Artykuł metodologiczny

Zielona synteza, charakterystyka, enkapsulacja i pomiar potencjału uwalniania nowych mikro-/submikronowych cząstek alkaliów ligniny

DOI:

10.3791/66216

⸱

1 marca 2024

 ,  , 
1Department of Pharmacology, Animal Physiology, Biochemistry and Chemistry, Faculty of Veterinary Medicine, Trakia University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy nowatorskie, proste metodologie syntezy i charakterystyki biokompatybilnych mikro- i submikronowych cząsteczek ligniny. Preparaty te zapewniają łatwe podejście do wykorzystania heteropolimeru, a także alternatywę dla racjonalnego projektowania wielofunkcyjnych matryc nośnikowych z potencjalnymi zastosowaniami w biomedycynie, technologii farmaceutycznej i przemyśle spożywczym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Możliwość zastosowania mikro-/nanotechnologii biopolimerów w medycynie weterynaryjnej, farmacji i technologii żywności szybko rośnie ze względu na duży potencjał cząsteczek na bazie biopolimerów jako skutecznych systemów nośnikowych. Zastosowanie ligniny jako podstawowej biomatrycy heteropolimerowej do projektowania innowacyjnych preparatów mikro-/submikronowych pozwala na osiągnięcie zwiększonej biokompatybilności i oferuje różne aktywne grupy funkcyjne, stwarzając możliwości dostosowania właściwości fizykochemicznych i bioaktywności preparatów do różnych zastosowań. Celem niniejszej pracy było opracowanie prostej i ekologicznej metodyki syntezy cząstek ligniny o rozmiarach mikro- i submikronowych; ocena ich cech fizykochemicznych, spektralnych i strukturalnych; oraz zbadanie ich zdolności do kapsułkowania biologicznie aktywnych cząsteczek oraz potencjału uwalniania bioflawonoidów in vitro w symulowanych pożywkach żołądkowo-jelitowych. W prezentowanych metodykach stosowane są tanie i ekologiczne rozpuszczalniki; Łatwe, proste, szybkie i czułe procesy wymagające niewielkiej ilości sprzętu, nietoksycznych substancji i prostych metod ich charakteryzacji, określenia zdolności kapsułkowania w kierunku słabo rozpuszczalnych w wodzie związków bioaktywnych morinu i kwercetyny oraz potencjału uwalniania in vitro matryc ligniny.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecnie skłonność do biopolimerów, takich jak celuloza, chitozan, kolagen, dekstran, żelatyna i lignina jako prekursorów do projektowania nośników mikro-/submikronowych o dostosowywalnym rozmiarze, właściwościach fizykochemicznych i biofunkcjonalnościach, wzrosła w przemyśle biomedycznym, farmaceutycznym i technologii żywności ze względu na ich zastosowanie w inżynierii tkankowej, biodruku 3D, in vitro Między innymi platformy do modelowania chorób, przemysł opakowaniowy, przygotowanie emulsji i dostarczanie składników odżywczych1,2,3.

Nowatorskie badania podkreślają aspekty hydrożeli na bazie ligniny, jak również mikro- i nanopreparatów4 jako korzystne nośniki stosowane do materiałów do pakowania żywności5, magazynowanie energii6, cosmetics7, stabilizatory termiczne/świetlne, materiały wzmocnione i matryce nośników leków8 do dostarczania cząsteczek hydrofobowych, poprawa barier UV9, jako środki wzmacniające w nanokompozytach oraz jako alternatywa dla nieorganicznych nanocząstek ze względu na niedawne problemy z bezpieczeństwem10,11,12. Powodem tej tendencji jest biokompatybilność, biodegradowalność i nietoksyczność naturalnego biopolimeru hetero, a także jego udowodniona bioaktywność potencjału przeciwutleniającego ligniny oraz działania wymiatające rodniki, antyproliferacyjne i przeciwdrobnoustrojowe13,14,15,16,17.

Literatura naukowa donosi o różnych metodach syntezy (samoorganizacja, wytrącanie antyrozpuszczalnikowe, wytrącanie kwasów i zmiana rozpuszczalnika)18 oraz charakterystykę preparatów mikro- i nano-skalowych na bazie ligniny, w tym stosowanie drogich lub szkodliwych rozpuszczalników, takich jak tetrahydrofuran (THF), dimetylosulfotlenek (DMSO), N,N-dimetyloformamid (DMF) i aceton oraz skomplikowane, pośrednie i żmudne procesy, które zużywają dużo sprzętu i substancji toksycznych12,19,20.

Aby przezwyciężyć te ostatnie wady, następujące protokoły prezentują nowatorskie metodologie syntezy mikro-/submikronowych cząstek na bazie ligniny przy użyciu tanich i zielonych rozpuszczalników; łatwe, nieskomplikowane, szybkie i wrażliwe procesy wymagające niewielkiego sprzętu, nietoksycznych substancji i prostych metod ich charakterystyki oraz określania zdolności kapsułkowania w kierunku słabo rozpuszczalnych w wodzie związków bioaktywnych i in vitro potencjał uwalniania matryc ligniny. Przedstawione metody produkcji w skali laboratoryjnej są korzystne dla wytwarzania funkcjonalnych nośników ligniny o regulowanych rozmiarach, wysokiej zdolności kapsułkowania i zrównoważonym uwalnianiu in vitro przy użyciu prostych procedur charakteryzacji i przyjaznych dla środowiska chemikaliów, które mogą znaleźć zastosowanie w różnych dziedzinach nauk biomedycznych i technologii żywności. Jako cząsteczki docelowe zamknięte w cząsteczkach ligniny zastosowano dwie flawonoidy: morinę – do mikrocząstek i kwercetynę – do cząstek submikronowych. Różnica w budowie obu flawonoidów polega tylko na położeniu drugiej grupy -OH w pierścieniu B-aromatycznym: grupa -OH znajduje się na pozycji 2' w morinie i na pozycji 3' w kwercetynie, a więc oba związki organiczne są izomerami pozycyjnymi. Ten ostatni fakt zakłada podobne zachowanie się obu bioaktywnych związków naturalnych w procesach enkapsulacji i/lub uwalniania.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synteza mikrocząsteczek ligniny

  1. Przygotować wodny roztwór ligniny alkalicznej o stężeniu 50 mg/ml, rozpuszczając 2,5 g ligniny alkalicznej w 50 ml ultraczystej wody na mieszadle magnetycznym.
  2. Przygotować 1% roztwór Tween 80, rozpuszczając 1 ml Tween 80 w 100 ml ultraczystej wody.
  3. Przygotować 2 M roztwór HNO3, rozcieńczając 6,65 ml 67% HNO3 (gęstość = 1,413 g/ml) ultraczystą wodą do końcowej objętości 50 ml.
  4. Powoli dodawać 15 ml 1% roztworu Tween 80 do 50 ml 50 mg/ml alkalicznego roztworu ligniny.
  5. Mieszać mieszaninę na mieszadle magnetycznym z prędkością 500 obr./min przez 10 minut, aby środek powierzchniowo czynny został dobrze zdyspergowany.
  6. Dodać kroplami 20 ml 2 M HNO3 za pomocą strzykawki o natężeniu przepływu około 150 μl/s do mieszaniny.
  7. Kontynuuj mieszanie mieszaniny przez 30 minut, gdy ciemnobrązowy roztwór przekształci się w jasnobrązową zawiesinę mikrocząstek.
  8. Przenieść zawiesinę do probówek o pojemności 1,5-2 ml i wirować przez 30 minut w temperaturze 15 000 × g w ultrawirówce w temperaturze 10 °C.
  9. Zebrać supernatant do dalszych analiz i spłukać mikrocząstki ultraczystą wodą.
  10. Powtórz procedury płukania/ultrawirowania 3x.
  11. Zanurz pojemnik z mikrocząstkami w łaźni lodowej przed homogenizacją ultradźwiękową.
  12. Homogenizuj mikrocząstki przez 4 minuty z intensywnością 93% na homogenizatorze ultradźwiękowym.
  13. Liofilizować mikrocząstki w temperaturze -64 °C w liofilizatorze i przechowywać je w eksykatorze do dalszego wykorzystania.

2. Synteza submikronowych cząstek ligniny

  1. Przygotować wodny roztwór ligniny alkalicznej o stężeniu 5 mg/ml, rozpuszczając 125 mg ligniny alkalicznej w 25 ml ultraczystej wody na mieszadle magnetycznym.
  2. Powoli dodawaj 1 ml 96% EtOH do alkalicznego roztworu ligniny.
  3. Mieszać mieszaninę na mieszadle magnetycznym przy 500 obr./min przez 3 min.
  4. Przygotować 50 ml 1% roztworu kwasu cytrynowego, rozpuszczając 0,5 g kwasu cytrynowego w ultraczystej wodzie do końcowej objętości 50 ml.
  5. Dodać kroplami 7 ml 1% kwasu cytrynowego za pomocą strzykawki o szybkości przepływu około 4 ml/min do mieszaniny.
  6. Kontynuuj mieszanie mieszaniny przez 10 minut, aż brązowy klarowny roztwór zamieni się w mętną, jasnobrązową zawiesinę cząstek submikronowych.
  7. Przenieść zawiesinę do probówek i odwirować przez 30 minut w temperaturze 15 000 × g w ultrawirówce w temperaturze 10 °C.
  8. Zebrać supernatant do dalszych analiz i spłukać mikrocząstki ultraczystą wodą.
  9. Powtórz procedury płukania/ultrawirowania 3x.
  10. Zanurz pojemnik z mikrocząstkami w łaźni lodowej przed homogenizacją ultradźwiękową.
  11. Homogenizuj mikrocząstki ultradźwiękowo przez dwa cykle po 4 minuty każdy z intensywnością 96% w homogenizatorze ultradźwiękowym.
  12. Schłodzić pojemniki przez 1 minutę po pierwszym cyklu.
  13. Liofilizować mikrocząstki w temperaturze -64 °C w liofilizatorze i przechowywać je w eksykatorze do dalszego wykorzystania.

3. Synteza naturalnych cząsteczek mikro-/submikronowych ligniny otoczonych flawonoidami

  1. Powtórz kroki 1.1-1.5 dla mikrocząstek.
  2. Odważyć 0,08 g morinu, rozpuścić go w 1 ml EtOH i dodać ten roztwór etanolowy do mieszaniny.
  3. Mieszać mieszaninę na mieszadle magnetycznym przy 500 obr./min przez 20 min.
  4. Dodać kroplami 20 ml 2 N HNO3 za pomocą strzykawki o szybkości przepływu około 150 μl/s do mieszaniny.
  5. Kontynuuj mieszanie mieszaniny przez 60 minut.
  6. Powtórz kroki 1.8-1.13.
  7. Powtórz krok 2.1 dla cząstek submikronowych.
  8. Odważyć 0,04 g kwercetyny, rozpuścić ją w 1 ml EtOH i dodać ten etanolowy roztwór do alkalicznego wodnego roztworu ligniny.
  9. Mieszać mieszaninę na mieszadle magnetycznym z prędkością 500 obr./min przez 10 min.
  10. Powtórz kroki 2.4-2.13.

4. Określenie skuteczności enkapsulacji mikro-/sumikro- cząstek ligniny

  1. Obliczyć zawartość dodanej substancji bioaktywnej podczas procedury syntezy obu rodzajów cząstek ligniny otoczonych flawonoidami.
    1. Oznaczyć spektrofotometrycznie absorpcję flawonoidu w supernatancie otrzymanym w krokach 1.9 i 2.8 po rozcieńczeniu go 96% EtOH.
    2. Obliczyć stężenie nieuwięzionej moryny/kwercetyny, korzystając z krzywych kalibracyjnych flawonoidów.
    3. Obliczyć skuteczność kapsułkowania (EE, %) mikrocząstek ligniny w stosunku do naturalnych flawonoidów, stosując równanie (1):
      figure-protocol-1 (1)
      Gdzie wo jest całkowitą ilością dodanej substancji bioaktywnej (mg), a wf jest ilością wolnego, nieuwięzionego flawonoidu (mg).
    4. Oblicz zdolność ładowania leku (DLC, %) - ważny parametr reprezentujący ilość leku w cząstkach na jednostkę masy układu nośnego - używając równania (2):
      figure-protocol-2 (2)
      Gdzie wp jest całkowitą ilością (wydajnością) mikro-/submikronowych cząstek ligniny otrzymanych po liofilizacji (mg).

5. Charakterystyka mikro- i submikronowych cząstek ligniny

  1. Określanie liczby cząstek, wielkości i rozkładu wielkości
    1. Oceń wielkość cząstek i rozkład wielkości cząstek w próbkach za pomocą automatycznego licznika komórek z opcją zliczania kulek. Dodać za pomocą mikropipety 1 μl zawiesiny mikro-/submikronowych cząstek ligniny/flawonoidu w ultraczystej wodzie w studzience szkiełka liczącego wymaganego do operacji.
    2. Poczekaj, aż liczba cząstek w 1 ml zawiesiny, jak również ich liczba i rozkład według wielkości zostaną pokazane na wyświetlaczu automatycznego licznika komórek.
      UWAGA: Urządzenie umożliwia przechowywanie danych na pamięci flash USB. Specjalne oprogramowanie do automatycznego liczenia komórek umożliwia dalsze przetwarzanie zapisanych plików cyfrowych i fotograficznych.
  2. Oznaczanie zawartości kwasowych/zasadowych grup powierzchniowych cząstek ligniny metodą miareczkowania potencjometrycznego
    1. Waga: 0,04 g niezaładowanych/otoczonych flawonoidami cząstek ligniny.
    2. Przenieść je do kolby Erlenmeyera, dodać 10 ml 0,1 M HCl i umieścić kolbę na mieszadle magnetycznym z prędkością 250 obr./min.
    3. Napełnić biuretę o pojemności 50 ml 0,1 M roztworem wzorcowym titranta NaOH.
    4. Przed rozpoczęciem miareczkowania zmierzyć początkowe pH roztworu w kolbie Erlenmeyera za pomocą pH-metru laboratoryjnego.
    5. Rozpocznij miareczkowanie i zmierz pH analizowanego roztworu po każdym 0,5 ml dodanej porcji titranta.
    6. Dane doświadczalne należy przechowywać w tabeli zawierającej objętość zastosowanego titranta i odpowiadającą mu wartość pH.
    7. Miareczkowanie należy przerwać po osiągnięciu w przybliżeniu stałej wartości pH poprzez zwiększenie objętości roztworu titranta.
    8. Wykreślić dane doświadczalne w postaci krzywych miareczkowania różnicowego dla zerowej, pierwszej i drugiej pochodnej.
    9. Oznaczyć punkty równoważne i odpowiadające im równoważne objętości użytych titrantów.
    10. Obliczyć zawartość kwasowych grup zasadowych Aa a i A b na powierzchni nieobciążonych i obciążonych flawonoidami cząstek ligniny, stosując równania (3) i (4):
      figure-protocol-3 , mgeq/g (3)
      figure-protocol-4 mgeq/g (4)
      gdzie Veqi jest objętością równoważną (ml); NT normalność titranta (mgeqv/ml); VT objętość titranta użytego w procedurze oznaczania (ml); m Masa analizowanej próbki (g).
  3. Oznaczanie punktu pH ładunku zerowego (pHPZC) cząstek na bazie ligniny metodą dodawania substancji stałych.
    1. Przygotować 60 ml 0,1 M wodnego roztworu NaCl.
    2. Dodać 9 ml 0,1 M roztworu NaCl do każdej z pięciu zakorkowanych kolb stożkowych i dostosować pH do pHi = 2, 4, 7, 10 i 12 (gdzie i = 1-5 oznacza liczbę odpowiedniego roztworu), odpowiednio przez dodanie 0,1 M HCl lub 0,1 M NaOH. Dostosować całkowitą objętość roztworu w każdej kolbie dokładnie do 10 ml, dodając roztwór NaCl o tej samej mocy.
    3. Dodać 40 mg suchych cząstek ligniny (nieobciążonych, naładowanych flawonoidami mikro-/submikronów) do każdej kolby i szczelnie przykryć kolby.
    4. Zabezpiecz kolby pionowo na wytrząsarce orbitalnej i utrzymuj je w stanie wstrząsu przez 24 godziny.
    5. Pozostawić do zrównoważenia przez 30 minut, a następnie zmierzyć końcowe pH (pHf) supernatantów w każdej kolbie.
    6. Wykreślić wartości pHf w stosunku do odpowiadających im początkowych wartości pH (pHi).
    7. Punkt ładunku zerowego (pHPZC) definiuje się jako wartość pH, przy której krzywa ΔpH w stosunku do pHi przecina linię prostą o współrzędnych (pHi; pHi).
  4. Oznaczanie całkowitej zawartości fenoli (TPC) w cząsteczkach ligniny
    UWAGA: Całkowitą zawartość fenoli (TPC) w mikro-/submikronowych cząstkach ligniny określa się za pomocą zmodyfikowanej metody kolorymetrycznej Folin-Ciocalteu.
    1. Zmieszać 200 μl wodnej zawiesiny cząstek o stężeniu 500 μg/ml z 600 μl ultraczystej wody i 200 μl odczynnika Folin-Ciocalteu (1:1, v/v).
    2. Po 5 minutach dodać do mieszaniny 1,0 ml 8% Na2CO3 i 1,0 ml wody Milli-Q i inkubować w ciemności w temperaturze 40 °C przez 30 minut w łaźni wodnej z przerywanym mieszaniem.
    3. Odwirować zawiesinę o stężeniu 5 300 × g przez 2 minuty.
    4. Przygotować półfabrykat niezawierający żadnych cząstek.
    5. Przenieść 3,5 ml supernatantu do kuwety kwarcowej o średnicy 10 mm i zmierzyć absorbancję za pomocą spektrofotometru UV/Vis w obszarze widzialnym przy długości fali 760 nm w stosunku do ślepej próby.
    6. Przygotować krzywą wzorcową wzorcowego kwasu galusowego zgodnie z krokami 5.3.1-5.3.5; tylko zamiast 200 μl zawiesiny cząstek ligniny użyć etanolowego roztworu kwasu galusowego o początkowych stężeniach 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 i 200 μg/ml.
    7. Wyrazić dane doświadczalne dotyczące mikrocząstek jako mg ekwiwalentu kwasu galusowego w miligramach na gram suchej próbki (mg GAE/g).
    8. Obliczać TPC za pomocą równania (5):
      figure-protocol-5 mg GAE/g (5)
      gdzie CGA jest stężeniem próbki równoważnym stężeniu wzorcowego kwasu galusowego otrzymanemu z wykresu kalibracyjnego kwasu (μg GA/ml); Cs jest stężeniem próbki, które jest równe masie suchej próbki podzielonej przez objętość rozpuszczalnika (μg/ml).

6. Określanie zdolności uwalniania in vitro cząsteczek ligniny

  1. Przygotować 250 ml symulowanej pożywki żołądkowej bez enzymów, dostosowując pH wzorcowego roztworu PBS z 0,1 M HCl do pH = 1,2.
  2. Przygotować 250 ml każdego z dwóch symulowanych roztworów płynu jelitowego, dostosowując pH wzorcowego roztworu PBS z 0,1 M NaOH/0,1 M HCl do pH = 6,8 i 7,4, odpowiednio.
  3. Dodać 25 mg mikro- i submikronowych cząstek otoczonych flawonoidami do 50 ml symulowanego bezenzymatycznego podłoża żołądkowego w szklanym reaktorze wsadowym wyposażonym w mieszadło mechaniczne i umieścić je w termalnej łaźni wodnej o stałej temperaturze T = 37 ± 0,2 oC.
  4. Zanurz mieszadło na głębokość 2/3 objętości cieczy, aby zapewnić pełne wymieszanie fazy stałej i ciekłej oraz zapewnić maksymalny transfer masy bez stref zastoju.
  5. Wyjmować 1 ml próbki z reaktora co 10 minut do 90th min i natychmiast odpipetować 1 ml świeżego symulowanego roztworu płynu do reaktora, aby zapobiec zmianie całkowitej objętości i zapewnić warunki zlewu.
  6. Powtórz tę samą procedurę, w tym kroki 6.3-6.6 z obydwoma symulowanymi roztworami płynu jelitowego o pH odpowiednio = 6,8 i 7,4 przez 200 minut.
  7. Przeprowadzić analogiczne eksperymenty z niezaładowanymi cząstkami ligniny w trzech symulowanych pożywkach i użyć próbek jako ślepych prób do zerowania spektrofotometru.
  8. Oznaczyć absorpcję próbek spektrofotometrycznie po przefiltrowaniu próbek i rozcieńczeniu ich 96% EtOH w stosunku do próbek zerowych z kroku 6.7 i obliczyć odpowiednie stężenie flawonoidów, stosując odpowiednie krzywe kalibracyjne moriny otrzymane odpowiednio przy pH = 1,2, 6,8 i 7,4.
  9. Obliczyć łączne uwalnianie (CR) bioflawonoidów, stosując równanie (6) w μg/ml i procent łącznego uwalniania (CRP) według równania (7):
    figure-protocol-6 (6)
    gdzie Ci i Ci+1 są stężeniami moriny/kwercetyny wi-tej i (i+1)-tej próbce (μg/ml); Vs objętość próbki pobranej z reaktora okresowego (ml); V całkowita objętość symulowanej pożywki (ml).
    figure-protocol-7 (7)
    Gdzie Cmax jest maksymalnym stężeniem związku biologicznie czynnego w nośniku (μg/ml).

7. Analizy statystyczne

  1. Wyrazić dane doświadczalne jako średnie ± odchyleń standardowych (SD) trzech niezależnych pomiarów.
  2. Określić istotność statystyczną wyników eksperymentu, wykonując test ANOVA jako test post hoc. Rozważmy wartość p < 0,05 istotną statystycznie.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technika wytrącania antyrozpuszczalnikowego została wykonana w celu wytworzenia mikro-/submikronowych cząsteczek ligniny alkalicznej. Wodny roztwór rozcieńczonego kwasu nieorganicznego-kwasu azotowego/kwasu organicznego-kwasu cytrynowego zdyspergowano w alkalicznym roztworze wodnym ligniny, wzbogaconym przyjaznym dla środowiska środkiem powierzchniowo czynnym/etanolem, co spowodowało stopniowe wytrącanie się substancji rozpuszczonej biopolimeru, a po sonikacji ostatecznie wyprodukowano zawiesinę zwartych cząstek mikro-/submikronowych (Rysunek 1).

figure-results-1
Rysunek 1: Homogenizacja cząsteczek ligniny. (A) Ultradźwiękowa homogenizacja zsyntetyzowanych submikronowych cząstek ligniny; (B) Homogenizowane mikrocząstki ligniny załadowane i niezaładowane moriną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ustalono wielkość, liczbę i rozkład rozmiarów niezaładowanych i zamkniętych w morinie mikronośników ligniny (Rysunek 2). Dane eksperymentalne wykazały wyższe stężenie, 1 × 107 cząstek/ml (2 037 cząstek/μl) i wyższą średnią wielkość, 6,1 μm, mikronośników obciążonych bioflawonoidami (Rysunek 2B) niż nieobciążonych o stężeniu 7,4 × 106 cząstek/ml (1,474 cząstek/μl) i średniej wielkości 5,7 μm (Rysunek 2A). Procentowy rozkład wielkości obu typów cząstek w zakresie wielkości 3-6 μm wynosił 75,2% dla mikronośników nieobciążonych i 69,3% dla mikronośników kapsułkowanych w morynie oraz odpowiednio 20,2% i 25,2% w zakresie 7-10 μm. Ilość, stężenie i szybkość przepływu antyrozpuszczalnika, kwasu azotowego, mają zasadnicze znaczenie dla wielkości cząstek. Wyższe stężenie i większa ilość kwasu prowadzi do większych cząstek, podczas gdy większe natężenie przepływu powoduje agregację zawiesiny.

figure-results-2
Rysunek 2: Rozkład wielkości cząstek. (A) Rzeczywisty rozkład wielkości niezaładowanych mikrocząstek ligniny w 1 μL zawiesiny-oprogramowania licznika cząstek; (B) rzeczywisty rozkład wielkości mikrocząstek ligniny alkalicznej w kapsułkach morinu w 1 μl oprogramowania zawiesinowego licznika cząstek. (C) Mikroskopijne zdjęcie licznika cząstek rozkładu niezaładowanych mikrocząstek ligniny; (D) mikroskopowe zdjęcie licznika cząstek rozkładu mikrocząstek ligniny alkalicznej otoczonych morinem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3 przedstawia widma absorpcji UV/Vis roztworów morinu etanolu, roztworów wodnych ligniny alkalicznej oraz mieszanin zawierających morin i ligninę o różnych stężeniach początkowych. Oczywiście piki absorpcji czystej ligniny i bioflawonoidu nie pokrywają się, a heteropolimer nie wywiera żadnego destrukcyjnego wpływu podczas stosowanej metody spektrofotometrycznej do oznaczania stężenia moriny w fazie ciekłej po enkapsulacji flawonoidu do mikronośników polimerowych oraz podczas eksperymentów uwalniania in vitro. Maksymalna absorpcja morinu w mieszaninie dwuskładnikowej przesunęła się na wyższą długość fali, od λmax = 359 nm do λmax = 395 nm, w wyniku wzrostu pH pożywki ze względu na obecność ligniny alkalicznej. To ostatnie odchylenie maksimum absorpcji w widocznym obszarze spowodowało konieczność zaprojektowania krzywych kalibracyjnych morinu przy różnych wartościach pH pożywki (Rysunek 4A). Trzy krzywe standardowe charakteryzujące się bardzo silnymi korelacjami liniowymi zostały potwierdzone wysokimi wartościami współczynników regresji (R2 > 0,99) w zakresie stężeń morina Co = 2,5-100 μg/ml. Podobnie, trzy standardowe krzywe kwercetyny w trzech symulowanych przedziałach fizjologicznych, przedstawione w Rysunek 4B, wykazały wysoką liniowość w tym samym zakresie stężeń.

figure-results-3
Rysunek 3: Porównanie widm UV/Vis etanolowych roztworów morinu, alkalicznych roztworów wodnych ligniny oraz mieszanin zawierających morinę i ligninę o różnych początkowych stężeniach. Widma czystej ligniny i moriny nie pokrywają się, a heteropolimer nie wywiera żadnego wpływu zakłócającego. Dodanie ligniny do moriny prowadzi do przesunięcia maksymalnej absorpcji moriny na wyższą długość fali, z λmax = 359 nm do λmax = 395 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Krzywe kalibracyjne etanolowych roztworów flawonoidów. (A) Morin i (B) kwercetyna w zakresie stężeń Co = 2,5-100 μg/ml przy pH = 1,2 (na niebiesko) (odpowiadającym symulowanemu płynowi żołądkowemu), pH = 6,8 (na czerwono) (odpowiadające symulowanemu płynowi z jelita cienkiego) i pH = 7,4 (na zielono) (odpowiadające symulowanemu płynowi z jelita grubego). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Względne stężenie kwaśnych i zasadowych miejsc aktywnych/grup funkcyjnych na powierzchni niezaładowanych i załadowanych alkalicznych cząstek ligniny zostało określone przez potencjometryczne miareczkowanie. Obliczenia oparto na równoważnych objętościach titranta wyznaczonych przez drugą pochodną różnicową krzywych miareczkowania (Rysunek 5). Wartości oznaczonego pKa, stężeń kwasowych (mocnych, słabych, całkowitych) grup funkcyjnych oraz pH i pHpzc cząstek mikro- i submikronowych przedstawiono w tabeli 1.

figure-results-5
Rysunek 5: Druga pochodna różnicowa krzywe miareczkowania potencjometrycznego niezaładowanych i załadowanych mikro-/submikronowych cząstek ligniny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. pkt.
parametrMikrocząsteczki ligninyMikrocząsteczki ligniny w kapsułkach MorinSubmikronowe cząstki ligninySubmikronowe cząstki ligniny zamknięte w kwercetynie
Veq., mlPytanie 10,5Godzina 2,752.25
4.3		2.75
Klasa 3,75
pKaRozdział 11.1Rozdział 10.83.0
8,0		4.2
7,0
Aa (silny), mgeq/gO godz. 26.256,88godz. 16.38Rozdział 16.3
Aa (słaby), mgeq/gGodzina 11.25Godzina 13.13Godzina 11.25Godzina 13.13
Aa (ogółem), mgeq/g37,520Godzina 27,63Godzina 29,43
pH (zawiesina wodna)Godzina 4,454.1Z godziny 4,54Rozdział 4.13
pHpzc2.32.03.8Wersja 3.0

Tabela 1: Wartości równoważnej objętości titranta (V eq), ujemna zasada -10 logarytmu stałej dysocjacji kwasu (pKa), stężenia kwasowych (mocnych, słabych, całkowitych) grup funkcyjnych (Aa, mgeq/g), pH i punkt zerowy ładunku (pHpzc) niezaładowanych i załadowanych mikro- i submikronowych cząstek ligniny. Mikro- i submikronowe, nieobciążone i naładowane flawonoidami cząstki ligniny są naładowane ujemnie, ponieważ ich pH > pHpzc.

Całkowita zawartość fenoli (TPC), określona zmodyfikowaną metodą kolorymetryczną Folin-Ciocalteu i obliczona jako ekwiwalenty kwasu galusowego, wynosiła 78,2 mg GAE/g niezaładowanych cząstek ligniny, podczas gdy wartość TPC mikronośników w kapsułkach morinu o tym samym stężeniu była 2,3 razy wyższa (183,43 mg GAE/g). To ostatnie wskazuje, że cząsteczki heterobiopolimeru są wzbogacone o dodatkowe grupy fenolowe w wyniku włączenia cząsteczek flawonoidów. Skuteczność enkapsulacji flawonoidów wyniosła: 98,1% dla moriny i 97,6% dla kwercetyny. Zdolność kapsułkowania leku wynosiła 28,2% dla mikrocząstek obciążonych moryną i 39,0% dla cząstek submikronowych zamkniętych w kwercetynie.

Skumulowane uwalnianie moryny i kwercetyny in vitro zostało zbadane w symulowanych pożywkach bezenzymatycznych przewodu pokarmowego: płynach żołądkowych, jelitowych i okrężnicowych przy pH odpowiednio = 1,2, 6,8 i 7,4 (Rysunek 6). Najwyższą skuteczność uwalniania wynoszącą około 24% osiągnięto po 30-40 minutach przy pH = 6,8. Zgodnie z wynikami eksperymentalnymi, ilość uwolnionego flawonoidu w symulowanym podłożu w jelicie cienkim była dwukrotnie większa niż ilość uwolniona w symulowanym środowisku okrężnicy i trzykrotnie większa niż skuteczność uwalniania określona w żołądku. Najwyższy stopień uwalniania kwercetyny ustalony w SIF przy pH = 7,4 w 70-90 minucie wynosił 34%, co przewyższało skumulowane uwalnianie flawonoidu w SGF (pH = 1,2) i SIF (pH = 6,8) przy 23,5% i 18%, odpowiednio.

figure-results-6
Rysunek 6: Analizy porównawcze skumulowanej skuteczności uwalniania in vitro morinu i kwercetyny z mikro- i submikronowych cząstek ligniny w symulowanych pożywkach fizjologicznych. Najwyższy stopień uwalniania moriny osiągnięto w symulowanym podłożu w jelicie cienkim. Najwyższą skuteczność uwalniania kwercetyny zarejestrowano w symulowanym płynie jelita grubego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z głównych krytycznych zagadnień nowoczesnych metodologii syntezy przy projektowaniu formulacji lekowo-nośnikowych na bazie biopolimerów jest stosowanie niebezpiecznych odczynników organicznych - lotnych i łatwopalnych rozpuszczalników, takich jak tetrahydrofuran, aceton, metanol, a nawet DMSO w wysokich stężeniach - co ogranicza ich zastosowanie w biomedycynie, przemyśle farmaceutycznym i technologii żywności ze względu na przejawianie się możliwych skutków toksycznych20, 21,22,23,24. Kolejną istotną kwestią jest udział skomplikowanych reakcji chemicznych (np. estryfikacji, polimeryzacji) lub kosztownej aparatury podczas procesu syntezy. Obie techniki przedstawione w niniejszym manuskrypcie przezwyciężają te ostatnie ograniczenia poprzez zastosowanie alternatywnych rozpuszczalników (woda) i nietoksycznych związków, takich jak środki powierzchniowo czynne (Tween 80) i środki sieciujące (etanol, kwas cytrynowy), klasyfikując je jako "zielone" metody syntezy. Co więcej, metodologie te oferują rozwiązanie zaspokajające krytyczną potrzebę i potrzebę opracowania niedrogich, przyjaznych dla środowiska, zrównoważonych procedur projektowania cząsteczek ligniny, służących jako biodegradowalne, bioaktywne i biokompatybilne szablony nośników substancji fizjologicznie czynnych25.

Aby uzyskać cząstki ligniny o pożądanej wielkości, wybrano dwa warunki produkcji: jeden o wysokim stężeniu ligniny (50 g/L) i kwasie azotowym jako środku przeciwrozpuszczalnikowym, a drugi o niższym stężeniu ligniny (5 g/L), etanolu jako przeciwrozpuszczalniku oraz kwasie cytrynowym pełniącym jednocześnie podwójną rolę antyrozpuszczalnika i środka sieciującego, ponieważ były to dwie zmienne wpływające na wielkość cząsteczek ligniny. Natężenie przepływu podczas obu procedur było utrzymywane na niskim poziomie, aby zapewnić mniejsze cząstki i zapobiec ich agregacji. Istnieje kilka krytycznych punktów, które należy wziąć pod uwagę przy wyborze kwasów nieorganicznych i organicznych do protokołów syntezy.

Kwas azotowy został wybrany, ponieważ jest to silny kwas nieorganiczny, który zapewnia wysoki stopień wytrącania ligniny alkalicznej, a kontrolując szybkość jej dodawania cząstek w pożądanym zakresie wielkości, można uzyskać. Ponadto oczekuje się, że dodanie HNO3 może zapewnić modyfikację cząstek heteropolimeru w wyniku prawdopodobnych zmian chemicznych struktury ligniny związanych z: procesami reakcji nitracji-podstawiania atomów H w pierścieniach benzenowych z grupami -NO2 ; estryfikacja grup alifatycznych -OH i tworzenie estrowych grup funkcyjnych; i/lub utlenianie grup fenolowych -OH i -OCH3 prowadzące do powstania struktur chinonowych. Jeśli chodzi o rolę stężenia środka strącającego i ligniny dla wielkości syntetyzowanych cząstek, z jednej strony wyższe początkowe stężenie ligniny w połączeniu z dodatkiem mocnego kwasu azotowego (pKa = -1,4) oraz ograniczona rozpuszczalność heteropolimeru alkalicznego w kwasie nieorganicznym doprowadziły do wytworzenia cząstek w zakresie mikrometrów. Z drugiej strony dodanie etanolu do wodnego roztworu ligniny alkalicznej o niższym stężeniu powoduje tworzenie się drobnej zawiesiny ze względu na częściową rozpuszczalność ligniny alkalicznej w alkoholu. Co więcej, późniejsze dodanie kwasu cytrynowego doprowadziło do wytworzenia cząstek w zakresie nanometrów, ponieważ kwas organiczny jest słabszy (pKa1 = 3,13) niż kwas azotowy, co w konsekwencji zapewnia mniejsze opady.

Niektóre podstawowe właściwości nanofarmaceutyków to krążenie leków, uwalnianie leków z postaci dawkowania w określonych miejscach oraz wchłanianie przez błony biologiczne. Na właściwości te znaczący wpływ mają niektóre właściwości fizyczne i chemiczne nośników nanocząstek oraz zamknięte w kapsułkach cząsteczki leków.

Charakterystyka fizykochemiczna nośników biopolimerowych: stężenie powierzchniowo czynnych grup kwasowych i zasadowych, punkt zerowego ładunku (pHPZC), wielkość, rozkład wielkości cząstek, a także charakterystyka widmowa cząstek przed i po włączeniu substancji bioaktywnej, są podstawowymi parametrami, które należy wziąć pod uwagę przy ocenie grup funkcyjnych, reaktywności, stabilność i jednorodność cząstek10.

Wielkość cząstek, rozkład wielkości cząstek, ładunek i morfologia to jedne z głównych czynników wpływających na te oceny. Wielkość cząstek wpływa na ich stabilność, reaktywność i zachowanie podczas uwalniania leku26. Mniejsze cząstki oferują większą powierzchnię przenoszenia masy, co prowadzi do szybszego uwalniania leku. W przeciwieństwie do tego, mniejsza powierzchnia przenoszenia masy większych cząstek powoduje mniejszą szybkość dyfuzji leków wewnątrz tych cząstek.

Zastosowanie metod miareczkowych jako podstawowych technik oznaczania miejsc kwaśnych i zasadowych oraz grup funkcyjnych obecnych na powierzchniach ciał stałych stale się rozwija. Do głównych zalet miareczkowania potencjometrycznego należy oszczędność czasu i pracy, wysoka precyzja oraz eliminacja wzorców referencyjnych i drogiej aparatury. Metoda ta została zastosowana w niniejszej pracy, ponieważ pozwala na scharakteryzowanie cząstek biopolimeru poprzez jakościowe i półilościowe określenie charakteru i liczby miejsc aktywnych obecnych na powierzchni załadowanych i nieobciążonych nośników biopolimerowych27.

Ładunek powierzchniowy biologicznych i medycznych mikro/nanonośników odgrywa ważną rolę w wychwytywaniu komórkowym28. pHPZC odpowiada zerowej gęstości ładunków powierzchniowych, to znaczy równoważnym ilościom ładunków ujemnych i dodatnich wytworzonych przez równowagę protonów. Wyznaczenie tych wartości dostarcza informacji na temat specyficzności adsorpcji29. Ponieważ jednak parametr punkt izoelektryczny reprezentuje tylko zewnętrzne ładunki powierzchniowe cząstek w zawiesinie, podczas gdy punkt zerowego ładunku zmienia się w odpowiedzi na całkowity ładunek powierzchniowy netto (zewnętrzny i wewnętrzny) cząstek, pHpzc Protokół został zastosowany po raz pierwszy w niniejszej pracy jako prosta i skuteczna metoda charakterystyki nośników leków biopolimerowych. Zgodnie z koncepcją pHpzc, przy pH powyżej pHpzc powierzchnia cząstek biopolimeru jest przeważnie naładowana ujemnie, podczas gdy ładunek dodatni netto obserwuje się, gdy pH zawiesiny jest poniżej pHpzc. Z danych doświadczalnych przedstawionych w tabeli 1 można wywnioskować, że mikro- i submikronowe, nieobciążone i obciążone flawonoidami cząstki ligniny są naładowane ujemnie, ponieważ ich pH > pHpzc.

Na skuteczność ładowania flawonoidami ma wpływ skuteczność kapsułkowania i zdolność ładowania leku. Skuteczność kapsułkowania (E, %) definiuje się jako stosunek ilości leku zawartego w cząsteczkach do całkowitej ilości w preparacie. Na skuteczność kapsułkowania ma wpływ charakterystyka leku, rozpuszczalnika i nośnika30.

Skuteczne dostarczenie substancji fizjologicznie czynnej zależy jednak od sposobu i zakresu, w jakim jej cząsteczki są uwalniane z matrycy nośnikowej. Dlatego bardzo ważne jest, aby wziąć pod uwagę mechanizm uwalniania leku i szybkość uwalniania 31,32,33. Wyjaśniając mechanizm uwalniania bioflawonoidów in vitro z ich biopolimerowych mikro/nanonośników, można symulować i przewidywać zachowanie flawonoidu i nośnika w rzeczywistym środowisku fizjologicznym oraz optymalizować projektowanie preparatów farmaceutycznych o zwiększonej biodostępności. Wyniki eksperymentu in vitro uzyskane w tym badaniu są przydatne w praktyce klinicznej, ponieważ dowodzą, że ze względu na mniejszy stopień uwalniania moriny/kwercetyny z ligniny submikronowej i mikrocząstek w środowisku żołądkowym, innowacyjne cząstki biopolimeru nadają się do podawania doustnego ze względu na mniejsze ryzyko podrażnienia żołądka w porównaniu z bezpośrednim doustnym podawaniem substancji bioaktywnych. Innowacyjne mikrocząsteczki biopolimeru nadają się do podawania doustnego ze względu na mniejsze ryzyko podrażnienia żołądka w porównaniu z bezpośrednim doustnym podawaniem substancji bioaktywnych. Co więcej, cząstki submikronowe, ze względu na ich mały rozmiar i znaczny potencjał uwalniania, mogą być stosowane jako preparaty do wstrzykiwań. Ponadto nowe nośniki ligniny mikro- i submikronowej dają możliwość przezwyciężenia ograniczeń zgłaszanych przez innych naukowców związanych z trudnościami związanymi z doustnym podawaniem dużych dawek niektórych bioflawonoidów, wynikającymi z ich tendencji do tworzenia nasyconych roztworów w przewodzie pokarmowym, co z kolei utrudnia proces rozpuszczania i ich efektywną resorpcję.

Łatwość syntezy, biokompatybilność otrzymanych cząstek, a także możliwość dostosowania obecnego protokołu to główne zalety przedstawionej metodologii. Wielkość cząstek jest optymalna dla ich zamierzonych zastosowań, oferując wystarczającą powierzchnię dostępną dla przyłączenia środków terapeutycznych i ugrupowań celujących, co z kolei nie wymaga podawania większej liczby cząstek, aby osiągnąć wymagania dotyczące dawki docelowej. Zastosowanie ligniny jako podstawowej matrycy heteropolimerowej do syntezy innowacyjnych cząstek pozwala na zwiększenie biokompatybilności i oferuje różne aktywne grupy funkcyjne, stwarzając możliwości dostosowania cząstek do różnych zastosowań.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Bułgarski Fundusz Naukowy w ramach umowy nr KΠ-06 H59/3 oraz przez projekt naukowy nr 07/2023 FVM, Uniwersytet Trakia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
automatyczny licznik komórekEVE, NanoEnTek
Citric acidSigma251275  odczynnik ACS, ≥ 99,5%
cyfrowa kąpiel wodnaProbówki Memmert
Eppendorf, 1,5-2 ml
EtanolSigma34852-Mabsolutny, odpowiedni do HPLC, ≥ 99.8%
Folin– Ciocalteu' s odczynnik fenolowySigmaF9252
  liofilizatorBiobase
kwas galusowySigma-BCBW7577monohydrat
HClSigma258148odczynnik ACS, 37%
HNO3Sigma438073  Odczynnik ACS, 70%
lignina, alkalicznySigma370959
morinSigmaPHL82601
NaClSigmaS9888Odczynnik ACS, ≥ 99,0%
Proszek Na2CO3Sigma223530proszek, ≥ 99,5%, odczynnik ACS
NaOHSigma655104klasa odczynnika, 97%,
wytrząsarka orbitalnaIKAKS 130 podstawowy
pH-metrConsort
fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)SigmaRNBH7571
Hydrat kwercetynySigmaSTBG3815V
oprogramowanie statystyczne dla programu ExcelMicrosoft CorporationXLSTAT  Wersja 2022.4.5.
Tween 80SigmaP8074lepkiej cieczy
HermleZ 326 K
System wody ultraczystejAdronaINTEGRITY+
homogenizator ultradźwiękowyBandelin SonopulsHD 2070
Spektrofotometr UV/VisHach-LangeDR 5000
do proszku sól BioXtra, ultrawirówka do

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yu, X., et al. Lignin nanoparticles with high phenolic content as efficient antioxidant and sun-blocker for food and cosmetics. ACS Sustainable Chem. Eng. 11 (10), 4082-4092 (2023).
  2. Boarino, A., Klok, H. -A. Opportunities and challenges for lignin valorization in food packaging, antimicrobial, and agricultural applications. Biomacromolecules. 24 (3), 1065-1077 (2023).
  3. Aadil, K., Barapatre, A., Jha, H. Synthesis and characterization of Acacia lignin-gelatin film for its possible application in food packaging. Bioresour. Bioprocess. 3 (27), 1-11 (2016).
  4. Sharma, S., et al. Valorization of lignin into nanoparticles and nanogel: characterization and application. Bioresour. Technol. Reports. 18, 101041(2022).
  5. Zadeh, E. M., O'Keefe, S. F., Kim, Y. -T. Utilization of lignin in biopolymeric packaging films. ACS Omega. 3 (7), 7388-7398 (2018).
  6. Beaucamp, A., et al. Lignin for energy applications - state of the art, life cycle, technoeconomic analysis and future trends (Critical Review). Green Chem. 24, 8193-8226 (2022).
  7. Antunes, F., et al. From sugarcane to skin: Lignin as a multifunctional ingredient for cosmetic application. Int J Biol Macromol. 234, 123592(2023).
  8. Garg, J., et al. Applications of lignin nanoparticles for cancer drug delivery: An update. Materials Letters. 311, 131573(2022).
  9. Anushikha, K. K. Lignin as a UV blocking, antioxidant, and antimicrobial agent for food packaging applications. Biomass Conv. Bioref. , 1-14 (2023).
  10. Freitas, F. M. C., et al. synthesis of lignin nano- and micro-particles: Physicochemical characterization, bioactive properties and cytotoxicity assessment. Int J Biol Macromol. 163, 1798-1809 (2020).
  11. Rismawati, R., Nurdin, I. A., Pradiptha, M. N., Maulidiyah, A., Mubarakati, N. J. Preparation and characterization of lignin nanoparticles from rice straw after biosynthesis using Lactobacillus bulgaricus. Journal of Physics: Conference Series. 9th International Seminar on New Paradigm and Innovation of Natural Sciences and its Application. 1524, 012070(2020).
  12. Worku, L. A., et al. Synthesis of lignin nanoparticles from Oxytenanthera abyssinica by nanoprecipitation method followed by ultrasonication for the nanocomposite application. Journal of King Saud University - Science. 35 (7), 102793(2023).
  13. Gala Morena, A., Tzanov, T. z Antibacterial lignin-based nanoparticles and their use in composite materials. Nanoscale Adv. 4, 4447-4469 (2022).
  14. Ivanova, D., Nikolova, G., Karamalakova, Y., Marutsova, V., Yaneva, Z. Water-soluble alkali lignin as a natural radical scavenger and anticancer alternative. Int J Mol Sci. 24 (16), 12705(2023).
  15. Ivanova, D., Toneva, M., Simeonov, E., Antov, G., Yaneva, Z. Newly synthesized lignin microparticles as bioinspired oral drug-delivery vehicles: Flavonoid-carrier potential and in vitro radical-scavenging activity. Pharmaceutics. 15 (4), 1067(2023).
  16. Yaneva, Z., et al. Antimicrobial potential of conjugated lignin/morin/chitosan combinations as a function of system complexity. Antibiotics. 11, 650(2022).
  17. Handral, H. K., Wyrobnik, T. A., Lam, A. T. -L. Emerging trends in biodegradable microcarriers for therapeutic applications. Polymers. 15 (6), 1487(2023).
  18. Figueiredo, P., Lintinen, K., Hirvonen, J. T., Kostiainen, M. A., Santos, H. A. Properties and chemical modifications of lignin: Towards lignin-based nanomaterials for biomedical applications. Prog. Mater. Sci. 93, 233-269 (2018).
  19. Tang, Q., et al. Lignin-based nanoparticles: a review on their preparations and applications. Polymers. 12 (11), Basel. 2471(2020).
  20. Zhao, W., Simmons, B., Singh, S., Ragauskas, A., Cheng, G. From lignin association to nano-/micro-particle preparation: extracting higher value of lignin. Green Chemistry. 18 (21), 5693-5700 (2016).
  21. Stewart, H., Golding, M., Matia-Merino, L., Archer, R., Davies, C. Manufacture of lignin microparticles by anti-solvent precipitation: Effect of preparation temperature and presence of sodium dodecyl sulfate. Food Res Int. 66, 93-99 (2014).
  22. Beisl, S., Friedl, A., Miltner, A. Lignin from micro- to nanosize: Applications. Int. J. Mol. Sci. 18, 2367(2017).
  23. Mishra, P. K., Ekielski, A. A simple method to synthesize lignin nanoparticles. Colloids Interfaces. 3, 52(2019).
  24. Qian, Y., Deng, Y., Qiu, X., Li, H., Yang, D. Formation of uniform colloidal spheres from lignin, a renewable resource recovered from pulping spent liquor. Green Chem. 16, 2156-2163 (2014).
  25. Tardy, B. L., et al. Lignin nano- and microparticles as template for nanostructured materials: formation of hollow metal-phenolic capsules. Green Chem. 20, 1335-1344 (2018).
  26. Silva, M., et al. Paraquat-loaded alginate/chitosan nanoparticles: preparation, characterization and soil sorption studies. J Haz Mat. 190 (1-3), 366-374 (2011).
  27. Georgieva, N., Yaneva, Z. Comparative evaluation of natural and acid-modified layered mineral materials as rimifon-carriers using UV/VIS, FTIR, and equilibrium sorption study. Cogent Chem. 1 (1), 1-16 (2015).
  28. Zhang, P., Chen, D., Li, L., Sun, K. Charge reversal nano-systems for tumor therapy. J Nanobiotechnol. 20, 31(2022).
  29. Yaneva, Z. L., Georgieva, N. V. Removal of diazo dye from the aqueous phase by biosorption onto ball-milled maize cob (BMMC) biomass of Zea mays. Maced. J. Chem. Chem. Eng. 32 (1), 133-149 (2013).
  30. Zatorska, M., et al. Drug-loading capacity of polylactide-based micro- and nanoparticles - Experimental and molecular modeling study. Int J Pharmaceutics. 591, 120031(2020).
  31. Yaneva, Z., Georgieva, N. Chapter 5 - Physicochemical and morphological characterization of pharmaceutical nanocarriers and mathematical modeling of drug encapsulation/release mass transfer processes. Nanoscale Fabrication, Optimization, Scale-Up and Biological Aspects of Pharmaceutical Nanotechnology. Grumezescu, A. M. , William Andrew Publishing. 173-218 (2018).
  32. Yaneva, Z., Georgieva, N., Staleva, M. Development of d,l-α-tocopherol acetate/zeolite carrier system: equilibrium study. Monatshefte fur Chemie Chemical Monthly. 147 (7), 1167-1175 (2016).
  33. Yaneva, Z., Georgieva, N. Study on the physical chemistry, equilibrium, and kinetic mechanism of Azure A biosorption by Zea mays biomass. Journal of Dispersion Science and Technology. 35 (2), 193-204 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cz steczki ligninyenkapsulacja cz steczkowauwalnianie in vitrodostarczanie bioflawonoid wsymulowane media o dkowo jelitowecharakterystyka cz steczekliofilizacjahomogenizacja ultrad wi kowa

Powiązane artykuły