Artykuł metodologiczny

Jednocząsteczkowy pomiar dynamiki oddziaływań białek w kondensatach biomolekularnych

DOI:

10.3791/66169

⸱

5 stycznia 2024

 , 
1Division of Chemistry and Chemical Engineering, California Institute of Technology, 2Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykazano, że wiele wewnętrznie nieuporządkowanych białek uczestniczy w tworzeniu wysoce dynamicznych kondensatów biomolekularnych, co jest ważne dla wielu procesów komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy opartą na obrazowaniu pojedynczych cząsteczek metodę ilościowego określania dynamiki, za pomocą której białka oddziałują ze sobą w kondensatach biomolekularnych w żywych komórkach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kondensaty biomolekularne powstałe w wyniku separacji fazy ciecz-ciecz (LLPS) zostały uznane za kluczowe dla organizacji komórkowej i rosnącej liczby funkcji komórkowych. Scharakteryzowanie LLPS w żywych komórkach jest również ważne, ponieważ nieprawidłowa kondensacja jest powiązana z wieloma chorobami, w tym nowotworami i zaburzeniami neurodegeneracyjnymi. LLPS jest często napędzany przez selektywne, przejściowe i wielowartościowe interakcje między wewnętrznie nieuporządkowanymi białkami. Dużym zainteresowaniem cieszy się dynamika oddziaływań białek uczestniczących w LLPS, którą dobrze podsumowują pomiary ich czasu przebywania w wiązaniu (RT), czyli czasu, jaki spędzają związane w kondensatach. W tym miejscu przedstawiamy metodę opartą na obrazowaniu pojedynczych cząsteczek żywych komórek, która pozwala na pomiar średniej RT określonego białka w kondensatach. Jednocześnie wizualizujemy poszczególne cząsteczki białka i kondensaty, z którymi się łączą, używamy śledzenia pojedynczych cząstek (SPT) do wykreślania trajektorii pojedynczych cząsteczek, a następnie dopasowujemy trajektorie do modelu wiązania białka z kropelką, aby wyodrębnić średnią RT białka. Na koniec pokazujemy reprezentatywne wyniki, w których zastosowano tę metodę obrazowania pojedynczej cząsteczki w celu porównania średnich RT białka w jego kondensatach LLPS po fuzji i niefuzji z domeną oligomeryzującą. Protokół ten ma szerokie zastosowanie do pomiaru dynamiki interakcji dowolnego białka, które uczestniczy w LLPS.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Coraz więcej prac sugeruje, że kondensaty biomolekularne odgrywają ważną rolę w organizacji komórkowej i licznych funkcjach komórkowych, np. regulacji transkrypcji1,2,3,4,5, naprawa uszkodzeń DNA6,7,8, organizacja chromatyny9,10,11,12, Inaktywacja chromosomu X13,14,15 oraz sygnalizacja wewnątrzkomórkowa16,17,18. Ponadto rozregulowanie kondensatów biomolekularnych jest związane z wieloma chorobami, w tym nowotworami19,20,21 i zaburzeniami neurodegeneracyjnymi22,23,24,25,26. Tworzenie kondensatu jest często napędzane przez przejściowe, selektywne i wielowartościowe interakcje białko-białko, białko-kwas nukleinowy lub kwas nukleinowy-kwas nukleinowy27. W pewnych warunkach interakcje te mogą prowadzić do separacji faz ciecz-ciecz (LLPS), przejścia gęstości, które lokalnie wzbogaca określone biomolekuły w kropelkach bez błony. Takie wielowartościowe interakcje są często pośredniczone przez wewnętrznie nieuporządkowane regiony (IDR) białek1,28,29. Biofizyczna charakterystyka tych interakcji na poziomie molekularnym ma kluczowe znaczenie dla naszego zrozumienia wielu zdrowych i nieprawidłowych funkcji komórkowych, biorąc pod uwagę wszechobecność kondensatów w nich. Chociaż techniki oparte na konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej, np. odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP)30,31,32, były szeroko stosowane do jakościowego wykazania, że wymiana molekularna między kondensatami a otaczającym środowiskiem komórkowym jest dynamiczna, ilościowe określenie dynamiki interakcji określonych biomolekuł w kondensatach jest na ogół niemożliwe przy użyciu konwencjonalnych mikroskopia konfokalna lub mikroskopia jednocząsteczkowa bez specjalistycznych metod analizy danych. Technika śledzenia pojedynczych cząstek (SPT) opisana w tym protokole opiera się na mikroskopii pojedynczych cząsteczek z żywych komórek33 i zapewnia wyjątkowo potężne narzędzie do ilościowego określania dynamiki interakcji między określonymi białkami w kondensatach. Odczyt SPT dla takiego pomiaru jest średnim czasem przebywania białka będącego przedmiotem zainteresowania w kondensatach.

Protokół można podzielić na dwie części - akwizycję danych i analizę danych. Pierwszym krokiem pozyskiwania danych obrazowych jest ekspresja w komórkach interesującego białka, które jest połączone z HaloTag34. Umożliwia to znakowanie białka będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą dwóch fluoroforów, przy czym większość cząsteczek białka ma być znakowana niefotoaktywowanym fluoroforem (np. JFX549 Halo ligand35), a niewielka ich część ma być znakowana spektralnie odrębnym, fotoaktywowanym fluoroforem (np. PA-JF646 Halo ligand36). Pozwala to na jednoczesne akwizycje wszystkich lokalizacji kondensatu w komórce oraz pozyskiwanie jednocząsteczkowych warstw białka będącego przedmiotem zainteresowania wiążących się i niewiążących z kondensatami. Tymczasem ten sam typ komórek jest modyfikowany w celu stabilnej ekspresji H2B oznaczonego Halo, histonu, który jest w dużej mierze nieruchomy na chromatynie. Komórki są następnie barwione ligandem PA-JF646 Halo, aby umożliwić obrazowanie pojedynczych cząsteczek H2B. Jak zostanie szczegółowo omówione poniżej, eksperyment ten uwzględnia wkład fotowybielania w umożliwienie precyzyjnej kwantyfikacji dynamiki interakcji białka będącego przedmiotem zainteresowania. Komórki do eksperymentów obrazowych muszą być następnie hodowane na czystych szkiełkach nakrywkowych, barwione ligandem (ligandami) HaloTag i składane w komorze obrazowania żywych komórek. Stamtąd próbka jest obrazowana pod silnie nachylonym i laminowanym oświetleniem arkusza optycznego (HILO) na mikroskopie fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) zdolnym do obrazowania dwukanałowego i wykrywania pojedynczych cząsteczek. Emisja jest następnie dzielona na dwie kamery, jedną śledzącą pozycje kondensatu i jedną śledzącą pojedyncze cząsteczki. Akwizycja odbywa się z długim czasem integracji (rzędu setek ms) w celu rozmycia swobodnie dyfuzyjnych białek i wychwycenia tylko białek, które są mniej mobilne ze względu na wiązanie się ze stabilnymi strukturami w komórce37.

Pierwszym krokiem analizy danych jest użycie ustalonego algorytmu śledzenia pojedynczych cząsteczek (SPT)38,39 do lokalizacji pojedynczych cząsteczek białka w każdej klatce filmu i połączenia lokalizacji w trajektorię dla każdej cząsteczki w ciągu jej wykrywalnego okresu życia. Trajektorie są następnie sortowane na te reprezentujące cząsteczki wewnątrz i te reprezentujące cząsteczki na zewnątrz kondensatów, porównując lokalizacje cząsteczek na ich trajektoriach z lokalizacjami wszystkich kondensatów w odpowiednich momentach1.

Następnie, generowana jest krzywa przeżycia (1 - CDF) przy użyciu długości wszystkich trajektorii kondensatu. Pozorny średni czas przebywania cząsteczek jest następnie ekstrahowany poprzez dopasowanie krzywej przeżycia do następującego dwuskładnikowego wykładniczego modelu wiązania białek:

figure-introduction-1,

gdzie A to frakcja cząsteczek niespecyficznie związanych, a kobs,ns i kobs,s to obserwowane tempo dysocjacji odpowiednio cząsteczek niespecyficznie związanych i specyficznie związanych. Od tego momentu brane jest pod uwagę tylko kobs,s. Dynamika zarówno dysocjacji białek, ktrue,s, jak i fotowybielania fluoroforu, kpb, przyczynia się do kobs,s jako

figure-introduction-2;

Tak więc, aby wyizolować efekty dysocjacji białek, mierzy się specyficzny współczynnik dysocjacji H2B-Halo w linii komórkowej wspomnianej wcześniej.

figure-introduction-3

H2B to białko, które jest stabilnie zintegrowane z chromatyną i które doświadcza minimalnej dysocjacji w skali czasowej akwizycji filmu pojedynczej cząsteczki37. Jego właściwa szybkość dysocjacji jest wtedy równa szybkości fotowybielania liganda PA-JF646 Halo, lub

figure-introduction-4.

Średni czas przebywania interesującego białka w kondensacie, figure-introduction-5, is then

figure-introduction-6.

Pokazane są reprezentatywne wyniki z Irgen-Gioro et al.40, gdzie ten protokół został zastosowany, aby wykazać, że fuzja domeny oligomeryzacji z IDR powoduje dłuższe przebywanie IDR w jego kondensatach. Wynik ten sugeruje, że dodana domena oligomeryzacji stabilizuje homotypowe interakcje IDR, który napędza LLPS. Zasadniczo ta sama metoda z nieznacznie zmodyfikowanymi protokołami może być zastosowana do scharakteryzowania homotypowych lub heterotypowych oddziaływań dowolnego białka, które uczestniczy w tworzeniu dowolnych typów kondensatów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Znakowanie białek w komórkach

  1. Ekspresja interesującego białka połączonego z HaloTag w żądanej linii komórkowej.
  2. Stabilna ekspresja H2B znakowanego Halo w tym samym typie komórek, co w 1.1 za pomocą transpozonów lub transdukcji wirusa.

2. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych

  1. Przed użyciem szkiełek nakrywkowych do hodowli komórkowych należy je oczyścić, aby usunąć zanieczyszczenia autofluorescencyjne.
    1. Zamontuj szkiełka nakrywkowe o średnicy 25 mm #1,5 na ceramicznym stojaku do barwienia i umieść w pojemniku polipropylenowym.
    2. Całkowicie zanurzyć szkiełka nakrywkowe w 1 M roztworze KOH i poddać sonikacji przez 1 godzinę.
    3. Szkiełka nakrywkowe spłukać trzykrotnie wodą podwójnie destylowaną (ddH2O).
    4. Całkowicie zanurz szkiełka nakrywkowe w 100% etanolu i poddaj sonikacji przez 1 godzinę.
    5. Szkiełka nakrywkowe należy całkowicie zanurzyć w 20% etanolu rozcieńczonymddH2O i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.

3. Przygotowanie komórek do mikroskopii

UWAGA: Wykonaj kroki opisane w tej sekcji w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zapobiec skażeniu komórek.

  1. Komórki płytki na oczyszczonych szkiełkach nakrywkowych. Wykonaj 2 dni przed obrazowaniem, jeśli białko znakowane Halo ma ulegać przejściowej ekspresji. Wykonaj 1 dzień przed obrazowaniem, jeśli białko znakowane aureolą ulega stabilnej lub endogennej ekspresji.
    1. Użyj sterylnych kleszczyków, aby umieścić szkiełka nakrywkowe na płytce 6-dołkowej (jedno szkiełko nakrywkowe/studzienka na próbkę komórki) i pozwól, aby resztki etanolu odparowały.
    2. Pokryj każdą studzienkę odpowiednią liczbą komórek, aby osiągnąć 70% zbieżność do czasu obrazowania. Umieść dodatkową studzienkę z komórkami stabilnie wyrażającymi H2B-Halo z tą samą konfluencją docelową.
    3. Wykonaj ten krok tylko wtedy, gdy dochodzi do przejściowej ekspresji białka oznaczonego aureolą. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Następnie należy transfekować komórki plazmidem kodującym znakowane białko będące przedmiotem zainteresowania, używając odpowiednich odczynników do transfekcji i postępując zgodnie z wytycznymi producenta.
    4. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Wybarwić komórki wyrażające interesujące białko znakowane Halo zarówno niefotoaktywowanym ligandem Halo (np. JFX549), jak i fotoaktywowanym ligandem Halo (np. PA-JF646). Wybarwić komórki wykazujące ekspresję H2B-Halo tylko fotoaktywowanym ligandem Halo.
    UWAGA: Wymienione tutaj stężenia ligandów Halo powinny być używane jako punkt wyjścia; Optymalne stężenie będzie zależało od poziomu ekspresji i lokalnego stężenia białka w kondensacie.
    1. Dla każdej próbki komórki wyrażającej interesujące białko znakowane Halo, rozcieńczyć 100 nM JFX549 Halo ligand35 i 20 nM PA-JF646 Halo ligand36 w 500 μl odpowiedniego podłoża komórkowego. Dla każdej próbki wykazującej ekspresję H2B-Halo rozcieńczyć tylko 20 nM liganda PA-JF646 Halo w 500 μl odpowiedniego podłoża komórkowego.
    2. Do każdej studzienki odessać istniejące pożywki, dodać 2 ml 1x PBS, a następnie odessać PBS (jest to określane jako "płukanie" przez pozostałą część protokołu) i zastąpić pożywką zawierającą odpowiednie ligandy Halo.
    3. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    4. Spłucz PBS cztery razy i zastąp świeżą pożywką niezawierającą ligandów Halo.
    5. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    6. Powtórzyć kroki 3.2.4 i 3.2.5 trzy razy (łącznie cztery cykle inkubacji płukania).
    7. Za pomocą sterylnych kleszczyków przenieś szkiełko nakrywkowe z komórkami do komory nakrywkowej do hodowli komórkowych kompatybilnej ze stolikiem mikroskopu.
    8. Dodaj pożywkę bez czerwieni fenolowej do komory i przystąp do obrazowania. Próbki, które nie są natychmiast obrazowane, należy inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do czasu, gdy będą potrzebne.

4. Obrazowanie pojedynczych cząsteczek

UWAGA: Niezależne eksperymenty mierzące czas przebywania zarówno H2B, jak i interesującego nas białka powinny być przeprowadzane przez wiele (≥3) dni, aby uzyskać statystycznie istotne wyniki. Przed obrazowaniem próbek komórek pod mikroskopem należy ustawić obie kamery za pomocą mikrosfer barwionych 0,1 μm (tabela materiałów) lub podobnego wzorca kalibracyjnego.

  1. Przygotuj mikroskop.
    1. Włącz mikroskop i komputer sterujący mikroskopem.
    2. Włączyć w mikroskopie elementy inkubacji żywych komórek (grzałkę i CO2 ) i ustawić ją na 37 °C i 5% CO2 . Pozwól, aby system się zrównoważył.
    3. Umieść kroplę odpowiedniego oleju na 100-krotnym obiektywie zanurzeniowym w oleju TIRF na mikroskopie i załaduj próbkę komórki na stolik mikroskopu.
  2. Zidentyfikuj komórkę do obrazu.
    1. Zobrazuj próbkę komórki w jasnym świetle i dostosuj pozycję z, aż komórki będą ostre.
    2. Zidentyfikuj komórkę, która wykazuje cechy morfologiczne zdrowych komórek.
    3. Przytnij pole widzenia (FOV) tak, aby obejmowało tylko jądro komórki docelowej.
    4. Użyj oświetlenia laserowego i dostosuj kąt TIRF, aż do uzyskania HILO illumination41 z optymalnym stosunkiem sygnału do szumu pojedynczych cząsteczek.
  3. Obraz H2B-Halo w żywych komórkach.
    UWAGA: Moce lasera użyte w tej sekcji są specyficzne dla tego eksperymentu i podane jako przykład. Odpowiednie moce lasera powinny być dobrane zgodnie z kryteriami wymienionymi w dyskusji.
    1. Skonfiguruj konfigurację pobierania w następujący sposób. Ustaw czas naświetlania na 500 ms. Podczas każdej 500 ms ekspozycji wzbudzaj cząsteczki H2B-Halo znakowane PA-JF646 wiązką o mocy 9,1 mW, 640 nm. Podczas martwego czasu między klatkami (158,01 μs w zastosowanym tutaj systemie obrazowania) fotoaktywuj cząsteczki wiązką o mocy 111 μW, 405 nm.
    2. Przy tych ustawieniach można rejestrować 2000 klatek w sposób ciągły. Stopniowo zwiększaj moc wiązki 405 nm w trakcie akwizycji, gdy liczba fotoaktywowanych cząsteczek staje się niewystarczająca.
  4. Wyobraź sobie białko oznaczone aureolą w żywych komórkach.
    1. Użyj długoprzepustowego zwierciadła dichroicznego, aby rozdzielić długości fal emisyjnych między dwie kamery, jedną do wykrywania PA-JF646, a drugą do wykrywania JFX549. Używaj odpowiednich filtrów emisji przed kamerami.
    2. Użyj tej samej konfiguracji akwizycji, która została opisana w 4.3.1 z następującą modyfikacją. Dodaj dodatkowy kanał JFX549, aby śledzić lokalizacje kondensatów białkowych oznaczonych Halo w czasie. Co 10 s pobieraj jedną ramkę (500 ms, 2,1 mW, wzbudzenie 561 nm) w kanale JFX549 z zachowaniem akwizycji kanału PA-JF646. Spowoduje to przebicie się do kanału PA-JF646, co zostanie uwzględnione w analizie danych po akwizycji.
    3. Przy tych ustawieniach można rejestrować 2000 klatek w sposób ciągły. Stopniowo zwiększaj moc wiązki 405 nm w trakcie akwizycji, gdy liczba fotoaktywowanych cząsteczek staje się niewystarczająca.

5. Analiza danych obrazowania pojedynczych cząsteczek

UWAGA: Parametry użyte w sekcji 5 są specyficzne dla tego eksperymentu i podane jako przykład. Odpowiednie parametry należy dobrać zgodnie z kryteriami wymienionymi w dyskusji.

  1. Przygotuj surowe dane obrazowania do przetworzenia.
    1. Aby uzyskać dane dotyczące białka będącego przedmiotem zainteresowania, przekonwertuj każdy kanał z pliku surowych danych obrazowania na niezależny plik .tif za pomocą ImageJ lub podobnego oprogramowania do przetwarzania obrazu. W przypadku danych H2B przekonwertuj pojedynczy kanał z pliku surowych danych obrazowania na plik .tif w ten sam sposób.
      UWAGA: W zależności od używanego oprogramowania do akwizycji, w filmie kondensatu mogą występować puste klatki, ponieważ co 10 s rejestrowana jest tylko jedna klatka śledzenia kondensatu. Puste ramki powinny zostać wypełnione najnowszą ramką kondensatu (niektóre programy do akwizycji robią to automatycznie). Dodatkowo, jeśli występuje znaczne przebicie z kanału kondensatu (JFX549) do kanału pojedynczej cząsteczki (PA-JF646) podczas tych ramek śledzenia kondensatu, odpowiednie ramki pojedynczej cząsteczki należy zastąpić najnowszą ramką jednocząsteczkową.
    2. Jeśli z powyższych powodów w którymś z filmów są jakieś klatki, które muszą zostać zastąpione, zastąp je najnowszą klatką z tego filmu, modyfikując (jeśli to konieczne) i uruchamiając pretracking_comb.txt, makro ImageJ dostępne w Chong et al.1, postępując zgodnie z instrukcjami.
  2. Generuj trajektorie pojedynczych cząstek za pomocą oprogramowania SPT, np. SLIMfast39, implementacji GUI algorytmu MTT38 dostępnej w Teves et al.42.
    1. Załaduj plik z 5.1.2 zawierający film o pojedynczej cząsteczce do SLIMfast, klikając Load > Imagestack.
    2. Ustaw parametry (współczynnik błędów lokalizacji: 10-6; pętle deflacyjne: 3) dla lokalizacji, klikając OPT > Arkusz: Lokalizacja.
    3. Ustaw parametry (emisja szczytowa: 664 nm; czas opóźnienia: 500 ms) do akwizycji, klikając OPT > Arkusz: Akwizycja.
    4. Wizualizuj lokalizacje wszystkich cząsteczek w jednej klatce, aby upewnić się, że wybrane parametry są odpowiednie (TEST LOC). Jeśli nie jest to właściwe, zmodyfikuj parametry w krokach 5.2.2 i 5.2.3 i powtórz ten krok.
    5. Wygeneruj plik zawierający lokalizacje wszystkich cząsteczek w każdej klatce (LOC ALL).
    6. Załaduj plik z 5.2.5 do SLIMfast, klikając Załaduj dane cząstek > > SLIMfast.
    7. Ustaw parametry (maksymalny oczekiwany współczynnik dyfuzji: 0,1 μm2/s; maksymalna liczba zawodników: 5) do generowania trajektorii poprzez kliknięcie OPT > Arkusz: Śledzenie.
    8. Wygeneruj plik zawierający trajektorie wszystkich cząsteczek (GEN TRAJ).
  3. Odfiltruj trajektorie, które są krótsze niż tmin, 2,5 s, za pomocą evalSPT39, dostępnego w Drosopoulos et al.43, aby uwzględnić błędy śledzenia, które skutkują sztucznie krótkimi trajektoriami.
    1. Załaduj plik z 5.2.8 do evalSPT (+ plik > z 5.2.8 > OK).
    2. Ustaw parametry (min: 5 klatek; max: maksymalna długość trajektorii dla pliku z 5.2.8), aby odfiltrować trajektorie krótsze niż 2,5 s.
    3. Wygeneruj plik ze wszystkimi przefiltrowanymi trajektoriami (EKSPORT DANYCH).
  4. Postępuj zgodnie z tym krokiem tylko dla trajektorii białka będącego przedmiotem zainteresowania. Posortuj trajektorie na trajektorie w kondensatach i na wyjściowe z kondensatów, a następnie wyodrębnij średni czas przebywania w kondensacie.
    UWAGA: Wszystkie kody dla tej sekcji są dostępne w Chong et al.1.
    1. Proguj wszystkie klatki filmu zarejestrowane w kanale JFX549, aby wygenerować film poklatkowy wypełniony ewoluującą w czasie maską binarną podkreślającą lokalizacje kondensatu, uruchamiając makro, jądro i mask_v2.txt klastra ImageJ, a następnie postępując zgodnie z instrukcjami.
    2. Sformatuj trajektorie pojedynczych cząsteczek wygenerowane w 5.3.3. za pomocą skryptu MATLAB, ConvertASCII_SlowTracking_css3.m, i dostosuj nazwy plików, ścieżki i parametry w razie potrzeby. (Parametry: Ekspozycja, 0,5 s; Rozdzielczość, 0,16 μm/piksel).
    3. Sortuj trajektorie na podstawie ułamka czasu, jaki dana cząsteczka spędza w kondensacie, F, za pomocą skryptu MATLAB, categorization_v4.m, dostosowując nazwy plików i ścieżki w razie potrzeby.
    4. Kontynuuj, używając tylko trajektorii w kondensacie.
  5. Wyodrębnij kobs,s i kpb i oblicz poprawiony średni czas przebywania, figure-protocol-1.
    1. Wyodrębnij kobs,s z interesujących trajektorii białka w kondensacie za pomocą skryptu MATLAB, PLOT_ResidenceHist_css.m, dostosowując w razie potrzeby nazwy plików, ścieżki i parametry.
      (Parametry: Ekspozycja, 0,5 s; StartFrameForFit, 5 ramek).
    2. Wyodrębnij kpb z trajektorii H2B za pomocą skryptu MATLAB, PLOT_ResidenceHist_css.m i dostosowując nazwy plików, ścieżki i parametry w razie potrzeby.
      (Parametry: Ekspozycja, 0,5 s; StartFrameForFit, 5 ramek).
    3. Oblicz skorygowany średni czas przebywania białka będącego przedmiotem zainteresowania specyficznie związanego z jego kondensatami, figure-protocol-2, as
      figure-protocol-3
      UWAGA: Należy przeprowadzić kontrole w celu sprawdzenia, czy różne czasy ekspozycji, które są wystarczająco długie, aby rozmyć ruchome cząstki, na przykład 300 ms i 800 ms, nadal skutkują tym samym średnim czasem przebywania białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy reprezentatywne wyniki z Irgen-Gioro et al.40, gdzie użyliśmy tego protokołu SPT do porównania dynamiki interakcji dwóch białek w ich odpowiednich samoorganizujących się kondensatach LLPS. TAF15 (czynnik 15 związany z białkiem wiążącym TATA-box) zawiera IDR, który może ulegać LLPS w przypadku nadekspresji w komórkach ludzkich. Postawiliśmy hipotezę, że fuzja TAF15 (IDR) z FTH1 (łańcuch ciężki ferrytyny 1), który tworzy oligomer 24-podjednostkowy, doprowadziłaby do bardziej stabilnych homotypowych interakcji białko-białko, które napędzają LLPS. Aby przetestować tę hipotezę, przejściowo ulegliśmy ekspresji w komórkach U2OS fuzji Halo-TAF15 (IDR) lub TAF15 (IDR) -Halo-FTH1 i przeprowadziliśmy dwukolorowe obrazowanie pojedynczej cząsteczki każdego białka zgodnie z powyższym protokołem. Reprezentatywna klatka z filmu TAF15(IDR)-Halo-FTH1 jest pokazana w Rysunek 1A. Cząsteczki wykryte w kanale PA-JF646 zostały zlokalizowane, a te lokalizacje zostały połączone w trajektorie. Uzyskane trajektorie zostały następnie posortowane między populacjami w kondensacie i poza kondensatem poprzez porównanie z binarną maską podkreślającą lokalizacje kondensatu (Rysunek 1B). Chociaż pokazujemy tylko niewielki ułamek trajektorii dla dobrej widoczności, istnieje wyraźne rozróżnienie między trajektoriami cząsteczek związanych z kondensatami i związanych na zewnątrz kondensatów. Następnie dopasowano krzywą przeżycia długości trajektorii kondensatu do dwuskładnikowego modelu wykładniczego (Rysunek 1C). Na koniec wyekstrahowano średnie czasy przebywania po korekcie do fotowybielania i wykreślono je dla obu białek (Rysunek 1D). Odkryliśmy, że średni czas przebywania Halo-TAF15(IDR) w kondensatach LLPS wynosił 10,23 s ± 1,10 s, podczas gdy TAF15(IDR)-Halo-FTH1 wynosił 64,15 s ± 11,65 s. Wynik ten sugeruje, że dodanie domeny oligomeryzującej do TAF15 (IDR) rzeczywiście stabilizuje wiązanie białka z kondensatem.

figure-results-1
Rysunek 1: Metoda oparta na SPT rozwiązuje różnice w czasie przebywania białek w ich kondensatach. A. Reprezentatywne klatki z dwukolorowego filmu o pojedynczej cząsteczce TAF15(IDR)-Halo-FTH1. Białka znakowano kombinacją wyższego stężenia barwnika niefotoaktywowanego (100 nM JFX549, żółty) w celu wizualizacji lokalizacji kondensatów oraz niższego stężenia barwnika fotoaktywowanego (20 nM PA-JF646, magenta) w celu wizualizacji pojedynczych białek, umożliwiając SPT. Filmy w tych samych warunkach obrazowania zostały pozyskane dla Halo-TAF15 (IDR) i jednokanałowe filmy PA-JF646 zostały pozyskane dla H2B-Halo. Biała przerywana linia wyznacza jądro. B. Reprezentatywny scalony obraz nakładający się na binarną maskę położenia kondensatu (szary) i trajektorii (wielokolorowy). C. Reprezentatywna krzywa przeżycia TAF15(IDR)-Halo-FTH1 wyposażona w dwuskładnikowy model wykładniczy. D. Średni czas przebywania Halo-TAF15 w był znacznie krótszy niż TAF15(IDR)-Halo-FTH1 w odpowiednich kondensatach. Wartość dla każdego białka została uśredniona z 20 komórek mierzonych w niezależnych eksperymentach przeprowadzanych przez trzy dni. Błąd propagowano jako błąd standardowy średniej, a gwiazdka reprezentuje istotną różnicę w czasie przebywania dwóch białek (p<0,05, test sumy rang Wilcoxona). Ten rysunek został zaadaptowany za zgodą Irgen-Gioro et al.40. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół jest przeznaczony dla systemów takich jak te badane w Irgen-Gioro et al.40. W zależności od zastosowania, niektóre elementy protokołu mogą być modyfikowane, np. metoda generowania linii komórkowych znakowanych fluorescencyjnie, system znakowania fluorescencyjnego oraz styl zastosowanego szkiełka nakrywkowego. Znakowanie halo białka w komórce można przeprowadzić przy użyciu dwóch strategii, w zależności od tego, która jest bardziej odpowiednia dla danego eksperymentu. 1) Ekspresja egzogenna: fuzja białka będącego przedmiotem zainteresowania z HaloTag i ekspresja fuzji w docelowej linii komórkowej albo przejściowo za pomocą transfekcji, albo stabilnie za pomocą transpozonów lub transdukcji wirusowej. 2) Edycja genomu: wbij HaloTag w locus genu kodującego endogenne białko będące przedmiotem zainteresowania w docelowej linii komórkowej za pomocą technik edycji genomu, np. CRISPR44. Zalety i wady każdego z nich są omówione w innym miejscu45, ale pokrótce, strategia ekspresji egzogennej jest mniej czasochłonna, ale tworzy populację komórek o szerokim zakresie poziomów ekspresji, które często są niefizjologiczne. Strategia edycji genomu trwa znacznie dłużej, ale znakuje interesujące nas białka o endogennej ekspresji na ich natywnych poziomach ekspresji.

Ponadto protokół ten nie wymaga użycia HaloTag; Jest raczej kompatybilny z dowolnym znacznikiem, który umożliwia jednoczesne znakowanie pojedynczej cząsteczki i zespołu tego samego białka w komórce. W ten sposób protokół można zmodyfikować do użytku z innymi znacznikami samoetykietującymi, takimi jak SNAP-tag46. Wreszcie, zamiast komór nakrywkowych można stosować wstępnie oczyszczone, komercyjne naczynia ze szklanym dnem do hodowli komórkowych, takie jak szalki MatTek (MatTek Life Sciences, P35G-1.5-20-C), pod warunkiem, że są one kompatybilne z obiektywem mikroskopu i olejkiem immersyjnym; Jednak szkiełka nakrywkowe można dokładniej wyczyścić bezpośrednio przed użyciem, dlatego są preferowane.

Chociaż powyższe modyfikacje protokołu są opcjonalne, istnieją parametry eksperymentalne i analityczne, które należy zoptymalizować, a mianowicie stężenia ligandów HaloTag, moce lasera, parametry lokalizacji i śledzenia oraz tmin. Stężenie niefotoaktywowanego liganda HaloTag powinno być tak dobrane, aby kondensat był znakowany wystarczająco gęsto, aby umożliwić wytworzenie maski. Stężenie fotoaktywowanego ligandu HaloTag i moc lasera fotoaktywacyjnego powinny być tak dobrane, aby cząsteczki białka były znakowane i fotoaktywowane wystarczająco rzadko, aby generować wysokiej jakości trajektorie pojedynczych cząstek, ponieważ nadmiar lokalizacji w każdej klatce spowoduje niedokładne generowanie trajektorii. W przypadku eksperymentów pokazanych w reprezentatywnych wynikach było na ogół mniej niż pięć lokalizacji na klatkę. Moc lasera wzbudzającego powinna być utrzymywana na tyle niska, aby zminimalizować szybkie fotowybielanie, ale wystarczająco wysoka, aby precyzyjnie zlokalizować pojedyncze cząsteczki. Parametry lokalizacji i śledzenia pojedynczej cząsteczki powinny być dostosowane w zależności od gęstości wzbudzeń i oczekiwanej dynamiki dyfuzji białka będącego przedmiotem zainteresowania. Na koniec wartości figure-discussion-1 należy obliczyć w zakresie tmin (zaczynając od 0 s i zwiększając się w przyrostach czasu ekspozycji). Wartości figure-discussion-2 powinny być zbieżne powyżej pewnego progu tmin; ten tmin powinien być użyty w kroku 5.3.

Opisana tutaj metoda określa ilościowo dynamikę oddziaływań białek w kondensatach z precyzją, która jest niedostępna dla konwencjonalnych technik. Ponadto może to robić w żywych komórkach przy minimalnych zakłóceniach próbki. Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ zachowania interakcyjne IDR, w tym tworzenie się kondensatu, są w dużym stopniu zależne od ich lokalnego środowiska40.

Reprezentatywne wyniki uzyskane przez Irgen-Gioro i wsp.40 wskazują na zdolność tej metody do wyodrębniania czasów przebywania białek wiążących się z ich samoorganizującymi się kondensatami LLPS. Co ważne, metodę tę można łatwo rozszerzyć na dowolne wiązanie białka z dowolnym typem kondensatów poprzez interakcje homotypowe lub heterotypowe. Co więcej, nie ogranicza się do pomiaru dynamiki oddziaływań białek ulegających LLPS. Wykazano, że onkoproteina fuzyjna EWS::FLI1, o której wiadomo, że powoduje mięsaka Ewinga, tworzy lokalne ośrodki o wysokim stężeniu, które odgrywają istotną rolę w jej aktywacji transkrypcyjnej i funkcjach transformacji onkogennej 1,2. Podczas gdy powstawanie tych węzłów jest napędzane przez przejściowe, selektywne i wielowartościowe oddziaływania IDR-IDR EWS::FLI1, jak dotąd nadal nie ma przekonujących dowodów na to, że są to kondensatyLLPS 1,2 w dobrej wierze. Mimo to, użyliśmy przedstawionej tutaj metody do zmierzenia średniego czasu przebywania EWS::FLI1 w jego hubach i wykazaliśmy, że mutacja specyficznych reszt i delecja jego IDR znacząco zdestabilizowały wiązanie EWS::FLI1 z jego hubami1.

Pomimo wszechstronności tej metody w charakteryzowaniu dynamiki wiązania białek w kondensatach, należy zachować ostrożność przy wyborze modelu wiązania białek w określonych kontekstach. Istniejące dane biochemiczne wspierają ideę, że dwuskładnikowy rozkład wykładniczy jest często odpowiednim modelem dla wielu układów 1,37,40,42, ale wykazano również, że ten sam rozkład jest niewłaściwą reprezentacją wiązania białek w innych układach, w których alternatywne modele, takie jak trzyskładnikowy wykładniczy 47,48,49 i rozkłady potęgowe50 lepiej pasuje do obserwacji eksperymentalnych. Aby uniknąć wyciągania błędnych wniosków, należy starannie dobrać i umotywować model, zweryfikować, czy jakość dopasowania przemawia za jego stosowaniem i rozsądnie interpretować wyniki.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship w ramach grantu nr. DGE-1745301 (S.Y.), Pew-Stewart Scholar Award (S.C.), Searle Scholar Award (S.C.), Shurl and Kay Curci Foundation Research Grant (S.C.), Merkin Innovation Seed Grant (S.C.), Mallinckrodt Research Grant (S.C.) oraz Margaret E. Grant Early Medical Research Trust 2024 (S.C.). S.C. jest również wspierany przez NIH/NCI w ramach nagrody numer P30CA016042.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,1 &mikro; m TetraSpeck mikrosferaInvitrogenT7279Obrazowanie pojedynczych cząsteczek
średnicy 25 mm, #1,5 Szkiełka nakrywkoweMarienfeld Superior111650Przygotowanie szkiełek nakrywkowych
Filtr pasmowo-przepustowy 593/40 nmSemrockFF01-593/40-25Obrazowanie pojedynczych cząsteczek
Filtr pasmowoprzepustowy 676/37 nmSemrockFF01-676/37-25Obrazowanie pojedynczych cząsteczek
6-dołkowe Płytka TCGenesee25-105MPPrzygotowanie komórek do mikroskopii
Linia komórkowa: U-2 OSATCCHTB-96Znakowanie białek w komórkach
ConvertASCII_SlowTracking_css3
.m		Analiza danych obrazowania pojedynczych cząsteczek: Dostępne w Chong et al., 2018
Stojak do barwienia szkła nakrywkowegoThomas24957Przygotowanie szkiełek
nakrywkowychDeuterowana Janelia Fluor 549 (JFX549)Badawczy JaneliaPrzygotowanie komórek do mikroskopii
DMEM, Niska glukozaGibco10-567-022Znakowanie białek w komórkach: Zastosowane pożywki wzrostowe: DMEM z 5% płodową surowicą bydlęcą, 1% penstrep
Mikroskop odwrócony Eclipse Ti2-ENikonObrazowanie pojedynczych cząsteczek
Etanol 200 ProofLab AlleyEAP200-1GALPrzygotowanie szkiełek nakrywkowych
evalSPTAnaliza danych obrazowania pojedynczych cząsteczek: Dostępne w Drosopoulos i wsp., 2020
Płodowa surowica bydlęcaCytivaSH30396.03Znakowanie białek w komórkach: Zastosowane pożywki wzrostowe: DMEM z 5% płodową surowicą bydlęcą, 1% penstrep
FidżiAnaliza danych obrazowania pojedynczych cząsteczek
Ikon Ultra CCD CameraAndorX-13723Obrazowanie pojedynczych cząsteczek
Longpass dichroiczny beamsplitterSemrockDi02-R635-25x36Obrazowanie pojedynczych cząsteczek: rozdzielacz wiązki czerwonej/dalekiej czerwieni
Jednostka laserowa LUN-FNikonObrazowanie pojedynczych cząsteczek: 405/488/561/640
Naczynie ze szklanym dnem MatTekMatTekP35G-1.5-20-CPrzygotowanie komórek do mikroskopii: 35 mm, #1,5 nasadka do hodowli komórek.
NIS-ElementsNikonObrazowanie pojedynczych cząsteczek: Oprogramowanie do akwizycji mikroskopu,
jądro i mask_v2.txtklastra Analiza danych obrazowania pojedynczych cząsteczek: Dostępne w Chong et al., 2018
Penicylina-StreptomycynaGibco15-140-122Znakowanie białek w komórkach: Zastosowane pożywki wzrostowe: DMEM z 5% płodową surowicą bydlęcą, 1% penstrep
Sól fizjologicznabuforowana fosforanemThermo Fisher Scientific18912014Znakowanie białek w komórkach
Fotoaktywowany Janelia Fluor 646 (PA-JF646)Janelia Research CampusPrzygotowanie komórek do mikroskopii
PLOT_ResidenceHist_css.mAnaliza danych obrazowania pojedynczych cząsteczek: Dostępne w Chong et al., 2018
Wodorotlenek potasuMallinckrodt Chemicals6984-06Przygotowanie szkiełka nakrywkowe
pretracking_comb.txtAnaliza danych obrazowania pojedynczych cząsteczek: Dostępne w Chong et al., 2018
SLIMfastAnaliza danych obrazowania pojedynczych cząsteczek: Dostępne w Teves et al., 2016
System inkubacji Stage-topTokai HitObrazowanie pojedynczych cząsteczek: Do obrazowania żywych komórek
Rozdzielacz obrazu z podwójną emisją TwinCamCairn ResearchObrazowanie pojedynczych cząsteczek
Myjka ultradźwiękowaBranson5800Przygotowanie szkiełek nakrywkowych
o Kampus

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chong, S., et al. Imaging dynamic and selective low-complexity domain interactions that control gene transcription. Science. 361 (6400), (2018).
  2. Chong, S., Graham, T. G. W., Dugast-Darzacq, C., Dailey, G. M., Darzacq, X., Tjian, R. Tuning levels of low-complexity domain interactions to modulate endogenous oncogenic transcription. Molecular Cell. 82 (11), 2084-2097 (2022).
  3. Boehning, M., et al. RNA polymerase II clustering through carboxy-terminal domain phase separation. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (9), 833-840 (2018).
  4. Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), New York, N.Y. (2018).
  5. Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
  6. Levone, B. R., et al. FUS-dependent liquid-liquid phase separation is important for DNA repair initiation. Journal of Cell Biology. 220 (5), e202008030(2021).
  7. Kilic, S., et al. Phase separation of 53BP1 determines liquid-like behavior of DNA repair compartments. The EMBO Journal. 38 (16), e101379(2019).
  8. Pessina, F., et al. Functional transcription promoters at DNA double-strand breaks mediate RNA-driven phase separation of damage-response factors. Nature Cell Biology. 21 (10), 1286-1299 (2019).
  9. Nozaki, T., et al. Condensed but liquid-like domain organization of active chromatin regions in living human cells. Science Advances. 9 (14), (2023).
  10. Maeshima, K., et al. Nucleosomal arrays self-assemble into supramolecular globular structures lacking 30-nm fibers. The EMBO Journal. 35 (10), 1115-1132 (2016).
  11. Strickfaden, H., Tolsma, T. O., Sharma, A., Underhill, D. A., Hansen, J. C., Hendzel, M. J. Condensed chromatin behaves like a solid on the mesoscale in vitro and in living cells. Cell. 183 (7), 1772-1784 (2020).
  12. Gibson, B. A., et al. Organization of chromatin by intrinsic and regulated phase separation. Cell. 179 (2), 470-484 (2019).
  13. Cerase, A., Armaos, A., Neumayer, C., Avner, P., Guttman, M., Tartaglia, G. G. Phase separation drives X-chromosome inactivation: a hypothesis. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (5), 331-334 (2019).
  14. Jachowicz, J. W., Strehle, M., Banerjee, A. K., Blanco, M. R., Thai, J., Guttman, M. Xist spatially amplifies SHARP/SPEN recruitment to balance chromosome-wide silencing and specificity to the X chromosome. Nature Structural & Molecular Biology. 29 (3), 239-249 (2022).
  15. Pandya-Jones, A., et al. A protein assembly mediates Xist localization and gene silencing. Nature. 587 (7832), 145-151 (2020).
  16. Du, M., Chen, Z. J. DNA-induced liquid phase condensation of cGAS activates innate immune signaling. Science. 361 (6403), 704-709 (2018).
  17. Zamudio, A. V., et al. Mediator condensates localize signaling factors to key cell identity genes. Molecular Cell. 76 (5), 753-766 (2019).
  18. Zhang, J. Z., et al. Phase separation of a PKA regulatory subunit controls cAMP compartmentation and oncogenic signaling. Cell. 182 (6), 1531-1544 (2020).
  19. Kovar, H. Dr. Jekyll and Mr. Hyde: The two faces of the FUS/EWS/TAF15 protein family. Sarcoma. 2011, e837474(2010).
  20. Linardic, C. M. PAX3-FOXO1 fusion gene in rhabdomyosarcoma. Cancer Letters. 270 (1), 10-18 (2008).
  21. Ahn, J. H., et al. Phase separation drives aberrant chromatin looping and cancer development. Nature. 595 (7868), 591-595 (2021).
  22. Wegmann, S., et al. Tau protein liquid-liquid phase separation can initiate tau aggregation. The EMBO Journal. 37 (7), e98049(2018).
  23. Friedman, M. J., et al. Polyglutamine domain modulates the TBP-TFIIB interaction: implications for its normal function and neurodegeneration. Nature Neuroscience. 10 (12), 1519-1528 (2007).
  24. Molliex, A., et al. Phase separation by low complexity domains promotes stress granule assembly and drives pathological fibrillization. Cell. 163 (1), 123-133 (2015).
  25. Murakami, T., et al. ALS/FTD mutation-induced phase transition of FUS liquid Droplets and reversible hydrogels into irreversible hydrogels impairs RNP granule function. Neuron. 88 (4), 678-690 (2015).
  26. Patel, A., et al. A liquid-to-solid phase transition of the ALS protein FUS accelerated by disease mutation. Cell. 162 (5), 1066-1077 (2015).
  27. Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
  28. Kato, M., McKnight, S. L. A solid-state conceptualization of information transfer from gene to message to protein. Annual Review of Biochemistry. 87, 351-390 (2018).
  29. Li, P., et al. Phase transitions in the assembly of multivalent signalling proteins. Nature. 483 (7389), 336-340 (2012).
  30. Muzzopappa, F., et al. Detecting and quantifying liquid-liquid phase separation in living cells by model-free calibrated half-bleaching. Nature Communications. 13 (1), 7787(2022).
  31. Sprague, B. L., Müller, F., Pego, R. L., Bungay, P. M., Stavreva, D. A., McNally, J. G. Analysis of binding at a single spatially localized cluster of binding sites by fluorescence recovery after photobleaching. Biophysical Journal. 91 (4), 1169-1191 (2006).
  32. Taylor, N. O., Wei, M. -T., Stone, H. A., Brangwynne, C. P. Quantifying dynamics in phase-separated condensates using fluorescence recovery after photobleaching. Biophysical Journal. 117 (7), 1285-1300 (2019).
  33. Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging live-cell dynamics and structure at the single-molecule level. Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
  34. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  35. Grimm, J. B., et al. A general method to improve fluorophores using deuterated auxochromes. JACS Au. 1 (5), 690-696 (2021).
  36. Grimm, J. B., et al. photoactivatable fluorophores for single-molecule imaging. Nature Methods. 13 (12), 985-988 (2016).
  37. Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics. eLife. 6, 25776(2017).
  38. Sergé, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).
  39. Normanno, D., et al. Probing the target search of DNA-binding proteins in mammalian cells using TetR as model searcher. Nature Communications. 6 (1), 7357(2015).
  40. Irgen-Gioro, S., Yoshida, S., Walling, V., Chong, S. Fixation can change the appearance of phase separation in living cells. eLife. 11, e79903(2022).
  41. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
  42. Teves, S. S., An, L., Hansen, A. S., Xie, L., Darzacq, X., Tjian, R. A dynamic mode of mitotic bookmarking by transcription factors. eLife. 5, e22280(2016).
  43. Drosopoulos, W. C., Vierra, D. A., Kenworthy, C. A., Coleman, R. A., Schildkraut, C. L. Dynamic assembly and disassembly of the human DNA polymerase δ holoenzyme on the genome In vivo. Cell Reports. 30 (5), 1329(2020).
  44. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), New York, N.Y. 819-823 (2013).
  45. Yoshida, S. R., Maity, B. K., Chong, S. Visualizing protein localizations in fixed cells: Caveats and the underlying mechanisms. The Journal of Physical Chemistry B. 127 (19), 4165-4173 (2023).
  46. Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
  47. Hipp, L., et al. Single-molecule imaging of the transcription factor SRF reveals prolonged chromatin-binding kinetics upon cell stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (3), 880-889 (2019).
  48. Agarwal, H., Reisser, M., Wortmann, C., Gebhardt, J. C. M. Direct observation of cell-cycle-dependent interactions between CTCF and chromatin. Biophysical Journal. 112 (10), 2051-2055 (2017).
  49. Chen, L., Zhang, Z., Han, Q., Maity, B. K., Rodrigues, L., Zboril, E., Adhikari, R., Ko, S. H., Li, X., Yoshida, S. R., Xue, P., Smith, E., Xu, K., Wang, Q., Huang, T. H., Chong, S., Liu, Z. Hormone-induced enhancer assembly requires an optimal level of hormone receptor multivalent interactions. Molecular cell. 83 (19), 3438-3456 (2023).
  50. Garcia, D. A., et al. Power-law behavior of transcription factor dynamics at the single-molecule level implies a continuum affinity model. Nucleic Acids Research. 49 (12), 6605-6620 (2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Single Molecule ImagingLiquid Liquid Phase SeparationIntrinsically Disordered ProteinsResidence Time MeasurementLive Cell ImagingSingle Particle TrackingHalo Tagged ProteinsProtein Condensate Binding

Powiązane artykuły