Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Monitorowanie stężenia glukozy we krwi u potomstwa myszy po docytoplazmatycznym wstrzyknięciu plemnika

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66212

⸱

17 maja 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shanghai-MOST Key Laboratory of Health and Disease Genomics, 2NHC Key Lab of Reproduction Regulation, 3Shanghai Institute for Biomedical and Pharmaceutical Technologies, 4International Peace Maternity and Child Health Hospital, 5School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 6Shanghai Key Laboratory of Embryo Original Diseases

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do ustanowienia mysiego modelu docytoplazmatycznego wstrzykiwania plemnika (ICSI) i transferu zarodków (ET), co pozwala nam obserwować związane z wiekiem zmiany w metabolizmie glukozy, które mogą być przypisane ICSI, dostarczając wglądu w jego potencjalny długoterminowy wpływ na rozwój człowieka.

Streszczenie

Długość życia człowieka jest znacznie długa, podczas gdy modele mysie mogą symulować całe życie człowieka w stosunkowo krótkim okresie, przy czym jeden rok życia myszy odpowiada mniej więcej 40 ludzkim latom. Docytoplazmatyczne wstrzyknięcie plemnika (ICSI) jest powszechnie stosowaną techniką wspomaganego rozrodu w praktyce klinicznej. Jednak biorąc pod uwagę jej stosunkowo niedawne pojawienie się około 30 lat temu, długoterminowy wpływ tej techniki na rozwój człowieka pozostaje niejasny. W tym badaniu ustaliliśmy metodę ICSI połączoną z transferem zarodków (ET) przy użyciu modelu mysiego. Wyniki wykazały, że normalne plemniki myszy, po przejściu hodowli in vitro, a następnie ICSI, wykazywały wskaźnik zapłodnienia 89,57% i wskaźnik dwukomórkowy 87,38%. Po ET wskaźnik urodzeń potomstwa wynosił około 42,50%. Ponadto wraz z wiekiem myszy obserwowano wahania poziomu metabolizmu glukozy, co może być związane z zastosowaniem techniki ICSI. Odkrycia te oznaczają, że mysia technika ICSI-ET stanowi cenną platformę do oceny wpływu nieprawidłowości plemników na rozwój zarodka i ich długoterminowego wpływu na zdrowie potomstwa, w szczególności w odniesieniu do metabolizmu glukozy. Badanie to dostarcza ważnych informacji dla dalszych badań nad potencjalnym wpływem techniki ICSI na rozwój człowieka, podkreślając konieczność dogłębnego zbadania długoterminowych implikacji tej technologii.

Wprowadzenie

Problemy z płodnością stały się głównym przedmiotem zainteresowania medycznego i socjologicznego, szczególnie w nowoczesnym społeczeństwie, gdzie spadające wskaźniki dzietności oraz rosnące nasilenie niepłodności i nasilenie urosły do rangi uwydatnienia. Technologia wspomaganego rozrodu (ART) zapewnia szeroki wachlarz możliwości radzenia sobie z tymi wyzwaniami, przy czym docytoplazmatyczne wstrzyknięcie plemnika (ICSI) jest powszechnie stosowane jako interwencja terapeutyczna.

Od 1992 roku, kiedy to w Palermo odnotowano pierwszą udaną ciążę uzyskaną dzięki docytoplazmatycznemu wstrzyknięciu plemnika (ICSI), ICSI stało się kluczową techniką w Technikach Wspomaganego Rozrodu (ART)1. Biorąc jednak pod uwagę, że ICSI jest stosowany w warunkach klinicznych dopiero od 30 lat, co jest stosunkowo krótkim okresem w porównaniu z długością życia człowieka, długoterminowe skutki ICSI, zwłaszcza na rozwój potomstwa, nie zostały dokładnie zbadane i wyjaśnione. Obecnie myszy charakteryzujące się jednolitym tłem genetycznym i krótszą długością życia stały się szeroko stosowanym modelem alternatywnym w badaniach medycznych. Co więcej, model mysi może podsumować całą długość życia człowieka w skompresowanych ramach czasowych, gdzie jeden rok u myszy odpowiada w przybliżeniu 40 latom u ludzi2.

W ciągu ostatniej dekady, kilka badań na małą skalę wykazało, że osoby poczęte za pomocą ICSI mogą być narażone na zwiększone ryzyko rozwoju zespołów metabolicznych, takich jak nieprawidłowy poziom cukru we krwi, w późniejszym życiu3,4. Chociaż dowody nie są ostateczne, odkrycie to wzbudziło jednak poważne obawy w społeczności naukowej dotyczące długoterminowych skutków zdrowotnych ICSI. Sytuacja ta podkreśla pilną potrzebę bardziej rygorystycznych ocen ART i jej długoterminowych konsekwencji zdrowotnych. Szczególnie w świetle ograniczeń i względów etycznych związanych z badaniami na ludziach, opracowanie modeli zwierzęcych, które mogą precyzyjnie odtworzyć rozwój ludzkiego potomstwa po ICSI, staje się coraz bardziej istotne. W tym kontekście, mysi model ICSI-ET (Intracytoplasmic Sperm Injection-Embryo Transfer), ze względu na swoją zdolność do naśladowania ludzkiego ICSI i ułatwiania długoterminowego monitorowania wyników zdrowotnych potomstwa, stał się skutecznym narzędziem do oceny potencjalnych zagrożeń dla zdrowia związanych z technologią ICSI dla potomstwa5.

To badanie ma na celu zbadanie wpływu technologii ICSI-ET na dominujący fenotyp metaboliczny, a mianowicie zdrowie metaboliczne glukozy u potomstwa, poprzez zastosowanie losowego monitorowania poziomu glukozy, badania poziomu glukozy na czczo i testów tolerancji glukozy w celu oceny stanu metabolicznego glukozy u myszy. Wyrywkowe monitorowanie stężenia glukozy we krwi służy do uchwycenia naturalnych wahań metabolizmu glukozy podczas normalnych czynności fizjologicznych, podczas gdy testy stężenia glukozy we krwi na czczo i tolerancji glukozy są stosowane do oceny potencjalnych stanów przedcukrzycowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół ICSI-ET opisany poniżej jest zgodny z wytycznymi i został zatwierdzony przez Przegląd Etyki Zwierząt Instytutu Badań Planned Parenthood w Szanghaju. Procedury bezpieczeństwa: Zawsze noś odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) podczas pracy z chemikaliami lub materiałami biologicznymi. Korzystanie z okapów: Wszystkie procedury związane z lotnymi chemikaliami lub wytwarzaniem aerozoli należy wykonywać w certyfikowanym dygestorium lub komorze bezpieczeństwa biologicznego. Do procedury superowulacji należy użyć samic myszy (6-8 tygodniowy szczep B6D2F1).

1. ICSI u myszy

  1. Superowulacja myszy
    1. Należy podać dootrzewnowe wstrzyknięcie gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG) w dawce 7,5 j.m. na mysz około godziny 20:00 pierwszego dnia.
    2. Należy podać dootrzewnowe wstrzyknięcie ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (HCG) w dawce 7,5 j.m. na mysz około godziny 20:00 (48 godzin po wstrzyknięciu PMSG) trzeciego dnia.
  2. Przygotować pożywkę HTF do 1 ml podwielokrotności i pozostawić je odkryte do zrównoważenia przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w tym samym dniu po wstrzyknięciu HCG samicom myszy.
  3. Przygotowanie kropelek zapłodnienia ICSI
    1. Tego samego dnia, w którym wstrzyknięto HCG samicom myszy, podziel pokrywkę naczynia do hodowli komórkowych o wymiarach 50 x 9 mm na górną i dolną połowę. Użyj górnej połowy, aby utworzyć 4-6 kropelek po 5 μl każda, używając 10% poliwinylopirolidonu (PVP) do umieszczenia nasienia. Użyj dolnej połowy, aby utworzyć 8-10 kropel po 5 μl każda, używając pożywki M2 do procedury ICSI.
    2. Przykryj kropelki pożywki PVP i M2 około 3 ml oleju mineralnego (Rysunek 1).
  4. Przygotowanie potraw kulturowych
    1. Tego samego dnia, w którym wstrzyknięto HCG samicom myszy, należy równomiernie rozlać 12 kropli pożywki KSOM (MR-020P-D) o pojemności 20 μl w naczyniu do hodowli komórkowych o wymiarach 35 x 10 mm. Przykryj krople około 3 ml oleju mineralnego.
  5. Pobieranie nasienia:
    1. Poddać eutanazji samce myszy przez zwichnięcie szyjki macicy około godziny 9:00 czwartego dnia (13 godzin po wstrzyknięciu HCG).
    2. Odizoluj ogon najądrza i dokładnie go oczyść, aby wyeliminować wszelkie resztki tkanki tłuszczowej i krwi, delikatnie osuszając sterylną gazą i spłukując we wstępnie podgrzanym podłożu HTF.
    3. Rozciąć najądrze ogona, aby plemniki mogły swobodnie wypłynąć do pożywki HTF. Delikatnie ściśnij ogon za pomocą kleszczy, aby uwolnić plemniki, zbierz je we wstępnie zbalansowanych probówkach HTF i trzymaj je odkryte w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 w celu kapacytacji plemników do dalszego użytku.
  6. Pobieranie komórek jajowych
    1. Eutanazja samic myszy stymulowanych do pobrania oocytów przez zwichnięcie szyjki macicy około 9:30 rano czwartego dnia. Ostrożnie wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry brzucha i warstwy mięśni, aby odsłonić jamę brzuszną.
    2. Użyj cienkich kleszczyków, aby delikatnie odizolować tkankę z obu stron jajowodów, zwłaszcza obrzękniętych obszarów bańki, i przenieś ją do pożywki M2 w wysterylizowanym naczyniu hodowlanym. Powtarzaj tę procedurę, aż jajowody od wszystkich wyznaczonych myszy zostaną zebrane.
    3. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj igły strzykawkowej o pojemności 1 ml, aby delikatnie nakłuć przezroczystą część obrzękniętej bańki jajowodu, ułatwiając uwalnianie kompleksów wzgórek-oocytów (COC) do pożywki.
    4. Używając tej samej strzykawki, ostrożnie wybierz COC i przenieś je do nowego naczynia zawierającego 100 μl świeżej pożywki M2. Powtarzaj ten krok, aż wszystkie COC zostaną pomyślnie przeniesione z oryginalnych segmentów jajowodu.
    5. Zetrzyj krew i płyny tkankowe, a następnie pod mikroskopem preparacyjnym rozerwij bańkę jajowodu za pomocą igły 25 G, powodując uwolnienie licznych COC.
    6. Usunąć jajowód i fragmenty tkanki, przenieść COC do kropelek pożywki M2 zawierającej hialuronidazę (HY) i podgrzać je do temperatury 37 °C.
    7. Po inkubacji trwającej około 5 minut przeprowadzić delikatne pipetowanie, aby ułatwić oddzielenie komórek wzgórka i oocytów. Przenieść oocyty metafazy II (MII) z roztworu zawierającego HY do świeżej pożywki M2; następnie wykonaj sekwencyjny transfer do wielu kropel pożywki M2.
    8. Po 2-3 rundach płukania przenieś oocyty na kropelki pożywki hodowlanej KSOM i przechowuj je w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 do dalszego wykorzystania.
  7. Około godziny 10:00 czwartego dnia należy poddać sonifikacji 100 μl zpojemnościonych plemników (patrz krok 1.5.2.) przez 5 sekund, aby oddzielić głowy od ogonów z częstotliwością 46 kHz, z ustawieniem mocy 50 watów.
    UWAGA: Podczas sonikacji plemników w celu obcięcia ogona należy zachować ostrożność, aby kontrolować czas, który nie powinien przekraczać 5 sekund. Kilka sekund po sonikacji plemniki można obserwować pod odwróconym mikroskopem; Przestań sonikować, gdy około połowa plemników ma ścięte ogony.
  8. Procedura ICSI
    1. Do wstrzykiwania należy użyć dostępnej w handlu igły do mikromanipulacji z płaską końcówką i średnicą wewnętrzną 6 μm, ustawionej pod kątem 25°. Napełnij igłę płynem eksploatacyjnym o długości 0,5 cm wewnątrz igły. Upewnij się, że poziom płynu osiągnął ~0,5 cm.
      UWAGA: Podczas wstrzykiwania należy utrzymywać temperaturę pokojową na poziomie 19 °C, aby uniknąć wysokich temperatur, które mogą zmniejszyć przeżywalność zapłodnionych oocytów. Precyzja w zapewnieniu, że poziom płynu osiągnie 0,5 cm, ma kluczowe znaczenie dla utrzymania integralności procesu iniekcji i zapewnienia żywotności oocytów.
    2. Zamontować igłę do wstrzykiwań na prawym ramieniu mikromanipulatora, bezpiecznie zamocować, dokręcając nasadkę mocującą. Zainstalować dostępną w handlu pipetę do mikromanipulacji z płaską końcówką przeznaczoną dla oocytów myszy na lewym ramieniu mikromanipulatora i umieścić igłę do wstrzykiwań oraz pipetę przytrzymującą w polu widzenia mikroskopu.
    3. Dodać 1 μl sonikowanego plemnika do kropli roztworu PVP za pomocą pipety.
    4. Umieść 20 oocytów MII w kropli pożywki M2.
    5. Użyj igły do wstrzykiwań, aby odessać 10-20 główek plemników w roztworze PVP. Następnie należy wprowadzić igłę do wstrzykiwań do kropli zawierającej oocyty.
    6. Bezpośrednio określ położenie wrzeciona metafazy w oocycie pod mikroskopem polaryzacyjnym, aby upewnić się, że aparat wrzeciona nie znajduje się po stronie wstrzyknięcia, a ciało biegunowe zwykle znajduje się na godzinie 12 lub 6 względem orientacji oocytu.
    7. Utrzymuj oocyt w kontakcie z dnem naczynia hodowlanego. Wyregulować płaszczyznę ogniskową tak, aby osłonka przejrzysta oocytu i igła do wstrzykiwań znajdowały się w tej samej płaszczyźnie.
    8. Po zetknięciu się igły iniekcyjnej z osłonką przejrzystą, należy przyłożyć lekki podciśnienie do igły iniekcyjnej, wciągając część osłonki przejrzystej.
    9. Jednocześnie aktywuj impulsy piezoelektryczne z ustawieniem intensywności 5 i częstotliwością 1, skutecznie tworząc perforację w osłonie przejrzystej i umożliwiając przejście igły iniekcyjnej.
    10. Wsuń igłę do wstrzykiwań do przestrzeni okołowitelińskiej, dociskając główkę plemnika do końcówki igły. Wprowadzić igłę do wstrzykiwań do oocytu, aż dotrze do przeciwnej strony osłonki przejrzystej.
    11. Użyj impulsów piezoelektrycznych ustawionych na intensywność 1 i częstotliwość 1, aby utworzyć mały por w błonie plazmatycznej, zapewniając, że główka plemnika zostanie wstrzyknięta do ooplazmy przy minimalnym wejściu PVP i optymalnym zachowaniu integralności oocytu.
    12. Powtarzać czynności opisane w pkt 1.8.11 aż do wstrzyknięcia wszystkich 20 oocytów, a następnie przeprowadzić 15-minutową inkubację w temperaturze 19 °C.
    13. Przenieś ocalałe oocyty na pożywkę KSOM i umieść je w inkubatorze. Obserwuj tempo tworzenia się 2-komórkowych, 4-komórkowych, moruli i blastocyst.
      UWAGA: Czas docytoplazmatycznego wstrzyknięcia pojedynczego plemnika (ICSI) do komórki jajowej powinien być kontrolowany, dążąc do zakończenia zabiegu w ciągu 14-18 godzin po wstrzyknięciu HCG.

2. Przeszczepienie macicy u myszy blastocyst

  1. Przygotowanie samców myszy po wazektomii
    UWAGA: Do badania należy użyć samców myszy ICR w wieku 6-8 tygodni.
    1. Wywołać znieczulenie przez wstrzyknięcie dootrzewnowe 1,25% 2,2,2-tribromoetanolu w dawce 0,2 ml/10 g masy ciała. Brak jakiejkolwiek reakcji bólowej wskazuje na udane znieczulenie.
      UWAGA: Chociaż obecny protokół nie obejmuje stosowania maści weterynaryjnej na oczy znieczulonych zwierząt, jest ona zalecana jako najlepsza praktyka, aby zapobiec suchości oczu i zapewnić zdrowie i komfort zwierząt podczas zabiegów. W trakcie całego procesu chirurgicznego i rekonwalescencji wszystkie narzędzia chirurgiczne zostały wysterylizowane przed użyciem, a obszar operacyjny został przygotowany przy użyciu roztworów antyseptycznych, aby zapewnić czyste środowisko operacyjne.
    2. Aby zabezpieczyć się przed potencjalnym stresem lub kontuzjami, trzymaj myszy, które przeszły operację, indywidualnie w początkowej fazie rekonwalescencji.
    3. Buprenorfinę należy podawać w dawce 0,05 mg/kg masy ciała, aby zapewnić optymalną ulgę w bólu.
      UWAGA: Aby zapewnić dobre samopoczucie myszy, należy ściśle monitorować myszy w okresie rekonwalescencji i nie pozostawiać ich bez opieki, dopóki nie odzyskają wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka.
    4. Przygotuj miejsce operacji w dolnej części brzucha, nad jądrami. Usuń sierść i zdezynfekuj jodonem powidonu. Za pomocą sterylnych nożyczek wykonaj 1 cm podłużne nacięcie wzdłuż linea alba. Delikatnie usuń krew sterylnym, wolnym od kurzu papierem i przystąp do wycinka mięśni brzucha wzdłuż kresy białej i uzyskaj dostęp do jamy brzusznej.
    5. Za pomocą zakrzywionych kleszczy delikatnie chwyć i odsłoń lewe jądro i związaną z nim poduszeczkę tłuszczową. Zidentyfikuj nasieniowody i ostrożnie odizoluj je za pomocą spiczastych kleszczy, tworząc 10-milimetrowy segment do manipulacji.
    6. Wysterylizuj zakrzywione kleszcze, trzymając je w zewnętrznym płomieniu lampy alkoholowej przez kilka sekund. Delikatnie chwyć nasieniowody, powodując ich spłaszczenie i wybielenie w wyniku kauteryzacji. Utwórz drugi punkt kauteryzacji 3-5 mm dystalnie do pierwszego. Za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych wyciąć odcinek nasieniowodów między dwoma punktami kauteryzacji.
    7. Dokładnie sprawdź kauteryzowane końce nasieniowodów, upewniając się, że pozostał krótki, spłaszczony, wybielony segment. Za pomocą zakrzywionych kleszczy delikatnie przywróć jądro i związaną z nim poduszeczkę tłuszczową do jamy brzusznej.
    8. Powtórzyć procedurę opisaną w kroku 2.1.6 po stronie przeciwnej (prawej).
    9. Zamknij miejsce operacji za pomocą szwów, zwykle umieszczając jeden szew w warstwie mięśniowej i trzy szwy w skórze. Zapewnić prawidłowe wyrównanie nacięcia chirurgicznego i zdezynfekować jodowidonem. Przenieś zwierzę na poduszkę grzewczą w celu obserwacji, monitorując przez 10-15 minut, aż zwierzę odzyska przytomność. Po wyzdrowieniu zwierzę należy umieścić z powrotem w klatce.
      UWAGA: Po operacji wazektomii myszy wymagają 14-dniowego okresu rekonwalescencji, a następnie 1-tygodniowego próbnego eksperymentu godowego.
    10. W tym tygodniu należy stale kojarzyć samce poddane wazektomii z samicami i obserwować stan ciąży wszystkich samic z czopami kopulacyjnymi. Na udane krycie wskazuje obecność żółtawo-białej, blokowej czopa pochwowego w otworze pochwy samicy myszy.
      1. Sparuj myszy między 16:00 a 18:00 pierwszego dnia i sprawdź zatyczki dopochwowe między 7:00 a 9:00 drugiego dnia. Rozważ, że samice z czopami dopochwowymi są w stanie ciąży rzekomej po 0,5 dnia i wykorzystaj je do kolejnych eksperymentów z transferem zarodków. Zwróć samice bez zatyczek dopochwowych do grupy biorców.
        UWAGA: Te samice bez zatyczek dopochwowych mogą być nadal używane do krycia w celu przygotowania samic w ciąży rzekomej. Upewnij się, że wszystkie zatkane samice nie zajdą w ciążę; Tylko wtedy samce po wazektomii mogą być wykorzystywane do formalnych eksperymentów.
      2. Podczas gdy samce po wazektomii mogą kojarzyć się codziennie, należy odpocząć 1 dzień między sesjami godowymi.
        UWAGA: Opierając się na naszym doświadczeniu, mężczyźni po wazektomii mogą utrzymać wysoki wskaźnik zatyczek kopulacyjnych przez ponad rok. Jednak samce poddane wazektomii, które nie wytwarzają czopów kopulacyjnych u samic kryjących się przez 4-6 kolejnych prób, powinny zostać usunięte z badania.
  2. Przygotowanie samic w ciąży rzekomej
    1. Wygeneruj samice myszy w pseudociąży, łącząc samice myszy ICR (w wieku 7-10 tygodni, o wadze ponad 25 g) z samcami myszy poddanych wazektomii (w wieku 3-6 miesięcy) w stosunku 1:1.
      UWAGA: Samce po wazektomii zastosowano do stymulacji szyjki macicy samic myszy, co spowodowało aktywację ciałka żółtego.
  3. Przygotowanie pipety do przenoszenia blastocyst
    1. Pobrać zarodki przeznaczone do przeszczepu z inkubatora i przenieść je do kropelki pożywki M2 o temperaturze 37 °C.
    2. Użyj pipety transferowej, aby zassać niewielką objętość płynu, zaczerpnij niewielką ilość powietrza i odessaj 6-10 zarodków. Na koniec odessać kolejną niewielką objętość powietrza, aby uszczelnić pipetę.
      UWAGA: Długość płynu w pipecie transferowej nie powinna przekraczać 0,5 cm.
  4. Przeszczep macicy (blastocysty)
    1. Zważyć samice myszy w ciąży rzekomej (2,5 dnia po kryciu) i znieczulić je przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 1,25% 2,2,2-tribromoetanolu w dawce 0,2 ml / 10 g masy ciała. Delikatnie dociśnij ucho kleszczami.
    2. Po podaniu myszom znieczulenia i zapewnieniu aseptyki poprzez dezynfekcję alkoholem, należy wykonać podłużne nacięcie w linii środkowej na brzusznej części brzucha. Korzystając z luźnej tkanki podskórnej, przesuń nacięcie na lewą lub prawą stronę, w zależności od potrzeb przeszczepu. Użyj małych nożyczek, aby wykonać wypreparowanie warstwy mięśniowej ściany brzucha w odległości ~0,5 cm bocznie do odcinka lędźwiowego kręgosłupa, aby uzyskać dostęp do jamy otrzewnej.
    3. Za pomocą atraumatycznych kleszczy ostrożnie zewnętrzizuj jajniki, jajowody i macicę.
    4. Za pomocą końcówki igły strzykawki wykonaj małe, ukośne do góry nacięcie na ścianie macicy poniżej połączenia macicowo-jajowodowego, omijając naczynia krwionośne. To nacięcie zapewnia dostęp do jamy macicy; Delikatnie włóż jajowód 2-3 mm przez mały otwór.
    5. Ostrożnie usunąć mały pęcherzyk powietrza na końcu pipety transferowej, jednocześnie uważnie obserwując pipetę transferową podczas powolnego wstrzykiwania zarodków. Po potwierdzeniu, że środkowa część pożywki hodowlanej została wydalona, należy przerwać procedurę i delikatnie wyjąć pipetę do przenoszenia.
    6. Przenieś jajniki, jajowody i macicę z powrotem do jamy brzusznej. Zszyj warstwę mięśniową i skórę osobno. Umieść myszy na poduszce grzewczej, aż wyzdrowieją ze znieczulenia. Aby zapewnić dobre samopoczucie myszy, należy ściśle monitorować myszy w okresie rekonwalescencji i nie pozostawiać ich bez opieki, dopóki nie odzyskają wystarczającej świadomości, aby utrzymać leżący mostek.
  5. Obserwacja ciąży
    1. Po operacji obserwuj myszy przez 18-21 dni, aby monitorować liczbę urodzonego potomstwa. W przypadku dystocji (trudnego porodu) należy wykonać cesarskie cięcie. Pozwól nowonarodzonym myszom być wychowywanym przez karmiące matki w tej samej grupie wiekowej.

3. Losowy poziom glukozy we krwi, poziom glukozy we krwi na czczo i test tolerancji glukozy

  1. Śledzenie losowego poziomu glukozy we krwi podczas wzrostu myszy
    1. Od urodzenia myszy monitoruj losowy poziom glukozy we krwi co 4 tygodnie o 9 rano po dobrej nocy karmienia i zabawy.
      1. Nakłuj końcówkę ogona myszy, aby uzyskać krew z żyły ogonowej.
      2. Pierwsza kropla krwi ma wyższą wartość pomiaru cukru ze względu na obecność zmieszanego z nią płynu tkankowego. Dlatego delikatnie wytrzyj pierwszą kroplę krwi czystym papierem chłonnym.
      3. Zmierz poziom glukozy we krwi od drugiej kropli (~4 μL) z żyły ogonowej za pomocą ręcznego glukometru.
  2. Śledzenie zmian stężenia glukozy we krwi na czczo i tolerancji glukozy podczas rozwoju myszy
    UWAGA: Biorąc pod uwagę, że pierwszy punkt czasowy pobierania krwi to 15 minut, wszystkie myszy muszą zostać wstrzyknięte w ciągu 15 minut. Ponieważ każde wstrzyknięcie myszy trwało 20-30 sekund, aby zapewnić, że wstrzyknięcia zostaną zakończone w tym czasie, maksymalna liczba myszy, które można wykorzystać w każdym teście, nie może przekroczyć 30.
    1. Wykonuj testy stężenia glukozy we krwi na czczo i tolerancji glukozy co 4 tygodnie po urodzeniu u myszy na czczo.
      1. Pierwszego dnia przygotuj świeżą napromieniowaną ściółkę, czyste klatki, pokrywki i butelki z wodą. Przenieś myszy do świeżej klatki bez jedzenia. Dodaj znaczniki "nie podawaj" do klatek.
      2. Przygotuj wystarczającą ilość strzykawek 10% glukozy (sterylnych i wolnych od pirogenów) oraz 1 ml strzykawek.
      3. Upewnij się, że myszy w każdej grupie poszczą przez 16 godzin, od 17:00 pierwszego dnia do 9:00 drugiego dnia, ale pozwól im na swobodny dostęp do wody. Zmierz poziom glukozy we krwi na czczo zgodnie z opisem w krokach 3.1.1.1-3.1.1.3 za pomocą glukometru.
    2. Zważ myszy i oznacz ich ogony, aby ułatwić szybką identyfikację. Przygotować strzykawki z glukozą o masie 10 μl/g myszy.
    3. W odstępach 30 s wstrzyknąć 10 μl/g glukozy do jamy dootrzewnowej myszy.
      UWAGA: W tym miejscu należy zwrócić szczególną uwagę na techniki iniekcji, aby uniknąć niedokładnej objętości wtrysku cieczy. Kluczowe punkty operacji są następujące:
      1. Unieruchom mysz i przytrzymaj ogon jedną ręką. Głowę należy trzymać nieco niżej niż pośladki, tak aby narządy w jamie brzusznej przesunęły się w kierunku głowy, pozostawiając wystarczająco dużo miejsca na wstrzyknięcie.
      2. Umieść igłę między linią środkową a kością biodrową, wprowadź ją przez skórę pod kątem 45 stopni, a następnie delikatnie wprowadź igłę głębiej do jamy brzusznej, utrzymując ją równolegle do powierzchni skóry przez ~0,5 cm.
        UWAGA: Należy zwrócić uwagę na ewentualny opór podczas wstrzykiwania, aby ustalić, czy narządy wewnętrzne nie zostały przypadkowo przebite.
      3. Wysunąć strzykawkę do jamy brzusznej.
      4. Należy zanotować czas rozpoczęcia wstrzykiwania i użyć timera do kontrolowania szybkości wstrzykiwania. Ustaw timer na 90 s dla trzech myszy, aby uniknąć straty czasu na obsługę timera.
    4. Wykonuj pomiar stężenia glukozy we krwi z żyły ogonowej w żądanych odstępach czasu (0 przed podaniem glukozy, 15, 30, 60, 90 i 120 minut po załadowaniu glukozy).
      UWAGA: Kolejne badanie stężenia glukozy we krwi powinno również trwać 20-30 s dla każdej myszy.
    5. Po eksperymencie zwróć myszy do ich domowych klatek wyposażonych w jedzenie i wodę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W naszym laboratorium osiągnęliśmy wskaźnik zapłodnienia na poziomie 89,57% oraz wskaźnik rozwoju do stadium 2 komórek na poziomie 87,38%, stosując metodę ICSI z wykorzystaniem plemników z ogona najądrza u myszy. Wskaźnik urodzeń potomstwa po transferze embrionów (ET) wynosi około 42,50%. Co istotne, wszystkie wskaźniki zapłodnienia, wskaźniki rozwoju do stadium 2 komórek oraz wskaźniki urodzeń potomstwa są porównywalne z poziomami osiąganymi w ludzkiej medycynie wspomaganej prokreacji (ART), co umożliwia kompleksową sym...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W badaniu tym zintegrowano techniki docytoplazmatycznego wstrzykiwania plemnika u myszy (ICSI) i transferu zarodków (ET), aby kompleksowo podsumować technologię wspomaganego rozrodu u ludzi (ART) i zbadać wpływ ICSI w połączeniu z ET na rozwój potomstwa. Zastosowanie techniki ICSI z normalnymi plemnikami myszy dało wysokie zapłodnienie (86,76%) i odsetek 2-komórek (88,48%). Po ET wskaźnik urodzeń potomstwa myszy wynosił około 42,50%, co wskazuje na solidność platformy technicznej. Najbardziej godnym uwagi odkryciem tego ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Plan Głównego Projektu Specjalnego Funduszu Rozwoju dla Narodowej Strefy Demonstracji Innowacji Shanghai Zhangjiang (ZJ2022-ZD-006), Projekt Finansowania Ukierunkowanego Komisji Nauki i Technologii Miasta Szanghaju (22DX1900400), Program Młodzieżowy Miejskiej Komisji Zdrowia w Szanghaju (20204Y0276). Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (32070849).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,25% avertin (2,2,2-tribromoetanol)Nanjing AibeiM2960do znieczulenia
Bakteriologiczne szalki Petriego 35 x 10 mm ze szczelną pokrywą, krystaliczny polistyren pierwotny, sterylneBD353001
Bakteriologiczne szalki Petriego 50 x 9 mm ze szczelną pokrywą, krystaliczny polistyren pierwotny, sterylnyBD351006
Szafa bezpieczeństwa biologicznegoESCOclass figure-materials-1 BSCOperacje aseptyczne, wytwarzanie szalek hodowlanych, porcjowanie odczynników itp.
Inkubator CO2Thermo8000DHHodowla zarodków
Mikroskop preparacyjnyOlympusSZX16Zastosowanie w transferze zarodków myszy
Fluorinert Fc-770SIGMAF3556Fluorinert FC-770 to stabilna termicznie, w pełni fluorowana ciecz o wysokiej wytrzymałości dielektrycznej i rezystywności, stosowana jako
płyn operacyjny ręczny glukometrRocheAccuChek performaBlood Pomiar stężenia glukozy
HTFMerckMR-070-DPłyn z ludzkich jajowodów EmbryoMax (HTF) (1x), płyn przeznaczony do stosowania z zapłodnieniem in vitro u myszy jest dostępny w formacie 50 ml i został zoptymalizowany i zatwierdzony do hodowli zarodków.
Mikroiniektor hydraulicznyEppendorfCellTram 4r Oil, 5196000030Do wstrzykiwań nasienia
Mikroskop odwróconyNikonTI2-UMikromanipulacja obserwacyjna
gospodarz KSOMMerckMR-020P-D(1x), Proszek, bez czerwieni fenolowej, 5 x 10 ml
M2MerckMR-015-DEmbryoMax M2 Medium (1x), Płyn, z mikromanipulatorem Phenol Red
NARISHIGENTX-N4Mikromanipulacyjny olej mineralny do ramienia
 SIGMAM8410nadaje się do stosowania jako warstwa wierzchnia do kontroli parowania i zanieczyszczenia krzyżowego w różnych zastosowaniach biologii molekularnej.
Obcinak do igiełNanjing AibeiSutter MF-800Służy do wytwarzania igieł do mikromanipulacji
Ściągacz igiełNanjing AibeiSutter model p-100Służy do wykonywania igieł do mikromanipulacji
Piezo Drill Trip Mouce ICSIEppendorf5195000.087Zastosowanie igły iniekcyjnej ICSI.
Mikromanipulator piezoelektryczny (łamacz membrany)EppendorfEppendorf PiezoXpertWykorzystanie mikroimpulsów do przerwania osłonki przejrzystej i oolemmy oocytu
Mikroiniektor pneumatycznyEppendorfCellTram 4r Air, 5196000013Do utrwalenia oocytu
Gotowa do użycia ludzka gonadotropina kosmówkowa (Hcg)Nanjing AibeiM2520Odczynnik do sterylizacji, wstrzyknięcie dootrzewnowe. 50 j.m./ml
Gotowa do użycia gonadotropina surowicy ciężarnej klaczy (PMSG)Nanjing AibeiM2620Odczynnik do sterylizacji, wstrzyknięcie dootrzewnowe. 50 IU/ml
Mikroskop stereoskopowyOlympusSZX7Pobieranie oocytów i obserwacja rozwoju zarodka
Olej mineralny

Bibliografia

  1. Palermo, G., Joris, H., Devroey, P., Van Steirteghem, A. C. Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte. Lancet. 340 (8810), 17-18 (1992).
  2. Flurkey, K. M., Currer, J., Harrison, D. E. Vol. III Mouse models in aging research. Ch. 20. The mouse in biomedical research (second edition). Fox, J. G., et al. , Academic Press. Burlington. 637-672 (2007).
  3. Chen, M., Heilbronn, L. K. The health outcomes of human offspring conceived by assisted reproductive technologies (art). J Dev Orig Health Dis. 8 (4), 388-402 (2017).
  4. Heber, M. F., Ptak, G. E. The effects of assisted reproduction technologies on metabolic health and diseasedagger. Biol Reprod. 104 (4), 734-744 (2021).
  5. Ma, R. C. W., Ng, N. Y. H., Cheung, L. P. Assisted reproduction technology and long-term cardiometabolic health in the offspring. PLoS Med. 18 (9), e1003724(2021).
  6. De Waal, E., et al. The cumulative effect of assisted reproduction procedures on placental development and epigenetic perturbations in a mouse model. Hum Mol Genet. 24 (24), 6975-6985 (2015).
  7. Carlin, J., George, R., Reyes, T. M. Methyl donor supplementation blocks the adverse effects of maternal high fat diet on offspring physiology. PLoS One. 8 (5), e63549(2013).
  8. Hiraoka, K., et al. Piezo-icsi for human oocytes. J Vis Exp. (170), e60224(2021).
  9. Sullivan-Pyke, C. S., Senapati, S., Mainigi, M. A., Barnhart, K. T. In vitro fertilization and adverse obstetric and perinatal outcomes. Semin Perinatol. 41 (6), 345-353 (2017).
  10. Luke, B., et al. The risk of birth defects with conception by art. Hum Reprod. 36 (1), 116-129 (2021).
  11. Norrman, E., et al. Cardiovascular disease, obesity, and type 2 diabetes in children born after assisted reproductive technology: A population-based cohort study. PLoS Med. 18 (9), e1003723(2021).
  12. Goldsmith, S., Mcintyre, S., Badawi, N., Hansen, M. Cerebral palsy after assisted reproductive technology: A cohort study. Dev Med Child Neurol. 60 (1), 73-80 (2018).
  13. Hansen, M., et al. Intellectual disability in children conceived using assisted reproductive technology. Pediatrics. 142 (6), e20181269(2018).
  14. Chang, R. C., Wang, H., Bedi, Y., Golding, M. C. Preconception paternal alcohol exposure exerts sex-specific effects on offspring growth and long-term metabolic programming. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 9(2019).
  15. Grasemann, C., et al. Parental diabetes: The akita mouse as a model of the effects of maternal and paternal hyperglycemia in wildtype offspring. PLoS One. 7 (11), e50210(2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Monitorowanie glikemiitest tolerancji glukozytransfer zarodkawspomagana prokreacjakapacytacja plemnikówzaburzenia metaboliczneglikemia na czczomonitorowanie masy ciała
Monitorowanie stężenia glukozy we krwi u potomstwa myszy po docytoplazmatycznym wstrzyknięciu plemnika
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.