Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja przeciwciał autoreaktywnych u myszy po eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia kręgowego

DOI:

10.3791/66218

⸱

1 grudnia 2023

 , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, Brody School of Medicine, East Carolina University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) to zwierzęcy model stwardnienia rozsianego (MS), który dzieli z ludzką chorobą silną humoralną odpowiedź autoimmunologiczną. W tym miejscu przedstawiamy prosty i elastyczny protokół ELISA do ilościowego oznaczania autoprzeciwciał w surowicy myszy uodpornionych na EAE.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) to model choroby, który podsumowuje chorobę autoimmunologiczną stwardnienie rozsiane (MS) na poziomie histopatologicznym i molekularnym. EAE jest indukowany przez uodparnianie zwierząt doświadczalnych poprzez podskórne wstrzyknięcie krótkich peptydów mielinowych wraz ze specyficznymi adiuwantami w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej. Podobnie jak ludzki odpowiednik, u myszy EAE rozwijają się zmiany demielinizacyjne, infiltracja komórek odpornościowych do ośrodkowego układu nerwowego (OUN), aktywacja gleju i uszkodzenie neuronów. Spójny materiał dowodowy potwierdza również mechanistyczną rolę dysfunkcji komórek B w etiologii zarówno stwardnienia rozsianego, jak i EAE. Limfocyty B mogą służyć jako komórki prezentujące antygen, a także jako główne źródło cytokin prozapalnych i autoprzeciwciał. W EAE wytwarzane są przeciwciała przeciwko peptydom mieliny, które zostały wykorzystane do wywołania choroby. Wykazano, że takie autoprzeciwciała pośredniczą w utracie mieliny lub reaktywacji patogennych limfocytów T do OUN. W artykule opisano skuteczny protokół oparty na ELISA do ilościowego oznaczania autoprzeciwciał w surowicy myszy C57BL / 6J immunizowanych peptydem glikoproteiny mielinowej oligodendrocytów 35-55 (MOG35-55). Proponowana metoda służy jako potężne narzędzie do badania swoistości i wielkości nieprawidłowej odpowiedzi humoralnej w kontekście demielinizacji autoimmunologicznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stwardnienie rozsiane (MS) jest przewlekłą chorobą autoimmunologiczną ośrodkowego układu nerwowego (OUN) charakteryzującą się ogniskową infiltracją komórek odpornościowych do miąższu mózgu, rozpadem osłonek mielinowych owijających aksony, aktywacją gleju i utratą neuronów1. Oprócz dobrze ugruntowanej roli patogennych limfocytów T, wiele linii dowodowych podkreśliło udział limfocytów B w pośredniczeniu w odpowiedzi autoimmunologicznej przeciwko OUN. Limfocyty B ulegają ekspansji klonalnej w mózgu SM, a przeciwciała przeciwko składnikom mieliny zostały wykryte w uszkodzeniach demielinizowanych2,3. Selektywna aktywacja obwodowych limfocytów B na początku choroby została niedawno udokumentowana, co sugeruje przypuszczalną rolę tego przedziału komórek odpornościowych również w inicjacji choroby4. Sukces terapii zubożających limfocyty B, takich jak przeciwciała monoklonalne anty-CD20, dodatkowo potwierdza mechanistyczny związek między nieprawidłowym funkcjonowaniem komórek B a autoimmunologiczną demielinizacją5,6. Z molekularnego punktu widzenia limfocyty B mogą przyczyniać się do choroby poprzez prezentację autoantygenu, prozapalne wydzielanie cytokin i autoreaktywną produkcję przeciwciał.

Wiele modeli zwierzęcych zostało opracowanych w celu podsumowania specyficznych cech złożonego fenotypu MS. Wśród nich eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) jest najpowszechniej stosowanym paradygmatem in vivo i opiera się na immunizacji zwierząt doświadczalnych krótkimi peptydami pochodzącymi z białek mielinowych, takich jak glikoproteina oligodendrocytów mielinowych (MOG) i podstawowe białko mieliny (MBP)7. U zwierząt uodparnionych EAE rozwija się patologia demielinizacyjna, która pod wieloma względami przypomina stwardnienie rozsiane, w tym silną odpowiedź humoralną przeciwko peptydowi encefalitogennemu8. Z tego powodu badania EAE odegrały zasadniczą rolę w analizie funkcji limfocytów B i autoprzeciwciał w kontekście choroby. Wykazano na przykład, że przeciwciała specyficzne dla MOG wyizolowane od pacjentów ze stwardnieniem rozsianym mogą pogarszać przebieg kliniczny w modelach EAE9. Warto zauważyć, że reszta proliny w pozycji 42 w ludzkim MOG okazała się kluczowa dla określenia patogeniczności autoprzeciwciał10. Ostatnio odkryto, że autoprzeciwciała specyficzne dla MOG sprzyjają chorobie nie tylko poprzez pośredniczenie w utracie mieliny, ale także poprzez zwiększanie reaktywacji autoreaktywnych limfocytów T w klasie CNS11.

Biorąc pod uwagę znaczenie odpowiedzi przeciwciał w autoimmunizacji OUN, ten artykuł przedstawia protokół oparty na ELISA, aby skutecznie mierzyć poziomy przeciwciał autoreaktywnych w surowicy u myszy C57BL/6J EAE immunizowanych peptydem MOG35-55. W pierwszej części protokołu opisana zostanie metoda pobierania surowicy poprzez nakłucie dosercowe. Następnie szczegółowo omówione zostaną procedury konfiguracji testu ELISA i uzyskania danych. Na koniec omówiona zostanie analiza i interpretacja danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury z udziałem myszy zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi eksperymentalnymi zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Wschodniej Karoliny (IACUC). W badaniu wykorzystano samice myszy typu dzikiego C57BL/6J w wieku 8-10 tygodni. Zwierzęta zostały pozyskane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów). EAE zostało wywołane zgodnie z wcześniej opublikowanymi raportami12,13,14.

1. Kolekcja surowicy

  1. Poddać eutanazji mysz eksperymentalną przez uduszenie CO2 lub przedawkowanie izofluranu w wymaganym punkcie czasowym (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami) po wywołaniu EAE poprzez immunizację MOG35-55.
    UWAGA: Całkowita liczba myszy i punkty czasowe do pobrania surowicy mogą się różnić w zależności od konkretnego eksperymentu.
  2. Po potwierdzeniu braku parametrów życiowych przez uszczypnięcie palca u nogi lub ogona, umieść mysz w pozycji leżącej grzbietowej na tacy sekcyjnej i przymocuj kończyny do pozycji za pomocą szpilek lub taśmy. Ustaw korpus myszy na źródle światła LED (patrz Tabela materiałów), aby oświetlić klatkę piersiową zwierzęcia.
  3. Spryskaj futro myszy 70% etanolem i wykonaj nacięcie w linii środkowej 3-4 cm wzdłuż brzucha od miednicy do mieczykowatego za pomocą nożyczek do rozwarstwiania, uważając, aby uniknąć jakichkolwiek narządów i głównych naczyń (Ryc. 1A-C). Aby ułatwić zabieg, użyj kleszczy, aby chwycić skórę nad wyrostkiem mieczykowatym.
  4. Przeciąć przeponę bocznie, a następnie przeciąć klatkę piersiową do przodu na obu bocznych krawędziach za pomocą nożyczek sprężynowych, zatrzymując się przed dotarciem do mostka w linii środkowej (Rysunek 1D). Złóż klapkę żeber, która została utworzona nad głową myszy, aby odsłonić serce (Rysunek 1E).
    UWAGA: Należy unikać przecinania mostka, ponieważ spowoduje to uszkodzenie głównych tętnic piersiowych przylegających do kości i zmniejszy objętość krwi, którą można zebrać.
  5. Wprowadzić igłę 25 G połączoną ze strzykawką o pojemności 1 ml do lewej komory i pobrać krew, delikatnie odciągając tłok (Rysunek 1F). Aby ułatwić nakłucie igłą, delikatnie przymocuj serce do kleszczy.
    UWAGA: Jeśli krew nie pojawi się natychmiast w strzykawce, igłę należy powoli obracać i badać pod innym kątem. Należy jednak dołożyć starań, aby przy pierwszej próbie prawidłowo umieścić igłę, aby uniknąć tworzenia niepotrzebnych otworów w sercu, przez które może wyciekać krew.
  6. Przenieś krew do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml i pozwól jej krzepnąć przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć skrzep przez odwirowanie w temperaturze 2000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant, który reprezentuje frakcję surowicy, i przechowywać podwielokrotności jednorazowego użytku w probówkach kriogenicznych w temperaturze -80 °C do przyszłych badań.

2. Test ELISA

  1. Zawiesić liofilizowany peptyd MOG35-55 (patrz tabela materiałów) w wodzie, aby uzyskać zapas 10 mg/ml. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy rozcieńczyć materiał podstawowy do 10 μg/ml w buforze powlekającym (patrz Tabela Materiałów) i odpipetować 100 μl/basenik roztworu końcowego do płytki 96-dołkowej. Uszczelnić płytkę folią samoprzylepną, aby uniknąć parowania, i inkubować płytkę przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Dla każdej próbki należy obliczyć co najmniej 2 studzienki, a w przypadku ślepej próby należy również uwzględnić 2 dodatkowe studzienki.
  2. Równolegle pokryć tę samą liczbę studzienek 100 μl/studzienkę albuminy surowicy bydlęcej (BSA) rozpuszczonej w buforze powlekającym o stężeniu 10 μg/ml. Te dodatkowe studnie będą służyć jako kontrolki w tle.
    UWAGA: Zaleca się pokrycie studzienek kontrolnych BSA, ponieważ powłokowe i blokujące mają różny skład. Należy pamiętać, że inne peptydy encefalitogenne (takie jak PLP139-151 lub MBP84-104) mogą być stosowane jako nieistotne antygeny jako alternatywa dla BSA.
  3. Następnego dnia przemyj płytkę 3 razy 200 μl/studzienkę soli fizjologicznej z buforem fosforanowym uzupełnionym 0,05% Tween 20 (PBS-T). Następnie dodać 100 μl/basenik roztworu blokującego sporządzonego z 3% BSA w PBS (bez Tween 20) i inkubować szczelnie zamkniętą płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w piecu do hybrydyzacji.
  4. Umyć płytkę 3 razy 200 μl/dołek PBS-T. Rozcieńczyć każdą próbkę surowicy w stosunku 1:100 w roztworze blokującym i dodać 100 μl / studzienkę do studzienek pokrytych MOG35-55 i BSA. Dodać tę samą objętość roztworu blokującego do studzienek oznaczonych jako ślepe próby. Inkubować szczelnie zamkniętą płytkę przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, stale wstrząsając (250 obr./min).
  5. Umyć płytkę 3 razy 200 μl/dołek PBS-T. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe sprzężone z HRP (1:2000, patrz Tabela Materiałów) w roztworze wykonanym z 0,2% BSA w PBS-T i dodać 100 μl / basenik do wszystkich studzienek. Inkubować szczelnie zamkniętą płytkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, stale wstrząsając (250 obr./min).
  6. Umyć płytkę 3 razy 200 μl/dołek PBS-T. Dodać 100 μl/studzienkę substratu 3,3',5,5' tetrametylobenzydyny (TMB) (patrz tabela materiałów) do wszystkich studzienek i inkubować w ciemności przez 1-5 minut, monitorując rozwój niebieskiego koloru.
    1. Zatrzymać reakcję przez dodanie 100 μl/studzienkę roztworu zatrzymującego (patrz tabela materiałów) i zmierzyć gęstość optyczną (OD) w każdym studzience za pomocą czytnika płytek ustawionych na długość fali 450 nm.
      UWAGA: Podłoże TMB należy równoważyć w temperaturze pokojowej przez 30-60 minut przed dodaniem go do studzienek.

3. Analiza danych

  1. Wypełnij arkusz kalkulacyjny programu Excel wartościami OD odczytanymi z tabliczki. Uśrednić wartości OD uzyskane ze zduplikowanych studzienek (zarówno MOG35-55, jak i pokrytych BSA) dla każdej próbki.
  2. Dla każdej próbki należy odjąć średnią wartość studzienek pokrytych BSA od wartości studzienek pokrytych MOG35-55. Uzyskane skorygowane wartości tła będą proporcjonalne do stężenia przeciwciał anty-MOG35-55 w różnych próbkach surowicy.
    UWAGA: Ślepe studzienki powinny skutkować skorygowanymi wartościami około 0.
  3. Zastosuj nieparametryczny test statystyczny, taki jak test U Manna-Whitneya, aby porównać średnie wartości OD między dwoma warunkami eksperymentalnymi. Należy uwzględnić co najmniej 3 niezależne próbki dla każdego warunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zademonstrować solidność obecnego testu ELISA, metoda została przetestowana na próbkach surowicy wyizolowanych z kohorty samic myszy C57BL/6J po 20 dniach od immunizacji (dpi) 100 μg peptydu MOG35-55 w kompletnym adiuwantie Freunda (CFA) zgodnie z zatwierdzonym protokołem indukcji EAE12,13,14. Zwierzęta otrzymały również 400 ng toksyny krztuścowej w dniach 0 i 2. Próbki surowicy od symulowanych uodpornionych zwierząt ze wszy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym przypadku opisano prosty i skuteczny protokół oparty na teście ELISA, który pozwolił na dokładne ilościowe określenie odpowiedzi humoralnej w odpowiednim zwierzęcym modelu patologii stwardnienia rozsianego. Metoda ta została niedawno zastosowana do opisania nowej roli białka ataksyny-1 w kontrolowaniu poziomów autoprzeciwciał w surowicy w paradygmacie MOG35-55/C57BL6J EAE12. W związku z tym należy wziąć pod uwagę szereg czynników, aby uzyskać spójne i biologicznie miarodajne wyniki za pomocą...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez National Institutes of Health (R03NS131908) i Departament Obrony poprzez Program Badań nad Stwardnieniem Rozsianym pod numerem nagrody W81XWH-22-1-0517. Opinie, interpretacje, wnioski i zalecenia są opiniami autora i niekoniecznie są zatwierdzone przez Departament Obrony. Badanie to było również wspierane przez fundusze startowe Uniwersytetu Wschodniej Karoliny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawki 1 mlBD Biosciences309628
1,5 ml probówki do mikrowirówekFisher05-408-129
Igły 25 GBD Biosciences305122
Podłoże 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (TMB)Thermo FisherN301Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C
Uszczelki samoprzylepneThermo FisherAB0558
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA7906Przechowywać w 4 & stopni; C
C57BL/6J samice myszyLaboratorium Jacksona000664Zwierzęta w wieku 8-10 tygodni powinny być wykorzystywane do eksperymentów EAE
Probówki kriogeniczneFisher10-500-25
Taca preparcyjnaNożyczki do
Fine Science Tools14082-09
Bufor do powlekania ELISABioLegend421701Przechowywać w 4° C
Oprogramowanie ExcelArkusz kalkulacyjnyMicrosoft
KleszczeNarzędzia do nauki pięknej11152-10
Koza Anti-Mouse IgG, Reklamy ludzkie-HRPSouthernBiotech1030-05Sklep pod adresem 4 & stopni; C
Źródło światłaLED FisherAMPSILED21
Czytnik mikropłytekFisher14-377-575 
Woda klasy biologii molekularnejCorning46-000-Cl
Peptyd myszy MOG35-55EZBiolabcp7203Przechowywać w temperaturze -80 & deg; C
Pipeta wielokanałowaAxygenAP-12-200-P
Noyes Nożyczki sprężynoweFine Science Tools15011-12
Nunc MaxiSorp 96-dołkowe płytkiBioLegend423501
Wytrząsarka orbitalnaFisher88-861-023
PiekarnikVWR445-0024
Bufor fosforanowy sola fizjologiczna (PBS)Thermo Fisher14190144
Wirówka stołowa z chłodzeniemThermo Fisher75002441
Stop roztwórThermo FisherN600
Tween 20Bio-Rad1706531
dyssekcji Fisher S111022 Analysis

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Reich, D. S., Lucchinetti, C. F., Calabresi, P. A. Multiple sclerosis. N Engl J Med. 378 (2), 169-180 (2018).
  2. Baranzini, S. E., et al. B cell repertoire diversity and clonal expansion in multiple sclerosis brain lesions. J Immunol. 163 (9), 5133-5144 (1999).
  3. Genain, C. P., Cannella, B., Hauser, S. L., Raine, C. S. Identification of autoantibodies associated with myelin damage in multiple sclerosis. Nat Med. 5 (2), 170-175 (1999).
  4. Ma, Q., et al. Specific hypomethylation programs underpin b cell activation in early multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2111920118(2021).
  5. Hauser, S. L., et al. Ocrelizumab versus interferon beta-1a in relapsing multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 221-234 (2017).
  6. Montalban, X., et al. Ocrelizumab versus placebo in primary progressive multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 209-220 (2017).
  7. Didonna, A. Preclinical models of multiple sclerosis: Advantages and limitations towards better therapies. Curr Med Chem. 23 (14), 1442-1459 (2016).
  8. Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).
  9. Khare, P., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific antibodies from multiple sclerosis patients exacerbate disease in a humanized mouse model. J Autoimmun. 86, 104-115 (2018).
  10. Marta, C. B., Oliver, A. R., Sweet, R. A., Pfeiffer, S. E., Ruddle, N. H. Pathogenic myelin oligodendrocyte glycoprotein antibodies recognize glycosylated epitopes and perturb oligodendrocyte physiology. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (39), 13992-13997 (2005).
  11. Flach, A. C., et al. Autoantibody-boosted t-cell reactivation in the target organ triggers manifestation of autoimmune cns disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), 3323-3328 (2016).
  12. Didonna, A., et al. Ataxin-1 regulates b cell function and the severity of autoimmune experimental encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23742-23750 (2020).
  13. Didonna, A., et al. Sex-specific tau methylation patterns and synaptic transcriptional alterations are associated with neural vulnerability during chronic neuroinflammation. J Autoimmun. 101, 56-69 (2019).
  14. Ma, Q., Matsunaga, A., Ho, B., Oksenberg, J. R., Didonna, A. Oligodendrocyte-specific argonaute profiling identifies micrornas associated with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroinflammation. 17 (1), 297(2020).
  15. Lanz, T. V., et al. Clonally expanded b cells in multiple sclerosis bind ebv ebna1 and glialcam. Nature. 603 (7900), 321-327 (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Multiple Sclerosis ModelB Cell DysfunctionMyelin Peptide ImmunizationELISA ProtocolSerum CollectionMOG35 55 PeptideImmunoglobulin G ResponseCentral Nervous System

Powiązane artykuły