Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hodowla laboratoryjna i terenowa larw skałoczepa pantofelkowego, Crepidula fornicata

1.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66208

⸱

5 stycznia 2024

1Department of Biology, Dickinson College

W tym artykule

Podsumowanie

Artykuł przedstawia metody hodowli larw ślimaka Crepidula fornicata w systemie laboratoryjnym o małej objętości oraz w systemie mezokosmosu z otaczającą wodą morską, który może być stosowany w terenie.

Streszczenie

Ślimak ślimakowaty z rodziny calyptraeidae, Crepidula fornicata, był szeroko stosowany do badań nad biologią, fizjologią i ekologią rozwoju larw. Wysiadłe larwy veligera tego gatunku zbierano przez zasysanie na sito po naturalnym uwolnieniu przez dorosłe osobniki, rozprowadzano do kultury w gęstości 200/l i karmiono Isochrysis galbana (szczep T-ISO) w ilości 1 x 10,5 komórek/ml. Wzrost skorupy i nabywanie kompetencji do metamorfozy udokumentowano u larw rodzeństwa hodowanych w wentylowanych kulturach o pojemności 800 ml zaprojektowanych do równoważenia z otaczającym powietrzem lub określonymi mieszaninami gazów atmosferycznych. W przeciwieństwie do tych warunków hodowli laboratoryjnej; Zebrano również dane dotyczące wzrostu i kompetencji larw hodowanych w 15-litrowym mezokosmosie przepływowej wody morskiej, znajdującym się w polowej populacji dorosłych osobników rozrodczych. Tempo wzrostu i czas trwania kompetencji metamorficznej w kulturach laboratoryjnych były podobne do tych zgłoszonych we wcześniej opublikowanych badaniach. Larwy hodowane w mezokosmosie polowym rosły znacznie szybciej i ulegały metamorfozie szybciej niż podano w jakichkolwiek badaniach laboratoryjnych. Łącznie metody te nadają się do badania rozwoju larw w określonych kontrolowanych warunkach w laboratorium, jak również w naturalnie występujących warunkach w terenie.

Wprowadzenie

Skałoczep pantofelkowy, Crepidula fornicata (Gastropoda: Calyptraeidae), jest dobrze reprezentowany w obecnej i historycznej literaturze badawczej ze względu na jego użyteczność jako modelu rozwojowego i ze względu na jego powszechne oddziaływanie jako gatunek inwazyjny. Posłużył jako fundamentalny przykład rozwoju spiralnego w klasycznej erze embriologii eksperymentalnej1 i doświadczył odrodzenia zainteresowania dzięki zastosowaniu nowoczesnych narzędzi obrazowania i genomiki do analizy mechanizmów wczesnego rozwoju lophotrochozoa2,3. Z drugiej strony, inne badania koncentrowały się na wpływie dorosłych populacji tego inżyniera ekosystemu w umiarkowanych przybrzeżnych środowiskach morskich, dalekich od jego pierwotnego rozmieszczenia we wschodniej Ameryce Północnej4,5. Pomiędzy zarodkiem a osobnikiem dorosłym, larwy welierów tego gatunku były przedmiotem licznych badań nad rozwojem larw i ekologią, zwłaszcza nad czynnikami wpływającymi na wzrost i nabywanie kompetencji do metamorfozy, wewnętrznymi i zewnętrznymi sygnałami pośredniczącymi w osiedlaniu się larw oraz wpływem doświadczeń larwalnych na wydajność młodocianych6,7,8,9,10,11. Ostatnie badania wykazały odporność larw i osobników młodocianych C. fornicata na zakwaszenie oceanów, co jest kolejnym sposobem na produktywne wykorzystanie tego zwierzęcia w badaniach12,13,14,15,16.

Zaletą C. fornicata do badań biologii larw morskich jest to, że jest stosunkowo łatwa do uprawy w laboratorium w naturalnej lub sztucznej wodzie morskiej na diecie jednoglonowej wiciowców Isochrysis galbana. Metody hodowli zostały szczegółowo opisane przez autora we wcześniejszej publikacji drukowanej poświęconej metodom17. Powody niniejszego wkładu są dwojakie. Po pierwsze, rutynowe manewry fizyczne związane z zakładaniem i pielęgnacją kultur są koncepcyjnie bardzo proste, ale trudne do prawidłowego wykonania bez praktycznej demonstracji lub demonstracji wideo. Po drugie, opisano dwie odmiany wcześniej opisanych metod hodowli, które są szczególnie przydatne w badaniach laboratoryjnych i terenowych reakcji na stresory środowiskowe, takie jak zakwaszenie oceanów, eutrofizacja i wyczerpanie tlenu. Pierwszym z nich jest system hodowli o małej objętości (800 ml) przystosowany do manipulowania pH i rozpuszczonym tlenem w wodzie morskiej za pomocą małych objętości pęcherzykowych gazów, a drugi to system mezokosmiczny o większej objętości (15 l), który można umieścić w terenie i który umożliwia swobodną wymianę otaczającej wody morskiej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Rutynowe manewry tworzenia i utrzymywania kultur larwalnych C. fornicata

UWAGA: Ta metoda zaczyna się od galonowego (3,8 L) słoika wody morskiej zawierającego dorosłe C. fornicata, które właśnie wypuściły wysiadłe larwy veligera. Dorosłe osobniki mogą być zbierane w terenie lub pozyskiwane od dostawcy podanego w Tabeli Materiałów. Dorosłe osobniki są protandroycznymi hermafrodytami, które żyją w stosach godowych z siedzącymi samicami wysiadującymi na dole stosu. Nie rozbijaj stosów dla dorosłych. Sezonowość rozmnażania i metody warunkowania dorosłych osobników do tarła poza sezonem zostały już wcześniej opisane17. Larwy najlepiej zbierać w ciągu 2-3 godzin po uwolnieniu, gdy są silnie geoujemne i koncentrują się w pobliżu powierzchni słoika.

  1. Zrób sitko, odcinając dno jednorazowej plastikowej zlewki o pojemności 400 ml i przyklejając panel z nylonowej siatki o grubości 236 μm. W tym celu, a zwłaszcza do budowy mezokosmosu (poniżej), należy użyć kleju topliwego, który został opracowany z myślą o dobrej przyczepności do polietylenu.
  2. Usuń napowietrzenie z dorosłego słoika i odstaw na 15-20 minut, aby zanieczyszczenia osiadły, a larwy mogły łatwo wypłynąć na powierzchnię.
  3. Przesączyć larwy przez krótki (15-20 cm) szklany rurkę o średnicy 5 mm przymocowaną do końca rurki akwariowej z miękkiego tworzywa sztucznego o długości 60-80 cm do sita przygotowanego w sposób opisany powyżej, zawieszonego w szklanej zlewce o pojemności 600 ml w taki sposób, aby nadmiar wody morskiej przelewał się przez szklaną zlewkę, podczas gdy larwy były zatrzymywane na sicie. Trzymaj dno sita pod wodą i unikaj pozostawiania larw na mieliźnie.
  4. Na krótko wyjmij sito ze zlewki i użyj butelki z filtrowaną wodą morską (FSW), aby spłukać larwy do szklanej miski FSW o wygodnym rozmiarze do manipulowania pod mikroskopem preparacyjnym o małej mocy.
    UWAGA: Larwy C. fornicata rozwijają się w przefiltrowanej naturalnej wodzie morskiej o zasoleniu zbliżonym do 30 ppt lub sztucznej wodzie morskiej Instant Ocean o zasoleniu do 32 ppt., w temperaturze 20-25 °C17,18. Filtracja na < 1 μm jest wystarczająca do wyeliminowania zanieczyszczających protistów epizootycznych, które mogą powodować problemy w hodowlach laboratoryjnych.
  5. Ręcznie przenieś i policz żądaną liczbę larw do słoika hodowlanego za pomocą pipety Pasteura. Aby uzyskać najlepsze wyniki, użyj 1 larwy/5 ml objętości kultury dla C. fornicata. Policz larwy i unikaj pokusy szacowania liczby.
  6. Nakarm larwy pożądaną dawką mikroalg po rozpoczęciu hodowli i co drugi dzień wymieniaj mikroalgi po wymianie wody hodowlanej.
    UWAGA: Dieta składająca się z 1 x 105 komórek/ml Isochrysis galbana (szczep T-ISO) jest dobrą standardową dietą, która zapewnia prawie maksymalne tempo wzrostu laboratoryjnego. Racja pokarmowa i metody hodowli T-ISO są podane we wcześniejszej publikacji17.
  7. Zmieniaj wodę z kultury co drugi dzień, wlewając zawartość kultury na sito w zlewce, jak w kroku 1.3 powyżej. Wyjmij sito i użyj butelki ze spryskiwaczem FSW, aby wypłukać larwy do słoika z kulturami świeżych FSW z nowym pokarmem.
    UWAGA: Najlepszą praktyką jest segregacja wszelkich naczyń szklanych używanych do hodowli larw i unikanie kontaktu tych naczyń szklanych z utrwalaczami, rozpuszczalnymi solami metali ciężkich lub detergentami. Rutynowe czyszczenie najlepiej wykonywać za pomocą pasty z sody oczyszczonej (NaHCO3) i nylonowej gąbki do szorowania, natomiast osady mineralne można usunąć łagodnym kwasem w białym occie lub rozcieńczonym HCl.

2. Budowa wentylowanych kultur dla larw C. fornicata

UWAGA: Zalecany szklany słoik (Tabela Materiałów) ma pokrywkę z polipropylenu, która jest obojętna na wodę morską i ma odpowiednią grubość do mocowania wlotów rurek dla wentylacji strumienia gazu.

  1. Wywierć dwa otwory o średnicy 5 mm w pokrywce każdego słoika z kulturą (w tym wewnętrzną wkładkę pokrywki), każdy około 1.5 cm od krawędzi i naprzeciwko siebie. (Wiertło 13/64 cala calowe calowe lub #7 ASME standardowe wiertło dla mechaników również wykona odpowiedni otwór prześwitowy).
  2. Zamontuj adapter rurki nylonowej z gwintem 1/8 cala x 10-32 w każdym otworze, używając nylonowej nakrętki 10-32, z zasuwą rurki na zewnętrznej powierzchni pokrywy.
  3. Nałóż odrobinę uszczelniacza akwariowego z kauczuku silikonowego na otwór gwintowanej wewnętrznej części jednego z adapterów rurki i wepchnij rurkę polietylenową o długości 20 cm (średnica zewnętrzna) przez otwór od wewnątrz, tak aby wystawała kilka mm poza zewnętrzny otwór króćca rurki.
  4. Rurka będzie teraz miała małą zatyczkę uszczelniacza akwariowego na końcu, która wystaje przez zadzior rurki, ale przezroczysta rurka będzie widoczna tuż za końcem zadzioru. Poczekaj, aż szczeliwo utwardzi się, a następnie przytnij wystający koniec rurki polietylenowej tak, aby zrównał się z końcem zadzioru rurki.
  5. Napełnij słoik hodowlany FSW z dokładnością do 1 cm od ramienia w górnej części słoika, przykręć pokrywkę i podłącz dopływ powietrza wentylacyjnego lub eksperymentalnej mieszanki gazów do króćca, w którym znajduje się rurka wentylacyjna z polietylenu. Przytnij długość rurki wentylacyjnej tak, aby jej koniec leżał starannie na dnie słoika.
  6. Dostosuj przepływ powietrza wentylacyjnego lub mieszanki gazów, aby uzyskać powolny strumień pęcherzyków (Rysunek 1). Użyj pompy powietrza do akwarium ze zwykłymi zaworami zespołu akwariowego, aby zapewnić wentylację powietrzem otoczenia lub użyj regulatorów przepływu masowego dla innych eksperymentalnych mieszanek gazów atmosferycznych14.

3. Budowa polowej kultury mezokosmicznej dla larw C. fornicata

  1. Wytnij 4 równomiernie rozmieszczone prostokątne otwory, każdy o wymiarach 25 cm x 14.5 cm, po bokach standardowego wiadra z polietylenu o pojemności 7 galonów. Umieść dno każdego otworu około 3,5 cm od wewnętrznego dna wiadra (Rysunek 2A). Do tego celu idealnie nadaje się ręczna elektryczna piła szablasta z ostrzem o drobnych zębach. Zachowaj wycięte kawałki odpadów i pokrój je wzdłuż na paski o szerokości 2 cm za pomocą piły stołowej.
  2. Wytnij 4 panele z siatki nylonowej 236 μm, każdy o wymiarach co najmniej 30 cm x 20 cm, tak aby wygodnie zachodziły na siebie (o co najmniej 2 cm) wycięte otwory w wiadrze. Tymczasowo zabezpiecz jedną krawędź panelu siatkowego nad długą krawędzią jego wycięcia za pomocą małych sprężyn clamps lub spinacze do bielizny.
  3. Przyklej krawędź panelu siatkowego do otworu wiadra za pomocą kleju topliwego, który jest przeznaczony do polietylenu. Po zamocowaniu pierwszej krawędzi przyklej pozostałe krawędzie, utrzymując napięcie, aby uzyskać napiętą powierzchnię na panelu z siatki.
  4. Przytnij długości pasków kawałków odpadów z wiadra z kroku 3.1, aby utworzyć paski wzmacniające, które starannie pokryją klejony obszar, w którym panele siatkowe zachodzą na otwory wiadra. Dociśnij każdy pasek zakrywający na miejsce dużą ilością kleju topliwego, pracując szybko, aby każdy pasek znalazł się na miejscu, zanim klej stwardnieje.
  5. Zabezpiecz koniec każdego paska nylonowym nitem zrywalnym zainstalowanym na zewnątrz wiadra. Nadmiar kleju i siatki odciąć od zewnętrznych krawędzi pasków wzmacniających za pomocą noża do golenia.
    UWAGA: Każdy nit wymaga otworu prowadzącego 15/64 cala. Wewnętrzne (ślepe) części nitów widoczne są po wewnętrznej stronie gotowego mezokosmosu w Rysunek 2B.
  6. Rozmieść mezokosmos w pływającym stojaku, który utrzymuje górną część wiadra wysoko nad wodą (Rysunek 2C). Pływający stojak, który jest pokazany, jest wykonany z 30-centymetrowych segmentów 2-calowej rury PVC Schedule 40, zacementowanych razem za pomocą kolanek i trójników, aby stworzyć hermetyczną konstrukcję, która może pomieścić rząd 4 replikujących się mezokosmosów.
  7. W zależności od lokalnych warunków, panele siatkowe mogą ulec zanieczyszczeniu w ciągu 1-2 dni, w sposób utrudniający wymianę wody morskiej przez mezokosmos. W takim stopniu, w jakim tak się stanie, przenieś larwy do świeżego, czystego mezokosmosu, wyciągając zanieczyszczony mezokosmos w 2/3z wody i wielokrotnie zanurzając się z jego dna w świeżym mezokosmosie za pomocą dzbanka o pojemności 2 litrów.
  8. Wykonaj 20-25 iteracji, aby przenieść większość larw lub do momentu, gdy larwy przestaną być obserwowane w zanieczyszczonym mezokosmosie. Oczyść zanieczyszczony mezokosmos, delikatnie szorując panele siatkowe miękką gąbką wypełnioną pastą z sody oczyszczonej (NaHCO3) i spłucz wodą z kranu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wzrost larw oraz nabycie zdolności do metamorfozy mierzono w 4 równoległych powtórzeniach w 800 ml napowietrzanych kultur, z których każda zawierała 160 larw pochodzących z tej samej partii rodzeństwa, które wykluły się z jednej masy jaj i były karmione Isochrysis galbana przy gęstości 1 x 105 komórek/ml. pH wynosiło 7,9–8,0, a temperatura 20–21 °C, a zasolenie wynosiło 30-31 ppt. Wzrost i przeobrażenie określono również na innej partii rodzeństwa larw w pojedynczej próbie w mezokosmosie o pojemności ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Chociaż larwy C. fornicata są stosunkowo łatwe do hodowli w porównaniu z innymi planktotroficznymi larwami morskimi, zwrócenie uwagi na podstawy dobrej praktyki hodowlanej jest nadal niezbędne17,19. Zdrowe larwy powinny zacząć żerować natychmiast po wykluciu. Można to łatwo zweryfikować następnego dnia po wykluciu, obserwując ich pełne jelita, wypełnione komórkami glonów, za pomocą mikroskopu preparacyjnego z transillumination. Skorupy zdrowych larw powi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie ma żadnych konfliktów interesów, które należy zgłaszać.

Podziękowania

Początkowy rozwój systemu hodowli wentylowanej o małej objętości był częściowo wspierany przez National Science Foundation (CRI-OA-1416690 dla Dickinson College). Dr Lauren Mullineaux uprzejmie udostępniła zaplecze laboratoryjne w Instytucie Oceanograficznym Woods Hole, gdzie zebrano dane przedstawione dla tego systemu (Rysunek 4).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wiadro, polietylen, 7 galonówUS Plastic16916do mezokosmosu
Crepidula fornicataMorskie Laboratorium Biologiczne, Centrum Zasobów Morskich760dorosłych stad lęgowych
Klej topliwy, Infinity Supertac 500Hotmelt.comINFINITY IM-SUPERTAC-500-12-1LBdobry do klejenia polietylenu
Słoik, szkło, 32 uncje, z polipropylenową pokrywkąUlineS-19316P-Wdo kultur wentylowanych 800 ml
Nitex siatka, 236 i mikro; mDynamic Aqua Supply Sp. z o.o.NTX236-136dla mezokosmosu
Nakrętka, sześciokątna, nylonowa, gwint 10-32Home Depot1004554441do mocowania zadziorów rurek
Nity nylonowe, zrywalne, średnica 15/64", zakres uchwytu 5/32"-5/16", zestaw 8sztuk części samochodowych NAPABK 66528444 opakowania potrzebne na mezokosmos
Zadzior rurki gwint 1/8" x 10-32Plastic655932 potrzebne na słoik
kulturowyRurka, polietylen, średnica zewnętrzna 2,08 mmFisher Scientific14-170-11Gdo wentylacji strumienia gazu wewnątrz słoika hodowlanego
Rurka, Tygon, 1/8"x3/16"x1/32"US Plastic57810pasuje do zadziorów do wentylacji kultur
US

Bibliografia

  1. Conklin, E. G. The embryology of Crepidula: a contribution to the cell lineage and early development of some marine gastropods. Gasteropods. , (1897).
  2. Henry, J. J., Collin, R., Perry, K. J. The slipper snail, Crepidula: an emerging lophotrochozoan model system. Biol Bull. 218 (3), 211-229 (2010).
  3. Lyons, D. C., Henry, J. Q. Slipper snail tales: how Crepidula fornicata and Crepidula atrasolea became model molluscs. Curr Top Dev Biol. 147, 375-399 (2022).
  4. Blanchard, M. Spread of the slipper limpet Crepidula fornicata (L. 1758) in Europe. Current state and consequences. ScientiaMarina. 61 (Suppl 2), 109-118 (1997).
  5. Beninger, P., Valdizan, A., Decottigies, P., Cognie, B. Field reproductive dynamics of the invasive slipper limpet, Crepidula fornicata. J Exp Mar Biol Ecol. 390 (2), 179-187 (2010).
  6. Pechenik, J. A. The relationship between temperature, growth rate, and duration of planktonic life for larvae of the gastropod Crepidula fornicata (L.). J Exp Mar Biol Ecol. 74 (3), 241-257 (1984).
  7. Pechenik, J. A. Latent effects: surprising consequences of embryonic and larval experience on life after metamorphosis. Evol Ecol Marine Invertebrate Larvae. , 208-225 (2018).
  8. Pechenik, J. A., Gee, C. C. Onset of metamorphic competence in larvae of the gastropod Crepidula fornicata (L.), judged by a natural and an artificial cue. J Exp Mar Biol Ecol. 167 (1), 59-72 (1993).
  9. Taris, M., Comtet, T., Viard, F. Inhibitory function of nitric oxide on the onset of metamorphosis in competent larvae of Crepidula fornicata: A transcriptional perspective. Mar Genomics. 2 (3-4), 161-167 (2009).
  10. Penniman, J. R., Doll, M. K., Pires, A. Neural correlates of settlement in veliger larvae of the gastropod, Crepidula fornicata. Invertebrate Biol. 132 (1), 14-26 (2013).
  11. Meyer-Kaiser, K. S. Carryover effects of brooding conditions on larvae in the slipper limpet Crepidula fornicata. Mar Ecol Prog Ser. 643, 87-97 (2020).
  12. Noisette, F., et al. Does encapsulation protect embryos from the effects of ocean acidification? The example of Crepidula fornicata. PLoS One. 9 (3), e93021(2014).
  13. Kriefall, N. G., Pechenik, J. A., Pires, A., Davies, S. W. Resilience of Atlantic slippersnail Crepidula fornicata larvae in the face of severe coastal acidification. Front in Mar Sci. 5, 312(2018).
  14. Bogan, S. N., McMahon, J. B., Pechenik, J. A., Pires, A. Legacy of multiple stressors: Responses of gastropod larvae and juveniles to ocean acidification and nutrition. Biol Bull. 236 (3), 159-173 (2019).
  15. Pechenik, J. A., et al. Impact of ocean acidification on growth, onset of competence, and perception of cues for metamorphosis in larvae of the slippershell snail, Crepidula fornicata. Mar Biol. 166, 128(2019).
  16. Reyes, C. L., et al. The marine gastropod Crepidula fornicata remains resilient to ocean acidification across two life history stages. Front Physiol. 12, 702864(2021).
  17. Pires, A. Artificial seawater culture of the gastropod Crepidula fornicata for studies of larval settlement and metamorphosis. In: Carroll, D., Stricker, S. (eds) Developmental biology of the sea urchin and other marine invertebrates. Methods Mol Biol. 1128, 35-44 (2014).
  18. Bashevkin, S. M., Pechenik, J. A. The interactive influence of temperature and salinity on larval and juvenile growth in the gastropod Crepidula fornicata (L.). J Exp Mar Biol Ecol. 470, 78-91 (2015).
  19. Strathmann, M. F. Reproduction and Development of Marine Invertebrates of the Northern Pacific Coast: Data and Methods for the Study of Eggs, Embryos, and Larvae. , University of Washington Press. (1987).
  20. Clark, H. R., Gobler, C. J. Diurnal fluctuations in CO2 and dissolved oxygen concentrations do not provide a refuge from hypoxia and acidification for early-life-stage bivalves. Mar Ecol Prog Ser. 558, 43114(2016).
  21. Gobler, C. J., Baumann, H. Hypoxia and acidification in ocean ecosystems: coupled dynamics and effects on marine life. Biol Lett. 12 (5), 20150976(2016).
  22. Pechenik, J. A., Hilbish, T. J., Eyster, L. S., Marshall, D. Relationship between larval and juvenile growth rates in two marine gastropods, Crepidula plana and C. fornicata. Mar Biol. 125, 119-127 (1996).
  23. Padilla, D. K., McCann, M. J., McCarty Glenn, M., Hooks, A. P., Shumway, S. E. Effect of food on metamorphic competence in the model system Crepidula fornicata. Biol Bull. 227 (3), 242-251 (2014).
  24. Wallace, R. B., Baumann, H., Grear, J. S., Aller, R. C., Gobler, C. J. Coastal ocean acidification: the other eutrophication problem. Estuarine, Coast Shelf Sci. 148, 1-13 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Larwy Crepidula fornicatahodowla larwmezokosmos laboratoryjnyrozwój larwalnykompetencja metamorficznawzrost muszlifiltrowana woda morskakarmienie mikroalgamimezokosmos polowyosiadanie larw
Hodowla laboratoryjna i terenowa larw skałoczepa pantofelkowego, Crepidula fornicata
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.