Neurony *Aplysia californica* w hodowli tworzą duże stożki wzrostu, które doskonale nadają się do obrazowania wysokiej rozdzielczości w badaniu motywności i prowadzenia stożków wzrostu. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół sekcji i wysiewu neuronów komórek torby *Aplysia* oraz przygotowania komory do obrazowania żywych komórek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Kultury komórek neuronalnych z Aplysia do obrazowania stożków wzrostu w wysokiej rozdzielczości
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Stożki wzrostu neuronów to wysoce ruchliwe struktury znajdujące się na końcach aksonów, które potrafią wykrywać sygnały kierujące w środowisku i przekształcać te informacje w ruch kierunkowy w stronę odpowiedniej komórki docelowej. Aby w pełni zrozumieć, w jaki sposób informacje kierujące są przekazywane z powierzchni komórki do leżących u jej podstaw dynamicznych sieci cytoszkieletu, niezbędny jest system modelowy odpowiedni do obrazowania na żywo dynamiki białek z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną. Typowe stożki wzrostu kręgowców są zbyt małe, aby ilościowo analizować dynamikę aktyny F i mikrotubul. Neurony z zająca morskiego Aplysia californica są 5–10 razy większe od neuronów kręgowców, można je łatwo utrzymywać w temperaturze pokojowej i są to komórki bardzo odporne na mikromanipulacje oraz pomiary biofizyczne. Ich stożki wzrostu posiadają bardzo wyraźnie zdefiniowane obszary cytoplazmatyczne i dobrze opisany system cytoszkieletu. Do ciał komórek neuronalnych można mikroiniekować różnorodne sondy służące do badania ruchliwości i kierowania stożków wzrostu. W niniejszym protokole prezentujemy procedurę wyizolowania zwoju brzusznego, hodowli neuronów komórek torbielkowatych oraz przygotowania komory obrazowania do obserwacji na żywo stożków wzrostu.
Protokół
Roztwory
- Pożywka do hodowli komórkowej L15-ASW (1 l)
- 1 woreczek proszku L15
- dodać 800 ml ultrapure H2O
- NaCl 400 mM
- MgSO4 27 mM
- MgCl2 28 mM
- L-Glutamina 4 mM
- Gentamycyna 50 µg/ml
- HEPES 5 mM
- Dostosować do pH 7,9
- Dodawać kroplami CaCl2 9,3 mM (przestrzegać, jeśli pojawią się osady)
- Dopełnić ultrapure H2O do 1 l
- Sprawdzić osmolarność (950-1000 mmol/kg) za pomocą osmometru (ciśnienia pary, Wescor # 5520)
- Przefiltrować przez filtr 0,22 µm, używając jednostki filtracji pod ciśnieniem dodatnim ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Neurony komórek torby (bag cell neurons) ślimaka Aplysia stanowią wolną od surowicy hodowlę komórek neuronalnych z bardzo niewielką liczbą komórek nieneuronalnych. Neurony te tworzą bardzo duże stożki wzrostu, które nadają się do badania szeregu istotnych zagadnień z zakresu biologii komórki. Neurony komórek torby można łatwo manipulować i obrazować w temperaturze pokojowej przez kilka godzin. Wykorzystując fluorescencyjną mikroskopię plamkową (Fluorescent Speckle Microscopy, FSM), można ilościowo analizować różne parame.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Pragniemy podziękować Ryanowi Maneriemu (Oystercatcher Productions, LLC) za nagranie naszej procedury oraz Rodneyowi McPhailowi (Department of Biological Sciences, Purdue University) za pomoc w montażu filmu z sekcji. Badania w laboratorium Suter są finansowane z grantów NIH (R01 NS049233) oraz Bindley Bioscience Center na Purdue University przyznanych dla D.M.S.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| szkiełka podstawowe #1 22x22 mm | Narzędzie | VWR international | 48366067 | |
| szkiełka podstawowe #1.5 22x22 mm | Narzędzie | Corning | 2870-22 | |
| szalki Petriego 35 mm | Narzędzie | Falcon BD | 353001 | |
| filtry do filtracji pożywki | Narzędzie | EMD Millipore | SVGV010RS | |
| smar wysokopróżniowy | Narzędzie | Dow Corning | 1597418 | |
| osmometr | Narzędzie | Wescor | 5520 | |
| podkładki plastikowe | Narzędzie | Small Parts, Inc. | SHSP-200 | |
| chlorek wapnia | Odczynnik | Fisher Scientific | C79-500 | |
| gentamicyna | Odczynnik | Invitrogen | 15750-060 | |
| HEPES | Odczynnik | Sigma-Aldrich | H4030 | |
| pożywka L15 | Odczynnik | Invitrogen | 41300-039 | |
| L-glutamina | Odczynnik | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| chlorek magnezu | Odczynnik | Mallinckrodt Baker Inc. | 5958-04 | |
| siarczan magnezu | Odczynnik | Mallinckrodt Baker Inc. | 6070-12 | |
| poli-L-lizyna (70-150 kD) | Odczynnik | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| chlorek sodu | Odczynnik | Mallinckrodt Baker Inc. | 7581 | |
| neutralna proteaza (dispaza) | Odczynnik | Worthington Biochemical | LS02111 |
Bibliografia
- Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).
- Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
