Artykuł metodologiczny

Zestaw symulowanych formatów pożywek opartych na informacjach in situ do hodowli mikroorganizmów beztlenowych nabytych w środowisku

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66228

⸱

12 stycznia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Southern Illinois University Carbondale, 2MEDPREP, Southern Illinois University School of Medicine, 3Department of Geology, Southern Illinois University Carbondale, 4Department of Zoology, Southern Illinois University Carbondale

W tym artykule

Podsumowanie

Tematem tego artykułu jest szczegółowe opisanie najlepszych praktyk tworzenia pożywek dla wymagających mikroorganizmów beztlenowych pozyskanych ze środowiska. Metody te pomagają w zarządzaniu kulturami beztlenowymi i mogą być stosowane do wspomagania wzrostu nieuchwytnych mikroorganizmów niehodowlanych, "mikrobiologicznej ciemnej materii".

Streszczenie

Zależne od kultury badania mikroorganizmów beztlenowych opierają się na kompetencjach metodologicznych. Metody te muszą stworzyć i utrzymać odpowiednie warunki wzrostu (np. pH i źródła węgla) dla mikroorganizmów beztlenowych, umożliwiając jednocześnie ekstrakcję próbek bez naruszania sztucznego środowiska. W tym celu metody, które opierają się na środowisku in situ i symulują je, mogą być bardzo pomocne w hodowli mikroorganizmów z tego środowiska. W tym miejscu przedstawiamy opartą na informacjach i symulacji metody beztlenowej in situ do hodowli mikroorganizmów naziemnych i podpowierzchniowych, kładąc nacisk na beztlenowe pobieranie próbek przy minimalnych zakłóceniach. Protokół ten szczegółowo opisuje produkcję konfigurowalnego płynnego podłoża beztlenowego oraz pozyskiwanie i hodowlę mikroorganizmów beztlenowych w środowisku in vitro. Protokół obejmuje również krytyczne komponenty bioreaktora beztlenowego wykorzystywanego do symulacji środowiskowych osadów i płynnych pożywek beztlenowych dla kultur nabytych w środowisku. Uwzględniliśmy wstępne dane z sekwencjonowania nowej generacji z utrzymywanego mikrobiomu przez cały okres życia bioreaktora, w którym aktywna kultura dynamicznie dostosowywała się w odpowiedzi na eksperymentalne źródło węgla.

Wprowadzenie

Większość mikroorganizmów pozostaje niehodowlana; potwierdza to duża dysproporcja między komórkami obserwowana za pomocą mikroskopii, w przeciwieństwie do kilku mikroorganizmów, które udało się wyhodować za pomocą płytek agarowych. Staley i Konopka nazwali tę rozbieżność "Anomalią Wielkiej Liczby Płyt"1. Szacowana nieuwzględniona różnorodność jest poparta danymi metagenomicznymi i metatranskryptomicznymi pokazującymi wiele nowych rodzajów rozmieszczonych na krzywych liczebności rang z kilku różnych środowisk2. Mikroorganizmy, które zostały zaobserwowane (zazwyczaj przez losowe sekwencjonowanie społeczności drobnoustrojów), ale nie zostały wyhodowane, zostały określone jako "mikrobiologiczna ciemna materia"3,4.

W erze -omiki, hodowla mikroorganizmów pozostaje niezbędna do pełnej oceny danych genomowych i weryfikacji funkcji/fenotypu obecnych genów. Sekwencjonowanie hodowanych mikroorganizmów jest nadal jedynym sposobem na pewne uzyskanie kompletnych genomów, dopóki technologie takie jak metagenomika typu shotgun i genomy składane metagenomem ze środowiska nie staną się akceptowalnie nieomylne5. Oceny genomiczne w połączeniu z hodowanymi mikroorganizmami dostarczają silnych wniosków dla zrozumienia "mikrobiologicznej ciemnej materii". Wielu członków "mikrobiologicznej ciemnej materii" pełni kluczowe funkcje, które wpływają na obieg składników odżywczych i innych pierwiastków oraz produkcję cennych produktów naturalnych, wspierają systemy ekologiczne i świadczą usługi ekologiczne. Z medycznego punktu widzenia około połowa wszystkich obecnie wprowadzanych na rynek farmaceutyków to produkty i pochodne produktów z bakterii, a podejrzewa się, że profilowanie gatunków niehodowanych może ujawnić antybiotyki przyszłości. Aby uzyskać dostęp do tej niekulturalnej większości, należy zwiększyć różnorodność metodologii hodowli6. Wśród członków "mikrobiologicznej ciemnej materii" beztlenowe mikroorganizmy oligotroficzne są w dużej mierze niedostatecznie opisywane i prawdopodobnie posiadają cenne ekologicznie i przemysłowo szlaki biochemiczne7, co czyni je ważnymi celami hodowli. Jednak beztlenowe mikroorganizmy oligotroficzne są trudniejsze do hodowli niż ich tlenowe i kopiotroficzne odpowiedniki ze względu na często wymagany dłuższy czas inkubacji, wybredne warunki (np. szczególne niestandardowe temperatury in vitro) oraz stosowanie specjalistycznych receptur pożywek.

Obecne techniki rozwoju kultur członków "mikrobiologicznej ciemnej materii", w tym nowych beztlenowych oligotroficznych mikroorganizmów, znacznie poprawiły nasze zrozumienie i zwiększyły reprezentację tych mikroorganizmów w drzewie filogenetycznym. Obecne techniki wykorzystujące pożywki informacyjne do hodowli nowych mikroorganizmów (tj. pożywki, które uzyskuje się na podstawie wiedzy o mikroorganizmie lub mikroorganizmach będących przedmiotem zainteresowania) można podzielić na trzy odrębne metody. Pierwsza z metod polega na bezpośrednim usunięciu dyskretnej części środowiska w celu przeniesienia jej do komory hodowlanej in vitro, która zawiera już interesujące mikroorganizmy w membranie. Sekcja dyskretna (np. Woda morska) działa w celu zapewnienia mikroorganizmom będącym przedmiotem zainteresowania siedliska geochemicznego, z którego korzystają in situ, podczas gdy błona zatrzymuje ruch komórek w poprzek (komórki będące przedmiotem zainteresowania pozostaną w środku; obce komórki, które przybyły z sekcją dyskretną, pozostaną na zewnątrz). Poprzez włączenie związków naturalnie dostępnych dla mikroorganizmów docelowych w ich naturalnym środowisku, takie mikroorganizmy mogą być hodowane8. Druga metoda wykorzystuje metatranskryptomikę lub genomikę w celu wyjaśnienia możliwości metabolicznych, dostarczając wskazówek dotyczących zawężenia parametrów hodowli dla docelowego projektu pożywki. Takie podejście zapewnia profil ekofizjologiczny, który można wykorzystać do ukierunkowania na wzbogacanie określonych typów mikroorganizmów poza środowiskiem. Zapasy pożywki są dostosowane do zidentyfikowanych genów, które przypuszczalnie wspierają docelowe mikroorganizmy w celu zmniejszenia różnorodności wzbogacania,9,10. Jednym zastrzeżeniem jest to, że informacja genomiczna nie wnioskuje bezpośrednio o ekspresji genów, podczas gdy informacja transkryptomiczna tak.

Trzecia metoda obejmuje media informowane i symulowane przez środowisko, w odróżnieniu od pierwszej metody, która nie symuluje mediów, ale raczej wykorzystuje środowisko bezpośrednio jako źródło mediów. Ta trzecia metoda wymaga rekonesansu środowiskowego geochemii terenu zawierającego interesujące mikroorganizmy. Dzięki tej wiedzy identyfikowane są podstawowe składniki i parametry fizyczne w celu wytworzenia symulowanego podłoża opartego na informacjach środowiskowych. Pożywka jest następnie bezpośrednio infuzji osadu lub cieczy zawierającej mikroorganizmy z otoczenia do pożywki. Metoda ta ma szczególne znaczenie w przypadkach, gdy mikrobiolog zajmujący się hodowlą nie ma dostępu do wystarczających ilości środowiska źródłowego (wymaganych dla pierwszej metody) ani odpowiednich danych metatranskryptomicznych lub genomicznych (wymaganych dla drugiej metody).

Poniższy protokół jest przykładem trzeciej metody; jest on oparty na symulacji interesujących środowisk i ma na celu symulację. W protokole przedstawiono równolegle trzy receptury oparte na pożywkach ukierunkowanych na różne kultury mikroorganizmów beztlenowych nabyte w terenie. Trzy reprezentowane kultury to kultury mieszane pochodzące z gleby (zwane dalej kulturą mieszaną gleby), kultury mieszane pochodzące z odwiertu (zwane dalej kulturą mieszaną w odwiercie) oraz wyizolowany metanogen pochodzący z odwiertu (zwany dalej metanogenem izolowany w odwiercie). Tożsamości i ilości złożone w przepisach na podłoża udostępnione tutaj mają służyć jako przewodnik początkowy; Są w stanie i są zachęcani do dostosowywania się do środowiska czytelnika i interesujących go mikroorganizmów.

Protokół

1. Produkcja konfigurowalnego płynnego podłoża beztlenowego

  1. Pożywka do butelek hodowlanych (produkcja 500 ml)
    1. Odmierz i dodaj związki do butelki o pojemności 1 litra i dostosuj pH za pomocą kolumny w tabeli 1 odpowiadającej kulturze interesującej czytelnika (ilości w tabeli 1 są rejestrowane dla produkcji 1000 ml, odpowiednio dostosuj). Wymieszaj związki do uzyskania jednorodności, obracając butelkę.
    2. Podgrzej płyn do wrzenia, podgrzewając butelkę w kuchence mikrofalowej przez 5-6 minut. Często otwieraj kuchenkę mikrofalową i delikatnie obracaj płynem za pomocą żaroodpornej rękawicy. Szybko otwórz kuchenkę mikrofalową, jeśli płyn zatrzyma się po bulgotaniu; W przeciwnym razie płyn może szybko się rozszerzyć i przelać butelkę.
    3. Podłącz sterylną szklaną pipetę o pojemności 10 ml do zestawu kolektora gazowego N2 (w oparciu o projekt Balch et al.11, chociaż nie wymaga podgrzewanej kolumny miedzianej dla gazu N2 o czystości; więcej informacji na temat kolektora gazowego można znaleźć w pliku uzupełniającym 1). Otwórz kolektor, aby odpowietrzyć O2 i pozwól wypłynąć gazowi N2.
    4. Umieść końcówkę pipety w cieczy i wyreguluj przepływ gazu tak, aby pęcherzyki były umiarkowanie energiczne. Przepłukać płynN2 do momentu, gdy butelka nie będzie już zbyt gorąca, aby ją dotknąć.
      UWAGA: Jest to zależne od zawartości nośnika, ale zwykle trwa ~20 minut.
    5. Czekając, aż butelka ostygnie, rozłóż 10 sterylnych butelek z kulturami o pojemności 100 ml; lub, jeśli przygotowujesz pożywkę do pobrania mieszanej kultury glebowej, ustaw dwie sterylne butelki o pojemności 500 ml.
    6. Gdy butelka z pożywką ostygnie w dotyku, pociągnij końcówkę pipety do góry w przestrzeń nad butelką. Dodać 0,125 gNaHCO3 i 0,300 g Na2S∙9H2Oi poczekać, aż rezazuryna stanie się bezbarwna.
      UWAGA: Na2S∙9 H2O jest, toksyczny i drażniący. Podczas pracy z metalowymi narzędziami należy używać środków ochrony osobistej, a po kontakcie dokładnie wypłukać metalowe narzędzia.
    7. Czekając, aż rezazuryna zmieni kolor, przymocuj metalowe kaniule do zestawu kolektora gazowego i umieść końcówki kaniuli w butelkach hodowlanych. Dostosuj przepływ N2 do butelek do umiarkowanej szybkości, tak aby płyn dodany w kolejnym kroku nie rozpryskiwał się z powodu przepływu gazu.
    8. Gdy rezazuryna stanie się bezbarwna, należy wlać 50 ml płynu do każdej butelki hodowlanej lub 250 ml płynu do każdej butelki o pojemności 500 ml.
    9. Natychmiast po wyjęciu kaniul należy zakręcić każdą butelkę gumowym korkiem o odpowiedniej wielkości. Zabezpiecz korek aluminiową uszczelką (w przypadku butelek hodowlanych) lub zakrętką GL45 z otwartą górą (w przypadku butelek o pojemności 500 ml).
    10. Umieść butelki w pojemniku na autoklawowium i napełnij pojemnik wodą z kranu, aż poziom wody zrówna się z poziomem w butelkach.
      UWAGA: Zapewni to, że butelki nie pękną z powodu naprężeń spowodowanych różnicami temperatur na szkle podczas autoklawowania.
    11. Butelki należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 minut.
  2. Podłoże do bioreaktora (produkcja 8 L)
    1. Przygotowanie gąsiora
      1. Otwórz zawór kulowy z zadziorem węża 1/4" (6.4 mm). Przymocuj dwie 6-centymetrowe rurki silikonowe o średnicy wewnętrznej (ID) 1/4" (6.4 mm) i średnicy zewnętrznej (OD) 1/2" (12.7 mm) na obu końcach zaworu kulowego z zadziorem węża.
      2. Do jednego końca zespołu przymocuj złączkę adaptera króćca węża 5/16"-1/4" (7.9 mm-6.4 mm). Przymocuj drugi koniec zespołu do króćca węża 8-litrowego balonu.
      3. Użyj opaski zaciskowej, aby zabezpieczyć połączenie między króćcem węża gążka a rurką oraz połączenie między złączką adaptera węża a rurką.
      4. Autoklawować gąsiora z montażem w temperaturze 121 °C przez 30 min.
    2. Średnia produkcja
      1. Zamknij zawór kulowy z zadziorem węża na zespole gąsiora o pojemności 8 l.
      2. Odmierzyć i dodać związki do 8-litrowego balonu i dostosować pH za pomocą kolumny w tabeli 1 odpowiadającej kulturze interesującej czytelnika (ilości w tabeli 1 są rejestrowane dla produkcji 1000 ml, należy odpowiednio dostosować). Dodaj mieszadło i użyj mieszającej płyty grzejnej, aby wymieszać związki do jednorodności.
      3. Podgrzej płyn do wrzenia za pomocą mieszającej płyty grzejnej. Pozostaw płyn do wrzenia przez 30 min.
        UWAGA: Podgrzanie płynu do wrzenia zależy od zawartości podłoża, ale może zająć 2-3 godziny.
      4. Podłącz sterylną szklaną pipetę o pojemności 10 ml do zestawu kolektora gazowego N2 (w oparciu o projekt Balch et al.11, chociaż nie wymaga podgrzewanej kolumny miedzianej dla gazu N2 o czystości; więcej informacji na temat kolektora gazowego można znaleźć w pliku uzupełniającym 1). Otwórz kolektor, aby odpowietrzyć O2 i pozwól wypłynąć gazowi N2.
      5. Wyłącz ogrzewanie, a następnie umieść końcówkę pipety w płynie i wyreguluj przepływ gazu tak, aby pęcherzyki były umiarkowanie energiczne, ale nie przepełnione. Przepłukiwać płyn roztworem N2 przez 30 minut.
      6. Pociągnij końcówkę pipety do góry w przestrzeń nad gąsiorem. Dodać 2,0 gNaHCO3 i 4,8 g Na2S∙9 H2O i poczekać, aż rezazuryna stanie się bezbarwna.
        UWAGA: Na2S∙9 H2O jest, toksyczny i drażniący. Podczas pracy z metalowymi narzędziami należy używać środków ochrony osobistej, a po kontakcie dokładnie wypłukać metalowe narzędzia.
      7. Gdy rezazuryna stanie się bezbarwna, wyjmij szklaną pipetę i natychmiast zakryj gąsiora korkiem #10. Owinąć drut nad korkiem i wokół krawędzi gąsiora, aby zabezpieczyć korek.

2. Pozyskiwanie in situ mikroorganizmów beztlenowych w środowisku

  1. Powierzchniowe pobieranie próbek beztlenowych (kultura mieszana w glebie)
    1. Przynieś butelkę/butelki z mieszaną pożywką do hodowli gleby wykonaną jak powyżej i rdzeń na pole.
      UWAGA: Autorzy używają standardowego wiertła do gleby Giddings 2 5/8" (Tabela materiałów). Można jednak użyć dowolnego rdzenia glebowego lub kielni, które mogą pobrać próbki na żądaną głębokość.
    2. Wepchnij rdzeń (wbijanie pali/kołków) w osad, aż górna część cylindra do pobierania próbki zrówna się z powierzchnią osadu.
    3. Przekręć rdzeń o 90°, aby uwolnić rdzeń i pociągnij w górę, aż próbka zostanie wydobyta z otoczenia.
    4. W luźnych osadach (takich jak te, które można napotkać podczas pobierania próbek z terenów podmokłych), przykryj podstawę rdzenia nową ręką w rękawicy nitrylowej podczas ekstrakcji, aby zapobiec wypadaniu próbki lub rozprzestrzenianiu się jej do wody podczas ekstrakcji.
    5. Szybko przybliż na oko 6-7 cm w górę od podstawy rdzenia. Użyj nowej nitrylowej rękawicy, aby pokroić rdzeń i oddzielić spód na 6-7 cm.
    6. Natychmiast przenieś dno rdzenia do butelki hodowlanej. Jeśli gleba/osad jest zbyt duży, szybko uformuj go, aby łatwiej zmieścił się w butelce, minimalizując narażenie na atmosferę tlenową tak bardzo, jak to możliwe.
    7. Po przeniesieniu próbki należy natychmiast zmienić położenie korka i przytrzymać go na miejscu za pomocą nakrętki.
    8. Utrzymuj próbkę w chłodnym miejscu. Butelkę do pobrania należy przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C po powrocie do laboratorium.
  2. Podpowierzchniowe pobieranie próbek beztlenowych (mieszana kultura w odwiercie)
    1. Umieść sterylną butlę o pojemności 1 l przy kolektorze gazowym. Zakręć butelkę gumowym korkiem. Wlej 100% etanol na korek i podpal go za pomocą zapalniczki.
    2. Przymocuj sterylną igłę 23 G do zestawu kolektora gazowego N2. Otwórz kolektor, aby odpowietrzyćO2 i pozwól, aby gazN2 (lub Ar) wypłynął z umiarkowaną prędkością.
    3. Gdy korek przestanie się palić, włóż igłę do butelki. Włożyć do butelki drugą sterylną igłę 23 G, która nie jest przymocowana do kolektora gazowego. Płucz butelkę przez 1-2 minuty.
    4. Wyjmij igłę, która nie jest przymocowana do kolektora gazowego. Zwiększaj ciśnienie w butelce przez 1 minutę. Wyciągnij pozostałą igłę.
    5. Przynieś butelkę pod ciśnieniem i wysterylizowaną igłę 23 G do miejsca odwiertu. Pobrać ciecz z odwiertu zgodnie z metodami Merino et al.12.
      UWAGA: W zależności od metody, połączenia i natężenia przepływu odwiertu zmienia to strategię pozyskiwania próbki wody. Jeśli woda przepływa w sposób ciągły, zbieraj wodę zgodnie z opisem w kroku 2.2.6. będzie wystarczające. Jeśli przepływ wody jest zbierany partiami lub ma niski przepływ, można zastosować alternatywną metodę wlotu/wylotu. We wszystkich sytuacjach należy zminimalizować zanieczyszczenie i upewnić się, że pobrana próbka jest reprezentatywna dla środowiska, w którym pobierana jest próbka. Jest to stwierdzenie szeroko uogólnione, ponieważ z doświadczenia autorów wynika, że każde zdarzenie związane z pobieraniem próbek z witryn rządowych lub prywatnych musiało być w dużym stopniu dostosowane do dostępnej dostępności.
    6. Szybko otwórz butelkę, wpompuj płyn, aby całkowicie napełnić butelkę, i zamknij butelkę.
    7. Włóż igłę 23 G, która została przyniesiona na miejsce, do gumowego korka butelki, aby zmniejszyć ciśnienie w butelce. Wyciągnąć igłę.
    8. Utrzymuj próbkę w chłodnym miejscu. Butelkę do pobrania należy przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C po powrocie do laboratorium.

3. Hodowla in vitro mikroorganizmów beztlenowych nabytych w terenie

  1. Wzrost przez butelkę z kulturą
    1. Wyłożyć sterylną butelkę N2 z korkiem oraz butelki z kulturami bakterii i butelkę do pobierania przygotowane w sposób opisany powyżej. Wlej 100% etanolu na korki i podpal je za pomocą zapalniczki.
    2. Założyć igłę 23 G na strzykawkę o pojemności 1 ml. Gdy korki przestaną się palić, włóż igłę do butelkiN2 i nabierz ~1 mlN2. Wyciągnąć igłę.
    3. Powoli naciskać tłok, aby zwolnić N2. Jak tylko strzykawka będzie pusta, włożyć igłę do butelki zbiorczej i pobrać 0,5 ml próbki środowiskowej. Wyciągnąć igłę.
    4. Włożyć igłę do butelki hodowlanej i wstrzyknąć próbkę. Wyciągnąć igłę.
    5. Zakręć butelką i umieść ją w inkubatorze o temperaturze zgodnej z Tabelą 1 lub w otoczeniu czytelnika.
      UWAGA: Postęp hodowli (w butelce lub bioreaktorze) jest monitorowany za pomocą hemocytometru Petroffa-Hausera o głębokości 0,02 mm. Wzbogacanie mikroorganizmów beztlenowych lub wybrednych zazwyczaj nie osiąga gęstości komórek, w których można użyć OD600, a inne metody wykrywania są niepraktyczne w przypadku rutynowego i powtarzalnego monitorowania. Granice wykrywalności, kontrola jakości i obliczenia statystyczne są zależne od rodzaju komory zliczania komórek i potrzeb użytkownika.
  2. Wzrost za pomocą bioreaktora
    1. Przygotowanie balonu za pomocą zmodyfikowanej strzykawki
      1. Wyjąć tłok z trzech strzykawek typu luer lock o pojemności 10 ml (po jednej na każdy zestaw końcowy). Odetnij kołnierz z każdej strzykawki i spiłuj odcięty koniec, aby nie przebił balonów. Oczyść wszystkie spiłowane wióry ze zmodyfikowanej strzykawki.
      2. Przygotuj zduplikowany balon, umieszczając jeden balon w drugim.
      3. Rozciągnij koniec podwójnego balonu na zmodyfikowanej strzykawce o pojemności 10 ml.
      4. Nieznacznie oddziel koniec balonu zewnętrznego od balonu wewnętrznego. Wyciśnij całe powietrze uwięzione między balonami.
      5. Zaciśnij opaskę zaciskową wokół podstawy balonów, aby przymocować balony do strzykawki.
    2. Przygotowanie zmodyfikowanego korka
      1. Usunąć tłoki z dziesięciu strzykawek typu luer lock o pojemności 1 ml (po dwa na każdy korek, który ma zostać zmodyfikowany). Odciąć kołnierz od strzykawek.
      2. Ustaw dwa gumowe korki w rozmiarze #10 (do balonów 8 L) i trzy w rozmiarze do butelek z gwintem GL45 (do butelek z wychwytywaniem). Za pomocą wiertła 1/4" (6,4 mm) wywierć dwa otwory w górnej części każdego gumowego korka wystarczająco szerokie, aby zmieściły się zmodyfikowane strzykawki i wystarczająco wąskie, aby dopasowanie było szczelne.
      3. Wprowadzić zmodyfikowane strzykawki przez otwory w gumowym korku.
      4. Zmodyfikowany korek należy oczyścić i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 minut.
    3. Przygotowanie zespołu bioreaktora
      1. Zdezynfekuj 70% etanolem wszystkie zawory odcinające, żeńskie złącza adaptera luer lock i inne materiały bioreaktora, które nie nadają się do sterylizacji w autoklawie, a następnie sterylizuj w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 minut wszystkie rurki (po przycięciu na długość), korki, watę szklaną i inne materiały bioreaktora nadające się do sterylizacji w autoklawie.
      2. Ustaw sterylny bioreaktor (Rysunek 1 i Rysunek 2) na stojaku pierścieniowym i zabezpiecz go paskiem do łańcucha. Należy również przygotować łaźnię wodną, pompę perystaltyczną, zakorkowany 8-litrowy balon zawierający pożywkę (z kroku 1.2 protokołu), jedną butelkę o pojemności 3,5 l (butelkę bez pobierania próbek) i jedną butelkę o pojemności 500 ml (butelkę do pobierania próbek).
      3. Zamykanie gąsiora
        1. Ustaw balon ze zmodyfikowaną strzykawką. Podłączyć trójdrożny kran do końcówki strzykawki typu luer lock.
        2. Weź zespół balonu i podłącz trójdrogowy kran do rurki zbiornika N2. Przekręć trójdrogowy kurek, aby zablokować koniec otwarty na atmosferę.
        3. Otwórz zbiornik paliwa i napełnij balon N2. Po napełnieniu przekręć trójdrożny kurek, aby zablokować koniec balonu. Zamknij zbiornik paliwa i odłącz rurkę zbiornika od trójdrogowego zaworu odcinającego.
        4. Podłącz kolejno następujące elementy: zawór trójdrogowy (balonu ze zmodyfikowaną strzykawką), zawór odcinający dwukierunkowy, żeński łącznik adaptera luer lock i końcówkę luer lock jednej ze strzykawek zmodyfikowanego korka.
        5. Do końcówki luer lock drugiej strzykawki podłączyć dwukierunkowy zawór odcinający. Zamknąć oba zawory dwudrogowych zaworów odcinających na zmodyfikowanym zespole korka.
        6. Odkręć drut przytrzymujący niezmodyfikowany korek gąsiora w rozmiarze #10. Szybko wymień niezmodyfikowany korek na zmodyfikowany zespół korka i przekręć drut jak poprzednio, aby przymocować zmodyfikowany zespół korka do gąsiora.
          UWAGA: Jeśli jest pewny siebie i przygotowany, zmodyfikowany zespół korka może być użyty do zakorkowania gąsiora na ostatnim etapie przygotowania podłoża (krok 1.2.2.7).
        7. Przekręć trójdrogowy kurek, aby zablokować koniec otwarty na atmosferę. Otwórz kolejno dwukierunkowy kran odcinający. Gaz z balonu i przestrzeń nad głową 8-litrowego balonu są teraz połączone.
      4. Zamykanie butelek niepobierających próbek i butelek do pobierania próbek
        1. Zakorkować 3,5-litrową butelkę bez pobierania próbek zmodyfikowanym korkiem o rozmiarze przeznaczonym do butelek z gwintem GL45, nakładając 70% etanolu na podstawę korka, aby ułatwić dopasowanie go do butelki. Zakręć butelkę zakrętką GL45 z otwartym otworem.
        2. Podłącz kolejno następujące elementy: balon z końcówką typu luer lock zmodyfikowanej strzykawki, zawór odcinający trójdrożny, żeński łącznik adaptera luer lock oraz końcówkę luer lock jednej ze strzykawek zmodyfikowanego korka. Przekręć zawór trójdrogowy, aby zablokować koniec otwarty bezpośrednio do atmosfery.
        3. Do końcówki luer lock drugiej strzykawki podłączyć żeńskie złącze adaptera luer lock.
        4. Powtórz powyższe trzy kroki dla butelki do pobierania próbek o pojemności 500 ml.
      5. Konfiguracja przewodów rurowych
        1. Zmierz odległość między portami płaszcza wodnego bioreaktora a króćcami węża kąpieli wodnej. Wytnij dwie długości silikonowej rurki o średnicy wewnętrznej 3/16" (4.8 mm) i średnicy zewnętrznej 3/8" (9.5 mm), aby rozciągnąć tę odległość.
        2. Zamontuj dwa proste złącza węży z otwartymi nakrętkami GL14. Przymocuj każde z nich do jednego końca dwóch odcinków rurki.
        3. Przekręć nakrętki na porty płaszcza wodnego bioreaktora. Przymocuj drugie końce rurki do zadziorów węża kąpieli wodnej tak, aby woda wypłynęła z łaźni wodnej, weszła na dole płaszcza wodnego bioreaktora, wyszła na górze płaszcza wodnego i wróciła do łaźni wodnej. Zaciśnij opaski zaciskowe wokół końców rurki, aby przymocować rurkę do zadziorów węża kąpieli wodnej.
        4. W przypadku pomp podobnych do minipompy o zmiennym przepływie VWR Ultra Low Flow należy przewlec przez pompę dołączony przewód rurowy o średnicy zewnętrznej 3/16" (4,8 mm).
        5. Zmierz odległość między zespołem rurki gąsienicy a zespołem rurki pompy perystaltycznej. Wytnij rurkę silikonową o średnicy wewnętrznej 3/16" (4.8 mm) i średnicy zewnętrznej 3/8" (9.5 mm), aby rozciągnąć tę odległość.
        6. Przymocuj jeden koniec rurki do króćca węża zespołu rurki gąsiora, a drugi do króćca węża zespołu rurki pompy perystaltycznej, zorientowany tak, aby medium przepływało z gąsiora i przez pompę perystaltyczną.
        7. Zmierz odległość między zespołem przewodów pompy perystaltycznej a dolnym portem bioreaktora. Wytnij rurkę silikonową o średnicy wewnętrznej 3/16" (4.8 mm) i średnicy zewnętrznej 3/8" (9.5 mm), aby rozciągnąć tę odległość.
        8. Podłącz jeden koniec tej rurki do króćca węża zespołu rurki pompy perystaltycznej, a drugi ostrożnie przymocuj do dolnego portu bioreaktora. Uważając, aby nie pęknąć szkła, ale także zabezpieczyć połączenie, zaciśnij opaskę zaciskową wokół końca rurki, aby przymocować rurkę do dolnego portu bioreaktora.
        9. Zmierz i przytnij rurkę silikonową o średnicy zewnętrznej 3/16" (4.8 mm) o średnicy wewnętrznej 3/16" (127 mm) (5 mm).
        10. Podłącz żeńskie złącze adaptera luer lock do trójdrożnego kranu. Podłącz dowolny koniec trójdrożnego kranu do rurki.
        11. Zamontuj jedno kątowe złącze węża z otwartą nakrętką GL14. Przymocuj go do drugiego końca rurki.
        12. Przekręć nakrętkę na najwyższy pionowy port bioreaktora. Przekręć zawór trójdrogowy, aby zablokować koniec wskazujący na bioreaktor.
        13. Zmierz odległość między najwyższym pionowym zespołem portu a zespołem butelki z wychwytem bez pobierania próbek. Wytnij rurkę silikonową o średnicy wewnętrznej 3/16" (4.8 mm) i średnicy zewnętrznej 3/8" (9.5 mm), aby rozciągnąć tę odległość. Odetnij kołnierze z dwóch strzykawek typu luer lock o pojemności 1 ml i włóż je do końców rurki.
        14. Przymocuj jeden koniec tego zespołu przewodów do trójdrogowego kranu najwyższego pionowego zespołu portu, a drugi koniec przymocuj do żeńskiego złącza adaptera luer lock na zespole butelki z chwytakiem bez pobierania próbek.
        15. Zmierzyć odległość między najwyższym pionowym zespołem portu a zespołem butelki do pobierania próbek. Wytnij rurkę silikonową o średnicy wewnętrznej 3/16" (4.8 mm) i średnicy zewnętrznej 3/8" (9.5 mm), aby rozciągnąć tę odległość. Odetnij kołnierze z dwóch strzykawek typu luer lock o pojemności 1 ml i włóż je do końców rurki.
        16. Podłącz jeden koniec tego zespołu przewodów do trójdrogowego kurka najwyższego pionowego zespołu portu, a drugi podłącz do żeńskiego złącza adaptera luer lock na zespole butelki do pobierania próbek.
    4. Napełnianie bioreaktora
      1. Zakryj jeden z portów GL18 bioreaktora białą gumową przegrodą. Zakryj drugi port GL18 i pozostałe pionowe odsłonięte porty GL14 silikonowymi przegrodami o rozmiarze GL18/GL14 z powłoką PTFE (PTFE skierowaną w stronę szkła) i otwartymi górnymi nakrętkami.
      2. Za pomocą pręta o długości 50 cm zapakuj 0,9 g waty szklanej do podstawy bioreaktora.
      3. Autoklaw 1,3 l piasku w temperaturze 121 °C przez 30 min. Napełnić bioreaktor piaskiem za pomocą lejka.
        UWAGA: W tym miejscu można zastąpić inne rodzaje osadów oparte na środowisku czytelnika i interesujących nas mikroorganizmach.
      4. Umieść rurkę w zbiorniku N2 w górnej części bioreaktora i przepłucz przestrzeń nad bioreaktorem N2 przez 2 minuty. Natychmiast przykryj bioreaktor korkiem w rozmiarze #7 i otwartą nakrętką GL45.
      5. Od butelki do pobierania próbek odłączyć rurkę i przekręcić zawór trójdrogowy, aby zablokować koniec wskazujący na balon. Podłącz rurkę do zbiornika N2 do żeńskiego złącza adaptera luer lock i przepłucz przestrzeń nad bioreaktorem za pomocą N2 przez 2 minuty. Natychmiast podłącz rurkę i włóż z powrotem trójdrożny kurek, aby zablokować koniec otwarty na atmosferę.
      6. Powtórzyć powyższy krok dla butelki do pobierania próbek.
      7. Przekręć trójdrogowy kran najwyższego pionowego portu bioreaktora, aby zablokować koniec wskazujący na butelkę do pobierania próbek. Przepompować ciecz z gąsiora do bioreaktora. Wstrzymać pompę i odpowietrzyć balon butelki do pobierania próbek, a następnie w razie potrzeby napełnić balon balonu balonu balonuN2.
      8. Po napełnieniu bioreaktora medium ustaw natężenie przepływu pompy na 0,6 ml/min (wartość cyfrowa 40 na minipompie).
        UWAGA: W tym miejscu można zastąpić inne pożądane przez czytelnika natężenia przepływu.
      9. Ustawić temperaturę łaźni wodnej zgodnie z Tabelą 1 lub środowiskiem interesującym czytelnika.
        UWAGA: Inokulum można dodać w tym momencie lub później, w zależności od specyfiki badania. Jeśli zaszczepiasz w tym momencie, przejdź do kroku 3.2.4.10. Jeśli zaszczepiasz później, przejdź do kroku 3.2.5.
      10. Umieścić butelkę do zbierania lub butelkę z zaszczepioną kulturą i sterylną butelkę N2 z zakorkiem. Wlej 100% etanolu na korki i podpal je za pomocą zapalniczki.
      11. Założyć igłę 23 G na strzykawkę o pojemności 60 ml. Gdy korki przestaną się palić, włóż igłę do butelki N2 i pobierz ~ 50 ml N2. Wyciągnąć igłę.
      12. Powoli naciskać tłok, aby zwolnić N2. Jak tylko strzykawka będzie pusta, włożyć igłę do butelki do pobierania próbek i pobrać 50 ml próbki środowiskowej. Wyciągnąć igłę.
      13. Wymień igłę 23 G na sterylną długą metalową igłę (kaniula o długości 31,5 cm). Włóż długą metalową igłę przez białą gumową przegrodę w porcie GL18 bioreaktora.
      14. Wbić igłę w osad i wstrzyknąć inokulum. Wyciągnąć igłę.
    5. Bieżąca konserwacja bioreaktora
      1. Każdego dnia, w którym bioreaktor pracuje, wykonaj następujące czynności:
        1. Sprawdź poziom kąpieli wodnej. Jeśli jest niski, dodaj więcej wody (użyj wody destylowanej, aby zapewnić długowieczność sprzętu, zmniejszając korozję i gromadzenie się minerałów).
        2. Sprawdzić balon w butelce do pobierania próbek; pełny balon zahamuje przepływ pożywki. Po napełnieniu przekręć trójdrożny kurek, aby zablokować koniec wskazujący na butelkę z chwytem. Ściśnij balon, aby go opróżnić; następnie przywróć trójdrożny kurek, aby zablokować koniec otwarty na atmosferę; Powtarzaj, aż balon będzie pusty.
        3. Sprawdź balon balonu balonu 8 L. Jeśli jest niski, zamknij kolejno dwukierunkowy kran i odłącz trójdrogowy kran od dwukierunkowego kranu. Napełnij i ponownie zamocuj zespół balonu, wykonując czynności 3.2.3.3.2, 3.2.3.3.3 i 3.2.3.3.7.
        4. Sprawdź poziom pożywki w 8-litrowym balonie. Jeśli jest niski, zmontuj kolejny 8-litrowy balon i przygotuj więcej podłoża, postępując zgodnie z krokami protokołu 1.2. oraz 3.2.3.3. Wstrzymaj pompę, zamknij zawór kulowy z zadziorem węża, szybko odłącz stary gąsiorowiec i podłącz nowy gąsiek.
          UWAGA: Przy natężeniu przepływu 0,6 ml/min nowe podłoże będzie potrzebne co 9 dni.
        5. Sprawdzić poziom pożywki w butelce do pobierania próbek bez pobierania próbek. Jeśli jest pełna, zamontować kolejną butelkę do pobierania próbek zgodnie z krokiem 3.2.3.4.1. Przepłukać nową butelkę roztworem N2, szybko odłączyć balon ze zmodyfikowaną strzykawką i rurką od starej butelki i podłączyć do nowej butelki.
        6. Wyjąć zmodyfikowany korek z pełnej butelki do pobierania próbek. Autoklawować ciecz w temperaturze 121 °C przez 30 min; Następnie zutylizuj płyn zgodnie z polityką instytucjonalną czytelnika. Oczyść i autoklaw wszystkie elementy zespołu butelki z wychwytywaniem bez pobierania próbek, aby przygotować je do następnego użycia.
      2. Wykonuj pobieranie próbek co 7 (lub liczbę żądaną przez czytelnika) dni, wykonując następujące czynności:
        1. Przekręć trójdrożny kran najwyższego pionowego portu bioreaktora, aby zablokować koniec wskazujący na butelkę do pobierania próbek. Zbierz 250 ml płynu.
          UWAGA: Przy natężeniu przepływu 0,6 ml/min zebranie 250 ml zajmie ~7 godzin.
        2. Przywrócić trójdrożny kran najwyższego pionowego portu bioreaktora, aby zablokować koniec wskazujący na butelkę do pobierania próbek. Odłączyć rurkę i butelkę do pobierania próbek od trójdrogowego zaworu odcinającego najwyższego pionowego portu bioreaktora.
        3. Po zbadaniach, przechowywaniu i/lub prawidłowym usunięciu cieczy do pobierania próbek, należy oczyścić wszystkie elementy zespołu butelki do pobierania próbek z wyjątkiem balonu za pomocą zmodyfikowanej strzykawki. Autoklawować wszystkie elementy w temperaturze 121 °C przez 30 minut, z wyjątkiem balonu ze zmodyfikowanymi strzykawkami i żeńskimi złączami adaptera luer lock. Zebrać ponownie na następny dzień pobierania próbek.
          UWAGA: Zdecydowanie zaleca się zduplikowaną lub trzykrotną redundancję części, nasadek, rurek i przegród w celu szybkiej naprawy i wymiany w razie potrzeby.

Wyniki

Przedstawiamy tutaj wyniki badania z użyciem bioreaktora, w którym zastosowano opisaną w niniejszej pracy metodę przygotowania pożywki dla mieszanej kultury z otworu wiertniczego oraz metodę konfiguracji bioreaktora. Pożywka dla mieszanej kultury z otworu wiertniczego została zmodyfikowana tak, aby zawierała jako źródło węgla zawiesinę kolb kukurydzy poddanych utleniającemu rozpuszczaniu hydrotermalnemu (OHD)13,14. Zmodyfikowana pożywka dla mieszanej kultury z otworu wiertniczego była pompowana do bioreaktora przez 44 dni z prędkością 0,4 mL/min. W 23. dniu dodano inokulum pochodzące z otworu wiertniczego BLM-1 w regionie Death Valley w Nevadzie, USA15. Próbki cieczy z bioreaktora pobierano do butelki odbiorczej w dniach 1, 8, 15, 22, 23 (po inokulacji), 30, 37 i 44.

W celu monitorowania ogólnego stanu kultury szczepionki (oraz obecnych w osadzie bioreaktora mikroorganizmów, które przetrwały autoklawowanie przed inokulacją), pobierane próbki cieczy z bioreaktora poddawano bezpośrednim zliczeniom komórek. Bezpośrednie zliczanie komórek w pobranych próbkach cieczy przeprowadzono przy użyciu hemocytometru Petroffa-Hausera. Aby zidentyfikować składniki mikrobiologiczne bioreaktora, z próbek cieczy wyekstrahowano DNA, a następnie przeanalizowano geny 16S rRNA metodą sekwencjonowania następnej generacji (NGS). Dane NGS przetworzono wewnętrznie przy użyciu oprogramowania mothur zgodnie z procedurą MiSeq SOP16.

Przed inokulacją bezpośrednie zliczenia komórek często znajdowały się poniżej granicy wykrywalności (b.d.l.) wynoszącej 1,0 × 106 cells/mL. W 23. dniu (po inokulacji) odnotowano niską liczbę komórek wynoszącą 2,6 × 106 cells/mL, natomiast w kolejnych dniach 30., 37. i 44. liczby komórek przekraczały 1,0 × 107 cells/mL (Rysunek 3). Mimo że w dniach 1., 8. i 22. liczby komórek były poniżej granicy wykrywalności, w każdym punkcie czasowym wyekstrahowano DNA do analizy NGS, co wskazywało na podstawową obecność mikroorganizmów przedinokulacyjnych w osadzie, nawet po autoklawowaniu. Główny rodzaj obecny (określony na podstawie liczby odczytów w każdej jednostce taksonomicznej operacyjnej (OTU)) był stabilny w dniach 8., 15. i 22. i został zidentyfikowany jako Geobacillus. Po inokulacji szczepem BLM-1 w 23. dniu Geobacillus przestał dominować i pojawiły się nowe główne rodzaje wraz z wieloma rzadziej występującymi rodzajami, które w większości utrzymywały się do końca badania (Rysunek 4). Na tej podstawie wyciągnęliśmy wniosek, że inokulum BLM-1 było aktywną i dynamicznie zmieniającą się kulturą wewnątrz bioreaktora.

Dodatkowe badanie danych NGS ujawniło obecność przedstawicieli tzw. „mikrobiologicznej ciemnej materii” (microbial dark matter). Jako wskaźnik OTU zawierających członków „mikrobiologicznej ciemnej materii” przyjęto OTU z przypisanymi nazwami taksonomicznymi zawierającymi słowa „unclassified” (niezaklasyfikowane) lub „uncultured” (niehodowane). Dane NGS zebrano dla dnia 44. (ostatniego dnia po inokulacji mikroorganizmami z otworu wiertniczego BLM-1) i przefiltrowano tak, aby nie zawierały OTU, które posiadały odczyty w danych przed inokulacją (dni 1, 8, 15 lub 22), ponieważ te OTU najprawdopodobniej nie znajdowały się w inokulum. Przefiltrowane dane NGS z dnia 44. zawierały 1 844 OTU i 3 396 odczytów. Z tej liczby 366 OTU (20%) i 925 odczytów (27%) nie zostało zaklasyfikowanych na poziomie typu, a 1252 OTU (68%) i 2357 odczytów (69%) były niezaklasyfikowane lub niehodowane na poziomie rodzaju. Mimo krótkiego czasu trwania, w oparciu o ten wskaźnik, niniejsze badanie pilotażowe potwierdza potencjał bioreaktora z pożywkami dostosowanymi do warunków środowiskowych w hodowli przedstawicieli „mikrobiologicznej ciemnej materii”.

Równowaga statyczna; schemat; kurek, proces obrotu, przyłącza GL; projekt zestawu eksperymentalnego.
Rycina 1: Schemat zaprojektowanego bioreaktora borokrzemianowego używanego do hodowli beztlenowych. (A) Widok bioreaktora z jednej strony. (B) Widok uzyskany po obróceniu A o 90° (zgodnie z ruchem wskazówek zegara) wokół osi z). (C) Widok bioreaktora z góry. Konstrukcja z płaszczem grzewczym umożliwia kontrolę temperatury za pomocą wody lub oleju. Dwa porty płaszcza są widoczne po prawej stronie widoku w B. Wewnętrzną komorę można wypełnić dowolnym rodzajem osadu lub pozostawić pustą w celu hodowli planktonicznej. Trzy porty pobierkowe (widoczne po prawej stronie widoku w A) umożliwiają pobieranie materiału z różnych głębokości kolumny bioreaktora. Standardowe otwory GL 45, 18 i 14 można uszczelnić za pomocą septa teflonowych lub butylowych, które zapewniają szczelność gazową przez okres od 1 do 6 miesięcy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat stanu równowagi statycznej w systemie chromatografii filtracyjnej; monitory; przepływ cieczy; kolumna piaskowa.
Rysunek 2: Zespół aktywnego bioreaktora. Szkło laboratoryjne przedstawione na zdjęciu od lewej do prawej to (A) butla 8 L, (B) bioreaktor (patrz Rysunek 1) oraz (C) butelka odbiorcza bez systemu pobierania próbek. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Wykres wzrostu komórek; dodanie inokulum; eksperyment z hodowlą mikrobową; stężenie komórek w funkcji czasu.
Rycina 3: Bezpośrednie liczenie komórek w badaniu z użyciem bioreaktora. Populacje drobnoustrojów w bioreaktorze monitorowano przy użyciu komory liczbowej hemocytometru Petroffa-Hausera 0,02 mm. Inokulum dodano na początku 23. dnia. Liczba komórek w dniach 1, 8 i 22 była poniżej granicy wykrywalności. Efektywna granica wykrywalności bezpośredniego liczenia komórek wynosi 1 × 106 cells/mL. Skrót: b.d.l. = poniżej granicy wykrywalności. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy składu społeczności mikrobowej; liczba odczytów według dni, zaznaczono dodanie inokulum, pokazano różnorodność.
Rysunek 4: Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) z bioreaktora. OTU przedstawiono na skumulowanych wykresach słupkowych, wskazujących procent odczytów należących do unikalnych OTU z każdego punktu czasowego badania w bioreaktorze. Unikalne OTU przypisano do odpowiadającej im taksonomii na poziomie rodzaju. Rodzaj „Other” definiuje wszystkie rodzaje stanowiące mniej niż 10% odczytów w każdym punkcie czasowym. Całkowita liczba przedstawionych odczytów DNA wynosi 506 358. Liczba odczytów dla każdego punktu czasowego jest podana na górze wykresu. Inokulum dodano na początku 23. dnia. Skrót: OTU = Operational Taxonomic Unit (operacyjna jednostka taksonomiczna). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

ZwiązekIlość dla mieszanej kultury glebowejIlość dla mieszanej kultury z otworu wiertniczegoIlość dla metanogenów wyizolowanych z otworu wiertniczego
Woda destylowana1000,0 mL1000,0 ml1000,0 ml
HEPES3,600 g--
MOPS--2,000 g
MgCl22 ∙6 h2O0,400 g0,400 g0,400 g
KCl0,500 g0,250 g0,500 g
NH4Cl0,268 g0,268 g0,268 g
Na2SO4-0,284 g1,500 g
Na2HPO (histochemia i patomorfologia)4 ∙2 H2O--0,356 g
1 M KH2PO42PO4 przy pH 61,0 mL1,0 ml-
1 M HCl3BO3 przy pH 9,41,0 mL1,0 ml1,0 ml
pierwiastki śladowe1,0 ml-1,0 ml
Witaminy--1,0 ml
1 mg/mL rezazureny sodowej0,4 mL0,3 ml0,4 ml
regulacja pH do-7.07.0
regulacja pH za pomocą-NaOHKOH
Temperatura inkubacji25 °C60 °C47 °C

Tabela 1: Skład pożywek. Lista związków i parametrów fizycznych dla każdej pożywki. Przedstawione pożywki są podstawowe; nie zawierają one źródeł węgla i energii, ponieważ mogą one być specyficzne dla mikroorganizmów i środowiska badawczego użytkownika. Proponowane dodatki źródeł węgla i energii znajdują się w sekcji dyskusji.

Plik uzupełniający 1: Konfiguracja kolektora gazowego. Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.

Dyskusja

Część tego protokołu dotycząca produkcji medium (sekcja 1) zawdzięcza swoją strukturę zmodyfikowanej technice hungate Millera i Wolina17, która jest szeroko stosowana od czasu jej publikacji. Praktyczność tego rozszerzonego protokołu wynika z jego opisowego charakteru i powiązania z pozyskiwaniem mikroorganizmów in situ . Butelki hodowlane zawierające symulowane pożywki przyjazne dla środowiska wykorzystano do pomyślnego wyhodowania następujących byłych członków "mikrobiologicznej ciemnej materii" nabytych in situ: beztlenowych bakterii podpowierzchniowych Thermoanaerosceptrum fracticalcis szczep DRI1318, Caldiatribacterium inferamans szczep SIUC1 (numer dostępu MT023787; manuskrypt w przygotowaniu) oraz Anaerothermus hephaesti szczep SIUC3 (numer dostępu MK618647; manuskrypt w przygotowaniu) oraz niescharakteryzowany szczep beztlenowej bakterii podpowierzchniowej DRI14 (numer dostępu KR708540).

Jednym z celów tego protokołu jest to, że jest on wysoce przystosowany do powierzchniowych i podpowierzchniowych środowisk beztlenowych oraz mikroorganizmów. Po pierwsze, zachęca się do zmiany składu podłoża w celu odzwierciedlenia składu środowiska będącego przedmiotem zainteresowania. Na przykład 3 000 mg/L NaCl można dodać do receptury podczas symulacji środowiska o stężeniach jonów 3 000 mg/L zarówno dla Na+, jak i Cl-; lub 650 ml piasku i 650 ml łupków można umieścić w bioreaktorze podczas symulacji środowiska, w którym stosunek objętości piaskowca do łupków wynosi 1:1. Po drugie, skład pożywki może być modyfikowany, aby stymulować wzrost określonych mikroorganizmów będących przedmiotem zainteresowania. W szczególności naiwne media, takie jak trzy media przedstawione w tym artykule, są przygotowane na takie modyfikacje i są od nich zależne. Przykłady węgla i źródeł energii obejmują fumaran18, pepton18, materię organiczną zawierającą celulozę19, octan20, ekstrakt drożdżowy19,20, ksylitol (szczep SIUC1), mrówczan (szczep SIUC3) i inne potencjalne źródła, takie jakH2/CO2, cytrynian i glukoza. Wreszcie, skład podłoża można zmienić w zależności od pożądanego badania. Na przykład głównym celem badania opisanego w sekcji dotyczącej wyników reprezentatywnych było odkrycie, w jaki sposób reprezentatywne podpowierzchniowe mikroorganizmy beztlenowe zareagowałyby na unikalną mieszaną zawiesinę organiczną (zawiesinę kolb kukurydzy przetworzoną za pomocą OHD13,14); W związku z tym jego receptura zawierała to źródło węgla zamiast bardziej konwencjonalnych opcji. Inne potencjalne poprawki do konkretnych badań obejmują dodawanie tworzyw sztucznych, kwasów i metali ciężkich lub innych ksenobiotyków do badań bioremediacji; dodanie opornych polimerów węglowych, takich jak celuloza i tworzywa sztuczne, w celu badań nad produktami zdepolimeryzowanymi o wartości dodanej; oraz dodawanie obornika i odpadów roślinnych do kompostu na małą skalę i innych badań rolniczych.

Jeśli pożądana jest analiza pożywki po redukcji, taka jak pomiary pH, potencjału oksydacyjno-redukcyjnego (ORP) i tlenu rozpuszczonego (DO), można to osiągnąć pośrednio, poświęcając reprezentatywną liczbę butelek z pożywką, aby z pewnością zrozumieć charakter tej partii. Po wystawieniu szczelnie zamkniętej butelki z podłożem na działanie powietrza zdecydowanie zaleca się, aby odczyty ORP i DO były wykonywane poniżej 1 minuty po otwarciu. Pomiary niezależne od tlenu (np. pH) można wykonać w trybie pilnym po pierwszym otwarciu. Wybredne mikroorganizmy beztlenowe zazwyczaj wymagają do wzrostu wartości ORP < -200 mV. Jeśli podłoże daje wartość ORP > -200 mV i/lub wartości DO >0,40 mg/L, można zastosować dodatkowy Na2S (0,1-0,2 g/L) lub inny reduktor (np. cytrynian tytanu, L-cysteinę, kwas askorbinowy) w celu dalszej redukcji pożywki.

Rezazuryna jest często używana jako wskaźnik tlenu (jak w tym protokole); Jednak dokładniej jest to wskaźnik redoks21, wskazujący na obecność tlenu pośrednio, gdy tlen zmienia potencjał redoks roztworu. Rezazuryna w roztworze początkowo ma niebieski kolor. Po wystawieniu na działanie środków redukujących roztwór nieodwracalnie zmienia kolor na różowy. Gdy roztwór jest dalej redukowany, odwracalnie zmienia się w bezbarwny i powraca do koloru różowego po utlenieniu. Autorzy zaobserwowali przypadki, w których zredukowane podłoża zawierające rezazurynę przesunęły się z niebieskiego na różowy, ale nie przesunęły się na bezbarwne. Jednak autorzy zaobserwowali również, że takie media często zmieniają się w bezbarwne po autoklawowaniu, a wydłużony czas spędzony na gotowaniu i płukaniu pożywki na ogół pozwala rezazurynie przejść do bezbarwnej postaci po dodaniu reduktorów. W razie potrzeby stężenie tlenu w pożywce można sprawdzić za pomocą sondy tlenu rozpuszczonego.

Wszystkie materiały potrzebne do uruchomienia tych bioreaktorów i same szklane bioreaktory wykonane na zamówienie nie przekroczyły ~5 tys. USD (przy założeniu, że sprzęt pomocniczy jest już dostępny, taki jak łaźnie wodne, pompy i inkubatory). Te techniki uprawy beztlenowej są ekonomicznie przyjazne w porównaniu z komercyjnymi automatycznymi bioreaktorami, których ceny mogą zaczynać się od 10 tys. > USD. Ponadto wiele komercyjnych bioreaktorów przechodzi na jednorazowe pojemniki reaktorów, co zmienia dynamikę porównań i nie jest opłacalne dla mniejszych laboratoriów badawczych/uniwersytetów, aby je stale wymieniać. Ponadto systemy komercyjne mogą mieć uprzedzenia chemiczne związane z produkcją (z powodu zastosowanych tworzyw sztucznych, smaru na uszczelkach/złączkach lub chemicznie uzdatnionej wody), które wpłyną na sukces hodowli wybrednych mikroorganizmów. Niski koszt, możliwość dostosowania i wszechstronność pobierania beztlenowej próbki środowiskowej w połączeniu z pożywką, którą można zaszczepić, co skutkuje generowaniem wzbogaceń do badań, znacznie zwiększa szanse na uzyskanie unikalnych mikroorganizmów.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy pragną podkreślić rodowód informacji i mentoringu, które wpłynęły/rozwinęły te techniki na przestrzeni lat. Dr Hamilton-Brehm jako były doktorant, doktorant, a obecnie profesor ma dług wdzięczności wobec tych, którzy poświęcili czas na nauczanie technik beztlenowych: Dr Mike Adams, Dr. Gerti Schut, Dr. Jim Elkins, Dr Mircea Podar, dr Duane Moser i dr Brian Hedlund. Nature Conservancy i American Rivers wsparły te prace poprzez granty odpowiednio G21-026-CON-P i AR-CE21GOS373. Wszelkie opinie, ustalenia, wnioski lub zalecenia wyrażone w tym artykule są opiniami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy Nature Conservancy lub American Rivers. Prace te zostały wsparte grantem z SIU Advanced Energy Institute, który z wdzięcznością dziękuje za finansowanie przyznane za pośrednictwem Advanced Energy Resource Board. NGS został wykonany przez LC Sciences.

Materiały

2
Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
General Materials
1 L butelka borokrzemianowaFisher Scientific
1 ml szklana pipetaFisher Scientific
100 mlFisher Scientifc
Fisher Scientifc
23 G IgłaFisher Scientifc
500 ml butelka borokrzemianowaFisher Scientific
Aluminiowa uszczelkaKaniula Fisher Scientifc
, długość 31,5 cmKaniula Fisher Scientific
, długość 6 cmFisher Scientifc
CorerFirma Giddings Machine Company Zmontowany z części firmowych
Kolektor gazowySwagelokZłożony z wielu różnych części
ZapalniczkaLowe's
nitrylowe
Gumowy korek (do butelek GL45)Glasgeratebau OCHS
Gumowy korek (do butelek hodowlanych)Ace Glass
Mieszanie gorącej płytyCorning
Minerały śladoweATCC
WitaminyATCC ATCC
strong>Materiały specyficzne dla bioreaktorów
#10 gumowy korekAce Glass
#7 gumowy korekFisher Scientifc
1 ml z końcówką typu luer lockFisher Scientifc
1/4" zawór kulowy z zadziorem do wężaStrzykawka Amazon
10 ml z końcówką typu luer lockFisher Scientifc
3,5 lFisher Scientific
5/16" - 1/4" adapter zadzioru węża dopasowaniestrzykawki Amazon
60 ml z końcówką luer lockFisher Scientifc
8 L borosillikate carboyAllen Glass
Kątowe złącze węża do GL14 otwarta górna nasadkaAce Glass7623-20
BalloonParty City
Bioreaktor borokrzemianowyAllen Scientific GlassWykonane na zamówienie
DrillLowe's
Szkło7625-06
Przegroda silikonowa pokryta PTFE do GL18 otwarta górna nasadkaAce Glass7625-07
Stojak na pierścionkiFisher Scientific
Zacisk łańcuchowyAmazon
Zacisk stojaka pierścieniowegoFisher Scientific
Rurki silikonowe; 1/4" średnica wewnętrzna, 1/2" odGrainger55YG13
Rurka silikonowa; 3/16" id, 3/8" odGrainger
Złącze proste do GL14 otwarta górna nasadkaAce Glass7623-22
Zawór trójdrogowyAmazon
Dwukierunkowy kran odcinającyAmazon Minipompa
Łaźnia wodnaFisher Scientifc
Biała gumowa przegroda do rur o średnicy 13-18 mmAce Glass9096-49
DrutLowe's
1 ml strzykawka z końcówką Fisher Scientific 10 ml Butelka hodowlana Fisher Scientific Zaciskarka ręczna 20 mm N gazowe Rękawice Airgas Fisher Scientific < Strzykawka Butelka borokrzemianowa Żeński łącznik adaptera luer lock Amazon GL14 otwarta górna nasadka Ace Glass 7621-04 GL18 otwarta górna nasadka Ace Glass 7621-08 GL45 otwarta górna nasadka Ace Glass z powłoką PTFE silikonowa przegroda do GL14 otwarta górna nasadka Ace stojaka na pierścionki o zmiennym przepływie o bardzo niskim przepływie VWR Opaska zaciskowa Lowe's

Bibliografia

  1. Staley, J. T., Konopka, A. Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annu. Rev. Microbiol. 39 (1), 321-346 (1985).
  2. Lloyd, K. G., Steen, A. D., Ladau, J., Yin, J., Crosby, L. Phylogenetically novel uncultured microbial cells dominate earth microbiomes. MSystems. 3 (5), e00055(2018).
  3. Rinke, C., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
  4. Marcy, Y., et al. Dissecting biological "dark matter" with single-cell genetic analysis of rare and uncultivated tm7 microbes from the human mouth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (29), 11889-11894 (2007).
  5. Giovannoni, S., Stingl, U. The importance of culturing bacterioplankton in the'omics' age. Nat. Rev. Microbiol. 5 (10), 820-826 (2007).
  6. Stewart, E. J. Growing unculturable bacteria. J. Bacteriol. 194 (16), 4151-4160 (2012).
  7. Dedysh, S. N. Cultivating uncultured bacteria from northern wetlands: Knowledge gained and remaining gaps. Front. Microbiol. 2, 184(2011).
  8. Kaeberlein, T., Lewis, K., Epstein, S. S. Isolating" uncultivable" microorganisms in pure culture in a simulated natural environment. Science. 296 (5570), 1127-1129 (2002).
  9. Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2 (2), e00012(2011).
  10. Tyson, G. W., et al. Genome-directed isolation of the key nitrogen fixer Leptospirillum ferrodiazotrophum sp. nov. from an acidophilic microbial community. Appl. Environ. Microbiol. 71 (10), 6319-6324 (2005).
  11. Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. Methanogens: Reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43 (2), 260-296 (1979).
  12. Merino, N., et al. Subsurface microbial communities as a tool for characterizing regional-scale groundwater flow. Sci. Total Environ. 842, 156768(2022).
  13. Anderson, K. B., Creeping, J. C., Huggett, W. W. Process for the dissolution of coal, biomass and other organic solids in superheated water. U.S. patent 8,563,791. , Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf (2013).
  14. Anderson, K. B., Crelling, J. C., Huggett, W. W., Perry, D. M. Production of organic materials using oxidative hydrothermal dissolution. U.S. patent 10,023,512. , Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf (2018).
  15. Mullin, S. W., et al. Patterns of in situ mineral colonization by microorganisms in a~ 60 c deep continental subsurface aquifer. Front. Microbiol. 11, 536535(2020).
  16. Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the miseq illumina sequencing platform. Appl. Environ. Microbiol. 79 (17), 5112-5120 (2013).
  17. Miller, T. L., Wolin, M. A serum bottle modification of the hungate technique for cultivating obligate anaerobes. Appl Microbiol. 27 (5), 985-987 (1974).
  18. Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermoanaerosceptrum fracticalcis gen. nov. sp. nov., a novel fumarate-fermenting microorganism from a deep fractured carbonate aquifer of the us great basin. Front. Microbiol. 10, 2224(2019).
  19. Hamilton-Brehm, S. D., et al. Caldicellulosiruptor obsidiansis sp. nov., an anaerobic, extremely thermophilic, cellulolytic bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Appl. Environ. Microbiol. 76 (4), 1014-1020 (2010).
  20. Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermodesulfobacterium geofontis sp. nov., a hyperthermophilic, sulfate-reducing bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Extremophiles. 17 (2), 251-263 (2013).
  21. Twigg, R. S. Oxidation-reduction aspects of resazurin. Nature. 155 (3935), 401-402 (1945).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Symulacja in situprzygotowanie pożywki beztlenowejpobieranie próbek środowiskowychbioreaktor beztlenowymikroorganizmy lądowemikroorganizmy podpowierzchnioweprzepłukiwanie azotemsekwencjonowanie nowej generacjiwzrost kultur mikrobowych
Zestaw symulowanych formatów pożywek opartych na informacjach in situ do hodowli mikroorganizmów beztlenowych nabytych w środowisku
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.