Artykuł metodologiczny

Bakterie do drukowania 3D do badania ruchliwości i wzrostu w złożonych porowatych ośrodkach 3D

3.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66166

⸱

19 stycznia 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biological Engineering, University of Colorado Boulder, 2Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje procedurę trójwymiarowego (3D) drukowania kolonii bakteryjnych w celu zbadania ich ruchliwości i wzrostu w złożonych 3D porowatych matrycach hydrożelowych, które są bardziej zbliżone do ich naturalnych siedlisk niż konwencjonalne kultury płynów lub szalki Petriego.

Streszczenie

Bakterie są wszechobecne w złożonych, trójwymiarowych (3D) porowatych środowiskach, takich jak biologiczne tkanki i żele oraz podpowierzchniowe gleby i osady. Jednak większość wcześniejszych prac koncentrowała się na badaniach komórek w płynach masowych lub na płaskich powierzchniach, które nie oddają w pełni złożoności wielu naturalnych siedlisk bakteryjnych. W tym miejscu ta luka w wiedzy została wypełniona poprzez opisanie opracowania metody drukowania 3D gęstych kolonii bakterii w zaciętych granulowanych matrycach hydrożelowych. Matryce te mają regulowane rozmiary porów i właściwości mechaniczne; fizycznie ograniczają komórki, wspierając je w ten sposób w 3D. Są one optycznie przezroczyste, co pozwala na bezpośrednią wizualizację rozprzestrzeniania się bakterii w ich otoczeniu za pomocą obrazowania. Jako dowód tej zasady, tutaj możliwości tego protokołu demonstruje się poprzez drukowanie 3D i obrazowanie nieruchliwych i ruchliwych Vibrocholerae, a także nieruchliwych Escherichia coli, w zakleszczonych granulowanych matrycach hydrożelowych o różnych rozmiarach porów śródmiąższowych.

Wprowadzenie

Bakterie często zamieszkują różnorodne, złożone porowate środowiska 3D, począwszy od żeli śluzówkowych w jelitach i płucach, a skończywszy na glebie w ziemi1,2, class="xref">3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,
22,23,24,25. W takich warunkach przemieszczanie się bakterii poprzez ruchliwość lub wzrost może być utrudnione przez otaczające przeszkody, takie jak sieci polimerowe lub upakowania stałych ziaren mineralnych, co wpływa na zdolność komórek do rozprzestrzeniania się w ich środowisku26, dostęp do źródeł składników odżywczych, kolonizacja nowego terenu i tworzenie ochronnych społeczności biofilmu27. Jednak tradycyjne badania laboratoryjne zazwyczaj wykorzystują bardzo uproszczoną geometrię, koncentrując się na komórkach w płynnych kulturach lub na płaskich powierzchniach. Chociaż podejścia te dostarczają kluczowych informacji na temat mikrobiologii, nie oddają w pełni złożoności naturalnych siedlisk, co prowadzi do dramatycznych różnic w tempie wzrostu i ruchliwości w porównaniu z pomiarami wykonanymi w warunkach rzeczywistych. Dlatego niezwykle potrzebna jest metoda definiowania kolonii bakterii i badania ich ruchliwości i wzrostu w porowatych środowiskach 3D, bardziej zbliżonych do wielu ich naturalnych siedlisk.

Inokulacja komórek w żelu agarowym, a następnie wizualizacja ich makroskopowego rozprzestrzeniania się za pomocą oka lub za pomocą kamery dostarcza jednego z prostych sposobów osiągnięcia tego celu, jak to po raz pierwszy zaproponowali Tittsler i Sandholzer w 1936 roku28. Podejście to wiąże się jednak z szeregiem kluczowych wyzwań technicznych: (1) Podczas gdy rozmiary porów można zasadniczo zmieniać poprzez zmianę stężenia agarozy, struktura porów takich żeli jest słabo zdefiniowana; (2) Rozpraszanie światła powoduje, że żele te są mętne, co utrudnia wizualizację komórek w indywidualnej skali z wysoką rozdzielczością i wiernością, szczególnie w dużych próbkach; (3) Gdy stężenie agaru jest zbyt duże, migracja komórek jest ograniczona do górnej płaskiej powierzchni żelu; (4) Złożona reologia takich żeli sprawia, że trudno jest wprowadzić inokulum o dobrze zdefiniowanej geometrii.

Aby rozwiązać te ograniczenia, w poprzedniej pracy, laboratorium Datty opracowało alternatywne podejście przy użyciu granularnych matryc hydrożelowych - składających się z zakleszczonych, biokompatybilnych cząsteczek hydrożelu spęczniałych w płynnej kulturze bakteryjnej - jako "porowatych szalek Petriego" do uwięzienia komórek w 3D. Matryce te są miękkimi, samonaprawiającymi się ciałami stałymi o granicy plastyczności; w przeciwieństwie do usieciowanych żeli stosowanych w innych procesach biodruku, mikrodysza iniekcyjna może swobodnie poruszać się wewnątrz matrycy wzdłuż dowolnej zalecanej ścieżki 3D, lokalnie przestawiając cząsteczki hydrożelu29. Cząsteczki te następnie szybko ponownie się zagęszczają i samoleczą wokół wstrzykniętych bakterii, podtrzymując komórki na miejscu bez dodatkowego szkodliwego przetwarzania. Proces ten jest zatem formą druku 3D, która umożliwia ułożenie komórek bakteryjnych - w pożądaną strukturę 3D, o określonym składzie społeczności - w porowatej matrycy o przestrajalnych właściwościach fizykochemicznych. Co więcej, matryce hydrożelowe są całkowicie przezroczyste, co umożliwia bezpośrednią wizualizację komórek za pomocą obrazowania.

Użyteczność tego podejścia została wcześniej zademonstrowana na dwa sposoby. W jednym zestawie badań rozcieńczone komórki zostały rozproszone w matrycy hydrożelowej, co umożliwiło badanie ruchliwości poszczególnych bakterii30,31. W innym zestawie badań społeczności wielokomórkowe zostały wydrukowane w 3D w żelach w skali centymetrowej za pomocą dyszy iniekcyjnej zamontowanej na programowalnym stoliku mikroskopu, co umożliwiło badania rozprzestrzeniania się zbiorowości bakteryjnych w ich otoczeniu32,33. W obu przypadkach badania te ujawniły nieznane wcześniej różnice w charakterystyce rozprzestrzeniania się bakterii zamieszkujących porowate środowiska w porównaniu z tymi w kulturach płynnych/na płaskich powierzchniach. Biorąc jednak pod uwagę, że były one zamontowane na stoliku mikroskopowym, te poprzednie badania ograniczały się do małych objętości próbek (~1 ml), a zatem krótkich skal czasowych eksperymentu. Mieli również ograniczoną zdolność do definiowania geometrii inokulantów z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

Tutaj opisana jest następna generacja tej eksperymentalnej platformy, która rozwiązuje oba ograniczenia. W szczególności zapewnione są protokoły, za pomocą których można użyć zmodyfikowanej drukarki 3D z dołączoną wytłaczarką strzykawkową do drukowania 3D i obrazowania kolonii bakterii na dużą skalę. Co więcej, reprezentatywne dane wskazują, w jaki sposób podejście to może być przydatne w badaniu ruchliwości i wzrostu bakterii, na przykładzie tworzącego biofilm Vibrio cholerae i planktonowego Escherichia coli. Takie podejście umożliwia utrzymywanie kolonii bakteryjnych przez długi czas i wizualizację przy użyciu różnych technik obrazowania. W związku z tym zdolność tego podejścia do badania społeczności bakteryjnych w porowatych siedliskach 3D ma ogromny potencjał badawczy i stosowany, wpływając na leczenie i badanie drobnoustrojów w jelitach, skórze, płucach i glebie. Co więcej, podejście to może być wykorzystane w przyszłości do drukowania 3D żywych materiałów inżynieryjnych na bazie bakterii w bardziej złożone, wolnostojące kształty.

Protokół

To podejście polega na przekształceniu komercyjnej drukarki do modelowania osadzania 3D w biodrukarkę 3D przy użyciu wcześniej ustalonego protokołu przez Tashman et al.34. Krótko mówiąc, Tashman i in. zastąpili komercyjną głowicę wytłaczarki wykonaną na zamówienie wytłaczarką z pompą strzykawkową. Ekstruder ten umożliwia drukowanie wysoko skoncentrowanych płynnych zawiesin komórek bakteryjnych w 3D, z wytłaczaną objętością i pozycją 3D kontrolowaną przez język programowania G-code. Wytłaczana objętość jest określana w oprogramowaniu przez krok wytłaczarki (E-step) i jest dodatkowo kalibrowana zgodnie z opisem poniżej. Te zawiesiny bakteryjne są w ten sposób drukowane bezpośrednio w ziarnistej matrycy hydrożelowej, która działa jako podpora 3D dla komórek. Poniżej w protokole opisano również, w jaki sposób przygotować matryce o różnych stężeniach polimerów, scharakteryzować wynikające z tego zmiany wielkości porów i właściwości reologicznych oraz scharakteryzować późniejszą ruchliwość i wzrost bakterii za pomocą obrazowania bezpośredniego.

1. Konwersja komercyjnej drukarki 3D na biodrukarkę 3D

  1. Wyjmij ekstruder i grzałkę z komercyjnej drukarki 3D (patrz Tabela materiałów).
  2. Postępuj zgodnie z poprzednimi protokołami, aby wyprodukować wytłaczarkę z pompą strzykawkową34, z dodatkową modyfikacją, aby pomieścić jednorazową strzykawkę Luer lock. Zamontuj ekstruder pompy strzykawkowej na drukarce.
    UWAGA: Pliki CAD wymagane do modyfikacji wytłaczarki pompy strzykawkowej do strzykawek plastikowych znajdują się w plikach uzupełniających 1-3.
  3. Zainstaluj i otwórz oprogramowanie drukarki 3D (patrz Spis materiałów) na komputerze. Podłącz drukarkę 3D do komputera.
  4. Załaduj jednorazową strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą o odpowiednim rozmiarze do zacisków wydrukowanych w 3D, wyrównując górną i dolną połowę mechanizmu (Rysunek 1). Zabezpiecz zaciski wokół strzykawki za pomocą trzech z gniazdem M8 i cienkich stalowych nakrętek sześciokątnych (patrz Tabela materiałów). Tłok strzykawki łączy się ze śrubą pociągową w wytłaczarce pompy strzykawkowej. Ręcznie podnieść tłok, obracając pociągową, aby utworzyć 0,5 ml szczeliny powietrznej w strzykawce.
  5. Jeśli zanieczyszczenie stanowi problem w eksperymencie, przetransportuj kompleks strzykawka-zacisk do biokaptura i wysterylizuj 70% etanolem w sprayu po wejściu przed wykonaniem poniższych kroków.

2. Przygotowanie zawiesiny bakteryjnej

  1. W przypadku V. cholerae i E. coli rosnąć przez noc na 2% płytce agarowej Lennox LB (Luria Broth, patrz tabela materiałów) w temperaturze 37 °C.
    1. W przypadku V. cholerae należy zaszczepić komórki w 3 ml płynnego LB za pomocą dziesięciu sterylnych szklanych kulek. Hodować komórki w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez 5-6 godzin do środkowej fazy wykładniczej do gęstości optycznej (OD) 600 ~0,9.
    2. W przypadku E. coli należy zaszczepić komórki w 3 ml płynnego LB. Hodować komórki w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez noc. Innokulować 200 μl nocnej kultury w świeżym LB przez 3 godziny, aż OD osiągnie 0,6.
  2. Przenieść kulturę do probówki wirówkowej o pojemności 10 ml. Odwiruj kulturę przez 5 minut przy 5 000 x g w temperaturze pokojowej, aby uzyskać osad. Usunąć supernatant. Ponownie zawiesić za pomocą ~10 μL cieczy LB, aby uzyskać gęstość komórek ~9 x10 10 komórek na ml.

3. Ładowanie zawiesiny bakteryjnej do strzykawki

UWAGA: Dostępne są dwie metody ładowania bakterii do strzykawki (krok 3.1 i krok 3.2). Krok 3.1 służy do ładowania małych objętości zawiesin bakteryjnych, <200 μL, a krok 3.2 działa do ładowania większych objętości zawiesin bakteryjnych, >200 μL. Krok 3.1 został wykorzystany do uzyskania reprezentatywnych wyników pokazanych tutaj.

  1. Załaduj pustą plastikową strzykawkę Luer lock o pojemności 1 ml do biodrukarki 3D. Połączyć tłok strzykawki ze śrubą pociągową. Ręcznie wycofaj strzykawkę, aby dodać 0,2 ml szczeliny powietrznej, aby zapewnić miejsce na ruch tłoka w strzykawce, ponieważ do każdej partii eksperymentów zużywa się niewielką objętość komórek ~ 20-50 μl.
    1. Przymocować igłę do końcówki strzykawki o rozmiarze igły niezbędnym do wymaganego rozmiaru elementów drukowania. W tym przypadku używana jest 2-calowa igła 20 G.
    2. Załadować zawiesinę bakteryjną do strzykawki, umieszczając 10 ml probówki wirówkowej z inokulum bakteryjnym poniżej igły. Ręcznie obrócić, aby cofnąć tłok strzykawki i załadować komórki do strzykawki. Objętości komórek bakteryjnych są tak małe, że często komórki są ładowane tylko do igły.
  2. Wyjąć tłok z kompleksu strzykawka-zacisk i użyć innej strzykawki i igły, aby ostrożnie załadować kompleks strzykawka-zacisk pożądanymi zawiesinami bakteryjnymi, uważając, aby nie utknąć pęcherzyków powietrza. Kompleks strzykawka-zacisk powinien być wypełniony nieco po brzegi pożądaną zawiesiną bakteryjną, a następnie przeniesiony do biodrukarki.
    1. Ostrożnie włóż kompleks zacisku strzykawkowego bez tłoka do odpowiedniego gniazda na głównym rdzeniu wytłaczarki do biodrukarki.
    2. Upewnij się, że karetka drukarki znajduje się mniej więcej w połowie pociągowej, a pod załadowaną strzykawką znajduje się naczynie zbiorcze. Następnie ostrożnie przełóż tłok zarówno przez wózek, jak i przez zespół strzykawka-zacisk, aż zaczepi się o karetkę. Powoli wciskać tłok w zawiesinę bakteryjną, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza w strzykawce.
    3. Wsuń adapter clamp na karetkę przez tylną część tłoka, aby zabezpieczyć go na miejscu zarówno podczas manewrów wytłaczania, jak i wciągania.

4. Kalibracja kroku ekstrudera do objętości osadzanej

  1. Aby skalibrować krok ekstrudera (E-step) do zdeponowanej objętości, najpierw skonfiguruj biodrukarkę z dokładną strzykawką, igłą strzykawki i osadzającą się zawiesiną bakteryjną, która zostanie użyta w eksperymencie. W tym przypadku używana jest strzykawka Luer lock o pojemności 1 ml.
  2. Określ szacowany zakres kroku E do kalibracji, wyciągając dowolny numer kroku E (~200) i zanotuj zmianę objętości tłoka za pomocą znaczników objętości strzykawki.
  3. Użyj tego zgrubnego stosunku kroku E do objętości, aby określić ustawienia kroku E, aby przeprowadzić kalibrację. Na przykład, jeśli krok E o pojemności 200 wytłacza około 20 μl za pomocą oględzin i chce się nanieść 10-200 μl, należy przetestować kroki E w zakresie 100-2000.
  4. Aby przeprowadzić kalibrację liniową, należy najpierw oznaczyć etykietą i zmierzyć suchą masę dwudziestu probówek do pobierania próbek o pojemności 1,5 ml na wadze analitycznej o czułości 0,1 mg.
  5. Wytłacz zawiesinę bakteryjną do wstępnie odmierzonych probówek o pojemności 1,5 ml. Dla każdego kroku E należy wykonać co najmniej 2 powtórzenia. Powtórz te czynności dla wszystkich kroków E w zakresie liniowym, w razie potrzeby wymieniając zawiesinę bakteryjną. Jeśli zanieczyszczenie stanowi problem w eksperymencie, po każdej próbce przetrzyj zewnętrzną część igły strzykawki niestrzępiącą się chusteczką nasączoną 70% etanolem.
  6. Zmierz masę wszystkich probówek o pojemności 1,5 ml za pomocą tej samej wagi analitycznej. Odejmij pierwszą wartość masy od drugiej, aby uzyskać masę netto zdeponowanej zawiesiny bakteryjnej.
  7. Przemień masę zawiesiny bakteryjnej na objętość o gęstości materiału. W przypadku wielu zawiesin bakteryjnych składających się głównie z wody, 1 g/ml jest odpowiednim przybliżeniem gęstości.
  8. Wykonaj dopasowanie liniowe między krokiem E a objętością wytłaczaną, aby zakończyć proces kalibracji.

5. Przygotowanie matrycy hydrożelowej granulowanej

  1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodać suche granulki usieciowanych kopolimerów kwasu akrylowego/akrylanu alkilu (patrz Tabela materiałów) do 400 ml 2% Lennox Luria-Bertani (LB), aby utrzymać sterylność matrycy; jednak do pęcznienia matrycy hydrożelowej można również użyć innych płynnych pożywek do hodowli komórek.
    UWAGA: Procent wagowy granulek dodanych do LB zależy od wielkości porów, do której dążysz. W niniejszym badaniu, w przypadku 0,9% granulowanej matrycy hydrożelowej, do LB dodaje się 3,6 g suchych granulek, a w przypadku 1,2% granulowanej matrycy hydrożelowej dodaje się 4,8 g suchych granulek do LB. Granulki hydrożelu są jednorodnie dyspergowane poprzez mieszanie ich w mikserze stojącym przez 2 minuty.
  2. Po wymieszaniu dostosuj pH do 7,4, dodając od 20 do 500 μl przyrostów 10 M wodorotlenku sodu (NaOH), aby zapewnić żywotność komórek. Po każdym dodaniu NaOH należy zmierzyć pH, zanurzając końcówkę pipety w mieszaninie, a następnie wycierając matrycę hydrożelową na bibułce do badania pH.
    UWAGA: Po dodaniu NaOH lepkość mieszaniny wzrośnie, gdy granulki hydrożelu zaczną pęcznieć. Spęczniałe granulki hydrożelu mają średnicę od ~5 μm do 10 μm i są zakleszczone razem w matrycy hydrożelowej. Wewnętrzny rozmiar oczek granulek wynosi od ~40 nm do 100 nm, jak wcześniej ustalono32. Rozmiar oczek jest wystarczająco duży, aby małe cząsteczki (np. tlen i składniki odżywcze) mogły swobodnie dyfundować, ale wystarczająco mały, aby bakterie mogły zostać zamknięte między porami śródmiąższowymi.
  3. Następnie przenieś granulowaną matrycę hydrożelową do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml za pomocą sterylnej plastikowej strzykawki o pojemności 50 ml. Odwirować matrycę hydrożelową o sile 161 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej w celu usunięcia pęcherzyków powstałych podczas procesu mieszania.
  4. Pozostaw matrycę hydrożelową na co najmniej 2 dni w temperaturze pokojowej, aby upewnić się, że nie doszło do zanieczyszczenia. Zanieczyszczenie pojawia się w postaci mikrokolonii zawieszonych w matrycy hydrożelowej. Po dwóch dniach odwirować matrycę hydrożelową o sile 161 x g przez 1 minutę, aby usunąć wszelkie dodatkowe pęcherzyki, które się utworzyły.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać, przechowując matrycę hydrożelową w temperaturze pokojowej przez okres do tygodnia.
  5. W komorze bezpieczeństwa biologicznego, za pomocą sterylnej plastikowej strzykawki o pojemności 30 ml, przenieś żądaną ilość matrycy hydrożelowej do pojemnika, w którym nastąpi drukowanie (tutaj użyto ~20 ml dla 20 ml kolby do hodowli tkankowej lub 1 ml dla 1 ml plastikowych mikrokuwet).

6. Charakterystyka właściwości reologicznych matrycy hydrożelowej granulatu

  1. Załaduj ~ 3 ml matrycy hydrożelowej do reometru ścinającego (patrz Tabela materiałów) z odstępem 1 mm między szorstkimi równoległymi płytkami o średnicy 50 mm w celu zmierzenia właściwości reologicznych.
  2. Określ ilościowo zachowanie plastyczności za pomocą jednokierunkowych pomiarów ścinania na reometrze ścinania, mierząc naprężenie ścinające w funkcji logarytmicznego przemiatania szybkości ścinania od 10-4 s-1 do 102 s-1 (np. Rysunek 2A).
    UWAGA: Przy niskich szybkościach ścinania matryca hydrożelowa będzie miała stałe naprężenie ścinające (granicę plastyczności), które jest niezależne od szybkości ścinania. Przy dużych szybkościach ścinania naprężenie ścinające będzie rosło wraz z zależnością prawa potęgowego od szybkości ścinania, co wskazuje na fluidyzację matrycy hydrożelowej. To zachowanie granicy plastyczności pozwala na drukowanie bakterii w 3D w ziarnistej matrycy hydrożelowej29.
  3. Zmierz moduły magazynowania i straty, odpowiednio G' i G'', w funkcji częstotliwości za pomocą reologii oscylacyjnej o małej amplitudzie z amplitudą odkształcenia 1% i częstotliwościami od 0,1 do 1 Hz (np. Rysunek 2B).
    UWAGA: Idealna granulowana matryca hydrożelowa do druku 3D powinna mieć moduł przechowywania większy niż moduł strat, co wskazuje, że medium działa jak zakleszczona elastyczna bryła29.

7. Charakterystyka wielkości porów śródmiąższowych matrycy granulowanego hydrożelu

  1. Sonizować 100 nm karboksylowane fluorescencyjne nanocząstki polistyrenu (~3,6 x 1013 cząstek/ml, patrz Tabela materiałów) w ich opakowaniu przez 15 minut w celu ponownego zawieszenia w celu rozbicia wszelkich agregacji/klastrów cząstek. Przenieś 50 μl nanocząstek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    1. Wirować przez 10 minut przy 9 500 x g w temperaturze pokojowej, aż utworzy się osad, a supernatant będzie klarowny. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml płynnej pożywki wzrostowej (tutaj LB) użytej do przygotowania granulowanej matrycy hydrożelowej.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać, przechowując zawieszone nanocząstki w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy.
  2. Sonikować zawieszone nanocząstki przez 30 minut. Przenieść 1 ml granulowanej matrycy hydrożelowej do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 1 μl zawieszonych nanocząstek do granulowanej matrycy hydrożelowej i wymieszać je z końcówką pipety. Po wymieszaniu wirować przez 30 s przy 161 x g w temperaturze pokojowej.
  3. Przenieść matrycę hydrożelową i mieszaninę nanocząstek na szalkę Petriego o średnicy 35 mm ze szklanym dnem o grubości 0,1 mm. Studnia ma średnicę 20 mm i głębokość 1 mm. Umieść szklane szkiełko nakrywkowe na wierzchu i dociśnij, aby wyłączyć przepływ i parowanie podczas obrazowania. Alternatywą dla szklanego szkiełka nakrywkowego jest dodanie 1 ml oleju parafinowego na wierzch.
  4. Zobrazuj nanocząstki za pomocą mikroskopu konfokalnego z 40-krotnym obiektywem olejowym z 8-krotnym dodatkowym zoomem w oprogramowaniu do obrazowania (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Zamiast korzystania z dodatkowego zoomu cyfrowego w oprogramowaniu można użyć obiektywu o większym powiększeniu.
    1. Wyobraź sobie pętlę czasową bez opóźnienia (najlepiej ~19 klatek/s) w jednej płaszczyźnie z 2 minutami z co najmniej czterema nanocząstkami w polu widzenia. Powtórz od 15 do 20 razy w różnych miejscach, aby zebrać wystarczającą ilość danych do statystyk (od 100 do 200 nanocząstek).
  5. Użyj oprogramowania do śledzenia cząstek, aby przeanalizować przemieszczenie cząstek. W tym przypadku używany jest specjalnie napisany skrypt oparty na klasycznym algorytmie Crockera-Griera do śledzenia środka masy nanocząstki35 (patrz plik uzupełniający 7).
    1. Na podstawie śledzenia cząstek oblicz średnie przemieszczenie kwadratowe (MSD). MSD będzie wykazywać swobodną dyfuzję w przestrzeni porów na krótkich odcinkach i w krótkich skalach czasowych oraz przejście do skalowania subdyfuzyjnego na dużych długościach i skalach czasowych z powodu ograniczenia35.
  6. Zidentyfikuj skalę długości, w której następuje przejście do skalowania subdyfuzyjnego, aby oszacować lokalną wielkość porów. Oblicz wielkość porów, dodając tę skalę długości do średnicy nanocząstek. Powtórz analizę wielkości porów dla każdej zmierzonej nanocząstki. W ten sposób uzyskamy rozkład wielkości porów, na podstawie którego można obliczyć średnią wielkość porów (np. Rysunek 3).

8. 3D proces drukowania

  1. Wykonane na zamówienie uchwyty do pojemników na próbki do druku 3D (patrz pliki uzupełniające 4-6 dla plików CAD). W tym przypadku stosuje się uchwyty do kolb do hodowli tkankowych i mikrokuwet. Uchwyty pozwalają zaprogramować drukarkę tak, aby drukowała wiele próbek w jednej sesji drukowania. Umieść pojemniki na próbki z pożywką hydrożelową w uchwytach na platformie roboczej.
  2. Otwórz oprogramowanie do drukowania 3D. Załaduj wstępnie zaprogramowany kod g do oprogramowania. Aby uzyskać reprezentatywne wyniki, krok 3.1 służy do załadowania zawiesiny bakteryjnej do drukarki 3D.
    UWAGA: Przykład kodu g do drukowania liniowych geometrii pionowych podano w tabeli 1.
  3. Za pomocą oprogramowania do drukowania 3D przesuń płaszczyzny x-y-z, aby wyśrodkować głowicę drukującą na płaszczyźnie x-y, aby była pierwszym kontenerem, a następnie ustaw oś z. Bazująca oś Z podniesie głowicę drukującą. Ręcznie powoli obracać, aby wcisnąć tłok strzykawki, aż na końcu igły będzie widoczna niewielka ilość zawiesiny bakteryjnej.
    1. Delikatnie zetrzyj nadmiar zawiesiny bakteryjnej sterylną jednorazową chusteczką. W zależności od wysokości uchwytu próbki, igły i strzykawki, za pomocą oprogramowania do drukowania 3D, opuść głowicę drukującą na stałą odległość do podłoża hydrożelowego w wybranym pojemniku na próbkę. Rozpocznij proces drukowania, klikając przycisk Drukuj.
  4. Po zakończeniu drukowania zamknij pojemniki na próbki. Przetrzyj drukarkę 70% etanolem. Strzykawkę i igłę należy usunąć w odpowiedni sposób.

9. Uprawa i obrazowanie V. cholerae

  1. W przypadku obrazowania o dużym polu widzenia użyj aparatu z nasadką obiektywu zmiennoogniskowego, aby zobrazować wzrost komórek za pomocą lightboxa. Próbki należy zobrazować zaraz po wydrukowaniu w temperaturze pokojowej, a następnie przenieść je do inkubatora. Próbki należy utrzymywać w temperaturze 37 °C w stacjonarnym inkubatorze między sesjami obrazowania podczas eksperymentu.
  2. Rejestruj obrazy przez żądany okres czasu, aby obserwować zachowanie wzrostu w długich okresach w ziarnistej matrycy hydrożelowej.

Wyniki

Zastosowanie biodrukarki 3D z granulowaną macierzą hydrożelową rozszerza możliwości biodrukarek w zakresie drukowania kolonii bakteryjnych w kształtach, które w przypadku druku na płaskim podłożu uległyby zapadnięciu ze względu na niską lepkość zawiesiny bakteryjnej. Rozdzielczość zaprezentowanej tutaj metody zależy od prędkości ekstruzji, rozmiaru igły, prędkości głowicy drukującej, obecności powietrza w igle oraz lepkości zawiesiny bakteryjnej. Ze względu na małą objętość zawiesiny bakteryjnej podczas jej wprowadzania do strzykawki i igły mogą nieumyślnie powstać pęcherzyki powietrza. Może to prowadzić do osadzenia pęcherzyka powietrza w końcowej wydrukowanej strukturze (Rycina 4). Inną przyczyną pojawienia się pęcherzyków powietrza w wydruku jest brak naciśnięcia tłoka w celu utworzenia małej kropli zawiesiny bakteryjnej na końcówce igły przed rozpoczęciem drukowania, co powoduje powstanie przerwy powietrznej na końcówce igły. Brak naciśnięcia tłoka strzykawki przed drukowaniem może również prowadzić do drukowania różnych objętości komórek w tej samej serii. Jednak wraz z upływem czasu pęcherzyk powietrza rozpuszcza się w otaczającym medium, co pokazano na Rycini 4.

W celu kalibracji etapu ekstruzji należy pamiętać, że objętość osadu zależy od tego, w jaki sposób siłownik liniowy głowicy drukującej przesuwa tłok strzykawki, a średnica wewnętrzna strzykawki bezpośrednio wpływa na tę objętość. Ponadto właściwości reologiczne zawiesiny bakteryjnej wpływają na to, jak łatwo przepływa ona przez zwężenie igły, co przekłada się na płynność druku. W związku z tym procedurę kalibracji należy powtórzyć dla każdego zestawu strzykawka/igła/zawiesina bakteryjna. Co do zasady kalibracja strzykawki mogłaby zostać zautomatyzowana, jednak w praktyce napisanie kodu, który byłby szeroko stosowalny w wielu przypadkach, byłoby trudne. Na przykład użytkownik dążący do skalibrowania ekstruzji około 300 µL ze strzykawki 1 mL musiałby znacznie częściej dopełniać strzykawkę niż użytkownik kalibrujący objętość docelową około 30 µL. Ponieważ stała kalibracyjna kroku E względem objętości jest nieznana na początku procesu, użytkownik może nie być w stanie dokładnie przewidzieć, jak często wymagane będzie dopełnianie. Ponadto, aby zautomatyzować proces kalibracji, należałoby określić dokładne pozycje każdej wcześniej zważonej probówki 1,5 mL. Aby zapewnić precyzyjną kalibrację, cały bioatrament musi zostać naniesiony z igły do probówki, co wymaga dokładnego kontaktu igły z dnem lub ścianką probówki. Bez właściwego kontaktu małe krople mogą pozostać zwilżone i przyczepione do igły. W związku z tym jakiekolwiek różnice w pozycjonowaniu probówek mogą znacząco przyczynić się do błędów w procesie kalibracji. Z tych względów autorzy zalecają, aby każdy użytkownik stworzył program kalibracyjny dostosowany do swoich indywidualnych potrzeb.

Kluczową cechą zaprezentowanego tutaj podejścia jest możliwość bezpośredniej wizualizacji rozprzestrzeniania się bakterii w ich środowisku poprzez ruchliwość i wzrost z wykorzystaniem obrazowania. W wcześniejszej wersji protokołu obrazowania płytki 6-dołkowe wypełniano 19 mL granularnej matrycy hydrożelowej. Jednakże, nawet przy udanym wydruku 3D poziomej linii komórek, którą można było obserwować pod mikroskopem odwróconym, na górnej powierzchni medium narastała również gęsta kolonia, co ograniczało wizualizację w mikroskopii w świetle przechodzącym (Rycina 5). Kolonia na górnej powierzchni prawdopodobnie była wynikiem kontaminacji podczas wprowadzania lub wyjmowania igły strzykawki z medium w trakcie drukowania. Aby rozwiązać ten problem, pionowe linie komórek są drukowane w fiolkach scyntylacyjnych (Rycina 6A). Jednakże krzywizna cylindrycznych fiolek powodowała zniekształcenia podczas obrazowania. Doprowadziło to do wyboru kuwet o płaskich ściankach oraz kolb do hodowli tkankowej jako pojemników na próbki do drukowania, co umożliwiło uzyskanie niezakłóconych obrazów (Rycina 6B-D). Jednym z ograniczeń kolb do hodowli tkankowej jest mała, nachylona szyjka, która ogranicza możliwe do wydrukowania geometrie.

Łącznie protokół ten umożliwia obserwację ruchliwości i wzrostu bakterii w złożonych środowiskach porowatych w długich przedziałach czasowych. Niektóre przykłady przedstawiono w Rysunek 6B-G do tworzenia biofilmu V. cholerae z wykorzystaniem mikroskopii w jasnym polu oraz komórek planktonicznych E. coli z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej z szybkim skanowaniem laserowym, co demonstruje wszechstronność tego podejścia. Rzeczywiście, potencjalnym problemem w przypadku macierzy hydrożelowych jest ich możliwa autofluorescencja podczas obrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej; jednak obrazy przedstawione w Rysunek 6F,G wykazano, że taka autofluorescencja jest minimalna w prezentowanej tutaj platformie eksperymentalnej. Kolejnym ograniczeniem tego typu podejść opartych na mikroskopii optycznej jest ich rozdzielczość przestrzenna, która jest określona przez limit dyfrakcyjny wynoszący ok. 100 nanometrów; jednak skala ta jest znacznie mniejsza niż rozmiar pojedynczej komórki bakteryjnej, w związku z czym techniki optyczne umożliwiają obrazowanie komórek bakteryjnych w skali pojedynczych komórek (Rysunek 6G) do skali większych kolonii wielokomórkowych30,31,32,33Poniżej opisano dodatkowe przykłady.

Jak wspomniano powyżej, przedstawione tutaj podejście może być wykorzystane do drukowania 3D i obrazowania kolonii bakteryjnych w małych (1 mL) i dużych (20 mL) objętościach macierzy. W związku z tym poniżej opisano różnice w wynikach uzyskanych przy zastosowaniu różnych objętości, wykorzystując jako reprezentatywne przykłady wydrukowane w 3D kolonie ruchliwych i nieruchliwych V. cholerae. Rozdzielczość przestrzenna (szerokość linii) wydruku jest określona przez średnicę wewnętrzną dyszy. W opisanych poniżej przykładach igła o średnicy wewnętrznej 0,6 mm pozwala na uzyskanie początkowej cylindrycznej kolonii o średnicy 0,6 mm. Wcześniejsze prace wykazały, że rozdzielczość druku można dodatkowo zwiększyć, stosując wyciąganą kapilarę szklaną o średnicy wewnętrznej ~100-200 µm33.

W przypadku małych objętości zastosowano dwie różne ziarniste matryce hydrożelowe o dwóch różnych rozkładach wielkości porów: jedną ze średnią wielkością porów większą niż średnia średnica komórki V. cholerae , wynosząca 0,2-0,4 µm36, oraz drugą ze średnią wielkością porów mniejszą od tej średnicy. Próbki obrazowano i mierzono przez dwanaście dni za pomocą analizy obrazu ekspansji powierzchniowej kolonii w czasie (Rycina 7 i Rycina 8). W przypadku komórek nieruchomych, które mogą rozprzestrzeniać się w otoczeniu jedynie poprzez wzrost komórkowy, tempo ekspansji powierzchniowej było podobne dla badanych matryc (Rycina 7), co zgodnie z oczekiwaniami wskazuje, że różnice w wielkości porów matrycy nie wpływają na rozprzestrzenianie się komórek poprzez wzrost. W przeciwieństwie do nich, w przypadku komórek ruchliwych, które rozprzestrzeniają się w otoczeniu poprzez aktywną motylość, tempo ekspansji powierzchniowej V. cholerae było wyższe dla matrycy hydrożelowej z większymi porami – w której ograniczenie przez ziarna hydrożelu w mniejszym stopniu utrudnia motylość komórkową. Różnice te w rozprzestrzenianiu się bakterii były również widoczne w morfologii kolonii (Rycina 8). Kolonia V. cholerae w matrycach hydrożelowych z większymi porami rozprzestrzeniała się poprzez gładkie, rozmyte pióropusze (Rycina 8A), co odzwierciedla rozprzestrzenianie się poprzez aktywną motylość, zgodnie z wcześniejszymi obserwacjami32. Rzeczywiście, zgodnie z tą interpretacją, rozmyte pióropusze nie są obserwowane w przypadku komórek nieruchomych (Rycina 8C). Dodatkowo pory są wystarczająco duże, aby komórki nie przesuwały kulek podczas przepływania przez pory. Co więcej, naprężenie lepkie wywołane pływaniem jest mniejsze niż 1 Pa, co jest niewystarczające do znaczącej deformacji otaczającej matrycy hydrożelowej. Z kolei kolonia w matrycach hydrożelowych z mniejszymi porami rozprzestrzenia się jedynie poprzez chropowate, fraktalne pióropusze zarówno dla komórek ruchliwych, jak i nieruchomych (Rycina 8B,D), co odzwierciedla rozprzestrzenianie się wyłącznie poprzez wzrost komórkowy; w miarę wzrostu komórek przejściowo deformują one i odkształcają otaczającą matrycę. W rzeczywistości, biorąc pod uwagę, że naprężenie graniczne matryc hydrożelowych jest znacznie mniejsze niż turgor komórek, w tej granicy małej wielkości porów matryca stawia jedynie słaby opór wzrostowi komórkowemu i nie wydaje się silnie wpływać na strukturę wydrukowaną w 3D, co potwierdzono również w naszej poprzedniej pracy37.

Podobne wyniki obserwuje się w eksperymentach przeprowadzonych na próbkach o dużej objętości; jednak ze względu na większą zawartość składników odżywczych w tych próbkach, eksperymenty mogły podtrzymywać wzrost komórkowy w dłuższych przedziałach czasowych. Jako przykład przedstawiono wyniki uzyskane z zastosowaniem granularnych macierzy hydrożelowych, w których średnia wielkość porów była mniejsza niż rozmiar komórki — w związku z czym rozprzestrzenianie się komórek wynikało przede wszystkim ze wzrostu. Próbki w granularnych macierzach hydrożelowych były obrazowane przez ok. 30 dni, przy czym przez pierwsze 150 h zaobserwowano podobną ekspansję powierzchniową zarówno dla komórek nieruchomych, jak i ruchliwych; jednak w jeszcze dłuższym czasie zaobserwowano silną zmienność między próbkami, przy czym niektóre z nich wykazywały szybsze tempo rozprzestrzeniania się (Rysunek 9 oraz Rysunek 10). Co ciekawe, po ponownym pobraniu próbek macierzy hydrożelowej po zakończeniu eksperymentu — co jest zaletą dużej objętości macierzy hydrożelowej — zmierzono spadek naprężenia granicznego, modułu zachowawczego i modułu strat (Rysunek 11), co wskazuje na to, że macierze stały się bardziej miękkie. Zmiana ta może wynikać z faktu, że V. cholerae produkuje cząsteczkę zmieniającą właściwości macierzy hydrożelowej i sprzyjającą rozprzestrzenianiu się komórek w dłuższym czasie, co będzie interesujące do przetestowania w przyszłych badaniach. Przykłady chropowatych, fraktalopodobnych morfologii kolonii powstałych w tych eksperymentach przedstawiono na Rysunku 10.

Układ biodruku 3D z ekstruderem strzykawkowym, macierzą hydrożelową i wydrukami bakterii, sterowanie pozycją.
Rycina 1: Zdjęcia własnoręcznie zbudowanej biodrukarki 3D. (A) Biodrukarka z zmodyfikowaną głowicą ekstrudera pompy strzykawkowej z jednorazową strzykawką Luer lock i igłą. Biodrukarka ma szerokość ok. 46 cm. (B) Zdjęcie biodruku 3D komórek w kolbach wypełnionych zagęszczoną macierzą hydrożelową. Szerokość obrazu wynosi 87 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres naprężenia ścinającego w funkcji szybkości ścinania; wykres G', G'' w funkcji częstotliwości; badanie wiskoelastyczności.
Rysunek 2: Charakterystyka właściwości reologicznych granulowanych matryc hydrożelowych. (A) Naprężenie ścinające jako funkcja przyłożonej szybkości ścinania. (B) Moduły zachowawczy i stratności, odpowiednio G' i G'', jako funkcja częstotliwości oscylacji. Legenda wskazuje frakcję masową hydrożelu wykorzystaną do przygotowania każdej matrycy hydrożelowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres funkcji dystrybucji skumulowanej dla analizy wymiarów porów; porównanie danych przy stężeniu 1,2% i 0,9%.
Rycina 3: Pomiary wielkości porów dwóch reprezentatywnych macierzy hydrożelu granulowanego. Poprzez śledzenie znaczników określono rozkład charakterystycznych wymiarów porów dla każdej macierzy hydrożelu. Dane przedstawiono jako 1-CDF, gdzie CDF oznacza funkcję dystrybucji skumulowanej. Legenda wskazuje ułamek masowy hydrożelu użyty do przygotowania każdej macierzy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wzrost kolonii bakteryjnych w hydrożelu. Schemat kolby, sekwencyjny wzrost w czasie 0-59 h pod mikroskopem.
Rysunek 4: Przykłady pęcherzyków powietrza powstałych podczas druku 3D bakterii. (A) Schemat układu do obrazowania. (B) Migawki wzrostu V. cholerae z pęcherzykiem powietrza na spodzie wydruku (czerwona ramka) w 1,2% macierzy hydrożelowej napęczniałej w LB. Po 59 h wzrostu w temperaturze 37 °C pęcherzyk powietrza całkowicie się rozpuścił, a kolonia zapadła się z powrotem ze względu na elastyczność macierzy hydrożelowej. Pasek skali = 2 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Układ obrazowania w płytce 6-dołkowej, schemat (A) i wynik (B), widoki z góry i z dołu do analizy.
Rysunek 5: Obrazy poziomej linii ruchomych V. cholerae wydrukowanych w płytce 6-dołkowej wypełnionej 1,2% macierzą hydrożelową napęczniałą w LB oraz biofilmu, który utworzył się na górnej powierzchni po 48 h inkubacji w 37 °C. (A) Schemat układu obrazowania. (B) Tworzenie się biofilmu na górnej powierzchni w wyniku kontaminacji podczas druku 3D zmniejsza przezroczystość i uniemożliwia wyraźne obrazowanie poziomej linii. Na górnej powierzchni tworzą się zmarszczki, prawdopodobnie z powodu różnicowego wzrostu. Pasek skali = 5 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Makroskopowe i mikroskopowe obrazy konfokalne; obiektyw zoom, hodowla komórkowa, szczegóły mikrostruktury.
Rycina 6: Przykłady różnych pojemników na próbki, które można wykorzystać w tej metodzie. (A) V. cholerae wydrukowane w szklanej fiolce wypełnionej 1,2% granulowaną macierzą hydrożelową po 470 h. Zakrzywienie fiolki utrudnia obrazowanie wzrostu. Paski skali = 5 mm. (B) V. cholerae wydrukowane w mikrokuwecie wypełnionej 1,2% granulowaną macierzą hydrożelową. Płaskie ścianki umożliwiają wyraźne obrazowanie, jednak małe objętości ograniczają czas trwania eksperymentów przed wyczerpaniem się podłoży wzrostowych dla komórek. (C) Układ obrazowania z obiektywem zoom do obrazowania V. cholerae wydrukowanych w kolbie do hodowli tkankowej wypełnionej 1,2% granulowaną macierzą hydrożelową. Podobnie jak w przypadku mikrokuwety, płaskie ścianki umożliwiają wyraźne obrazowanie. Kolby do hodowli tkankowej mogą być wypełnione większymi objętościami granulowanej macierzy hydrożelowej, co wydłuża czas trwania eksperymentu. (D) Obraz z obiektywu zoom przedstawiający V. cholerae wydrukowane wewnątrz 1,2% granulowanej macierzy hydrożelowej po 100 h inkubacji w 37 °C. Pasek skali = 1 mm. (E) Układ obrazowania z mikroskopem konfokalnym do obrazowania komórek fluorescencyjnych. (F) Projekcja 3D mikrofotografii konfokalnych fluorescencyjnych E. coli wewnątrz 1,2% granulowanej macierzy hydrożelowej po 10 dniach inkubacji w 37 °C. Pasek skali = 50 µm. (G) Mikrofotografia konfokalna pojedynczych komórek fluorescencyjnych E. coli wewnątrz macierzy hydrożelowej. Pasek skali = 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres ruchliwości drobnoustrojów; powierzchnia w funkcji czasu; porównanie drobnoustrojów ruchliwych i nieruchliwych; punkty danych; badanie macierzy.
Rycina 7Ekspansja powierzchni kolonii w funkcji czasu dla V. cholerae wydrukowane w 1 ml granulowanych matryc hydrożelowych wspierających. Dane na wykresie pochodzą z analizy obrazu Rycina 8Zaobserwowano, że komórki ruchliwe (zamknięte czerwone koło i kwadrat) rozprzestrzeniają się szybciej niż komórki nieruchliwe, co odzwierciedla rozprzestrzenianie się zarówno poprzez wzrost, jak i ruchliwość. Dodatkowo komórki ruchliwe w macierzy hydrożelowej o dużym rozmiarze porów (czerwone kwadraty) rozprzestrzeniają się szybciej niż komórki w macierzy hydrożelowej z 0.3 µm pory (czerwone kółka). Komórki nieruchome nie wykazują różnic w tempie rozszerzania powierzchni pomiędzy dwoma rozmiarami porów, ponieważ ulegają one jedynie wzrostowi. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Ruchliwość i wzrost bakterii w macierzach agarowych o różnych stężeniach; obrazy wyników eksperymentalnych.
Rysunek 8: Kolonie V. cholerae naniesione w 1 mL granularnych macierzy wspierających z hydrożelu. (A) Migawki wzrostu i ruchliwości ruchliwych szczepów V. cholerae w 0,9% granularnej macierzy hydrożelowej, w której rozmiar porów jest większy od średniej średnicy komórek. Strzałki wskazują rozproszoną pióropuszową strukturę, która powstaje w wyniku przemieszczania się komórek przez macierz hydrożelową. (B) Migawki wzrostu i ruchliwości ruchliwych szczepów V. cholerae w 1,2% granularnej macierzy hydrożelowej, w której rozmiar porów jest mniejszy od średniej średnicy komórek. Strzałki wskazują chropowatą, fraktalopodobną strukturę pióropusza, która powstaje w wyniku wzrostu komórkowego. (C) Migawki ewolucji czasowej nieruchliwych szczepów V. cholerae w 0,9% granularnej macierzy hydrożelowej, w której rozmiar porów jest większy od średniej średnicy komórek. W tym przypadku nie obserwuje się rozproszonych pióropuszy odzwierciedlających ruchliwość. (D) Migawki wzrostu nieruchliwych szczepów V. cholerae w 1,2% granularnej macierzy wspierającej z hydrożelu, w której rozmiar porów jest mniejszy od średniej średnicy komórek. W tym przypadku ponownie obserwuje się chropowate, fraktalopodobne pióropusze odzwierciedlające wzrost. Paski skali = 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza ruchliwości komórek; wykres powierzchni wzrostu w funkcji czasu; macierz 20 mL; porównanie komórek ruchliwych i nieruchliwych.
Rysunek 9: Ekspansja powierzchni kolonii V. cholerae w funkcji czasu, naniesionych na 20 mL granularnych macierzy wspierających z hydrożelu 1,2%. Zaobserwowano, że komórki nieruchliwe (otwarte kółka) i ruchliwe (zamknięte kółka) rozprzestrzeniają się z podobną prędkością przez pierwsze 100 h. Po 100 h odnotowano różnice w tempie ekspansji powierzchniowej, co może wynikać z pojawienia się zmienności w dłuższych odstępach czasu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Time-lapse wzrostu bakterii, kultury ruchliwe vs nieruchliwe, 0-397 h, obraz mikroskopowy, ekspansja kolonii.
Rycina 10: Kolonie V. cholerae naniesione w 22 mL 1,2% granulowanych macierzy hydrożelowych, hodowane w 37 °C. (Góra) Migawki wzrostu ruchliwych V. cholerae. (Dół) Migawki wzrostu nieruchliwych V. cholerae. W obu przypadkach widoczne są chropowate, fraktalopodobne pióropusze odzwierciedlające wzrost. Paski skali = 2 mm. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza reologiczna macierzy hydrożelowej; naprężenie ścinające w funkcji szybkości ścinania, odpowiedź częstotliwościowa G' i G
Rycina 11Charakterystyka właściwości reologicznych 1,2% matrycy hydrożelowej z granulatem przed (0 h) i po zakończeniu eksperymentu (397 h). (A) Naprężenie ścinające jako funkcja przyłożonej prędkości ścinania. (B) moduły magazynowania i strat, Gi Godpowiednio, w zależności od zastosowanej częstotliwości oscylacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Polecenia G-codeZadania
M82Tryb ekstruzji absolutnej
M302 S0Włącz wytłaczanie na zimno
M92 E14575Ustaw liczbę kroków ekstruzji na milimetr
G92 X35.61 Y81 Z0 E0.0 Ustaw pozycję osi z oraz pozycję ekstruzji na zero, a pozycję x i y na odpowiednio 35,71 mm i 88 mm, czyli w miejscu, w którym znajduje się głowica drukująca w momencie rozpoczęcia g-kodu.
M221 S100 T0ustawia przepływ na 100%
M107Wyłączyć wentylator
G1 F1 X35.61 Y81 E0.1Wytłocz 20 µL bioatramentu do macierzy z prędkością podawania wynoszącą 50 µL/min gdzie ustawiono aktualną pozycję
G0 F200 Z60Wyciągnąć igłę z matrycy i pojemnika na próbkę z prędkością 200 mm/min. 
G0 F500 X65.81 Y81.0Przesuń igłę do kolejnego pojemnika z próbką z prędkością 500 mm/min.
G0 F100 Z0Opuść igłę do kolejnego pojemnika z próbką na tę samą pozycję z, w której rozpoczęto drukowanie, z prędkością 100 mm/min.
G1 F1 X65.81 Y81.0 E0.2Wytłocz 20 µL bioatramentu do matrycy z szybkością podawania 50 µL/min gdzie ustawiono aktualną pozycję
G0 F200 Z60Wysuń igłę z matrycy i naczynia z próbką z prędkością 200 mm/min. 
G0 F500 X96.01 Y81.0Przesunąć igłę do następnego pojemnika z próbką z prędkością 500 mm/min.
G0 F100 Z0 Opuść igłę do pojemnika z próbką do tej samej pozycji z, w której rozpoczęto drukowanie, z prędkością 100 mm/min.
G1 F1 X96.01 Y81.0 E0.3Wytłocz 20 µL bioatramentu do macierzy z prędkością podawania 50 µL/min gdzie ustawiono aktualną pozycję
G0 F200 Z60Wyciągnij igłę z matrycy i pojemnika na próbkę z prędkością 200 mm/min. 
G0 F500 X126,21 Y81,0Przesuń igłę do kolejnego pojemnika z próbką z prędkością 500 mm/min
G0 F100 Z0Obniż igłę do następnego naczynia z próbką do tej samej pozycji z, w której rozpoczęto drukowanie, z prędkością 100 mm/min.
G1 F1 X126.21 Y81.0 E0.4Wytłocz 20 µL bioatramentu do macierzy z prędkością podawania wynoszącą 50 µL/min gdzie ustawiono aktualną pozycję
G0 F200 Z80Wyciągnij igłę z matrycy i pojemnika z próbką z prędkością 200 mm/min. 

Tabela 1: Programowanie G-code dla drukowania pionowych linii zawiesiny bakteryjnej.

Plik uzupełniający 1: Plik STL dla dolnego zacisku do jednorazowych strzykawek Luer lock o pojemności 1 mL do ekstrudera strzykawkowego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Plik STL dla górnego zacisku do jednorazowych strzykawek 1 mL z końcówką Luer Lock do ekstrudera strzykawkowego. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: plik STL dla adaptera strzykawki do jednorazowych strzykawek 1 mL z końcówką Luer lock do wytłaczarki strzykawkowej. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: plik STL uchwytu na próbkę do kuwety. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 5: Plik STL dla uchwytu do próbek w kolbach tkankowych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 6: plik STL dla platformy drukowania do płytek 6-dołkowych i szalek Petriego 35 mm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 7: Niestandardowy skrypt do śledzenia cząsteczek. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Krytyczne kroki w protokole
Ważne jest, aby podczas przygotowywania każdej matrycy hydrożelowej matryca była wytwarzana w sterylnym środowisku. W przeciwnym razie może dojść do zanieczyszczenia, które po kilku dniach objawia się np. mikrokoloniami (małymi sferoidami) w matrycy. Podczas procesu mieszania ważne jest, aby wszystkie suche ziarniste cząstki hydrożelu zostały rozpuszczone. Dodatkowo, podczas regulacji pH każdej matrycy hydrożelowej za pomocą NaOH, granulki zaczną pęcznieć, co zwiększa lepkość matrycy hydrożelowej, co prowadzi do utrudnienia mieszania. Korzystanie z miksera stojącego pomoże upewnić się, że NaOH jest dobrze wymieszany z matrycą hydrożelową. Podczas ładowania każdej zawiesiny bakteryjnej w igle mogą tworzyć się kieszenie powietrzne. Aby uniknąć tego problemu, upewnij się, że końcówka igły zawsze znajduje się w zawiesinie bakteryjnej w probówce wirówkowej, a nie na dnie probówki lub w pobliżu górnej powierzchni. Innym sposobem na przezwyciężenie tego problemu jest hodowanie dużych ilości komórek, a tym samym posiadanie większych objętości zawiesiny bakteryjnej do drukowania.

Ograniczenia
Obecnie, podczas drukowania, niska lepkość zawiesiny bakteryjnej ogranicza geometrie, które można wydrukować, i często prowadzi do tworzenia się i wzrostu biofilmu na powierzchni matrycy hydrożelowej z powodu komórek śladowych. Istnieje kilka potencjalnych metod przezwyciężenia tego ograniczenia, w tym zwiększenie lepkości zawiesiny bakteryjnej lub dalsza optymalizacja ustawień drukarki 3D. Aby zwiększyć lepkość zawiesiny bakteryjnej, można zmieszać zawiesinę bakteryjną z innym polimerem - na przykład alginianem, który był wcześniej używany do drukowania 3D bakterii na płaskich powierzchniach38. Ustawienia drukarki można dodatkowo zoptymalizować, aby umożliwić wycofanie tłoka strzykawki podczas wyjmowania igły z ziarnistej matrycy hydrożelowej, co mogłoby zapobiec osadzaniu się komórek podczas wyjmowania igły z matrycy hydrożelowej.

Znaczenie metody w odniesieniu do istniejących/alternatywnych metod
Opisana tutaj metoda pozwala na drukowanie kolonii bakteryjnych w ziarnistych matrycach hydrożelowych. Granulowane matryce hydrożelowe pozwalają na badanie wpływu zewnętrznych czynników środowiskowych (np. wielkości porów, odkształcalności matrycy) na ruchliwość i rozwój bakterii. Dodatkowo, podczas gdy w tej pracy LB jest używany jako płynne podłoże wzrostowe do pęcznienia matrycy hydrożelowej, matryca hydrożelowa może być pęczniejąca innymi płynnymi pożywkami wzrostowymi, w tym pożywką z antybiotykami. Dotychczasowe metody badania bakterii w zamkniętych środowiskach były ograniczone długością czasu eksperymentu, rozmiarem siatki polimerowej i sztywnością otaczającej matrycy hydrożelowej37,38. Istnieją już protokoły wytwarzania granulowanych matryc hydrożelowych z różnych polimerów, więc potencjał badania wpływu różnych warunków środowiskowych na ruchliwość i wzrost bakterii jest ogromny. Metoda ta pozwala na badanie bakterii w środowiskach kontrolnych, które łatwiej podsumowują środowiska, w których bakterie zamieszkują w świecie rzeczywistym, takie jak śluz gospodarza lub gleba. Innym ograniczeniem wielu innych metod jest nieprzezroczystość otaczającej matrycy; jednak takie podejście wykorzystujące optycznie przezroczyste materiały daje możliwość eksploracji np. kontroli optogenetycznej i modelowania bakterii w 3D.

Poza badaniem ruchliwości i wzrostu, opisana tutaj metoda druku 3D pokonuje ograniczenia wielu innych metod biodrukowania, które wymagają osadzania biotuszu na podłożu, a zatem są ograniczone pod względem wysokości zaprojektowanego żywego materiału, który mogą wyprodukować. W przyszłości ten protokół biodrukowania może być dalej rozszerzany o wytwarzanie materiałów biohybrydowych poprzez mieszanie polimerów z komórkami tworzącymi biofilm. Granulowane matryce hydrożelowe zapewniają wsparcie dla drukowania 3D grubszych, większych materiałów inżynieryjnych i bardziej złożonych geometrii niż wiele innych obecnych metod biodrukowania bakterii. Podczas gdy w tej pracy wykorzystano tylko V. cholerae i E. coli, inne gatunki, takie jak Pseudomonas aeruginosa, również zostały z powodzeniem wydrukowane w3D 37. Poza drukowaniem drukarkę można przystosować do wykonywania kontrolowanych próbek bakterii po wzroście, aby sprawdzić, czy nie nastąpiły jakiekolwiek zmiany genetyczne.

Oświadczenia

Eksperymentalna platforma używana do drukowania 3D i obrazowania społeczności bakteryjnych w tej publikacji jest przedmiotem wniosku patentowego złożonego przez Uniwersytet Princeton w imieniu Tapomoy Bhattacharjee i S.S.D. (numer wniosku PCT: PCT/US/2020/030213).

Podziękowania

R.K.B. dziękuje za wsparcie ze strony Prezydenckiego Programu Stypendialnego dla Doktorantów Doktoranckich. Materiał ten jest również oparty na pracy wspieranej przez grant programu stypendialnego dla absolwentów NSF DGE-2039656 (dla A.M.H.). A.S.D.-M. i H.N.L. dziękują za wsparcie ze strony Lidow Independent Work/Senior Thesis Fund na Uniwersytecie Princeton. Dziękujemy również laboratorium Bonnie Bassler za dostarczenie szczepów V. cholerae. S.S.D. dziękuje za wsparcie ze strony grantów NSF CBET-1941716, DMR-2011750 i EF-2124863, a także Funduszu Technologii Transformacyjnych Erica i Wendy Schmidtów, New Jersey Health Foundation, Pew Biomedical Scholars Program oraz Camille Dreyfus Teacher-Scholar Program.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kuwety 1 mlVWR97000-586
1 mL Strzykawka Luer lockBH SuppliesBH1LL
10 M NaOHSigma-Aldrich72068
100 nm karboksylowane fluorescencyjne nanocząstki polistyrenu (FluoSpheres)   Invitrogen, (ThermoFischer Scientific)
F8803
15 ml probówki wirówkoweThermoFischer Scientific14-955-237
igła 20 GMcMaster Carr75165A252
25 ml Kolby do hodowli tkankowychVWR10861-566
Drukarka 3DLulzbotLulzBot Mini 2
Oprogramowanie do druku 3DCuraCura-Lulzbot
50 mlThermoFischer Scientific14-955-239
AgarSigma-AldrichA1296
Karbomer Granulowane cząstki hydrożeluLubrizol Carbopol 980NFsuche granulki usieciowanych kopolimerów kwasu akrylowego/akrylanu alkilu
Wirówka (pojemność probówki 2 ml)VWR2405-37
Wirówka (pojemność probówki 50 ml)ThermoFischer Scientific75007200Sorvall (marka) ST 8 (model)
Mikroskop konfokalnyNikonA1R+ odwrócony skaning laserowy
mikroskop
Szklane dno szalka PetriegoCellvisD35-10-1-N
Lennox LB (Lubria Broth)Sigma-AldrichL3022
M8 & razy; 1,25 mm, 150 mm długości, w pełni gwintowana nasadka nasadkiMcMaster Carr91290A478
M8 &; 1,25 mm, mosiężna cienka nakrętka sześciokątnaMcMaster Carr93187A300
Pompa strzykawkowa o otwartym kodzie źródłowymReplistruder 4na zamówieniehttps://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468067220300791
szalka Petriego (okrągła 60 mm)ThermoFischer ScientificFB0875713A
Anton PaarMCR 501
Myjka ultradźwiękowaVWR97043-992
Probówki wirówkowe konfokalnyReometr ścinający

Bibliografia

  1. Persat, A., et al. The mechanical world of bacteria. Cell. 161 (5), 988-997 (2015).
  2. Stoodley, P., Dodds, I., Beer, D. D., Scott, H. L., Boyle, J. D. Flowing biofilms as a transport mechanism for biomass through porous media under laminar and turbulent conditions in a laboratory reactor system. Biofouling. 21 (3-4), 161-168 (2005).
  3. Ludemann, H., Arth, I., Liesack, W. Spatial changes in the bacterial community structure along a vertical oxygen gradient in flooded paddy soil cores. Applied and Environmental Microbiology. 66 (2), 754-762 (2000).
  4. Sicard, J. F., Bihan, G. L., Vogeleer, P., Jacques, M., Harel, J. Interactions of intestinal bacteria with components of the intestinal mucus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 387(2017).
  5. Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nature Reviews Microbiology. 9 (4), 244-253 (2011).
  6. Balzan, S., Quadros, C. D. A., Cleva, R. D., Zilberstein, B., Cecconello, I. Bacterial translocation: Overview of mechanisms and clinical impact. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 22 (4), 464-471 (2007).
  7. Chaban, B., Hughes, H. V., Beeby, M. The flagellum in bacterial pathogens: For motility and a whole lot more. Seminars in Cell & Developmental Biology. 46, 91-103 (2015).
  8. Datta, S. S., Steinberg, A. P., Ismagilov, R. F. Polymers in the gut compress the colonic mucus hydrogel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 7041-7046 (2016).
  9. Harman, M. W., et al. The heterogeneous motility of the Lyme disease spirochete in gelatin mimics dissemination through tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (8), 3059-3064 (2012).
  10. Ribet, D., Cossart, P. How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues. Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).
  11. Siitonen, A., Nurminen, M. Bacterial motility is a colonization factor in experimental urinary tract infection. Infection and Immunity. 60 (9), 3918-3920 (1992).
  12. Lux, R., Miller, J. N., Park, N. H., Shi, W. Motility and chemotaxis in tissue penetration of oral epithelial cell layers by Treponema denticola. Infection and Immunity. 69 (10), 6276-6283 (2001).
  13. O’Neil, H. S., Marquis, H. Listeria monocytogenes flagella are used for motility, not as adhesins, to increase host cell invasion. Infection and Immunity. 74 (12), 6675-6681 (2006).
  14. Gill, C. O., Penney, N. Penetration of bacteria into meat. Applied and Environmental Microbiology. 33 (6), 1284-1286 (1977).
  15. Shirai, H., Datta, A. K., Oshita, S. Penetration of aerobic bacteria into meat: A mechanistic understanding. Journal of Food Engineering. 196, 193-207 (2017).
  16. Thornlow, D. N., Brackett, E. L., Gigas, J. M., Dessel, N. V., Forbes, N. S. Persistent enhancement of bacterial motility increases tumor penetration: Motility enhances bacterial tumor penetration. Biotechnology and Bioengineering. 112 (11), 2397-2405 (2015).
  17. Toley, B. J., Forbes, N. S. Motility is critical for effective distribution and accumulation of bacteria in tumor tissue. Integrative Biology. 4 (2), 165-176 (2011).
  18. Dechesne, A., Wang, G., Gülez, G., Or, D., Smets, B. F. Hydration-controlled bacterial motility and dispersal on surfaces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14369-14372 (2010).
  19. de Souza, R., Ambrosini, A., Passaglia, L. M. P. Plant growth-promoting bacteria as inoculants in agricultural soils. Genetics and Molecular Biology. 38 (4), 401-419 (2015).
  20. Turnbull, G. A., Morgan, J. A. W., Whipps, J. M., Saunders, J. R. The role of bacterial motility in the survival and spread of Pseudomonas fluorescens in soil and in the attachment and colonisation of wheat roots. FEMS Microbiology Ecology. 36 (1), 21-31 (2001).
  21. Watt, M., Kirkegaard, J. A., Passioura, J. B. Rhizosphere biology and crop productivity—a review. Soil Research. 44 (4), 299-317 (2006).
  22. Adadevoh, J. S. T., Ramsburg, C. A., Ford, R. M. Chemotaxis Increases the Retention of Bacteria in Porous Media with Residual NAPL Entrapment. Environmental Science & Technology. 52 (13), 7289-7295 (2018).
  23. Adadevoh, J. S. T., Triolo, S., Ramsburg, C. A., Ford, R. M. Chemotaxis Increases the Residence Time of Bacteria in Granular Media Containing Distributed Contaminant Sources. Environmental Science & Technology. 50 (1), 181-187 (2016).
  24. Ford, R. M., Harvey, R. W. Role of chemotaxis in the transport of bacteria through saturated porous media. Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1608-1617 (2007).
  25. Wang, M., Ford, R. M., Harvey, R. W. Coupled effect of chemotaxis and growth on microbial distributions in organic-amended aquifer sediments: Observations from laboratory and field studies. Environmental Science & Technology. 42 (10), 3556-3562 (2008).
  26. Amchin, D. B., Ott, J. A., Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Influence of confinement on the spreading of bacterial populations. PLoS Computational Biology. 18 (5), e1010063(2022).
  27. Moore-Ott, J. A., Chiu, S., Amchin, D. B., Bhattacharjee, T., Datta, S. S. A biophysical threshold for biofilm formation. eLife. 11, e76380(2022).
  28. Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility. Journal of Bacteriology. 31 (6), 575-580 (1936).
  29. Bhattacharjee, T., et al. Polyelectrolyte scaling laws for microgel yielding near jamming. Soft Matter. 14 (9), 1559-1570 (2018).
  30. Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Confinement and activity regulate bacterial motion in porous media. Soft Matter. 15 (48), 9920-9930 (2019).
  31. Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Bacterial hopping and trapping in porous media. Nature Communications. 10 (1), 2075(2019).
  32. Bhattacharjee, T., Amchin, D. B., Ott, J. A., Kratz, F., Datta, S. S. Chemotactic migration of bacteria in porous media. Biophysical Journal. 120 (16), 3483-3497 (2021).
  33. Bhattacharjee, T., Amchin, D. B., Alert, R., Ott, J. A., Datta, S. S. Chemotactic smoothing of collective migration. eLife. 11, e71226(2022).
  34. Tashman, J. W., Shiwarski, D. J., Feinberg, A. W. A high performance open-source syringe extruder optimized for extrusion and retraction during FRESH 3D bioprinting. HardwareX. 9, e00170(2021).
  35. Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of digital video microscopy for colloidal studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
  36. Chatterjee, T., Chatterjee, B. K., Chakrabarti, P. Modelling of growth kinetics of Vibrio cholerae in presence of gold nanoparticles: Effect of size and morphology. Scientific Reports. 7 (1), 9671(2017).
  37. Martínez-Calvo, A., et al. Morphological instability and roughening of growing 3D bacterial colonies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (43), e2208019119(2022).
  38. Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. A Straightforward approach for 3D bacterial printing. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).
  39. Zhang, Q., et al. Morphogenesis and cell ordering in confined bacterial biofilms. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (31), e2107107118(2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ruchliwo bakteriigranularna matryca hydro elowawzrost koloniiVibrio choleraeEscherichia coliwp yw wielko ci por wtechnika biodrukurozprzestrzenianie si kom rek
Bakterie do drukowania 3D do badania ruchliwości i wzrostu w złożonych porowatych ośrodkach 3D
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.