1. Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
  2. Terry, S. C., Herman, J. H., Angell, J. B. A gas chromatographic air analyzer fabricated on a Silicon wafer. IEEE Transactions on Electron Devices. 26 (12), 1880-1886 (1979).
  3. Mellors, J. S., Gorbounov, V., Ramsey, R. S., Ramsey, J. M. Fully integrated glass microfluidic device for performing high-efficiency capillary electrophoresis and electrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem. 80 (18), 6881-6887 (2008).
  4. Wlodarczyk, K. L., Hand, D. P., Maroto-Valer, M. M. Maskless, rapid manufacturing of glass microfluidic devices using a picosecond pulsed laser. Sci Rep. 9 (1), 20215(2019).
  5. Nielsen, J. B., et al. Microfluidics: innovations in materials and their fabrication and functionalization. Anal Chem. 92 (1), 150-168 (2020).
  6. Nge, P. N., Rogers, C. I., Woolley, A. T. Advances in microfluidic materials, functions, integration, and applications. Chem Rev. 113 (4), 2550-2583 (2013).
  7. Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Anal Chem. 70 (23), 4974-4984 (1998).
  8. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
  9. Oh, K. W., Ahn, C. H. A review of microvalves. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (5), R13(2006).
  10. Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. Microvalves and micropumps for BioMEMS. Micromachines. 2 (2), 179-220 (2011).
  11. Jerman, H. Electrically-activated, normally-closed diaphragm valves. J. Micromech. Microeng. 4 (4), 210(1994).
  12. Neagu, C. R., Gardeniers, J. G. E., Elwenspoek, M., Kelly, J. J. An electrochemical microactuator: principle and first results. J microelectromechanical sys. 5 (1), 2-9 (1996).
  13. Gu, W., Zhu, X., Futai, N., Cho, B. S., Takayama, S. Computerized microfluidic cell culture using elastomeric channels and Braille displays. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15861-15866 (2004).
  14. Studer, V., et al. Scaling properties of a low-actuation pressure microfluidic valve. J Appl Phys. 95 (1), 393-398 (2004).
  15. Hansen, C. L., Sommer, M. O. A., Quake, S. R. Systematic investigation of protein phase behavior with a microfluidic formulator. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (40), 14431-14436 (2004).
  16. Ridgeway, W. K., Seitaridou, E., Phillips, R., Williamson, J. R. RNA-protein binding kinetics in an automated microfluidic reactor. Nucleic Acids Res. 37 (21), e142(2009).
  17. Fu, A. Y., Chou, H. P., Spence, C., Arnold, F. H., Quake, S. R. An integrated microfabricated cell sorter. Anal Chem. 74 (11), 2451-2457 (2002).
  18. Liu, J., Enzelberger, M., Quake, S. A nanoliter rotary device for polymerase chain reaction. Electrophoresis. 23 (10), 1531-1536 (2002).
  19. Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
  20. Galas, J. C., Haghiri-Gosnet, A. M., Estévez-Torres, A. A nanoliter-scale open chemical reactor. Lab Chip. 13 (3), 415-423 (2013).
  21. Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. Implementation of cell-free biological networks at steady state. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 15985-15990 (2013).
  22. Yelleswarapu, M., et al. Sigma factor-mediated tuning of bacterial cell-free synthetic genetic oscillators. ACS Synth Biol. 7 (12), 2879-2887 (2018).
  23. van der Linden, A. J., et al. A multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression. J Vis Exp. (152), 59655(2019).
  24. Shang, L., Cheng, Y., Zhao, Y. Emerging droplet microfluidics. Chem Rev. 117 (12), 7964-8040 (2017).
  25. Seemann, R., Brinkmann, M., Pfohl, T., Herminghaus, S. Droplet based microfluidics. Rep Prog Phys. 75, 016601(2012).
  26. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  27. Clausell-Tormos, J., et al. Droplet-based microfluidic platforms for the encapsulation and screening of mammalian cells and multicellular organisms. Chem Biol. 15 (5), 427-437 (2008).
  28. Umbanhowar, P. B., Prasad, V., Weitz, D. A. Monodisperse emulsion generation via drop break off in a coflowing stream. Langmuir. 16 (2), 347-351 (2000).
  29. Abate, A. R., Thiele, J., Weitz, D. A. One-step formation of multiple emulsions in microfluidics. Lab Chip. 11 (2), 253-258 (2011).
  30. Chen, Y., Gao, W., Zhang, C., Zhao, Y. Three-dimensional splitting microfluidics. Lab Chip. 16 (8), 1332-1339 (2016).
  31. Ahn, K., Agresti, J., Chong, H., Marquez, M., Weitz, D. A. Electrocoalescence of drops synchronized by size-dependent flow in microfluidic channels. Appl Phys Lett. 88 (26), 264105(2006).
  32. Fidalgo, L. M., Abell, C., Huck, W. T. S. Surface-induced droplet fusion in microfluidic devices. Lab Chip. 7 (8), 984-986 (2007).
  33. Bernath, K., et al. In vitro compartmentalization by double emulsions: Sorting and gene enrichment by fluorescence activated cell sorting. Anal Biochem. 325 (1), 151-157 (2004).
  34. Aharoni, A., Amitai, G., Bernath, K., Magdassi, S., Tawfik, D. S. High-throughput screening of enzyme libraries: thiolactonases evolved by fluorescence-activated sorting of single cells in emulsion compartments. Chem Biol. 12 (12), 1281-1289 (2005).
  35. Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Huck, W. T. S. Monodisperse uni- and multicompartment liposomes. J Am Chem Soc. 138 (24), 7584-7591 (2016).
  36. Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. S. Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models. J Am Chem Soc. 139 (2), 587-590 (2016).
  37. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  38. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  39. Shembekar, N., Chaipan, C., Utharala, R., Merten, C. A. Droplet-based microfluidics in drug discovery, transcriptomics and high-throughput molecular genetics. Lab Chip. 16 (8), 1314-1331 (2016).
  40. Wong, A. H., et al. Drug screening of cancer cell lines and human primary tumors using droplet microfluidics. Sci Rep. 7 (1), 9109(2017).
  41. Jing, W., Han, H. Droplet microfluidics for high-resolution virology. Anal Chem. 94 (23), 8085-8100 (2022).
  42. Ding, Y., Choo, J., deMello, A. J. From single-molecule detection to next-generation sequencing: microfluidic droplets for high-throughput nucleic acid analysis. Microfluid Nanofluidics. 21 (3), 58(2017).
  43. Nightingale, A. M., et al. A stable droplet reactor for high temperature nanocrystal synthesis. Lab Chip. 11 (7), 1221-1227 (2011).
  44. De Stefano, P., Bianchi, E., Dubini, G. The impact of microfluidics in high- throughput drug-screening applications. Biomicrofluidics. 16 (3), 031501(2022).
  45. Tekin, E., et al. Prevalence and patterns of higher-order drug interactions in Escherichia coli. NPJ Syst Biol Appl. 4, 31(2018).
  46. Eduati, F., et al. A microfluidics platform for combinatorial drug screening on cancer biopsies. Nat Commun. 9 (1), 2434(2018).
  47. Utharala, R., et al. A microfluidic Braille valve platform for on-demand production, combinatorial screening and sorting of chemically distinct droplets. Nat Protoc. 17 (12), 2920-2965 (2022).
  48. Mathur, L., et al. Combi-seq for multiplexed transcriptome-based profiling of drug combinations using deterministic barcoding in single-cell droplets. Nat Commun. 13 (1), 4450(2022).
  49. Dubuc, E., et al. Cell-free microcompartmentalised transcription–translation for the prototyping of synthetic communication networks. Curr Opin Biotechnol. 58, 72-80 (2019).
  50. Kulesa, A., Kehe, J., Hurtado, J. E., Tawde, P., Blainey, P. C. Combinatorial drug discovery in nanoliter droplets. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (26), 6685-6690 (2018).
  51. Tomasi, R. F. X., Sart, S., Champetier, T., Baroud, C. N. Individual control and quantification of 3D spheroids in a high-density microfluidic droplet array. Cell Rep. 31 (8), 107670(2020).
  52. White, J. A., Streets, A. M. Controller for microfluidic large-scale integration. HardwareX. 3, 135-145 (2018).
  53. Brower, K., et al. An open-source, programmable pneumatic setup for operation and automated control of single- and multi-layer microfluidic devices. HardwareX. 3, 117-134 (2018).
  54. Gonzalez-Suarez, A. M., Long, A., Huang, X. H., Revzin, A. A Compact control system to enable automated operation of microfluidic bioanalytical assays. Biosensors. 12 (12), 1160(2022).
  55. Mathur, L., Ballinger, M., Utharala, R., Merten, C. A. Microfluidics as an enabling technology for personalized cancer therapy. Small. 16 (9), e1904321(2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Dwuwarstwowa mikroprzepływowośćmikroprzepływowość kropelkowaurządzenie PDMSmikroprzepływowość sterowana ciśnieniemzawory Quakegenerowanie biblioteki wtyczekmikrośrodowisko guzawysokoprzepustowe przesiewanieonkologia precyzyjna
Dwuwarstwowe urządzenie mikroprzepływowe do kombinatorycznej produkcji korków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.