Ten protokół dostarcza informacji technicznych dotyczących rekonstrukcji naczyń krwionośnych przy użyciu techniki mankietowej w ortotopowym przeszczepie wątroby u myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Rekonstrukcja naczyń krwionośnych techniką mankietową w ortotopowym przeszczepie wątroby u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przeszczep ortotopowy wątroby u myszy jest skuteczną metodologią badania mechanizmów leżących u podstaw niedokrwienia wątroby i uszkodzenia reperfuzyjnego. Jednak wyzwania techniczne stanowią barierę w wykorzystaniu tego cennego modelu eksperymentalnego i przekazaniu tych umiejętności następnemu pokoleniu. Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest rekonstrukcja naczyń krwionośnych, w tym żyły wrotnej (PV), żyły podwątrobowej dolnej (IHIVC) i żyły głównej dolnej nadwątrobowej. Zastosowanie plastikowych mankietów, zamiast szwów, pozwala na płynniejszą rekonstrukcję PV i IHIVC. Naczynia są rekonstruowane poprzez przymocowanie mankietu wykonanego z cewnika dożylnego do końcówki naczynia przeszczepu i włożenie mankietu do naczynia biorczego. Dwa najważniejsze aspekty to odpowiednia wizualizacja wewnętrznego światła naczynia oraz unikanie użycia nadmiernej siły. Naszym celem jest przedstawienie technicznego przeglądu rekonstrukcji naczyń krwionośnych z wykorzystaniem techniki mankietowej w chirurgii biorcy. Oczekuje się, że te wskazówki techniczne dotyczące techniki mankietu pomogą mikrochirurgom ułatwić rekonstrukcję naczyń krwionośnych i przyspieszyć ich badania.
Wprowadzenie
Mysi ortotopowy przeszczep wątroby (MOLT) to skuteczna metoda eksperymentalna, po raz pierwszy opisana w 1991 roku1. Ten eksperymentalny model, który wykorzystuje genetycznie zmodyfikowane myszy i różne odczynniki badawcze, odegrał kluczową rolę w badaniu ciepłych i zimnych niedokrwień oraz urazów reperfuzyjnych. Jednak wysoki stopień złożoności technicznej modelu utrudnił rozwój podstawowej medycyny do przeszczepiania wątroby2. MOLT obejmuje trzy główne etapy: (1) pobranie wątroby od myszy dawcy, (2) operację tylnego stołu oraz (3) wszczepienie wątroby biorcy. Spośród tych zabiegów biorców największym wyzwaniem jest zespolenie naczyniowe. Podczas gdy zespolenie żyły głównej dolnej nadwątrobowej jest zwykle uzupełniane przez ręczne zszywanie2, żyła podwątrobowa dolna główna (IHIVC) i żyła wrotna (PV) mogą być zrekonstruowane bardziej efektywnie za pomocą plastikowych mankietów zamiast ręcznie szytych szwów.
Okres bezwątrobowy oznacza przerwę między usunięciem natywnej wątroby biorcy a implantacją przeszczepu. Aby zapewnić spójne wyniki, konieczne jest ograniczenie czasu znieczulenia do mniej niż 20 minut. W związku z tym badania wykorzystujące ten model zostały ograniczone do konkretnych instytucji3,4,5,6,7,8,9. Spośród różnych etapów MOLT, osiągnięcie płynnej rekonstrukcji PV i IHIVC ma kluczowe znaczenie dla zminimalizowania czasu znieczulenia i zapewnienia udanego przeszczepu.
Rekonstrukcja PV i IVC jest zazwyczaj przeprowadzana przy użyciu mankietów naczyniowych, ponieważ technika mankietowa upraszcza zespolenie naczyniowe w porównaniu do szwów szytych ręcznie2,5,8. Technika związana z przygotowaniem mankietu naczyniowego i bezpiecznym mocowaniem mankietu znacząco wpływa na złożoność rekonstrukcji naczyniowej biorcy. Naszym celem jest zapewnienie szczegółowych wskazówek wizualnych dla wielu wskazówek technicznych związanych z metodą mankietu, zmniejszając w ten sposób krzywą uczenia się. Te klipy wideo zapewnią jasne zrozumienie, jak przymocować mankiet do naczyń i zrekonstruować PV i IHIVC podczas operacji biorcy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez Komitet Eksperymentów na Zwierzętach na Uniwersytecie w Kioto. W badaniu wykorzystano myszy C57BL/6 w wieku powyżej 10 tygodni i wadze od 25 g do 30 g, pozyskane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów). Wszystkie zwierzęta znieczulono 2,5% izofluranem (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami), utrzymywano w określonych warunkach wolnych od patogenów, a wszystkie procedury eksperymentalne przeprowadzono zgodnie z przepisami Uniwersytetu w Kioto dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach. Odpowiednie instrumenty użyte do badania są wymienione w Tabeli Materiałów i przedstawione w Rysunek 1 i Rysunek 2.
1. Wybór zwierząt
- Używaj myszy o masie ciała 25-30 g.
UWAGA: Podczas gdy alloprzeszczepy wątroby myszy 2 są ogólnie akceptowane przez główną barierę kompleksu zgodności tkankowej, zdecydowaliśmy się na syngeniczny model MOLT w tym badaniu, aby skupić się na szczegółowym mechanizmie uszkodzenia reperfuzyjnego zimnego niedokrwienia10. Myszy o masie ciała mniejszej niż 25 g nie są zalecane, ponieważ niemożliwe jest wprowadzenie stentu wewnętrznego do cienkiego przewodu żółciowego. Podobnie myszy o masie ciała powyżej 30 g nie są zalecane ze względu na obecność dużej ilości tłuszczu w jamie brzusznej wokół naczyń.
2. Produkcja mankietów
- Przygotuj cewniki dożylne 20 G i 16 G odpowiednio dla PV i IHIVC.
- Za pomocą skalpela przetnij cewnik, aby utworzyć mankiet. Główny korpus mankietu powinien mieć długość 2 mm, z przedłużającym uchwytem 1 mm (Rysunek 3A).
UWAGA: Jeśli uchwyt jest zbyt duży, włożenie mankietu może być trudne. - Na powierzchni mankietu utwórz płytki rowek do mocowania nici za pomocą tylnej części ostrza skalpela.
UWAGA: Przykładając tylną część ostrza skalpela do mankietu, upewnij się, że końcówka ostrza jest ustawiona pod kątem około 60 stopni (jak pokazano na Rysunek 3B). Po wykonaniu pierwszego rowka zabezpiecz ostrze skalpela i obróć mankiet. Idealnie zalecane są dwa rowki, ale pojedynczy rowek może wystarczyć bez problemów.
3. Mocowanie mankietu
- W plastikowym prostokątnym pojemniku umieść małe kostki lodu i umieść na nim mały metalowy kubek (o średnicy 6 cm). Napełnij kubek płynem do konserwacji narządów (patrz Tabela materiałów) i umieść w nim przeszczep syngeniczny.
- Delikatnie zwiń syngeniczny przeszczep wątroby (pobrany od innej myszy dawcy) za pomocą bawełnianego wacika, upewniając się, że porta hepatis jest skierowana do góry. Dokładnie usuń krew zgromadzoną w świetle IVC za pomocą płynu zachowującego narządy.
- Przeciągnij PV przez mankiet za pomocą nici przymocowanej, na przykładample, do żyły śledziony (patrz Rysunek 4A).
- Trzymając uchwyt mankietu w pozycji godziny 12, zabezpiecz zarówno uchwyt, jak i mankiet za pomocą bulldoga clamp (patrz Tabela materiałów), ustawiając go w odległości 2 do 3 mm od krawędzi PV.
- Zabezpiecz zacisk buldoga dalej za pomocą dużych kleszczy naczyniowych i formy mocującej, aby ustalić pole operacyjne (patrz Rysunek 4B).
- Dokładnie sprawdź prześwit PV przy powiększeniu około 15 do 20x. W razie potrzeby kapiąca woda może poprawić widoczność światła.
- Delikatnie chwyć światło PV i uzewnętrznij je przez mankiet.
- Po całkowitym uzewnętrznieniu zabezpiecz go podwójnym podwiązaniem za pomocą 8-0 jedwabna nić wzdłuż rowka mankietu (Rysunek 4C,D).
UWAGA: Upewnij się, że ligatura nie jest luźna. Należy również uważać, aby punkt ligatury nie był zbyt duży, ponieważ może to przeszkadzać w zakładaniu mankietu. Punkt ligatury można ustawić w dowolnym kierunku. - Przymocuj mankiet do IHIVC, stosując procedurę podobną do tej stosowanej w przypadku PV (Rysunek 4E).
UWAGA: Podczas zaciskania IHIVC za pomocą mankietu należy unikać wgryzania się w miąższ wątroby. Ponieważ szyjka jest krótsza niż PV, dokładnie określ pozycję zacisku. - Utwórz węzeł ślizgowy, przesuwając nić wokół podstawy IHIVC, aby tymczasowo podwiązać IHIVC (Rysunek 5). Ten gwint zostanie usunięty po reperfuzji.
4. Rekonstrukcja żyły wrotnej
- Znieczulić mysz biorcę, indukując znieczulenie izofluranem w stężeniu 2,5% i zmniejsz go do 0,6% przed ekstrakcją rodzimej wątroby, jak opisano w opublikowanej literaturze2. Przed laparotomią należy przelać obszar chirurgiczny co najmniej trzy razy naprzemiennie jodoforem i 70% etanolem.
- Upewnij się, że płat wątroby jest prawidłowo ustawiony, a mankiet PV jest wolny od załamań i skręceń.
- Delikatnie chwyć krawędź fotowoltaiki odbiorcy za pomocą kleszczyków grochowych i zabezpiecz ją imadłem.
UWAGA: W tym artykule imadło odnosi się do mechanicznego urządzenia służącego do mocowania kleszczy grochowych na stole. Więcej informacji na temat imadła można znaleźć w tabeli materiałów. - Przyłóż zacisk naczyniowy do PV odbiorcy i przekaż 8-0 jedwabna nić wokół niego.
- Utwórz przekrój 1/4 obwodu około 0,5 mm od krawędzi PV (Rysunek 6A). Powiększ otwór, przepuszczając roztwór soli fizjologicznej przez światło za pomocą specjalistycznego przyrządu (igła 27 G z odciętą końcówką i wygiętą w kształt litery L).
- Użyj prostych kleszczy, aby chwycić uchwyt mankietu i włóż go do światła.
- Po całkowitym włożeniu zabezpiecz mankiet za pomocą 8-0 jedwabna nić. Do utrwalenia wystarczy pojedyncze podwiązanie.
- Usuń zacisk naczyniowy i ponownie wykonaj fuzję wątroby.
- Ostrożnie zwolnij kleszczyki grochowe i zakończ rekonstrukcję żyły wrotnej. Cały proces rekonstrukcji PV powinien zająć około 5 minut.
5. Rekonstrukcja żyły głównej dolnej podwątrobowej
- Ustaw odpowiednio płat wątroby i przesuń kleszczyki grochowe przymocowane do grzbietu biorcy IHIVC do prawego dolnego płata przeszczepu, zabezpieczając go imadłem.
- Wyeliminuj pozostałą tkankę wątroby wokół IVIHC biorcy, delikatnie pocierając bawełnianym wacikiem.
- Podanie 8-0 jedwabna nić wokół IVIHC biorcy.
- Utwórz przekrój 1/4 obwodu w odległości około 0,5 mm od krawędzi IVIHC odbiorcy (Rysunek 6B).
- Po wprowadzeniu normalnego roztworu soli fizjologicznej do światła, włóż mankiet do lumenu.
UWAGA: Ze względu na krótką szyję mankiet jest często wkładany płytko niż w PV. - Ostrożnie zabezpiecz mankiet za pomocą 8-0 jedwabną nić, a następnie usuń zacisk naczyniowy i kleszcze grochowe.
6. Opieka pooperacyjna
- Użyj poduszki grzewczej i lampy grzewczej, aby ułatwić rekonwalescencję pooperacyjną.
- Stale monitoruj ciśnienie krwi, tętno, częstość oddechów, temperaturę ciała, a także spożycie pokarmu i wody.
- Podawanie karprofenu we wstrzyknięciu podskórnym (5 mg/kg, co 6 godzin lub do momentu, gdy będzie to potrzebne) w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego. Postępuj zgodnie z lokalnymi wytycznymi instytucjonalnymi.
UWAGA: Jeśli stan myszy ulegnie pogorszeniu, eksperyment zostanie natychmiast przerwany, a myszy zostaną poddane eutanazji przez wdychanie dwutlenku węgla. - Aby pobrać próbkę tkanki, należy ponownie znieczulić myszy i poddać je eutanazji metodą zatwierdzoną przez IACUC.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rekonstrukcja żyły wrotnej (PV) jest udana, gdy po zwolnieniu zacisku na żyłę wrotnej nie występuje skręcanie naczynia, a wątroba jest jednorodnie ukrwiona. Czas anhepatyczny nie powinien przekraczać 20 min, ponieważ czas anhepatyczny przekraczający 25 min zwiększa ryzyko śmiertelności myszy. Rekonstrukcja dolnej części żyły głównej w obrębie wątroby (IHIVC) uznawana jest za udaną, jeśli nie występuje cofanie się krwi z przeszczepu.
Przechowywanie przeszczepu w niskich temperaturach przez 1 h ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Nauka rekonstrukcji naczyń krwionośnych jest najtrudniejszym aspektem osiągnięcia udanego MOLT. Jakość mankietu znacząco wpływa na trudność rekonstrukcji, biorąc pod uwagę niewielkie rozmiary myszy5. Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół przygotowania, zakładania i rekonstrukcji mankietu.
Chociaż nie ma większych różnic w stosunku do poprzednich raportów dotyczących przygotowania mankietu i połączenia 2,5, na...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Żaden z autorów nie ma do ujawnienia żadnego konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez podstawowe badania JST (Japońskie Towarzystwo Transplantacyjne) z 2022 roku.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Cewnik dożylny 16 G | TERUMO | SR-FF2032 | Mankiet IHIVC |
| Cewnik dożylny 20 G | TERUMO | SR-FF1651 | Mankiet PV |
| 8-0 warkocz jedwabny | Natsume Seisakusho | CR9-80B2 | 8-0 jedwab |
| Belzer UW Rozwiązanie do chłodni | Astellas | Płyn do konserwacji narządów | |
| Zacisk Bulldog | B BRAUN | FB329R | Zacisk Bulldog |
| C57BL/6 myszy | Oriental Bio Service | ||
| Izofluran roztwór do inhalacji | Viatris | Anesthesic | |
| Micro Blunted Tips 0,1 mm x 0,06 mm | FST | 11253-20 | Proste mikrokleszcze |
| Micro Serrefine Clamp Aplikator z zamkiem | FST | 18056-14 | Aplikator do naczyń |
| Micro Serrefines | FST | 18055-4 | Zacisk do naczynia |
| nr 11 Ostrza zapasowe | Maszynka do golenia FEATHER | 11 | ostrzy |
| Nożyczki okulistyczne, okrągły uchwyt | Mikronożyczki | BRAUN | FD103R |
| Plastikowy pojemnik w kształcie prostokąta | Daiso | 10 cm długości, 15 cm szerokości i 6 cm wysokości | |
| SuperGrip Końcówki | F.S.T | 00649-11 | Zakrzywione mikrokleszcze |
| mikroskopowe | SZX7 | Olympus | SZX7 |
| Niigataseiki | 00505351 | Mechaniczne narzędzie do mocowania kleszczyków do grochu na stole |
Bibliografia
- Qian, S. G., Fung, J. J., Demetris, A. V., Ildstad, S. T., Starzl, T. E. Orthotopic liver transplantation in the mouse. Transplantation. 52 (3), 562-564 (1991).
- Yokota, S., et al. Orthotopic mouse liver transplantation to study liver biology and allograft tolerance. Nat Protoc. 11 (7), 1163-1174 (2016).
- Shen, X. D., et al. Inflammatory responses in a new mouse model of prolonged hepatic cold ischemia followed by arterialized orthotopic liver transplantation. Liver Transpl. 11 (10), 1273-1281 (2005).
- Kageyama, S., et al. Ischemia-reperfusion injury in allogeneic liver transplantation: A role of CD4 T cells in early allograft injury. Transplantation. 105 (9), 1989-1997 (2021).
- Li, T., Hu, Z., Wang, L., Lv, G. Y. Details determining the success in establishing a mouse orthotopic liver transplantation model. World J Gastroenterol. 26 (27), 3889-3898 (2020).
- Tian, Y., Rüdiger, H. A., Jochum, W., Clavien, P. A. Comparison of arterialized and nonarterialized orthotopic liver transplantation in mice: Prowess or relevant model. Transplantation. 74 (9), 1242-1246 (2002).
- Steger, U., Sawitzki, B., Gassel, A. M., Gassel, H. J., Wood, K. J. Impact of hepatic rearterialization on reperfusion injury and outcome after mouse liver transplantation. Transplantation. 76 (2), 327-332 (2003).
- Chen, J., et al. A review of various techniques of mouse liver transplantation. Transplant Proc. 45 (6), 2517-2521 (2013).
- Kojima, H., et al. T cell carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1-T cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 3 cross talk alleviates liver transplant injury in mice and humans. Gastroenterology. 165 (5), 1233-1248 (2023).
- Yokota, S., Yoshida, O., Ono, Y., Geller, D. A., Thomson, A. W. Liver transplantation in the mouse: Insights into liver immunobiology, tissue injury, and allograft tolerance. Liver Transpl. 22 (4), 536-546 (2016).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
