Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Techniki uprawy in vitro do modelowania organogenezy wątroby, budowania asembloidów i projektowania tkanek syntetycznych przy użyciu ludzkich linii komórkowych

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66229

⸱

18 kwietnia 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University at Buffalo (State University of New York), 2Clinical and Translation Research Center (CTRC), University at Buffalo (State University of New York), 3Department of Chemical and Biological Engineering, University at Buffalo (State University of New York), 4Center for Cell, Gene and Tissue Engineering, University at Buffalo, State University of New York, 5Khufu Therapeutics, Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

Organoidy rewolucjonizują spersonalizowane modelowanie tkanek do rozwoju narządów, odkrywania leków i badań nad chorobami. Inżynieria organoidowa się naprzód w tworzeniu skomplikowanych tkanek syntetycznych. Celem jest zintegrowanie morfogenezy, technologii asembloidów i biomatryc w celu poczynienia postępów w inżynierii tkankowej. Protokół ten pomaga w modelowaniu organogenezy wątroby i ustalaniu wytycznych dotyczących budowy tkanek syntetycznych.

Streszczenie

Przewlekła choroba wątroby osiągnęła rozmiary epidemii, dotykając ponad 800 milionów ludzi na całym świecie. Obecne leczenie, ortotopowe przeszczepienie wątroby, ma kilka ograniczeń. Pojawiły się obiecujące rozwiązania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej wątroby, przy czym organogeneza wątroby ma znaczny potencjał. Wczesna organogeneza wątroby, zachodząca między E8,5 a 11,5, obejmuje tworzenie interakcji nabłonkowo-mezenchymalnych prowadzących do morfogenezy, tworzenia się rdzenia wątrobowego i migracji zbiorowej. Brakuje jednak metod modelowania tego procesu in vitro. W pracy przedstawiono szczegółowy szereg metod, umożliwiających modelowanie różnych etapów i aspektów organogenezy wątroby za pomocą ludzkich linii komórkowych. W jednej serii metod wykorzystuje się technologię asembloidów ze sferoidami wątrobowymi (HEP) i mezenchymalnymi (MES), replikując wczesne struktury znalezione w organogenezie wątroby, modelując wczesną morfogenezę i demonstrując migrację komórek śródmiąższowych, jak widać in vivo. Te innowacyjne systemy asembloidów pomagają zidentyfikować czynniki wpływające na powstawanie i migrację asembloidów. Wykorzystano również systemy hodowli sferoidów HEP do modelowania migracji zbiorowej i morfogenezy rozgałęzień. Pożywki kondycjonowane mezenchymalnie (M-CM) odgrywają znaczącą rolę w inicjowaniu zależnej od dawki migracji rozgałęzień. Wszystkie zaprezentowane metody okazały się wysoce powtarzalne z wysokim wskaźnikiem sukcesu. Łącząc ze sobą te wydarzenia, nasze prace umożliwią odtworzenie sekwencyjnych, morfogenetycznych zdarzeń w celu odtworzenia organogenezy in vitro i in vivo.

Wprowadzenie

Migracja komórek wątroby odgrywa znaczącą rolę w organogenezie wątroby, chorobach i terapii komórkowej. Podczas organogenezy wątroby (E8,5-9,0, mysz) nabłonek przedwątrobowy brzusznego jelita przedniego zaczyna wyrażać geny wątroby dzięki sygnałom indukcyjnym emanującym z otaczającej mezenchymy i serca. W E9.0 nabłonek jelita przedniego gęstnieje, gdy komórki przechodzą z prostopadłościennej do pseudowarstwowej morfologii kolumnowej, tworząc uchyłek wątroby1,2. Na tym krytycznym etapie uchyłek wątroby składa się tylko z ~1,500 komórek. Następnie endoderma wątrobowa wyściełająca uchyłek wątroby gęstnieje, rozwarstwia się i tworzy sznury migrujących hepatoblastów (HB). Te HB komigrują z komórkami śródbłonka i komórkami mezenchymalnymi, rozgałęziając się do otaczającej tkanki mezenchymalnej, inicjując trójwymiarową zbiorową migrację komórek w celu utworzenia zawiązka wątroby3,4. W rzeczywistości na tym etapie komórki wspólnie przechodzą (1) komigrację lub ruch wraz z innymi typami komórek, (2) rozgałęziającą się morfogenezę lub tworzenie rozgałęzionych struktur przypominających rurki oraz (3) migrację śródmiąższową lub migrację na wierzch lub między innymi komórkami. Do E11.5 migracja ustaje, a prymitywna wątroba tworzy się, rozszerzając się 103 razy3. Migracja komórek wątroby może być również wymagana w późniejszych etapach organogenezy wątroby, ponieważ ekspresja HBs u płodu szczura wykazała dowody na wysoce regulowane geny związane z kolektywną migracją komórek 3D, morfogenezą i przebudową macierzy zewnątrzkomórkowej5. Oprócz swojej roli we wczesnej organogenezie wątroby, zbiorowa migracja 3D jest ściśle związana z lokalnym rozprzestrzenianiem się i przerzutami zaawansowanego raka wątrobowokomórkowego (HCC), co ostatecznie prowadzi do pogorszenia rokowania i zwiększonej oporności na leczenie6. Hepatocyty dorosłe i płodowe również wykorzystują migrację zbiorową podczas przemieszczania się ze śledziony do wątroby podczas ponownego zasiedlania wątroby. Badania obrazowe in vivo wykazały, że przeszczepione hepatocyty dostają się do żyły wrotnej, a następnie do naczyń włosowatych w ciągu kilku godzin, migrując przez sinusoidy wątroby i przez tkankę wątroby7,8,9. Wreszcie, ostatnie badania pokazują, że migrujące HB powstają podczas regeneracji wątroby myszy i człowieka, z pewnymi dowodami na ruch w arkuszach10. Ogólnie rzecz biorąc, zbiorowa migracja wątroby, zdolna do wielu trybów morfogenezy, odgrywa znaczącą rolę w organogenezie, raku, terapii komórkami hepatocytów i regeneracji wątroby.

Liczne badania genetyczne badały molekularne szlaki leżące u podstaw 3D migracji zbiorowych komórek wątroby. Badania te ujawniają, że brak rdzenia wątrobowego utrudnia tworzenie wątroby, podkreślając konieczność tworzenia się rdzenia wątrobowego i ich interakcji z komórkami wspierającymi tworzenie wątroby1,11,12,13. Badania te pokazują również, że wzrost wątroby jest inicjowany przez różne czynniki, w tym FGF-2 wydzielany z mezodermy serca, BMP4 wydzielany z otaczającej mezenchymy, HGF i interakcje komórek śródbłonka. Ponadto czynniki transkrypcyjne związane z migracją, w tym HEX, PROX1 i TBX3, odgrywają kluczową rolę2,14. Podsumowując, badania genetyczne dostarczają dowodów na to, że sygnalizacja czynnika rozpuszczalnego, prowadząca do ekspresji czynnika transkrypcyjnego, napędza migrację, sygnalizację i interakcje molekularne między HB a otaczającymi je mezenchymami.

Podczas gdy migracja komórek we wczesnej organogenezie wątroby była szeroko badana, obecne badania in vitro migracji wątroby często wykorzystują testy 2D wykorzystujące wysoce migrujące komórki HCC wraz z modelami nowotworów in vivo15. Badania te dostarczyły informacji na temat kilku czynników wpływających na migrację wątroby, w tym TGFβ-116, c-Myc17, YAP18, goosecoid19, actopaxin20 oraz miRNAs21,22,23. Chociaż poczyniono godne uwagi postępy w zrozumieniu mechanizmów molekularnych migracji komórek wątroby w 3D, wyraźne rozbieżności między migracją komórkową 2D i 3D sugerują, że testy 2D mają nieodłączne ograniczenia. Co więcej, modele te często nie uwzględniają typów komórek mezenchymalnych, które są niezbędne zarówno dla migracji, jak i wzrostu. Chociaż nastąpił postęp w opracowywaniu modeli 3D migracji wątroby, które integrują mezenchymę wspierającą, modele te kładą nacisk przede wszystkim na komigrację, a nie na badanie różnych sposobów migracji zbiorowej.

Możliwość generowania tkanek ze sferoidów poprzez różne procesy samoorganizacji i morfogenetyki ułatwia naukową eksplorację tkanek syntetycznych. Tkanki te mają szerokie zastosowanie w opracowywaniu leków i badaniach przesiewowych, modelowaniu chorób, terapii i innych zastosowaniach biomedycznych i biotechnologicznych. Podano szczegóły metodologiczne kilku systemów hodowli in vitro 3D zaprojektowanych tak, aby wykazywały różne tryby zbiorowej migracji wątroby 3D. Systemy te obejmują (1) hodowlę kosferoidową ze sferoidami HEP i MES w matrycy, (2) kropelkę matrycy sferoidalnej HEP hodowaną za pomocą M-CM, (3) mieszane sferoidy HEP-MES oraz (4) matrycę sferoidalną HEP hodowaną z dużą gęstością komórek MES. Systemy te umożliwiają solidne modelowanie zbiorowej migracji wątroby w środowisku 3D, pogłębiając w ten sposób naszą wiedzę na temat procesów molekularnych i komórkowych leżących u podstaw organogenezy wątroby, raka i terapii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów. Skróty użyte w tym artykule są zdefiniowane w pliku uzupełniającym 1.

1. Przygotowanie 1% roztworu agarozy o niskiej elektroendosmozie (EEO)

  1. Odważyć 2,5 g proszku agarozy o niskiej zawartości EEO i przenieść do zlewki.
    UWAGA: Upewnij się, że zlewka jest co najmniej dwa razy większa od żądanej objętości, aby pomieścić bulgotanie podczas przygotowywania roztworu.
  2. Za pomocą cylindra z podziałką odmierz 250 ml wody destylowanej i wlej ją do zlewki, dążąc do uzyskania końcowego stężenia (w/v) 1%.
  3. Przykryj otwór zlewki folią, pozostawiając mały otwór do wentylacji. Podgrzej zlewkę w kuchence mikrofalowej przez 30 sekund.
  4. Ostrożnie wyjmij zlewkę i zakręć zawartością. Powtarzaj ten proces co 30 s, aż do całkowitego rozpuszczenia.
    UWAGA: Ze szklanymi naczyniami do kuchenki mikrofalowej należy obchodzić się ostrożnie, używając odpowiednich rękawic. Uważnie monitoruj roztwór, aby zapobiec przegrzaniu lub wykipieniu.
  5. Po uzyskaniu jednorodnego roztworu wyjmij zlewkę z kuchenki mikrofalowej. Delikatnie zamieszaj roztwór przed przeniesieniem go do wstępnie wysterylizowanej butelki. Roztwór należy sterylizować w autoklawie i przechowywać roztwór agarozy w temperaturze pokojowej (RT) do momentu użycia.

2. Powłoka płytki 96-dołkowej

UWAGA: 384-dołkowe ultra-nisko dołączone mikropłytki sferoidalne mogą być wykorzystane w tych i dalszych eksperymentach.

  1. Poluzować nakrętkę butelki zawierającej sterylny 1% roztwór agarozy. Podgrzewaj roztwór w kuchence mikrofalowej w odstępach 30 sekund, aż przejdzie do fazy ciekłej; Następnie dokręć nakrętkę.
    UWAGA: Ze szklanymi naczyniami do kuchenki mikrofalowej należy obchodzić się ostrożnie, używając odpowiednich rękawic. Uważnie monitorować roztwór, aby zapobiec przegrzaniu lub wykipieniu.
    UWAGA: Wykonaj te czynności pod sterylnym kapturem z przepływem laminarnym do hodowli tkankowych.
  2. Przenieś 55-65 μl 1% roztworu agarozy na studzienkę, aby pokryć 96-dołkową płytkę z kulturą tkankową i natychmiast obrócić płytkę.
  3. Po przeniesieniu 1% roztworu agarozy do żądanej liczby dołków, umieść płytki w lodówce o temperaturze 4 °C na 20-30 minut, aby agaroza zastygła. Przed użyciem doprowadź płytkę do temperatury pokojowej (Rysunek 1A).

3. Przygotowanie sferoid HEP

  1. Hoduj komórki HepG2-WT w kolbie T-75 przy użyciu kompletnej pożywki wzrostowej (cDMEM) składającej się ze zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną (Pen-Strep). Utrzymuj hodowlę komórkową w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , codziennie zmieniając pożywkę wzrostową.
  2. Po osiągnięciu 80% konfluencji przepłucz komórki 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) i wyrzuć płukanie. Dodać 5 ml 0,05% trypsyny-EDTA do kolby i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 5-10 minut.
  3. Dodać równe ilości cDMEM i zmyć komórki z kolby. Po odłączeniu komórek przenieść mieszaninę do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować zawiesinę komórek o stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze RT.
    UWAGA: Wszystkie etapy wirowania opisane w niniejszym protokole przeprowadzono w temperaturze pokojowej (RT). Jednak te procedury wirowania można alternatywnie przeprowadzać w niskich temperaturach.
  4. Ponownie zawiesić zawiesinę komórkową w świeżym cDMEM i policzyć komórki, aby określić końcowe stężenie w komórkach / ml (Rysunek 1B).
  5. Znakowanie barwnikowe komórek
    UWAGA: Jest to krok opcjonalny.
    1. Przenieść żądaną ilość zawiesiny komórek do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować zawiesinę komórek o sile 300 x g przez 5 minut.
    2. Ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce bez surowicy, aby uzyskać końcowe stężenie 1,0 x 106 komórek/ml. Dodać 5 μl fluorescencyjnego roztworu do znakowania komórek na ml zawiesiny komórek i inkubować zawiesinę komórek w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na przemian przez 20 min.
      UWAGA: Pożywką wzrostową bez surowicy jest DMEM i jest uzupełniona tylko 1% paciorkowcem. Dostosuj czas inkubacji, aby uzyskać jednolite barwienie w oparciu o gęstość zawiesiny komórek.
    3. Po zakończeniu inkubacji odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 450 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad komórkowy w świeżym cDMEM. Powtórz ten proces prania jeszcze dwa razy (Rysunek 1C).
  6. Formacja sferoidalna
    1. Zawieś komórki w świeżym cDMEM, aby osiągnąć końcowe stężenie 5,0 x 104 komórek/ml w oparciu o liczbę komórek. Dobrze wymieszać zawiesinę komórek i przenieść 100 μl zawiesiny komórek na studzienkę na 96-dołkową płytkę pokrytą agarozą.
      UWAGA: Gęstość zawiesiny komórek jest ustawiona na osiągnięcie 5,000 komórek na dołek w 96-dołkowej płytce pokrytej agarozą. W przypadku stosowania płytek 384-dołkowych komórki są zawieszane w końcowym stężeniu 2,0 x 105 komórek/ml, a 50 μl zawiesiny komórek jest przenoszone na studzienkę, aby osiągnąć stężenie 10 000 komórek na studzienkę.
    2. Odwirować płytkę przy 340 x g przez 10 minut i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 5-9 dni (Rysunek 1D).
      UWAGA: Zmieniaj pożywkę wzrostową co drugi dzień po posianiu, delikatnie usuwając 50% cDMEM i zastępując go. Sferoidy HEP są odpowiednie dla modelu asembloidowego HEP-MES lub modelu M-CM.

4. Przygotowanie sferoid MES

  1. Hodować komórki HFF / MRC-5 w kolbie T-175 przy użyciu cDMEM składającego się z DMEM, uzupełnionego 10% FBS i 1% Pen-Strep. Utrzymywać hodowlę komórkową w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , zmieniając pożywkę co drugi dzień.
  2. Po osiągnięciu 80% zbiegu wykonaj płukanie komórek 1x PBS i wyrzuć płukanie. Dodać 5 ml 0,25% trypsyny-EDTA do kolby i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 5-10 minut.
  3. Dodać równe ilości cDMEM i zmyć komórki z kolby. Po odłączeniu komórek przenieść mieszaninę do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować zawiesinę komórek o sile 300 x g przez 5 minut.
  4. Ponownie zawiesić zawiesinę komórkową w świeżym cDMEM i policzyć komórki, aby określić końcowe stężenie w komórkach / ml (Rysunek 1B).
  5. Znakowanie barwnikowe komórek
    UWAGA: Jest to krok opcjonalny.
    1. Przenieść żądaną ilość zawiesiny komórek do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować zawiesinę komórek o sile 300 x g przez 5 minut.
    2. Ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce bez surowicy, aby uzyskać końcowe stężenie 1,0 x 106 komórek/ml. Dodać 5 μl fluorescencyjnego roztworu do znakowania komórek na ml zawiesiny komórek i inkubować zawiesinę komórek w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na przemian przez 20 min.
      UWAGA: Pożywką wzrostową bez surowicy jest DMEM i jest uzupełniona tylko 1% paciorkowcem. Dostosuj czas inkubacji, aby uzyskać jednolite barwienie w oparciu o gęstość zawiesiny komórek.
    3. Po zakończeniu inkubacji odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 450 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad komórkowy w świeżym cDMEM. Powtórz ten proces prania jeszcze dwa razy (Rysunek 1C).
  6. Formacja sferoidalna
    1. Zawieś komórki w świeżym cDMEM, aby osiągnąć końcowe stężenie 1,0 x 105 komórek/ml w oparciu o liczbę komórek. Dobrze wymieszać zawiesinę komórek i przenieść 100 μl zawiesiny komórek na studzienkę na 96-dołkową płytkę pokrytą agarozą.
      UWAGA: Gęstość zawiesiny komórek jest ustawiona tak, aby osiągnąć gęstość 10 000 komórek na studzienkę w 96-dołkowej płytce pokrytej agarozą.
    2. Odwirować płytkę przy 340 x g przez 10 minut i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 5-9 dni (Rysunek 1D).
      UWAGA: Zmieniaj pożywkę wzrostową co drugi dzień po posianiu, delikatnie usuwając 50% cDMEM i zastępując go. Sferoidy MES są odpowiednie dla modelu asembloidu HEP-MES.

5. Tworzenie asembloidów HEP-MES

UWAGA: Patrz krok 3 i krok 4, aby dowiedzieć się, jak powstać sferoidy HEP (Rysunek 2A) i MES (Rysunek 2B).

  1. Sferoidy HFF/MRC-5 należy pobierać pojedynczo za pomocą pipety z płytki 96-dołkowej. Przenieś je do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej świeży cDMEM. Pozwól sferoidom osiąść w probówce przez 5 minut, a następnie delikatnie spłucz ciepłym cDMEM.
    UWAGA: Proces płukania należy wykonywać delikatnie i ostrożnie.
  2. Delikatnie przenieść pojedynczą sferoidę HFF/MRC-5 za pomocą pipety do studzienki zawierającej sferoidę HepG2-WT. Dodaj lodowaty czynnik wzrostu o obniżonym współczynniku wzrostu (GFR) Matrigel (MG) lub kolagen z ogona szczura (CG) w rozcieńczeniu 1:1 i 1:5 i inkubuj w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez 3 godziny ( Rysunek 2C).
    UWAGA: MG rozmrażać przez noc na lodzie w lodówce o temperaturze od 2 °C do 8 °C. Upewnij się, że podczas pracy z MG używane są wstępnie schłodzone pipety, końcówki i rurki, ponieważ tworzą one żel o temperaturze powyżej 10 °C.
  3. Po inkubacji dodać 75 μl świeżego cDMEM do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez 2-3 dni.
    UWAGA: Zmieniaj pożywkę wzrostową co drugi dzień po posianiu, delikatnie usuwając 50% cDMEM i zastępując go. Assembloidy będą nadal tworzyć się bez zmian w pożywce przez okres do 3-4 dni. Tworzenie asembloidu HEP-MES może odbywać się bez użycia matrycy.

6. Tworzenie kropelek sferoidalnych HEP

UWAGA: Patrz krok 3, aby dowiedzieć się, jak powstawać sferoidy HEP (Rysunek 3A). Do zawieszania sferoid HEP w kropelkach można użyć dwóch różnych materiałów. Dwie metody są podane poniżej.

  1. Kropelki GFR MG
    1. Sferoidy HepG2-WT należy zbierać pojedynczo za pomocą pipety z 96-dołkowej płytki, pozwalając im osiąść w sterylnej wirówce stożkowej o pojemności 15 ml na lodzie.
    2. W oddzielnej sterylnej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml wymieszaj 1 ml lodowatego GFR MG i lodowato zimną pożywkę kontrolną w rozcieńczeniu 1:1. Odessać pożywkę za pomocą pipety z probówki o pojemności 15 ml zawierającej sferoidy HepG2-WT i umieścić ją na lodzie.
      UWAGA: MG rozmrażać przez noc na lodzie w lodówce o temperaturze od 2 °C do 8 °C. Podczas pracy z MG należy upewnić się, że pipety, końcówki i probówki są wstępnie schłodzone, ponieważ tworzą one żel o temperaturze powyżej 10 °C.
    3. Dodaj roztwór MG do sferoid HepG2-WT, zapewniając równomierny rozkład sferoidów wewnątrz roztworu MG.
    4. Za pomocą pipety o pojemności 200 μl zebrać 15 μl objętości pojedynczego sferoidu w roztworze MG i powoli wysiewać go na 60-milimetrową szalkę Petriego (Rysunek 3B).
      UWAGA: Jeśli w jednej kropli wysiano więcej niż jedną sferoidę, usuń i ponownie wysiewaj prawidłowo. W razie potrzeby sferoidy są przestawiane, aby upewnić się, że znajdują się w środku kropli. Aby uzyskać optymalny wysiew sferoidalny, rozważ użycie pipetowania wstecznego, aby zminimalizować tworzenie się pęcherzyków powietrza.
  2. Ogon szczura CG kropelki
    UWAGA: Całe przygotowanie CG powinno być wykonane na lodzie.
    1. Sferoidy HepG2-WT należy zbierać pojedynczo za pomocą pipety z 96-dołkowej płytki, pozwalając im osadzić się w sterylnej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml na lodzie (Rysunek 3B).
    2. Do probówki mikrowirówki dodać 358,8 μl wody dejonizowanej, 100 μl 10x PBS, 12,1 μl 1 N NaOH i 529,1 μl CG z ogona szczura, aby uzyskać całkowitą objętość 1 ml.
      UWAGA: Standardowy środek ciężkości ogona szczura musi być zawsze dodawany na końcu.
    3. Dodaj roztwór CG do sferoid HepG2-WT, zapewniając równomierny rozkład sferoidów wewnątrz roztworu CG.
    4. Za pomocą pipety o pojemności 200 μl zebrać 15 μl objętości pojedynczego sferoidu w roztworze CG i powoli wysiewać go na szalkę Petriego o średnicy 60 mm.
      UWAGA: Jeśli w jednej kropli wysiano więcej niż jedną sferoidę, usuń i ponownie wysiewaj prawidłowo. Sferoidy są przestawiane tak, aby upewnić się, że znajdują się w środku kropli. Aby uzyskać optymalny wysiew sferoidalny, rozważ użycie pipetowania wstecznego, aby zminimalizować tworzenie się pęcherzyków powietrza.
  3. Inkubować kropelki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 60 minut przed dodaniem pożywki wzrostowej.
  4. Powoli dodawać 5 ml pożądanej pożywki wzrostowej do szalki Petriego i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 ze zmianami pożywki wzrostowej co trzy dni (Rysunek 3C).
    UWAGA: M-CM został użyty w teście tworzenia kropelek HEP.

7. Przygotowanie M-CM

  1. Pobrać komórki HFF/MRC-5 i wysiać je w kolbie poddanej kulturze tkankowej T-75 o gęstości wysiewu 5 000 komórek/cm2 i inkubować kolbę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 72 godziny w 15 ml cDMEM.
    UWAGA: W tym okresie należy monitorować kolbę, aby zapewnić optymalne zdrowie komórek.
  2. Po 72 godzinach inkubacji zebrać M-CM do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwiruj M-CM przy 290 x g przez 5 minut w celu usunięcia zanieczyszczeń i przefiltruj za pomocą filtra 0,2 μm do sterylizacji (Rysunek 4A).
  3. Rozcieńczyć M-CM kompletną pożywką wzrostową w stosunku rozcieńczenia 1:1 do 1:7 i dodać do pożądanego eksperymentu (Rysunek 4B).
    UWAGA: Wykorzystaj M-CM w teście tworzenia kropelek HEP.

8. Mieszana formacja sferoidalna HEP-MES

UWAGA: Patrz kroki 3.1-3.5. dla przygotowania zawiesiny komórek HepG2-WT i kroki 4.1-4.5 dla przygotowania zawiesiny komórek HFF/MRC-5.

  1. Zawieś komórki HepG2-WT w świeżym cDMEM, aby osiągnąć końcowe stężenie 1,0 x 105 komórek/ml dla każdej zawiesiny komórek.
  2. Zawieś komórki HFF / MRC-5 w świeżym cDMEM, aby osiągnąć końcowe stężenie 1,0 x 105 komórek / ml dla każdej zawiesiny komórek.
  3. Przenieś zawiesiny komórek HepG2-WT i HFF/MRC-5 do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml w stosunku 1:1, aby uzyskać końcowe stężenie 2,0 x 105 komórek/ml. Dokładnie wymieszać zawiesinę komórek i przenieść 100 μl zawiesiny komórek na basenik na 96-dołkową płytkę pokrytą agarozą.
    UWAGA: Gęstość zawiesiny komórek jest ustawiona na uzyskanie 20 000 komórek na studzienkę na 96-dołkowej płytce pokrytej agarozą.
  4. Odwirować płytkę przy 340 x g przez 10 minut i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 1-2 dni (Rysunek 5C).
  5. Dodatek hydrożeli fibrynowych
    UWAGA: Jest to opcjonalny krok, który wykonuje się w ciągu 72 godzin po posiewaniu sferoid mieszanych HEP-MES.
    1. W sterylnej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml wymieszaj fibrynogen (3,25 mg/ml) i trombinę (12,5 jednostki/ml) w stosunku 4:1 w celu wytworzenia fibryny i umieść probówkę na lodzie.
  6. Przenieść fibrynę do każdej studzienki z wcześniej istniejącą mieszaną sferoidą w rozcieńczeniu 1:1 z aktualnym cDMEM w studzience. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 minut.
  7. Po inkubacji dodać 75 μl świeżego cDMEM do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez 1-2 dni.
    UWAGA: Zmieniaj pożywkę wzrostową co drugi dzień po posianiu, delikatnie usuwając 50% cDMEM i zastępując go.

9. Model migracyjny MES o dużej gęstości

UWAGA: Patrz krok 3 dla przygotowania sferoidy HepG2-WT (Rysunek 6A) i kroki 4.1-4.5 dla przygotowania zawiesiny komórek HFF/MRC-5 (Rysunek 6B).

  1. Zawieś komórki HFF / MRC-5 w świeżym cDMEM, aby osiągnąć końcowe stężenie 6,0 x 105 komórek / ml i umieść je na lodzie.
  2. Wymieszaj zawiesinę komórek HFF/MRC-5 i lodowaty MG/CG w rozcieńczeniu 1:1 (Rysunek 6C).
    UWAGA: Gęstość zawiesiny komórek jest ustawiona na uzyskanie 30 000 komórek na dołek w 96-dołkowej płytce pokrytej agarozą. Rozmrozić MG przez noc na lodzie w lodówce o temperaturze od 2 °C do 8 °C. Podczas pracy z MG należy upewnić się, że pipety, końcówki i probówki są wstępnie schłodzone, ponieważ tworzą one żel o temperaturze powyżej 10 °C.
  3. Przenieść 100 μl roztworu HFF/MRC-5 i MG za pomocą pipety do studzienki zawierającej sferoidę HepG2-WT. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 minut.
  4. Po inkubacji dodać 75 μl świeżego cDMEM do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez okres do 12 dni.

10. Analiza statystyczna

  1. Przeglądaj i analizuj dane zebrane za pomocą programu Microsoft Excel lub dowolnego oprogramowania statystycznego/graficznego.
    UWAGA: W celu oceny statystycznej między dwiema grupami wykonano test t-Studenta (typ II z dwoma ogonami), a wartości p równe lub mniejsze niż 0,05 uznano za mające istotność statystyczną i zdefiniowane w tekście i legendach rycin/rycin.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rośnie zainteresowanie syntetycznymi tkankami w szerokim zakresie zastosowań biomedycznych, takich jak modelowanie chorób, odkrywanie leków i inżynieria tkankowa (Rysunek 7). W tej dziedzinie organoidy, sferoidy i komórki pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) są przekształcane w bardziej syntetyczne, złożone i większe tkanki. Transformacja ta obejmuje zastosowanie zasad morfogenezy, wykorzystanie narzędzi takich jak mikrofabrykacja oraz integrację biomacierzy,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejszy protokół obejmuje wiele metod hodowli zarówno prostych, jak i złożonych asembloidów, a także techniki indukowania zbiorowej migracji komórek 3D we wczesnej organogenezie wątroby24,25. Przedstawione protokoły podkreślają kilka krytycznych etapów, przy czym tworzenie sferoid jest centralnym aspektem we wszystkich metodologiach. Mikrostudzienki (96- lub 384-dołkowe) są wykorzystywane z nieprzylegającymi lub pokrytymi agarozą płytkami w celu uzyskania tworz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

NP jest założycielem Khufu Therapeutics, firmy zajmującej się inżynierią organoidów, która opracowuje metody leczenia ostrych i przewlekłych chorób wątroby.

Podziękowania

Autorzy pragną wyrazić szczerą wdzięczność Ogechi Ogoke i Osamie Yousefowi za ich nieoceniony wkład w dane użyte w tym artykule. NP był wspierany przez fundusze startowe UB CBE, stypendium Marka Diamonda, New York State Stem Cell Science C024316, centrum UB Stem Cells in Regenerative Medicine (ScIRM), University at Buffalo Center for Cell, Gene, Tissue Engineering (CGTE).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
384-dołkowa/przezroczysta płytka sferoidalna z okrągłym dnem i ultra-niskim nasadkąCorning3830
96-wl Płytka do hodowli komórkowej płaska, TC, STRL, 1 / pk, 100 / CSSprzedaż produktów laboratoryjnych701001
AgarozaSigma-AldrichA0576Oprogramowanie Axiovision o niskim EEO
ZEISSwersja 4
komórkowych, 60mm, TC, STRL, 20/opk,Sprzedaż produktów laboratoryjnych705001
Kolba do hodowli komórkowych, 175cm², Vent,TC,STRL,5/pk,40/CSSprzedaż produktów laboratoryjnych709003
Kolba do hodowli komórkowych,75cm², Vent,TC,STRL,5/pk,100/CSSprzedaż produktów laboratoryjnych708003
Probówki wirówkowe, 15mL, PP,STRL,grad,50/bg,500/CSSprzedaż produktów laboratoryjnychL226010
Kolagen I, Ogon Szczura, 100 mgCorning354236
DMEM, wysoka zawartość glukozy, Suplement GlutaMAX, pirogronianThermoFisher Scientific10569010
EVOS Fluorescencyjny mikroskop z kontrastem fazowymEVOSAMEFC4300R1,360 x 1,024 gęstość pikseli
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, Stany ZjednoczoneThermoFisher Scientific26140079
Fibrynogen z ludzkiego osoczaSigma-AldrichF4883-500MG500 mg
Hep G2 [HEPG2]ATCCHB-8065
HERAcell vios 160iThermoFisher Scientific51033557
HFF-1ATCCSCRC-1041
ImageJIJ1.46r; https://imagej.net/ij/
Matrigel Błona podstawna o zredukowanym czynniku wzrostu (GFR) Matryca, bez LDEV, 10 mlCorning354230
MRC-5ATCCCCL-171
MSCGMT Zestaw kul do wzrostu ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystychLonzaPT-3001
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)ThermoFisher Scientific15140122
Trombina z ludzkiego osoczaSigma-AldrichT6884-100UN100 jednostek
Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowaThermoFisher Scientific25300062
Trypsin-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaThermoFisher Scientific25200072
Vybrant DiD Roztwór do znakowania komórekThermoFisher ScientificV22887
Vybrant DiI Roztwór do znakowania komórekThermoFisher ScientificV22885
Vybrant DiO Znakowanie komórek RozwiązanieThermoFisher ScientificV22886
Mikroskop fluorescencyjny Zeiss AxioZEISSSE64, 1,344 &; 1,024 gęstość pikseli
Naczynie do hodowli 500 / CS

Bibliografia

  1. Bort, R., Signore, M., Tremblay, K., Martinez Barbera, J. P., Zaret, K. S. Hex homeobox gene controls the transition of the endoderm to a pseudostratified, cell emergent epithelium for liver bud development. Dev Biol. 290 (1), 44-56 (2006).
  2. Gualdi, R., et al. Hepatic specification of the gut endoderm in vitro: Cell signaling and transcriptional control. Genes Dev. 10 (13), 1670-1682 (1996).
  3. Ogoke, O., et al. Spatiotemporal imaging and analysis of mouse and human liver bud morphogenesis. Dev Dyn. 251 (4), 662-686 (2022).
  4. Ogoke, O., Oluwole, J., Parashurama, N. Bioengineering considerations in liver regenerative medicine. J Biol Eng. 11, 46(2017).
  5. Petkov, P. M., Kim, K., Sandhu, J., Shafritz, D. A., Dabeva, M. D. Identification of differentially expressed genes in epithelial stem/progenitor cells of fetal rat liver. Genomics. 68 (2), 197-209 (2000).
  6. Yang, M. H., et al. Comprehensive analysis of the independent effect of twist and snail in promoting metastasis of hepatocellular carcinoma. Hepatology. 50 (5), 1464-1474 (2009).
  7. Gupta, S., et al. Entry and integration of transplanted hepatocytes in rat liver plates occur by disruption of hepatic sinusoidal endothelium. Hepatology. 29 (2), 509-519 (1999).
  8. Koenig, S., Stoesser, C., Krause, P., Becker, H., Markus, P. M. Liver repopulation after hepatocellular transplantation: Integration and interaction of transplanted hepatocytes in the host. Cell Transplant. 14 (1), 31-40 (2005).
  9. Rajvanshi, P., Kerr, A., Bhargava, K. K., Burk, R. D., Gupta, S. Studies of liver repopulation using the dipeptidyl peptidase iv-deficient rat and other rodent recipients: Cell size and structure relationships regulate capacity for increased transplanted hepatocyte mass in the liver lobule. Hepatology. 23 (3), 482-496 (1996).
  10. Matchett, K., et al. Multimodal decoding of human liver regeneration. bioRxiv. , 10.1101/2023.02.24.529873 2023.2002.2024.529873 (2023).
  11. Matsumoto, K., Yoshitomi, H., Rossant, J., Zaret, K. S. Liver organogenesis promoted by endothelial cells prior to vascular function. Science. 294 (5542), 559-563 (2001).
  12. Sosa-Pineda, B., Wigle, J. T., Oliver, G. Hepatocyte migration during liver development requires prox1. Nat Genet. 25 (3), 254-255 (2000).
  13. Suzuki, A., Sekiya, S., Büscher, D., Izpisúa Belmonte, J. C., Taniguchi, H. Tbx3 controls the fate of hepatic progenitor cells in liver development by suppressing p19ARF expression. Development. 135 (9), 1589-1595 (2008).
  14. Rossi, J. M., Dunn, N. R., Hogan, B. L., Zaret, K. S. Distinct mesodermal signals, including BMPs from the septum transversum mesenchyme, are required in combination for hepatogenesis from the endoderm. Genes Dev. 15 (15), 1998-2009 (2001).
  15. Ng, L., et al. Suppression of actopaxin impairs hepatocellular carcinoma metastasis through modulation of cell migration and invasion. Hepatology. 58 (2), 667-679 (2013).
  16. Fransvea, E., Angelotti, U., Antonaci, S., Giannelli, G. Blocking transforming growth factor-beta up-regulates e-cadherin and reduces migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells. Hepatology. 47 (5), 1557-1566 (2008).
  17. Zhao, Y., et al. RNAi silencing of c-myc inhibits cell migration, invasion, and proliferation in hepg2 human hepatocellular carcinoma cell line: C-myc silencing in hepatocellular carcinoma cell. Cancer Cell Int. 13 (1), 23(2013).
  18. Fitamant, J., et al. Yap inhibition restores hepatocyte differentiation in advanced HCC, leading to tumor regression. Cell Rep. 10 (10), 1692-1707 (2015).
  19. Xue, T. C., et al. Goosecoid promotes the metastasis of hepatocellular carcinoma by modulating the epithelial-mesenchymal transition. PLoS One. 9 (10), e109695(2014).
  20. Biname, F., Lassus, P., Hibner, U. Transforming growth factor beta controls the directional migration of hepatocyte cohorts by modulating their adhesion to fibronectin. Mol Biol Cell. 19 (3), 945-956 (2008).
  21. Chen, J. S., et al. MiR-338-3p inhibits epithelial-mesenchymal transition and metastasis in hepatocellular carcinoma cells. Oncotarget. 8 (42), 71418-71429 (2017).
  22. Yang, C., et al. MiR-1301 inhibits hepatocellular carcinoma cell migration, invasion, and angiogenesis by decreasing Wnt/beta-catenin signaling through targeting BCL9. Cell Death Dis. 8 (8), e2999(2017).
  23. Zeng, Y. B., et al. MiRNA-135a promotes hepatocellular carcinoma cell migration and invasion by targeting forkhead box o1. Cancer Cell Int. 16, 63(2016).
  24. Ogoke, O., et al. Dynamic changes in the niche and transcription trigger early murine and human pluripotent stem cell-derived liver organogenesis. bioRxiv. , 10.1101/2022.07.24.501313 (2023).
  25. Ogoke, O., et al. Modeling liver organogenesis by recreating three-dimensional collective cell migration: A role for TGF-beta pathway. Front Bioeng Biotechnol. 9, 621286(2021).
  26. Kanton, S., Pasca, S. P. Human assembloids. Development. 149 (20), dev201120 (2022).
  27. Bayley, H., Cazimoglu, I., Hoskin, C. E. G. Synthetic tissues. Emerg Top Life Sci. 3 (5), 615(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Assembloidy w trobysferoidy w trobowesferoidy mezenchymalnemorfogeneza rozga zionamigracja zbiorowapo ywka warunkuj ca mezenchymalna
Techniki uprawy in vitro do modelowania organogenezy wątroby, budowania asembloidów i projektowania tkanek syntetycznych przy użyciu ludzkich linii komórkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.