Profilowanie epitopów białek powierzchniowych na cząsteczkach wirusa za pomocą strategii multipleksu dual-reporter

Podsumowanie

Tutaj opisujemy nowo opracowany multipleksowy fluorescencyjny test immunologiczny, który wykorzystuje system cytometrii z podwójnym przepływem reporterowym do jednoczesnego wykrywania dwóch unikalnych epitopów białka kolca na nienaruszonych cząsteczkach wirusa SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2) zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej, które zostały wychwycone przez mikrosfery magnetyczne sprzężone z enzymem konwertującym angiotensynę.

Streszczenie

Białka błonowe na wirusach otoczkowych odgrywają ważną rolę w wielu funkcjach biologicznych, takich jak przyłączanie wirusa do receptorów komórek docelowych, fuzja cząsteczek wirusa z komórkami gospodarza, interakcje gospodarz-wirus i patogeneza choroby. Co więcej, białka błony wirusowej na cząsteczkach wirusa i prezentowane na powierzchni komórek gospodarza okazały się doskonałymi celami dla leków przeciwwirusowych i szczepionek. W tym miejscu opisujemy protokół badania białek powierzchniowych na nienaruszonych cząstkach koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2) przy użyciu systemu cytometrii z podwójnym przepływem reporterowym. Test wykorzystuje technologię multipleksu w celu uzyskania potrójnego wykrywania cząstek wirusa za pomocą trzech niezależnych reakcji powinowactwa. Kulki magnetyczne sprzężone z rekombinowanym ludzkim enzymem konwertującym angiotensynę-2 (ACE2) wykorzystano do wychwycenia cząstek wirusa z supernatantu komórek zakażonych SARS-CoV-2. Następnie jednocześnie zastosowano dwa odczynniki detekcyjne znakowane R-fikoerytryną (PE) lub fioletem brylantowym 421 (BV421). Jako dowód słuszności koncepcji wykorzystano fragmenty przeciwciał ukierunkowane na różne epitopy białka powierzchniowego Spike (S1) SARS-CoV-2. Wykrycie cząstek wirusa za pomocą trzech niezależnych reakcji powinowactwa zapewnia silną specyficzność i potwierdza wychwytywanie nienaruszonych cząstek wirusa. Krzywe zależności od dawki supernatantu komórkowego zakażonego SARS-CoV-2 uzyskano z wariancjami współczynników replikacji (średnia/SD) ˂14%. Dobre wyniki testów w obu kanałach potwierdziły, że dwa epitopy białka docelowego na powierzchni wirusa są wykrywalne równolegle. Opisany tutaj protokół może być zastosowany do (i) wysokomultipleksowego, wysokoprzepustowego profilowania białek powierzchniowych ulegających ekspresji na wirusach otoczkowych; ii) wykrywanie aktywnych, nienaruszonych cząstek wirusa; oraz (iii) ocenę swoistości i powinowactwa przeciwciał i leków przeciwwirusowych do epitopów powierzchniowych antygenów wirusowych. Zastosowanie można potencjalnie rozszerzyć na każdy rodzaj pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i biocząstek, odsłaniając antygeny powierzchniowe w płynach ustrojowych lub innych płynnych matrycach.

Wprowadzenie

Najczęstszymi wirusami chorobotwórczymi, takimi jak grypa, HIV, ludzki wirus cytomegalii i szczepy SARS-CoV, są wirusy otoczkowe. Zakażenie komórek wirusami otoczkowymi wymaga fuzji błon komórkowych wirusa i gospodarza, co powoduje uwolnienie genomu wirusa do cytoplazmy. Wirusowe RNA zostanie następnie zreplikowane, zanim zostanie upakowane w nową cząsteczkę wirusa^1,2. Podczas tych procesów nie tylko białka wirusowe, ale także białka błony gospodarza mogą zostać włączone do otoczki, stając się integralną częścią nowej cząsteczki wirusa. Białka błony komórkowej gospodarza włączone do otoczki wirusa mogą ułatwiać wirusowi wnikanie do nowej komórki gospodarza, wykorzystując mechanizmy interakcji komórka-komórka, naprowadzania i ucieczki układu odpornościowego^3,4.

Pomimo wagi badania białek związanych z wirusem, większość obecnie dostępnych technik analizy wirusów⁵ nie obsługuje charakterystyki powierzchniowej wirusa o wysokiej przepustowości i multipleksie. Nie są też w stanie wykryć pojedynczych cząstek wirusa ani rozróżnić zakaźnych nienaruszonych cząstek wirusa, niezakaźnego RNA, białek wirusowych i subpopulacji wirusa wyrażających różne antygeny. Ostatnio cytometria przepływowa została zmodyfikowana i zaadaptowana do nowej metody analizy cząstek wirusowych, a mianowicie wirometrii przepływowej. Wirometria przepływowa pozwala na badanie pojedynczych cząstek wirusa i ich antygenów powierzchniowych. Pozostają jednak ograniczenia, takie jak niska przepustowość, niska zdolność do multipleksowania, skomplikowana konfiguracja eksperymentalna i analiza danych oraz ograniczona wykrywalność małych cząstek wirusa^6,7.

Multipleksowana kwantyfikacja białek i kwasów nukleinowych oparta na mikrosferach to sprawdzona technologia o wielu zastosowaniach, począwszy od kwantyfikacji białek w płynach ustrojowych, poprzez badania interakcji białko-białko, aż po diagnostykę infekcji wirusowych^{8,9,10,11,12,13}. Niedawno wprowadzony przyrząd do analizy przepływu posiada podwójny kanał reporterowy, co pozwala na pomiar dwóch fluorescencyjnych cząsteczek reporterowych w tej samej studni reakcyjnej. Ta nowa funkcja okazała się szczególnie przydatna do równoległego profilowania różnych izotypów immunoglobulin¹⁴. W tym miejscu opisano, w jaki sposób system podwójnego reportera może być wykorzystany do wykrywania nienaruszonych cząstek wirusa, celujących równolegle w wiele antygenów powierzchniowych.

Jako dowód słuszności koncepcji, ten raport szczegółowo opisuje rozwój systemu potrójnego wykrywania cząsteczek wirusa SARS-CoV-2. SARS-CoV-2 składa się z czterech głównych białek, jednym z nich jest białko kolca (S), które składa się z dwóch podjednostek. Pierwsza podjednostka, S1, powoduje pierwotne wiązanie z ACE2 wyrażającym się w błonach komórkowych ludzkich. Druga podjednostka, S2, ułatwia wejście do komórki docelowej przez peptyd fuzyjny, tworząc pory w błonie komórki docelowej, przez które wirion może przedostać się przez¹⁵. Trzy pozostałe elementy budulcowe SARS-CoV-2 to nukleokapsyd (N), białko błonowe (M) i białko otoczki (E). Nukleokapsyd jest odpowiedzialny za pakowanie genomu wirusa poprzez tworzenie struktur rybonukleoproteinowych z RNA, podczas gdy białka błony i otoczki odgrywają kluczową rolę w składaniu wirusa.

Opisany tutaj test jest ukierunkowany na trzy niezależne epitopy podjednostki S1 wyrażone na powierzchni otoczki SARS-CoV-2. Stosuje się seryjne rozcieńczenia zarówno supernatantów komórkowych zakażonych SARS-CoV-2, jak i niezakażonych. Cząsteczki wirusa są wychwytywane przez mikrosfery sprzężone z ACE2, wiążące podjednostkę S1 na wirusie. Białko powierzchniowe wirusa S jest następnie wykrywane równolegle z dostępnym na rynku znakowanym fragmentem zmiennej jednołańcuchowej immunoglobuliny (scFv) i ludzkim przeciwciałem monoklonalnym anty-S1 (Hu-anty-S1) wraz z opracowanym przez nas scFv znakowanym FLAG. Hu-anty-S1 jest wykrywany przez pierwszy kanał (RP1) w układzie podwójnego reportera z pomarańczowym przeciwciałem anty-ludzkim IgG-Fc sprzężonym z pomarańczową R-fikoerytryną (PE), a scFv jest wykrywany przez drugi kanał (RP2) z niebieskim przeciwciałem anty-FLAG sprzężonym z niebieskim fioletem brylantowym 421 (BV421). Test cząsteczek wirusa jest reprezentowany w Rysunek 1.

Protokół

1. Koniugacja neutrawidyny i przeciwciał kontrolnych z mikrosferami magnetycznymi

UWAGA: Fluorescencyjnie barwione kulki magnetyczne (mikrosfery polistyrenowe o średnicy 6,5 μm z zatopionym magnetytem) z różnymi etykietami fluorescencyjnymi, wymienione w Tabeli Materiałów, są używane do generowania następujących koniugatów i kontroli koralików: (1) Biotynylowany rekombinowany ludzki ACE2 związany z koralikami sprzężony z linkerem neutrawidyny; (2) Biotyna związana z kulkami sprzężona z łącznikiem neutrawidyny; (3) Kozia IgG sprzężona bezpośrednio z koralikami; oraz (4) Koraliki niesprzężone. Białko, które ma być sprzężone z kulkami, powinno być wolne od azydku sodu, albuminy surowicy bydlęcej (BSA), glicyny, tris(hydroksymetylo)aminometanu (Tris), glicerolu lub dodatków zawierających aminy. Bufor aktywacyjny to 0,1 M Fosforan sodu jednozasadowy, bezwodny (NaH₂PO₄), pH 6. Kwas 2-morfolinoetanosulfonowy (MES; 50 mM) Bufor o pH 5 służy do rozcieńczania koniugatów. Bufor płuczący to PBS-T (1x PBS [sól fizjologiczna buforowana fosforanami], pH 7,4 + 0,05 % (v/v) Tween-20). Bufor magazynowy to 2,7 mg/ml odczynnik blokujący do testu ELISA (BRE) + 0,1% antybiotyków (tutaj ProClin 300).

1. Usunąć sproszkowany sulfo-N-hydroksysulfosukcynimid (NHS) z lodówki i 65 mg wstępnie podzielonego chlorowodorku 1-etylo-3-[3-dimetyloaminopropylo]karbodimidu (EDC) z zamrażarki i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej (RT; 18-22 °C) przez 30 minut. Na tym etapie należy przechowywać zarówno NHS, jak i EDC w kopercie zawierającej kulki krzemionki, aby zapobiec hydrolizie z wilgoci atmosferycznej.
2. Przygotuj mikrosfery do aktywacji i sprzężenia.
   UWAGA: Barwniki fluorescencyjne w mikrosferach są wrażliwe na światło, a kulki należy przechowywać w ciemności i w temperaturze lodówki (4-8 °C), gdy nie są aktywnie używane.
   1. Ponownie zawiesić 4 różne zapasy mikrosfer oznaczonych kolorem ID (12,5 x 10⁶/ml) (tabela materiałów) poprzez krótkie wirowanie, sonikację lub obracanie (15 min przy 15-30 obr./min), zgodnie z kartą informacyjną produktu.
   2. Przenieść 40 μl każdej zawiesiny kulek (5 x 10⁵ mikrosfer) do przypisanych studzienek półdołkowej, płaskodennej, 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania (tabela materiałów).
   3. Umyj koraliki magnetyczne.
      UWAGA: Etapy mycia można wykonywać ręcznie lub za pomocą automatycznej myjki do płyt.
      1. Dodać 80 μl/studzienkę buforu aktywacyjnego do kulek i unieruchomić kulki na magnetycznym separatorze płytkowym na 30 sekund. Odessać supernatant z mikrosfer, podczas gdy kulki są unieruchomione na magnetycznym separatorze płytkowym.
      2. Wyjąć płytkę do mikromiareczkowania z magnetycznego separatora płytkowego i ponownie zawiesić kulki w 50 μl buforu aktywacyjnego.
3. Aktywuj kulki za pomocą Sulfo-NHS i EDC.
   1. Przygotować roztwór roboczy Sulfo-NHS o stężeniu 50 mg/ml w buforze aktywacyjnym w probówce do mikrofug o pojemności 1,5 ml. Zapas NHS należy włożyć do lodówki (4-8 °C), chronić przed wilgocią.
   2. Przygotować roztwór roboczy EDC o stężeniu 50 mg/ml w buforze aktywacyjnym w probówce do mikrofug o pojemności 1,5 ml. Rozpuścić przygotowane 65 mg porcje proszku EDC w 1,3 ml buforu aktywacyjnego.
      UWAGA: Sulfo-NHS i EDC zaczynają się hydrolizować i tracą aktywność po rozpuszczeniu. Unikaj przerywania procedury sprzęgania, dopóki NHS i EDC nie zostaną dodane do koralików. Nie należy przechowywać rozpuszczonych roztworów NHS lub EDC do późniejszego wykorzystania.
   3. Przygotuj roztwór aktywacyjny do aktywacji kulek poprzez wolumetryczne połączenie 20% roztworu podstawowego Sulfo-NHS (50 mg / ml), 20% roztworu podstawowego EDC (50 mg / ml) i 60% buforu aktywacyjnego. Do każdej reakcji aktywacji kulek (przy użyciu 5 × 10⁵ kulek na reakcję) wymagany jest roztwór aktywacyjny o objętości 50 μl, a także dodatkowa objętość wystarczająca do zniwelowania strat związanych z pipetowaniem.
   4. Dodać 50 μl kompletnego roztworu aktywacyjnego do każdej studzienki zawierającej umyte kulki. Przy istniejącej wcześniej objętości zawiesiny kulek wynoszącej 50 μl w buforze aktywacyjnym na studzienkę, końcowe stężenie Sulfo-NHS wyniesie 5 mg / ml, a końcowe stężenie EDC również wyniesie 5 mg / ml.
   5. Uszczelnić płytkę reakcyjną mikrosfery jednorazowym klejem z tworzywa sztucznego lub folii uszczelniającej płytki i inkubować przez 20 minut na wytrząsarce orbitalnej (650 obr./min) w temperaturze pokojowej (18-22 °C) w ciemności.
4. Zmyj nadmiar roztworu aktywacyjnego z kulek.
   1. Odwirować płytkę do mikromiareczkowania o masie 233 × g przez 1 min.
   2. Unieruchomić aktywowane kulki na magnetycznym separatorze płytkowym na 30 sekund. Usunąć zgrzewarkę do płytek i zassać supernatant z kulek unieruchomionych magnesem, gdy płytka mikromiareczkowania jest nadal umieszczona na separatorze magnetycznym.
   3. Wyjąć płytkę do mikromiareczkowania z separatora magnetycznego i dodać 100 μl buforu MES do każdej studzienki.
   4. Powtórz kroki 1.4.2-1.4.3 jeszcze jeden raz, w sumie dwa prania.
5. Połącz neutrawidynę i kozią IgG (kontrolę) z odpowiednimi zestawami kulek. Przygotować wystarczającą ilość roztworów roboczych neutrawidyny i kozich IgG, planując 100 μl/reakcję i wystarczającą ilość dodatkowej ilości do uzupełnienia strat przy pipetowaniu, jak następuje:
   UWAGA: Białko neutrawidyny w proszku rozpuszcza się w ultraczystej wodzie, a następnie rozcieńcza do roztworu podstawowego o stężeniu 1 mg/ml z PBS przed podaniem do przechowywania/użycia (białko neutrawidyny nie jest bezpośrednio rozpuszczalne w PBS, ale jest rozpuszczalne w wodzie do ~10 mg/ml).
   1. Przygotować roztwór roboczy neutrawidyny o stężeniu 125 μg/ml w buforze MES w probówce o zawartości 1,5 ml o niskiej zawartości białka do mikrofuge.
   2. Przygotować roztwór roboczy przeciwciała kontrolnego IgG koziego o stężeniu 17,5 μg/ml w buforze MES.
   3. Przygotować płytkę do mikromiareczkowania zawierającą aktywowane kulki. Unieruchomij koraliki na magnetycznym separatorze płytkowym na 30 s. Trzymając płytkę do mikromiareczkowania nadal umieszczoną na separatorze magnetycznym, odessać supernatant z kulek unieruchomionych magnesem.
   4. Dodać 100 μl roztworu roboczego neutrawidyny (125 μg/ml) do odpowiednich studzienek zawierających kulki (dla sprzężenia neutrawidyna-biotyna i neutrawidyna-ACE2).
   5. Dodać 100 μl koziego roztworu roboczego IgG (17,5 μg/ml) do studzienki zawierającej kulki przypisane jako kontrole tylko dla kozich IgG.
   6. Dodać 100 μl buforu MES do dobrze przypisanych jako kontrolne niesprzężone kulki.
   7. Uszczelnić płytkę do mikromiareczkowania i inkubować przez 2 godziny na wytrząsarce orbitalnej (650 obr./min) w temperaturze suchej (18-22 °C) w ciemności. Po 1 godzinie inkubacji krótko zagrodzić płytkę, aby upewnić się, że kulki pozostają w zawiesinie.
6. Umyj koraliki za pomocą PBS-T.
   1. Odwirować płytkę do mikromiareczkowania o masie 233 × g przez 1 min.
   2. Unieruchomij sprzężone koraliki na magnetycznym separatorze płytkowym na 30 s. Trzymając płytkę do mikromiareczkowania nadal umieszczoną na separatorze magnetycznym, odessać supernatant z kulek unieruchomionych magnesem.
   3. Wyjmij płytkę do mikromiareczkowania z separatora magnetycznego.
   4. Dodać 100 μl PBS-T do każdej studzienki zawierającej kulki.
   5. Powtórzyć kroki prania 1.6.2-1.6.4 jeden raz, co daje w sumie dwa prania z PBS-T.
7. Przygotuj sprzężone koraliki do przechowywania.
   1. Unieruchomij sprzężone koraliki na magnetycznym separatorze płytkowym na 30 s. Trzymając płytkę do mikromiareczkowania nadal umieszczoną na separatorze magnetycznym, odessać supernatant z kulek unieruchomionych magnesem. Wyjmij płytkę do mikromiareczkowania z separatora magnetycznego.
   2. Dodaj 50 μl bufora do przechowywania każdego identyfikatora mikrosfery, aby ugasić pozostałą aktywność kulek.
   3. Inkubować płytkę do mikromiareczkowania w temperaturze lodówki (4-8 °C) w ciemności przez noc (16-22 h).
   4. Przenieś niesprzężone i sprzężone z kozią IgG zawiesiny kulek (50 μl) do odpowiednio oznakowanych 1,5 ml probówek mikrofuge o niskiej zawartości wiązania białka, w połączeniu z dwoma 100-μl płukania studzienek buforem magazynującym, aby zapewnić maksymalny odzysk kulek.
      UWAGA: Niesprzężone i kozie koraliki sprzężone IgG będą miały liczbę 5 × 10⁵ w końcowej objętości 250 μL (tj. 2 × 10³ koraliki/μL). Przechowuj probówki do mikrofug w temperaturze lodówki (4-8 °C) do czasu użycia.
8. Zwiąż biotynylowany ACE2 i biotynę z kulkami sprzężonymi z neutrawidyną.
   1. Przygotować rekombinowany ludzki biotynylowany roztwór roboczy ACE2 o stężeniu 18 μg/ml ACE2 w 10 mM PBS. Na reakcję potrzebne będzie 100 μl. Przygotować roztwór roboczy biotyny o stężeniu 2,4 mg/ml biotyny w 10 mM PBS. Na reakcję potrzebne będzie 100 μl.
   2. Przygotować płytkę do mikromiareczkowania zawierającą mikrosfery sprzężone z neutrawidyną.
      1. Unieruchomij mikrosfery na magnetycznym separatorze płytkowym na 30 sekund. Trzymając płytkę do mikromiareczkowania nadal umieszczoną na separatorze magnetycznym, wyjmij uszczelniacz płytek i odessaj supernatant z mikrosfer unieruchomionych magnesem.
      2. Wyjąć płytkę do mikromiareczkowania z separatora magnetycznego i dodać 50 μl 10 mM PBS/studzienkę.
      3. Powtórz kroki 1.8.2.1-1.8.2.2 jeden raz.
   3. Dodać 100 μl roztworu roboczego biotynylowanego ACE2 do odpowiednich studzienek zawierających mikrosfery sprzężone z neutrawidyną. Dodać 100 μl roztworu roboczego biotyny do odpowiednich studzienek zawierających mikrosfery sprzężone z neutrawidyną.
   4. Uszczelnić płytkę do mikromiareczkowania i inkubować przez 1 godzinę na wytrząsarce orbitalnej (650 obr./min) w temperaturze suchej (18-22 °C) w ciemności.
9. Umyj mikrosfery zgodnie z opisem w krokach 1.6.1-1.6.5.
10. Przygotuj i przechowuj mikrosfery sprzężone z ACE2 i biotyną zgodnie z opisem w krokach 1.7.1-1.7.4.
    UWAGA: Biotynylowane kulki sprzężone z ACE2 i biotyną będą miały liczbę 5 × 10⁵ w końcowej objętości 250 μL (tj. 2 × 10³ kulki/μL).

2. Test koniugacyjny

1. Przygotuj mieszaninę kulek, łącząc wszystkie cztery typy mikrosfer utworzonych w sekcji 1 (tj. biotynylowany ACE2 sprzężony z neutrawzyną, biotyna sprzężona z neutrawidyną, kozia IgG sprzężona i niesprzężona).
   UWAGA: Mikrosfery podstawowe przechowywano w ilości 2 × 10³ kulek/μl i łączono w taki sposób, aby końcowe stężenie kulek w roboczej mieszaninie kulek wynosiło 40 kulek z każdego zestawu/μl.
   1. Obliczyć objętość roboczej mieszaniny kulek niezbędnej do badania (5 μl/reakcję), pozwalając na zniwelowanie strat związanych z pipetowaniem. Krótko zmieszaj każdą probówkę i połącz równe obliczone objętości każdej zawiesiny kulek w nowej probówce do mikrofugi o niskim poziomie wiązania białek. Stężenie kulek wynosi teraz 400 kulek z każdego zestawu/μl.
   2. Utwórz roboczą mieszaninę kulek, rozcieńczając połączoną zawiesinę kulek dodatkowo 10-krotnie za pomocą buforu do przechowywania (40 każdego zestawu/μl stężenia roboczego).
      UWAGA: Najpierw wykonaj niewielką ilość roboczej mieszanki kulek, aby oszacować liczbę mikrosfer/μl dla każdego ID.
2. Inkubować mikrosfery z kozim przeciwciałem anty-ACE2.
   1. Odpipetować 5 μl roboczej mieszaniny kulek do 3 dołków płaskodennej, półdołkowej, 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania.
   2. Dodać 50 μl koziego anty-ACE2 (0,4 μg/ml rozcieńczonego w PBS-T, tabela materiałów) do 3 dołków zawierających kulki na płytce do mikromiareczkowania. Uszczelnić płytkę do mikromiareczkowania, odwirować i inkubować na wytrząsarce orbitalnej (650 obr./min) w temperaturze suchej (18-22 °C) przez 1 godzinę w ciemności.
3. Pulsacyjnie przesuwać płytkę do mikromiareczkowania przy 233 × g przez 1 minutę i przemyć mikrosfery trzykrotnie PBS-T, jak opisano w ppkt 1.6.2-1.6.4.
4. Inkubuj mikrosfery z przeciwciałami wykrywającymi.
   1. Odpipetować 5 μl roboczej mieszaniny kulek do 6 nowych dołków płytki do mikromiareczkowania.
   2. Przygotować 1 μg/ml każdej z roboczych mieszanin detekcyjnych: anty-koziej IgG PE, anty-mysiej IgG PE i anty-króliczej IgG PE w 3 oddzielnych probówkach o pojemności 1,5 ml, używając PBS-T jako rozcieńczalnika.
   3. Dodać 50 μl mieszanin detekcyjnych do 3 studzienek każdy, a anty-kozią IgG dodaje się do tych samych studzienek co anty-ACE2 z kroku 2.2.
   4. Uszczelnić, wirować i inkubować na wytrząsarce orbitalnej (650 obr./min) w temperaturze RT (18-22 °C) przez 30 min.
5. Pulsacyjnie przesuwać płytkę przy stężeniu 233 × g przez 1 minutę i przemyć mikrosfery trzykrotnie PBS-T, jak opisano w 1.6.2-1.6.4.
6. Dodaj 100 μl PBS-T i uruchom na przyrządzie do analizy przepływu z podwójnym reporterem z następującymi ustawieniami:
   Tryb: Podwójny reporter; Limit czasu: 45 s; Bramkowanie DD: 7500-17500; Minimalna liczba mikrosfer: 100 mikrosfer/zestaw (najniższa granica QC: 35 mikrosfer/zestaw).

3. Produkcja supernatantu komórkowego zakażonego SARS-CoV-2

Wirus SARS-CoV-2 rozprzestrzenia się w komórkach Vero E6 gospodarza (linia komórkowa nabłonka nerki małpy; ATCC; Tabela materiałów). Komórki Vero E6 są hodowane w zmodyfikowanej pożywce Eagles (MEM) w temperaturze 37°C w atmosferze o wilgotności 5%_CO2 i wilgotności względnej 95%. Każdy litr MEM uzupełnia się 10 ml L-glutaminy (200 mM), 38 ml NaHCO₃ (7,5%), 5 ml roztworu penicyliny/streptomycyny i 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FCS); Tabela materiałów.

UWAGA: Używaj odpowiednich procedur i sprzętu bezpieczeństwa biologicznego podczas obchodzenia się z SARS-CoV-2.

1. Komórki Vero E6 są hodowane do zbiegu w dwóch kolbach do hodowli tkankowych o długości 150^cm2. Zainfekuj jedną butelkę wirusem SARS-CoV-2, a drugą pozorowaną infekcję użyj jako kontroli.
2. Wymieszaj około 100 000 zakaźnych cząstek SARS-CoV-2 typu dzikiego (WT) z 5 ml pożywki Eagles MEM.
3. Odessać pożywkę z jednej kolby o średnicy 150^cm2 i dodać 55 ml kompletnego MEM w celu wytworzenia niezakażonych supernatantów kontrolnych. Odessać pożywkę z drugiej kolby o długości^{150 cm2} i dodać mieszaninę wirusów do komórek. Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Delikatnie wstrząsać kolbą co 15 minut w celu rozprowadzenia wirusa.
4. Dodać 50 ml kompletnej pożywki MEM do kolby z dodatkiem SARS-CoV-2 i inkubować komórki, aż zaobserwuje się efekty cytopatyczne, wizualnie oceniając kolby co 24 godziny
   UWAGA: Wystąpienie cytopatii powinno zająć około 3-4 dni po zakażeniu. Wpływ cytopatyczny na strukturę jednowarstwową komórki Vero E6 (np. retrakcja komórki, krenacja, zaokrąglenie, deadhezja, utrata ziarnistości wewnątrzcytoplazmatycznej, jawna liza) ocenia się jakościowo, obserwując komórki za pomocą mikroskopu ze światłem odwróconym, zgodnie z wytycznymi Międzynarodowej Organizacji Normalizacyjnej dotyczącymi badań cytotoksyczności in vitro¹⁶.
5. Zebrać supernatant komórkowy z obu kolb i wirować przez 6 minut w temperaturze 253 × g do osadu na resztkach komórek.
6. Inaktywowany promieniami UV wirus SARS-CoV-2 w supernatancie komórki
   1. Odpipetować 0,5 ml supernatantu na studzienkę do 12 dołków w 24-dołkowej płytce do mikromiareczkowania. Naświetlić promieniami UV płytkę do mikromiareczkowania, bez pokrywy, przez 30 s pod odpowiednią lampą ultrafioletową (tabela materiałów).
      UWAGA: Inaktywację wirusa w supernatancie komórkowym należy stwierdzić poprzez próbę namnażania wirusa w hodowlach komórkowych Vero E6.
7. Porcję supernatantu komórkowego rozmieścić w probówkach o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
   UWAGA: Supernatant komórki może być przechowywany w temperaturze -80 °C.

4. Test: Wykrywanie cząsteczek wirusa SARS-CoV-2 w supernatancie komórki

1. Przygotuj bufor do testów, mieszając 0,1% kazeiny, 0,5% alkoholu poliwinylowego, 0,8% poliwinylopirolidonu i 1% BSA (wszystkie w/v) (pH 7). Przygotować bufor do rozcieńczania próbki, przygotowując 10% królicze IgG w buforze do oznaczania.
2. Obliczyć i przygotować objętość roboczej mieszaniny kulek (krok 2.1) niezbędną do badania (5 μl/reakcję), pozwalając na zniwelowanie strat związanych z pipetowaniem.
3. Przygotować serię rozcieńczeń supernatantu. Obliczyć niezbędne objętości supernatantu. Oznaczyć każdy punkt rozcieńczenia w trzech dołkach dla każdego z pięciu scFv, co daje 15 dołków na punkt rozcieńczenia i typ próbki. Użyć 45 μl rozcieńczonych supernatantów w każdym dołku, co daje w sumie wymagane 675 μl; wystarczy pojedyncza probówka o pojemności 1,5 ml do mikrofiltrów dla każdego z supernatantów SARS-CoV-2 i kontrolnych.
   1. Supernatanty SARS-CoV-2 rozmrażać i supernatanty kontrolne w temperaturze 4 °C przez co najmniej 1 godzinę. Przechowywać supernatanty i ich rozcieńczenia w niskiej temperaturze (2–8 °C) do czasu użycia. Oznacz i ułóż osiem probówek do mikrofuge o pojemności 1,5 ml każda dla SARS-CoV-2 i supernatantów kontrolnych.
      UWAGA: Najwyższym badanym stężeniem będzie rozcieńczenie sklarowanego osadu w stosunku 1:1 (2-krotnie), z którego zostanie wykonana seria rozcieńczeń w stosunku 1:2 (3-krotnie) przy użyciu buforu do rozcieńczania próbki, przy czym najwyższe rozcieńczenie będzie miało miejsce w stosunku 1:1458. Ślepe próby zawierające bufor do rozcieńczania próbki służą wyłącznie jako kontrole bez stosowania supernatantu. W związku z tym badane rozcieńczenia każdego typu supernatantu (SARS-CoV-2 lub kontrola) będą 2, 6, 18, 54, 162, 486 i 1458-krotne, z kontrolą tylko buforową.
   2. Dodaj bufor do rozcieńczania próbki do oznakowanych probówek do mikrofuge. Probówki rozcieńczające 1:1 (2-krotnie) wymagają 600 μl buforu, a pozostałe probówki wymagają 800 μl buforu. Uzyskać najwyższe rozcieńczenie (1:1; 2-krotnie) każdego supernatantu, łącząc 600 μl supernatantu z 600 μl buforu do rozcieńczania próbki w odpowiednio oznakowanych probówkach, a następnie krótko wirując probówkę w celu wymieszania.
   3. Kontynuować serię, przenosząc kolejno 400 μl rozcieńczonych supernatantów w stosunku 1:1 (2-krotnie) do następnej probówki rozcieńczającej (tj. rozcieńczenie 6-krotne) i kontynuować 3-krotne rozcieńczenia, aż do uzyskania najniższego rozcieńczenia (1458-krotnie). Krótko zawirować każdy rozcieńczony supernatant przed przystąpieniem do następnego rozcieńczenia.
4. Inkubować mikrosfery z supernatantem.
   1. Wirować wstępnie przygotowaną roboczą mieszaninę kulek przez 30 sekund w celu ponownego zawieszenia mikrosfer i dodać 5 μl mieszaniny kulek do każdego przypisanego dołka płaskodennej 384-dołkowej płytki do mikromiareczkowania.
      UWAGA: Można również stosować płytki 96-dołkowe.
   2. Dodać 45 μl przygotowanych rozcieńczeń supernatantu do wyznaczonych studzienek zawierających mikrosfery w płytce 384-dołkowej. Uszczelnić płytkę i inkubować przez noc (16-22 h) na wytrząsarce orbitalnej (650 obr./min) w temperaturze RT (18-22°C) w ciemności.
5. Zmyć nadmiar supernatantu z koralików.
   1. Wyjmij płytkę do mikromiareczkowania z wytrząsarki orbitalnej i usuń uszczelniacz płytek. Odwirować płytkę o sile 931 x g przez 1 min.
   2. Unieruchomić kulki, umieszczając płytkę mikromiareczkowania na magnetycznym separatorze płytkowym na 30 sekund. Trzymając płytkę do mikromiareczkowania nadal umieszczoną na separatorze magnetycznym, usuń uszczelniacz płytek i odessaj supernatant z kulek unieruchomionych przez magnes.
   3. Wyjmij płytkę do mikromiareczkowania z separatora magnetycznego.
   4. Dodaj 60 μl PBS-T do każdej studzienki zawierającej kulki.
   5. Powtórzyć kroki prania 4.5.2-4.5.4 dwa razy, co daje w sumie trzy prania PBS-T.
6. Przygotuj różne mieszaniny detekcyjne w oddzielnych probówkach o pojemności 1,5 ml. Każda mieszanina detekcyjna składa się z komercyjnego ludzkiego przeciwciała monoklonalnego anty-S1 (Hu-anty-S1) (1 μg/ml) i jednego z pięciu różnych scFvs znakowanych FLAG (1 μg/ml) (plik uzupełniający 1, tabela uzupełniająca 1 i tabela uzupełniająca 2) ukierunkowanych na białko kolca na cząsteczce SARS-CoV-2, rozcieńczone w buforze testowym (krok 4.1), co daje w sumie pięć różnych mieszanek wykrywających.
7. Powtórz kroki 4.5.2-4.5.3. Ponownie zawiesić przemyte mikrosfery w 50 μl/studzienkę odpowiedniej mieszanki do wykrywania kolców specyficznej dla scFv. Uszczelnić płytkę do mikromiareczkowania i inkubować przez 1 godzinę na wytrząsarce orbitalnej (650 obr./min) w temperaturze suchej (18-22 °C) w ciemności.
8. Odwirować płytkę do mikromiareczkowania o masie 931 × g przez 1 minutę. Nadmiar odczynnika do wykrywania kolców wypłukać z kulek. Wykonać trzy etapy płukania 60 μl PBS-T zgodnie z krokami 4.5.2-4.5.5.
9. Inkubować mikrosfery z mieszaniną przeciwciał detekcyjnych fluorescencyjnych.
   1. Przygotować mieszaninę roztworów fluorescencyjnych składającą się z dostępnych w handlu anty-ludzkich IgG sprzężonych z PE wraz z przeciwciałem anty-FLAG sprzężonym z BV421 rozcieńczonym w buforze testowym, o stężeniach roboczych odpowiednio 0,2 μg/ml i 1 μg/ml. Na reakcję potrzeba 50 μl odczynnika do wykrywania fluorescencyjnego.
   2. Powtórz kroki 4.5.2-4.5.3. Zawiesić mikrosfery w 50 μl/studzienkę mieszaniny roztworu fluorescencyjnego. Uszczelnić płytkę do mikromiareczkowania i inkubować przez 30 minut na wytrząsarce orbitalnej (650 obr./min) w temperaturze suchej temperatury (18-22 °C) w ciemności.
10. Obracać płytkę do mikromiareczkowania w temperaturze 931 × g przez 1 minutę. Nadmiar mieszanki roztworów fluorescencyjnych wypłukać z mikrosfer. Wykonać trzy etapy płukania 60 μl PBS-T zgodnie z krokami 4.5.2-4.5.5.
11. Zawiesić mikrosfery w 60 μl PBS-T od ostatniego etapu mycia. Przeanalizuj płytkę w systemie analizy przepływu z podwójnym reporterem z ustawieniami opisanymi w kroku 2.6.

Wyniki

Test koniugacyjny
Test koniugacji wykazał, że kozi IgG i biotynylowany neutrawidyna ACE2 były z powodzeniem sprzężone z mikrosferami. Swoistość wykrywania testu została potwierdzona przez sondowanie mikrosfer sprzężonych z ACE2 z przeciwciałami drugorzędowymi znakowanymi PE generowanymi u różnych gatunków zwierząt (Rysunek 2). Nie zaobserwowano reaktywności krzyżowej między różnymi wykrywanymi przeciwciałami. Gdy mieszaniny kulek badano kozią anty-ACE2 + anty-kozią IgG PE, wykryto medianę intensywności fluorescencji (MFI; jednostki arbitralne) powyżej tła zarówno dla mikrosfer ACE2, jak i kozich IgG, ale nie dla mikrosfery niesprzężonej (gołej) lub dla mikrosfer pokrytych biotyną. Anty-mysie IgG PE i anty-królicze IgG PE zastosowano jako kontrole ujemne w celu sprawdzenia sygnałów fałszywie dodatnich. Znikomy sygnał fluorescencyjny został wygenerowany podczas inkubacji z mikrosferami, co wskazuje, że pozytywne sygnały dla ACE2 i koziej IgG były specyficzne.

Wykrywalność cząsteczek wirusa w supernatantach komórkowych
Kulki magnetyczne sprzężone z rekombinowanym ludzkim ACE2 wykorzystano do wychwycenia cząstek wirusa SARS-CoV-2 z zakażonych i kontrolnych (bez wirusa) supernatantów hodowli komórkowej VeroE6, a następnie jednocześnie sondowano pod kątem dwóch odrębnych regionów kolców wirusowych przy użyciu przeciwciała monoklonalnego i jednego z pięciu odrębnych scFv. Sygnał zależny od stężenia w rozcieńczeniach supernatantów komórkowych zakażonych SARS-Cov-2 zaobserwowano w obu kanałach reporterowych (RP1 i RP2) (Figura 3), co wskazuje, że zarówno komercyjne przeciwciało Hu-anty-S1, jak i różne scFv wykryły cząsteczkę wirusa związaną z mikrosferą sprzężoną z ACE2. W przypadku trzech z pięciu scFv wirus jest wykrywalny w rozcieńczeniach do 1:18 (scFv2, scFv3, scFv5); dla pozostałych dwóch scFv (scFv7 i scFv9) jest wykrywalny w rozcieńczeniach 1:6. Może to wynikać z innego powinowactwa do celu. Jak pokazano na Rysunek 3 i Tabela 1, scFv3 zapewnia najwyższą intensywność MFI, a następnie odpowiednio scFv5, scFv2, scFv7 i scFv9.

Globalnie, wykrywanie scFvs skutkuje niższym MFI w porównaniu do Hu-anti-S1. Może to wskazywać na mniejsze powinowactwo, ale może to być również artefakt ze względu na znakowanie różnymi barwnikami fluorescencyjnymi (PE i BV421). Innym trendem, który można zaobserwować w przypadku scFv7 i scFv9, jest to, że wartości MFI są nieco niższe dla kanału RP1 (anty-spike) w porównaniu z pozostałymi trzema konfiguracjami. Może to wskazywać, że scFv reagują krzyżowo lub w inny sposób zakłócają oddziaływanie ACE2-Hu-anty-S1, co może również wyjaśniać niższy sygnał w kanale RP2. Nie wykryto żadnych cząstek wirusa w supernatancie niezakażonych komórek Vero E6 ani w kanale RP1, ani w kanale RP2.

Mikrosfera sprzężona neutrawityna-biotyna, mikrosfera koziołka-IgG i mikrosfery niesprzężone są używane jako kulki kontroli negatywnej. Cząsteczki wirusa wychwycono za pomocą mikrosfer magnetycznych sprzężonych z ACE2 i przetestowano z komercyjnym ludzkim anty-kolcem w kanale reporterowym RP1 oraz z różnymi scFv w kanale reporterowym RP2 (scFv jest wskazany w lewym górnym rogu każdego panelu). W żadnej z zakażonych i niezakażonych próbek nie wykryto żadnych cząstek wirusa.

Precyzja i solidność testu
Aby ocenić precyzję testu, wszystkie warunki przeprowadzono w trzech egzemplarzach. Dla każdego punktu rozcieńczenia obliczono współczynnik wariancji (CV) dla mikrosfery ACE2. Wszystkie obliczone CV dla testu były poniżej 15%, gdzie najwyższe zmierzone CV wynosiło 13%, a najniższe CV wynosiło 1% (Tabela 2). Jak widać na wykresie gęstości (Rysunek 4) kanału RP1, detekcja PE komercyjnego Hu-anty-S1 wykazuje wyższą precyzję, skoncentrowaną głównie wokół CV wynoszącej 3%. Kanał RP2, detekcja BV scFV, pokazuje wyższe CV. Jednak, jak widać w tabeli 2, większy zakres CV zależy od próbek o niskich stężeniach cząstek wirusa, takich jak ślepa próba ślepa. Aby przetestować solidność protokołu, test został powtórzony dwukrotnie przez różnych operatorów, przy użyciu mieszanin kulek wygenerowanych w różnych dniach i mniejszej objętości próbki (o 72% niższej). Bardzo dobrą korelację Pearsona, w zakresie od 0,98 do 1, zaobserwowano zarówno dla kanałów RP1, jak i RP2 (wartość p < 0,01), potwierdzając solidność testu i możliwość zastosowania testu, gdy dostępna jest mniejsza próbka (Rysunek 5). Ta technologia analizy przepływu jest zgodna z "teorią analitu otoczenia"¹⁷, dzięki czemu test jest czuły na stężenie, ale nie na objętość.

Rysunek 1: Test cząsteczek wirusa. (A) Supernatant komórkowy zarówno z zakażonych, jak i niezakażonych komórek Vero E6 dodaje się w seryjnym rozcieńczeniu do płytki 96-dołkowej lub 384-dołkowej, wraz z mikrosferami magnetycznymi sprzężonymi z neutrawidyną, a następnie sprzężony z biotynylowanym ludzkim ACE2 lub biotyną. Mikrosfery niesprzężone z kozio-IgG i mikrosferami gołymi są stosowane jako kontrole ujemne wraz z mikrosferą sprzężoną neutrawidyna-biotyna. (B) Powstałe kompleksy cząstek mikrosferyczno-wirusowych są wykrywane za pomocą koktajlu detekcyjnego składającego się z Hu-anty-S1 i jednego z różnych scFv ze znacznikiem FLAG. Następnie dodaje się fluorescencyjną mieszankę z anty-ludzką IgG PE skierowaną na Hu-anty-S1 i anty-FLAG Brilliant Violet 421 ukierunkowaną na scFvs. (C) Trzylaserowy, podwójny system detekcji emituje czerwony, zielony i fioletowy laser w celu wykrycia kompleksu mikrocząstek. Czerwony laser wykrywa etykietę barwnika mikrosferycznego, podczas gdy lasery zielony i fioletowy wykrywają odpowiednio anty-S1 i scFvs. Wygenerowane dane są następnie analizowane. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Wykres potwierdzenia koniugacji. Mieszaniny kulek składały się z czterech różnych identyfikatorów mikrosfer, z których każdy był sprzężony z innym białkiem: neutrawidyna-biotyna-ACE2 (ACE2), niesprzężona mikrosfera (Bare Bead), neutrawidyna-biotyna (Biotyna) i kozio-IgG (Kozia IgG). W teście koniugacji zastosowano trzy różne konfiguracje fluoroforów detekcyjnych. Mianowicie, kozia anty-ACE2 + anty-kozia IgG PE, anty-mysia IgG PE i anty-królicza IgG PE. Oś Y pokazuje średni zmierzony sygnał MFI (mediana intensywności fluorescencji; jednostki dowolne) z każdej mikrosfery w trzech różnych warunkach. Oś X pokazuje różne zastosowane przeciwciała wychwytujące. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Multipleksowane wykrywanie białek powierzchniowych. Oś Y: średnia MFI (mediana intensywności fluorescencji; dowolne jednostki ± odchylenie standardowe) dla każdej próbki, analizowanej w trzech dołkach dla każdego warunku. Oś X: Szeregowe punkty rozcieńczania supernatantu komórkowego. Pomarańczowy: Cząsteczki wirusa w supernatancie z Vero E6 zakażonego SARS-CoV-2 WT wykryte za pomocą ludzkiego anty-spike + anty-ludzkiego PE (fikoerytryny). Niebieski: Supernatant z Vero E6 zakażony SARS-CoV-2 WT wykryty za pomocą różnych scFvs + anty-FLAG Brilliant Violet 421. Szary: Wykryto niezakażony supernatant komórkowy z ludzkim anty-spike + anty-ludzkim PE. : Supernatant niezakażonych komórek wykryty za pomocą pięciu różnych scFvs + anty-FLAG Brilliant Violet 421. Cząsteczki wirusa wychwycono za pomocą mikrosfer magnetycznych sprzężonych z ACE2 i przetestowano z komercyjnymi ludzkimi przeciwciałami anty-kolczastymi w kanale reporterowym RP1 oraz z różnymi scFv w kanale reporterowym RP2 (scFv jest wskazany w lewym górnym rogu każdego panelu). W żadnej z niezakażonych próbek nie wykryto żadnych cząsteczek wirusa. Epitop, na który celuje scFv3, miał najwyższe powinowactwo. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Wykres dyspersji wariantów. Oś Y to częstotliwość zdarzeń, a oś X pokazuje współczynnik wariancji (CV) w procentach dla każdej kontrpróby różnych próbek. RP1 i RP2 to pierwszy i drugi kanał reporterowy, który wykrywa fluorescencję związaną odpowiednio z fikoerytryną i fioletem brylantowym 421. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Uruchom macierz korelacji. (A,B) Oś Y: Macierz korelacji Pearsona w skali log10 pomiędzy trzema oddzielnymi przebiegami, prowadzonymi przez trzy różne operatory i z różnymi mieszankami kulek. W trzecim cyklu zastosowano mniejszą objętość próbki. Histogramy pokazują rozkład różnych klastrów zmiennych w oparciu o zmierzone MFI. (A) Korelacja dla kanału reporterskiego RP1 między różnymi przebiegami. (B) Korelacja dla kanału reporterskiego RP2 między różnymi przebiegami. MFI = mediana intensywności fluorescencji w dowolnych jednostkach. p < 0,001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział:

wykrywanie	Reaktywność
scFv2	++
scFv3	+++
scFv5	++
scFv7	+
scFv9	+
Ludzka anty-Spike IgG	++++

Tabela 1: Ranking scFvs w wykrywaniu na podstawie intensywności MFI uzyskanej na krzywych standardowych.

	Przekaźnik RP1 (PE)	Zobacz materiał RP2 (BV421)
Rozcieńczenie próbki	Zakres CV [%]	Zakres CV [%]
pusty	3–11	2–13
1:1458	1–7	2–7
1:456	4–6	3–8
1:162	3–6	3–7
Godzina 1:54	2–4	2–4
Godzina 1:18	2–4	1–4
1:6	2–6	1–6
1:2	1–5	1–3

Tabela 2: Zakres CV% (średnia/odchylenie standardowe × 100) każdego punktu rozcieńczenia supernatantu zakażonego SARS-CoV-2 zarówno dla kanału reporterowego RP1, jak i RP2.

Plik uzupełniający 1: Generacja jednołańcuchowego fragmentu zmiennej immunoglobuliny (scFv). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Badanie przesiewowe scFvs w parach z Fabs przeciwko seryjnemu rozcieńczaniu rekombinowanego Spike (RBD). Aby ocenić wydajność różnych peptydów detekcyjnych, użyto 12 kombinacji białka kolca, Fab, jako wychwytu w buforze wzbogaconym rekombinowanym RBD. Jako detekcję zastosowano dziesięć (10) scFv ukierunkowanych na różne epitopy białka kolca. W zależności od wydajności pary przechwytywania-wykrywania, były one oznaczane jako nieudane (-) lub udane (+). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Badanie przesiewowe scFvs w parach z Fabs przeciwko seryjnemu rozcieńczaniu supernatantu komórek Calu-3 zakażonego SARS-Cov-2. Do oceny skuteczności różnych peptydów detekcyjnych wykorzystano 12 kombinacji białka kolca, Fab, jako wychwyt w supernatancie komórek Calu-3 zakażonym SARS-Cov-2. Jako detekcję zastosowano dziesięć (10) scFv ukierunkowanych na różne epitopy białka kolca. W zależności od wydajności pary przechwytywania-wykrywania, były one oznaczane jako nieudane (-) lub udane (+). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Wykazano, że technologia multipleksowa oparta na koralikach jest cenną platformą do wysokowydajnego wykrywania patogenów w wielu zastosowaniach klinicznych. Wysoka elastyczność platformy, oparta na zasadach cytometrii przepływowej, pozwala na celowanie w przeciwciała, białka i kwasy nukleinowe 18,19,20,21,22^, multipleksując setki analitów jednocześnie. Jednak, zgodnie z naszą wiedzą, technologia ta nie była wcześniej stosowana do wykrywania nienaruszonych cząstek wirusa. W tym raporcie technologia została zastosowana do wykrywania nienaruszonych cząstek wirusa poprzez celowanie w trzy niezależne epitopy powierzchniowe SARS-CoV-2.

Otoczkowe wirusy RNA wykazują wysokie podobieństwo strukturalne do pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV), małych błon fosfolipidowych przenoszących wirusowe RNA i białka wraz z białkami gospodarza²³. Testy immunologiczne typu sandwich były wcześniej stosowane do wykrywania EV przy użyciu pary przeciwciał skierowanych przeciwko dwóm odrębnym białkom powierzchniowym^24,25. Ograniczenie testów kanapkowych do jednoczesnego wykrywania tylko dwóch białek zostało usunięte dzięki podejściu multipleksowemu, które pozwala na jednoczesne wykrywanie więcej niż dwóch białek na reakcję.

Opisany tutaj trzylaserowy system detekcji z podwójnym reporterem jest jak dotąd najbardziej zaawansowanym instrumentem do analizy przepływu opartym na kulkach. W odniesieniu do systemów odczytu z pojedynczym reporterem, podwójny reporter (kanały RP1 i RP2) umożliwia równoległe wykrywanie trzech białek/epitopów powierzchniowych. Celowanie w wiele białek powierzchniowych i epitopów wirusa zapewnia dokładniejsze odwzorowanie obciążenia białkami wirusa, co poza potwierdzeniem, że wirus jest w rzeczywistości nienaruszony, otwiera również możliwość dalszego badania antygenów powierzchniowych wirusa i mechanizmów interakcji między wirusem a białkiem gospodarza.

Podczas pandemii COVID-19 znaczenie szybkiej identyfikacji osób będących nosicielami aktywnych cząstek wirusa było ważne w wysiłkach na rzecz powstrzymania rozprzestrzeniania się wirusa. Genomowe RNA jest wykrywane za pomocą ilościowego RT-PCR niezależnie od jego pochodzenia (nienaruszone cząsteczki wirusa lub wolne). Jednak tylko nienaruszona otoczka z dostępnym białkiem S może pośredniczyć w wejściu do komórki i późniejszej replikacji wirusa. Wcześniejsze badania z wykorzystaniem chipów mikroprzepływowych w próbkach pobranych od pacjentów wykazały, że wykrywanie nienaruszonych cząstek wirusa w połączeniu z testami w miejscu opieki nad pacjentem umożliwiłoby częste testowanie i wzmocniony nadzór nad rozprzestrzenianiem się choroby, w tym bardziej świadomy wybór osób, które mają zostać poddane kwarantannie²⁶. Zastosowanie multipleksowanego testu opartego na mikrosferze pozwoliłoby na zaprojektowanie testów mających na celu badanie przesiewowe wielu wirusów i ich wariantów antygenów powierzchniowych, uzyskując dokładniejszy obraz rozprzestrzeniania się wirusa w populacji.

Wirometria przepływowa to najnowsze osiągnięcie cytometrii przepływowej mające na celu analizę cząstek wirusa. Pomimo zdolności do wykrywania dyskretnych cząstek wirusa, analiza małych wirusów stanowi aktualny problem dla wirometrii przepływowej^27,28. Podobnie jak opisana tu metoda, wirometria przepływowa polega na wychwytywaniu nienaruszonych wirionów przez nanocząstki złota sprzężone z przeciwciałami. Ograniczenia obu metod obejmują (i) zależność od odczynników o wysokim powinowactwie do wychwytywania i wykrywania antygenu o ekspresji powierzchniowej, na który celują mikrosfery lub nanocząstki, (ii) ograniczoną zdolność do rozróżniania cząstek wirusa od pęcherzyków zewnątrzkomórkowych oraz (iii) brak standardów prawidłowej kwantyfikacji cząstek.

Komórki wydzielają EV do swojego otoczenia, a po zakażeniu wirusem mogą również wydzielać wiriony, które są podobnej wielkości jak EV i mogą ostatecznie wyrażać te same antygeny²⁹. Ponieważ EV będą miały podobny skład błon co wirus, może być trudno odróżnić je od siebie przy użyciu wyłącznie metod opartych na powinowactwie, takich jak podejście z podwójnym laserem i pojedynczym reporterem. Jednak opisane tutaj strategie charakteryzują się większą pojemnością multipleksu, co umożliwia szersze i głębsze badanie składu białek cząstek. Metody oparte na przepływie umożliwiają śledzenie dyskretnych cząstek, co daje możliwości cyfrowej kwantyfikacji. Jedną ze strategii rozwiązania problemu kwantyfikacji w naszej metodzie byłoby użycie dobrze scharakteryzowanych syntetycznych pęcherzyków wyrażających interesujące nas antygeny jako cząstki wirusopodobne (VLP) do przygotowania krzywych standardowych.

Powszechną drogą wnikania i wychodzenia SARS-CoV-2 z komórek gospodarza jest interakcja wirusa i błony komórkowej gospodarza ^2,15. W tym procesie prawdopodobieństwo, że białka błony błonowej gospodarza zostaną włączone do powierzchni wirusa, jest wysokie. Poprzez badania przesiewowe wbudowanych białek gospodarza można śledzić drogę infekcji i potencjalnie przewidywać przebieg choroby u pacjentów o różnym ryzyku, co pozwala na wcześniejsze decyzje dotyczące leczenia. Pozwala również na charakterystykę wirusów w różnych partiach próbek w laboratoriach badawczych. Można to dokładniej zbadać, badając, czy różne cechy są związane z różnymi poziomami zakaźności wirusa oraz przeprowadzając badania przesiewowe przeciwciał i cząsteczek leków, które są ukierunkowane na białka powierzchniowe wirusa.

Ważnym aspektem opisanej metody jest to, że opiera się ona na powinowactwie odczynników do wychwytywania i wykrywania w stosunku do ich docelowych białek na wirusie. Wybór odczynników do pomiaru powinowactwa jest zatem czynnikiem decydującym o wydajności testu. Możliwe, że wiele odczynników powinowactwa powinno być przesiewanych i testowanych pod kątem wychwytywania i wykrywania, aby wybrać te o najwyższym powinowactwie. W tym przypadku wstępnie oceniono wydajność dziesięciu scFv i dwunastu fragmentów Fab przy użyciu rekombinowanego RBD i na cząstkach wirusa z supernatantu komórek nabłonka płuc Calu-3 zakażonych SARS-Cov-2 (komórki VeroE6 wykorzystano do hodowli/oceny cytotoksyczności we wszystkich kolejnych badaniach). Anty-FLAG PE został użyty do wykrycia scFv oznaczonych FLAG (Tabela Uzupełniająca 1 i Tabela Uzupełniająca 2). Następnie wybrano pięć najlepiej działających scFv, które miały być zastosowane w teście z podwójnym reporterem, wraz z komercyjnym Hu-anty-S1 (Tabela 1), na supernatantach z zakażonych komórek nabłonka nerki VeroE6 afrykańskiej zielonej małpy.

Kolejnym czynnikiem decydującym o powodzeniu protokołu jest wybrana procedura dla sprzężenia mikrosfery. Metoda sprzęgania powinna być skuteczna, a jednocześnie utrzymywać epitopy konformacyjne lub reszty aminokwasowe biorące udział w wiązaniu białek w stanie nienaruszonym i niezmodyfikowanym. W tym przypadku zastosowano reakcję EDC-NHS w celu sprzężenia neutrawidyny bezpośrednio z mikrosferami, dostosowując wcześniej opisany protokół³⁰ i układ neutrawidyna + biotyna do wiązania rekombinowanego ACE2 ze sprzężonymi mikrosferami. Można testować i porównywać alternatywne metody sprzęgania i ich skuteczność. Na koniec zaobserwowano, że różne znakowane fluorescencyjnie odczynniki detekcyjne (np. anty-FLAG PE (fikoerytryna) i anty-FLAG Brilliant Violet 421) mogą powodować różne poziomy MFI, które mogą wpływać na czułość testu.

Podsumowując, opisana metoda pozwala na wykrycie nienaruszonych cząstek wirusa w roztworze, przy zastosowaniu strategii podwójnego reportera. Równoległa analiza trzech determinantów powierzchniowych dostarcza bardziej szczegółowego narzędzia do charakteryzowania cząstek wirusa i ostatecznie odróżniania ich od innych EV (np. niezawierających antygenów wirusowych). Strategia ta jest alternatywą dla wirometrii przepływowej. Chociaż obecne podejście nie rozróżnia rozmiarów cząstek, strategie kulek magnetycznych wykorzystujące mikrosfery oznaczone kolorami oferują szersze możliwości w profilowaniu antygenów powierzchniowych i projektowaniu eksperymentalnym poprzez analizę o wysokiej wydajności i przepustowości. Test wykazuje wysoką precyzję i solidność i może być rozszerzony na analizę dowolnego rodzaju pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i każdego innego rodzaju biocząstek eksponujących antygeny powierzchniowe w płynach ustrojowych lub innych płynnych matrycach. Było to badanie potwierdzające słuszność koncepcji, które wykazało użyteczność stosowania scFvs jako jednego odczynnika do wykrywania w analizie multipleksowej wielu epitopów białkowych na cząsteczkach wirusa. Konieczne są przyszłe badania w celu określenia specyficznych cech scFvs (np. powinowactwa wiązania, reaktywności krzyżowej z innymi odczynnikami i celami), jeśli mają być one stosowane do celów ilościowych lub klinicznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ACE2-Biotin	Acro Biosystems (Newark, DE)	AC2-H82E6-25 ug	Conc: 340 µ g / mL, LOT#BV35376-203HFI-2128
IgG przeciw kozom, PE sprzężone z PE	Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA)	705-116-147	Gatunek żywiciela: Osioł
Anty-ludzkie IgG R-PE	Life Technologies/Thermo Fisher (Waltham, MA)	H10104	Stężenie: 0,15 mg/mL, LOT#2079224, Gatunek gospodarza: Goat
Anti-Mouse IgG, Jackson	ImmunoResearch (West Grove, PA) sprzężony z PE (West Grove, PA)	115-116-146	Gatunek żywiciela: Koza
Anty-królicze IgG, sprzężone z PE	Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA)	111-116-144	Gatunek żywiciela: Koza
Biotin	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA)	20RUO	100 mM, pH 10 Conc. 1 mg/mL
Kazeina blokująca w PBS	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA)	37528	LOT#VD301372
Odczynnik blokujący do ELISA (BRE)	Roche (Bazylea, Szwajcaria)	11112589001
Brilliant Violet 421 anty-DYKDDDDK Przeciwciało znacznikowe (Anti-FLAG) 0,2 mg/ml, szczur IgG2a, λ	BioLegend (Amsterdam, Holandia)	637321
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Saveen & Werner (Limhamn, Szwecja)	B2000-500	LOT#04D5865
EDC (chlorowodorek 1-etylo-3-[3-dimetyloaminopropylo]karbodimidu)	Proteochem (Hurricane, UT)	C1100-custom (65 mg)	LOT# MK3857
Surowica cielęca płodu (FCS)	Gibco/Thermo Fisher (Waltham, MA)	10270-106
Kozie przeciwciało poliklonalne anty-ACE2	R& D Systems/Bio-Techne (Minneapolis, MN)	AF933	Gatunek żywiciela: Koza
Goat IgG	Bethyl Labs (Montgomery, TX)	P50-200	LOT#P50-200-6
L-glutamina	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA)	25030024
Probówki do mikrofug o niskim poziomie wiązania 1,5 ml	VWR (Radnor, PA)	525-0133
MagPlex-C Microspheres	Luminex Corporation (Austin, TX)	MC10XXX-01
Pożywki tkankowe MEM	Gibco/Thermo Fisher (Waltham, MA)	21430-020
Mikropłytka, 96-dołkowa, polistyren, półpowierzchniowa, przezroczysta	Greiner Bio-One (Kremsmü nster, Austria)	675101
NaHCO3	Gibco/Thermo Fisher (Waltham, MA)	25080-060
Neutravidin	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA)	31000	LOT#UK292857
Tabletki PBS	Medicago AB (Uppsala, Szwecja)	09-9400-100	LOT#272320-01
Penicylina/Streptomycyna	Gibco/Thermo Fisher (Waltham, MA)	15140122
Poli(alkohol winylowy)	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)
Poliwinylopirolidon	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	437190
ProClin 300	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	48915-U
Rabbit IgG	Bethyl Labs (Montgomery, TX)	P120-301	LOT#12
scFv-FAb1	Własna produkcja		Human Antibody Therapeutics Unit, Scilifelab, Szwecja. Monoklonalny scFv. Stężenie: 0,12 mg/ml.
scFv-FAb2	Własna produkcja		Human Antibody Therapeutics Unit, Scilifelab, Szwecja. Monoklonalny scFv. Stężenie w partii1: 0,38 mg/ml. Partia stężenia2: 0,45 mg/ml
scFv-FAb3	Produkcja		Human Antibody Therapeutics Unit, Scilifelab, Szwecja. Monoklonalny scFv. Stężenie: 0,34 mg/ml.
scFv-FAb4	Własna produkcja		Human Antibody Therapeutics Unit, Scilifelab, Szwecja. Monoklonalny scFv. Stężenie: 2,85 mg/ml.
scFv-FAb5	Własna produkcja		Human Antibody Therapeutics Unit, Scilifelab, Szwecja. Monoklonalny scFv. Stężenie: 2,7 mg / ml.
Cząstki zakaźne SARS-CoV-2, izolat szwedzki	Produkcja własna		Szwedzka Agencja Zdrowia Publicznego
Przeciwciało kolca SARS-CoV-2 (Hu-anty-S1)	Novus Biologicals (Centennial, CO)	NBP2-90980	Przeciwciało monoklonalne. Stężenie: 1 mg/ml. Gospodarz: Człowiek. Klon: CR3022. Izotyp: IgG1 Kappa. LOT#T201B06
Fosforan sodu jednozasadowy, bezwodny	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	S3139
Sulfo-NHS (N-hydroksysulfosukcynimid)	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA)	24510	LOT# XH321563
Tween	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA)	BP337-50	LOT#194435
Lampa ultrafioletowa	Vilber Lourmat GmbH (Eberhardzell, Niemcy)	VL-215. G	Długość fali = 254 nm; 2 &razy; 15-watowe żarówki
Ogniwa Vero E6	ATCC (Manassus, VA)	CRL-1586
xMAP INTELLIFLEX DR-SE (dual-reporterowy przyrząd do pomiaru przepływu)	Luminex Corporation (Austin, TX)	INTELLIFLEX-DRSE-RUO