Neurony *Aplysia californica* w hodowli tworzą duże stożki wzrostu, które doskonale nadają się do obrazowania wysokiej rozdzielczości w badaniu motywności i prowadzenia stożków wzrostu. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół sekcji i wysiewu neuronów komórek torby *Aplysia* oraz przygotowania komory do obrazowania żywych komórek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Kultury komórek neuronalnych z Aplysia do obrazowania stożków wzrostu w wysokiej rozdzielczości
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Stożki wzrostu neuronów to wysoce ruchliwe struktury znajdujące się na końcach aksonów, które potrafią wykrywać sygnały kierujące w środowisku i przekształcać te informacje w ruch kierunkowy w stronę odpowiedniej komórki docelowej. Aby w pełni zrozumieć, w jaki sposób informacje kierujące są przekazywane z powierzchni komórki do leżących u jej podstaw dynamicznych sieci cytoszkieletu, niezbędny jest system modelowy odpowiedni do obrazowania na żywo dynamiki białek z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną. Typowe stożki wzrostu kręgowców są zbyt małe, aby ilościowo analizować dynamikę aktyny F i mikrotubul. Neurony z zająca morskiego Aplysia californica są 5–10 razy większe od neuronów kręgowców, można je łatwo utrzymywać w temperaturze pokojowej i są to komórki bardzo odporne na mikromanipulacje oraz pomiary biofizyczne. Ich stożki wzrostu posiadają bardzo wyraźnie zdefiniowane obszary cytoplazmatyczne i dobrze opisany system cytoszkieletu. Do ciał komórek neuronalnych można mikroiniekować różnorodne sondy służące do badania ruchliwości i kierowania stożków wzrostu. W niniejszym protokole prezentujemy procedurę wyizolowania zwoju brzusznego, hodowli neuronów komórek torbielkowatych oraz przygotowania komory obrazowania do obserwacji na żywo stożków wzrostu.
Protokół
Roztwory
- Pożywka do hodowli komórkowej L15-ASW (1 l)
- 1 woreczek proszku L15
- dodać 800 ml ultrapure H2O
- NaCl 400 mM
- MgSO4 27 mM
- MgCl2 28 mM
- L-Glutamina 4 mM
- Gentamycyna 50 µg/ml
- HEPES 5 mM
- Dostosować do pH 7,9
- Dodawać kroplami CaCl2 9,3 mM (przestrzegać, jeśli pojawią się osady)
- Dopełnić ultrapure H2O do 1 l
- Sprawdzić osmolarność (950-1000 mmol/kg) za pomocą osmometru (ciśnienia pary, Wescor # 5520)
- Przefiltrować przez filtr 0,22 µm, używając jednostki filtracji pod ciśnieniem dodatnim (Filtry: Millipore SVGV010RS)
- Przechowywać w 4°C do 1 miesiąca
- Poly-L-lizyna (70-150 kD) roztwór stokowy 200 µg/ml w sterylnej ultrapure H2O, przechowywany w -20oC
- Roztwór MgCl2 0,5 M
Dzień 1: Disekcja zwoju brzusznego Aplysia
Przygotowanie roztworu do dysocjacji enzymatycznej
- Odważyć 9-10 mg enzymu Dispase (Worthington, Cat: LS02111) do probówki Eppendorf
- Dodać 900 µl pożywki hodowlanej L15-ASW oraz 100 µl sterylnej ultraczystej wody H2O
- Wymieszać i pozostawić w temperaturze pokojowej (RT)
Disekcja zwoju brzusznego
- Napełnić strzykawkę 50 ml roztworem MgCl2 o stężeniu 0,5 M.
- Wyjąć jedno zwierzę z akwarium, obchodzić je delikatnie, aby uniknąć obronnej reakcji wydzielania atramentu.
- Położyć Aplysia na boku na podkładce do sekcji (płycie styropianowej), stroną rostralną w prawą, a stroną kaudalną w lewą.
- Wprowadzić igłę do ciała zwierzęcia tuż za głową i wstrzyknąć cały roztwór MgCl2 do jamy ciała.
- Delikatnie rozmasować zwierzę, aby rozprowadzić roztwór MgCl2 w całej jamie ciała; odczekać kilka minut do pełnego znieczulenia zwierzęcia.
- Przymocować głowę i ogon zwierzęcia do podkładki do sekcji za pomocą dwóch igieł.
- Używając pincety, unieść skórę, a następnie naciąć skórę i warstwę mięśniową dużymi nożyczkami w kierunku głowy i ogona, aby stworzyć szeroki otwór z boku ciała.
- Zlokalizować zwoj abdominalny pod szczoteczkowatym jajnikiem. Używając pincety, uchwycić nerwy łączące około 1 cm przed zwojem abdominalnym, a następnie przeciąć nerwy nożyczkami do sekcji przed miejscem uchwytu pincetą i za zwojem abdominalnym.
- Umieścić zwoj w roztworze Dispase i inkubować przez 15-16 h w temperaturze 22°C w łaźni wodnej z kontrolą temperatury.
Dzień 2: Wysiew komórek torby Aplysia
Przygotowanie szkiełek podstawowych pokrytych poli-lizyną
- W komorze z laminarnym przepływem powietrza przygotuj trzy szalki Petriego o średnicy 35 mm jako naczynia robocze do sekcji zwoju, napełniając każdą z nich 4 ml pożywki L15-ASW. Po 15,5 godzinach trawienia przenieś zwój brzuszny z roztworu dispazy do jednego z naczyń roboczych.
- Za pomocą pęsety pobierz oczyszczone kwasem szkiełka nakrywki nr 1,5 (22x22 mm) przechowywane w etanolu, usuń alkohol i wysterylizuj szkiełka, krótko opalając je nad palnikiem Bunsena. Pozostaw je na chwilę do ochłonięcia przed umieszczeniem w naczyniach hodowlanych.
- Przygotuj zakrzywioną końcówkę do nakładania, wyginając żółtą końcówkę nad palnikiem Bunsena (opalaj krótko, aby uniknąć stopienia plastiku!).
- Przygotuj odpowiednią ilość roztworu poli-lizyny o stężeniu 20 µg/ml, rozcieńczając roztwór zapasowy 200 µg/ml sterylną wodą ultrapure H2O.
- Pokryj każde szkiełko nakrywkowe 500 µl poli-lizyny (20 µg/ml) i inkubuj przez 20 min w temperaturze pokojowej (RT).
- Umyj każde szkiełko nakrywkowe 3-5 razy, używając za każdym razem 500 µl sterylnej wody ultrapure H2O.
- Usuń wodę ze szkiełek nakrywkowych; napełnij każdą szalkę 4 ml pożywki hodowlanej L15-ASW.
Dysocjacja komórek workowatych
- Pod mikroskopem sekcyjnym przeciąć zwoje brzuszne na pół, używając nożyczek sekcyjnych i pincety uprzednio oczyszczonych 95% etanolem (Rysunek 1 linia 1).
- W jednej połowie zwoju przeciąć obszar pomiędzy klastrem komórek workowatych a komórkami hemiganglionu (Rysunek 1 linia 2), a następnie odciąć pozostałe rozgałęzienia nerwowe po przeciwnej stronie komórek workowatych (Rysunek 1 linia 3). Pracować na jednej połowie zwoju na raz; drugą połowę pozostawić w naczyniu podczas wysiewania komórek z pierwszego klastra.
- Używając dwóch pincet (lub jednej pincety i nożyczek sekcyjnych), uwolnić klaster komórek workowatych, odsuwając otaczającą go osłonkę tkanki łącznej. W razie potrzeby odciąć tkankę łączną nożyczkami sekcyjnymi. Należy uważać, aby nie ściskać i nie dotykać zbyt mocno klastra komórek workowatych podczas tego procesu.
- Po usunięciu większości tkanki łącznej przenieść klaster komórek workowatych do nowego naczynia roboczego za pomocą przygotowanej wcześniej zgiętej żółtej końcówki. Należy uważać, aby klaster komórek workowatych nie został uwięziony wewnątrz żółtej końcówki ani nie przywarł do granicy fazy powietrze/medium.
- Rozbić klaster za pomocą żółtej końcówki, aby wydzielić pojedyncze komórki workowate. Należy to zrobić poprzez wielokrotne pobieranie i wypuszczanie klastra z końcówki pipety. Zacząć od niskich sił ścinających i zwiększać siłę w razie potrzeby. Zawsze stosować najniższą możliwą siłę potrzebną do uwolnienia neuronów, aby nie zniszczyć zbyt wielu komórek.
- Zebrać 3-5 zdrowych komórek workowatych i przenieść je na szkiełko nakrywkę pokrytą poli-lizyną. Unikać pobierania martwych komórek (są one czarne/przezroczyste w centrum) oraz fragmentów tkanki łącznej.
- Powtórzyć krok 6 i umieścić około 15-25 żywych neuronów w centrum każdego szkiełka nakrywki. Jeśli przeniesione zostaną również martwe komórki lub zanieczyszczenia, usunąć niepożądany materiał poprzez jego pobranie lub wydmuchanie z obszaru zdrowych komórek. Proces ten trwa około 2-3 godzin dla obu klastrów.
- Po zakończeniu pozostawić naczynia hodowlane na dygestorze przez co najmniej 2 godziny w RT, aby umożliwić adhezję komórek (wyłączyć nadmuch dygestora, aby uniknąć niepożądanych wibracji).
- Umieścić naczynia w inkubatorze w temperaturze 14°C na noc lub do czasu dalszego wykorzystania. Stożki wzrostu mogą rozwinąć się w ciągu 4-10 godzin.
Rysunek 1. Schemat zwoju brzusznego Aplysia californica. Kolorowe linie wskazują miejsca nacięć w celu wyizolowania klastrów komórek torbielowatych.
Dzień 3: Przygotowanie komory do obrazowania na żywo komórek torbielowatych Aplysia
Montaż komory obrazowania
- Przed użyciem komórek woreczkowych do eksperymentów z obrazowaniem żywych komórek, należy zbadać komórki pod mikroskopem przy małym powiększeniu. Jeśli komórki nie wykształciły zdrowych stożków wzrostu, należy podać świeżą pożywkę i pozostawić w RT na 1-2 godziny.
- Aby dostarczyć na płytki świeżą pożywkę L15-ASW, należy usunąć połowę (~2ml) starej pożywki za pomocą linii próżniowej, a następnie dodać 2 ml nowej pożywki L15-ASW na każdą płytkę Petriego. Ważne jest, aby nie usuwać całkowicie całej pożywki z płytki za jednym razem, ponieważ może to doprowadzić do oderwania komórek od szkiełka podstawowego.
- Do obrazowania komórek woreczkowych montujemy dwa szkiełka podstawowe i dwa plastikowe dystansery w komorze obrazującej o budowie kanapkowej. Górne szkiełko w kanapce jest przycinane do krótszego rozmiaru, aby umożliwić łatką wymianę pożywki i odczynników. Podczas montażu szkiełka z przytwierdzonymi komórkami woreczkowymi powinny być przez cały czas zanurzone w pożywce L15-ASW, aby zapobiec odrywaniu się komórek.
- Aby przygotować komorę, należy odciąć ~2mm z prawej strony szkiełka podstawowego nr 1 o wymiarach 22x22 mm za pomocą rysika diamentowego (noża do szkła) i linijki.
- Używając strzykawki 1 ml, należy nanieść wysokopróżniowy smar na dwie strony krótszego szkiełka i przymocować plastikowe dystansery po każdej stronie. Nanieść smar próżniowy na górną część obu dystanserów.
- Odwrócić zestaw szkiełka i dystanserów, a następnie umieścić go w płytce Petriego zawierającej komórki woreczkowe na szkiełku podstawowym. Wyrównać i delikatnie docisnąć, aby przykleić górne szkiełko do dolnego, używając do tego końcówki dwóch patyczków higienicznych.
- Używając pęsety, należy delikatnie podnieść zestaw kanapkowy z płytki Petriego, uważając, aby pożywka nie wyciekła. W razie potrzeby wyrównać oba szkiełka i wytrzeć nadmiar pożywki chusteczką Kimwipe. Umieścić kanapkę w dolnej części uchwytu do preparatów mikroskopowych i ostrożnie przymocować pokrywę za pomocą klipsów.
- Oczyścić środek górnej strony kanapki patyczkami higienicznymi zwilżonymi środkiem do mycia szyb (jako środek do mycia szyb stosowany jest Sparkle). Szybko osuszyć powierzchnię drugim, suchym patyczkiem, aby uniknąć smug. Postąpić tak samo z dolnym szkiełkiem. Czyste szkiełka, wolne od smug, są kluczowe dla uzyskania wysokiej jakości obrazowania.
Przygotowanie komórek w woreczku pod mikroskopem
Ponieważ hodowle neuronalne komórek torby Aplysia mają niską gęstość, najlepiej, aby konfiguracja mikroskopu posiadała funkcje pozycjonowania stolika, co ułatwia przełączanie się między komórkami. Komórki torby można bez problemu przechowywać w temperaturze RT przez kilka godzin na stoliku podczas eksperymentów obrazowania. Okresowo wymieniaj medium, aby zapobiec parowaniu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Neurony komórek torby (bag cell neurons) ślimaka Aplysia stanowią wolną od surowicy hodowlę komórek neuronalnych z bardzo niewielką liczbą komórek nieneuronalnych. Neurony te tworzą bardzo duże stożki wzrostu, które nadają się do badania szeregu istotnych zagadnień z zakresu biologii komórki. Neurony komórek torby można łatwo manipulować i obrazować w temperaturze pokojowej przez kilka godzin. Wykorzystując fluorescencyjną mikroskopię plamkową (Fluorescent Speckle Microscopy, FSM), można ilościowo analizować różne parame...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Pragniemy podziękować Ryanowi Maneriemu (Oystercatcher Productions, LLC) za nagranie naszej procedury oraz Rodneyowi McPhailowi (Department of Biological Sciences, Purdue University) za pomoc w montażu filmu z sekcji. Badania w laboratorium Suter są finansowane z grantów NIH (R01 NS049233) oraz Bindley Bioscience Center na Purdue University przyznanych dla D.M.S.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| szkiełka podstawowe #1 22x22 mm | Narzędzie | VWR international | 48366067 | |
| szkiełka podstawowe #1.5 22x22 mm | Narzędzie | Corning | 2870-22 | |
| szalki Petriego 35 mm | Narzędzie | Falcon BD | 353001 | |
| filtry do filtracji pożywki | Narzędzie | EMD Millipore | SVGV010RS | |
| smar wysokopróżniowy | Narzędzie | Dow Corning | 1597418 | |
| osmometr | Narzędzie | Wescor | 5520 | |
| podkładki plastikowe | Narzędzie | Small Parts, Inc. | SHSP-200 | |
| chlorek wapnia | Odczynnik | Fisher Scientific | C79-500 | |
| gentamicyna | Odczynnik | Invitrogen | 15750-060 | |
| HEPES | Odczynnik | Sigma-Aldrich | H4030 | |
| pożywka L15 | Odczynnik | Invitrogen | 41300-039 | |
| L-glutamina | Odczynnik | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| chlorek magnezu | Odczynnik | Mallinckrodt Baker Inc. | 5958-04 | |
| siarczan magnezu | Odczynnik | Mallinckrodt Baker Inc. | 6070-12 | |
| poli-L-lizyna (70-150 kD) | Odczynnik | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| chlorek sodu | Odczynnik | Mallinckrodt Baker Inc. | 7581 | |
| neutralna proteaza (dispaza) | Odczynnik | Worthington Biochemical | LS02111 |
Bibliografia
- Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).
- Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling. J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).
- Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones. J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).
- Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering. Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
