Artykuł metodologiczny

Profilowanie epitopów białek powierzchniowych na cząsteczkach wirusa za pomocą strategii multipleksu dual-reporter

1.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66230

⸱

12 stycznia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Affinity Proteomics-Stockholm Unit, SciLifeLab, Division of Affinity Proteomics, Department of Protein Science, School of Engineering Sciences in Chemistry, Biotechnology and Health (CBH), KTH Royal Institute of Technology, 2Human Antibody Therapeutics Unit, SciLifeLab, Division of Drug Discovery and Development, Department of Protein Science, School of Engineering Sciences in Chemistry, Biotechnology and Health (CBH), KTH Royal Institute of Technology, 3Center for Infectious Medicine, Department of Medicine Huddinge, Karolinska Institutet, 4Public Health Agency of Sweden, 5Department of Microbiology, Tumor and Cell Biology, Karolinska Institutet

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy nowo opracowany multipleksowy fluorescencyjny test immunologiczny, który wykorzystuje system cytometrii z podwójnym przepływem reporterowym do jednoczesnego wykrywania dwóch unikalnych epitopów białka kolca na nienaruszonych cząsteczkach wirusa SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2) zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej, które zostały wychwycone przez mikrosfery magnetyczne sprzężone z enzymem konwertującym angiotensynę.

Streszczenie

Białka błonowe na wirusach otoczkowych odgrywają ważną rolę w wielu funkcjach biologicznych, takich jak przyłączanie wirusa do receptorów komórek docelowych, fuzja cząsteczek wirusa z komórkami gospodarza, interakcje gospodarz-wirus i patogeneza choroby. Co więcej, białka błony wirusowej na cząsteczkach wirusa i prezentowane na powierzchni komórek gospodarza okazały się doskonałymi celami dla leków przeciwwirusowych i szczepionek. W tym miejscu opisujemy protokół badania białek powierzchniowych na nienaruszonych cząstkach koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2) przy użyciu systemu cytometrii z podwójnym przepływem reporterowym. Test wykorzystuje technologię multipleksu w celu uzyskania potrójnego wykrywania cząstek wirusa za pomocą trzech niezależnych reakcji powinowactwa. Kulki magnetyczne sprzężone z rekombinowanym ludzkim enzymem konwertującym angiotensynę-2 (ACE2) wykorzystano do wychwycenia cząstek wirusa z supernatantu komórek zakażonych SARS-CoV-2. Następnie jednocześnie zastosowano dwa odczynniki detekcyjne znakowane R-fikoerytryną (PE) lub fioletem brylantowym 421 (BV421). Jako dowód słuszności koncepcji wykorzystano fragmenty przeciwciał ukierunkowane na różne epitopy białka powierzchniowego Spike (S1) SARS-CoV-2. Wykrycie cząstek wirusa za pomocą trzech niezależnych reakcji powinowactwa zapewnia silną specyficzność i potwierdza wychwytywanie nienaruszonych cząstek wirusa. Krzywe zależności od dawki supernatantu komórkowego zakażonego SARS-CoV-2 uzyskano z wariancjami współczynników replikacji (średnia/SD) ˂14%. Dobre wyniki testów w obu kanałach potwierdziły, że dwa epitopy białka docelowego na powierzchni wirusa są wykrywalne równolegle. Opisany tutaj protokół może być zastosowany do (i) wysokomultipleksowego, wysokoprzepustowego profilowania białek powierzchniowych ulegających ekspresji na wirusach otoczkowych; ii) wykrywanie aktywnych, nienaruszonych cząstek wirusa; oraz (iii) ocenę swoistości i powinowactwa przeciwciał i leków przeciwwirusowych do epitopów powierzchniowych antygenów wirusowych. Zastosowanie można potencjalnie rozszerzyć na każdy rodzaj pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i biocząstek, odsłaniając antygeny powierzchniowe w płynach ustrojowych lub innych płynnych matrycach.

Wprowadzenie

Najczęstszymi wirusami chorobotwórczymi, takimi jak grypa, HIV, ludzki wirus cytomegalii i szczepy SARS-CoV, są wirusy otoczkowe. Zakażenie komórek wirusami otoczkowymi wymaga fuzji błon komórkowych wirusa i gospodarza, co powoduje uwolnienie genomu wirusa do cytoplazmy. Wirusowe RNA zostanie następnie zreplikowane, zanim zostanie upakowane w nową cząsteczkę wirusa1,2. Podczas tych procesów nie tylko białka wirusowe, ale także białka błony gospodarza mogą zostać włączone do otoczki, stając się integralną częścią nowej cząsteczki wirusa. Białka błony komórkowej gospodarza włączone do otoczki wirusa mogą ułatwiać wirusowi wnikanie do nowej komórki gospodarza, wykorzystując mechanizmy interakcji komórka-komórka, naprowadzania i ucieczki układu odpornościowego3,4.

Pomimo wagi badania białek związanych z wirusem, większość obecnie dostępnych technik analizy wirusów5 nie obsługuje charakterystyki powierzchniowej wirusa o wysokiej przepustowości i multipleksie. Nie są też w stanie wykryć pojedynczych cząstek wirusa ani rozróżnić zakaźnych nienaruszonych cząstek wirusa, niezakaźnego RNA, białek wirusowych i subpopulacji wirusa wyrażających różne antygeny. Ostatnio cytometria przepływowa została zmodyfikowana i zaadaptowana do nowej metody analizy cząstek wirusowych, a mianowicie wirometrii przepływowej. Wirometria przepływowa pozwala na badanie pojedynczych cząstek wirusa i ich antygenów powierzchniowych. Pozostają jednak ograniczenia, takie jak niska przepustowość, niska zdolność do multipleksowania, skomplikowana konfiguracja eksperymentalna i analiza danych oraz ograniczona wykrywalność małych cząstek wirusa6,7.

Multipleksowana kwantyfikacja białek i kwasów nukleinowych oparta na mikrosferach to sprawdzona technologia o wielu zastosowaniach, począwszy od kwantyfikacji białek w płynach ustrojowych, poprzez badania interakcji białko-białko, aż po diagnostykę infekcji wirusowych8,9,10,11,12,13. Niedawno wprowadzony przyrząd do analizy przepływu posiada podwójny kanał reporterowy, co pozwala na pomiar dwóch fluorescencyjnych cząsteczek reporterowych w tej samej studni reakcyjnej. Ta nowa funkcja okazała się szczególnie przydatna do równoległego profilowania różnych izotypów immunoglobulin14. W tym miejscu opisano, w jaki sposób system podwójnego reportera może być wykorzystany do wykrywania nienaruszonych cząstek wirusa, celujących równolegle w wiele antygenów powierzchniowych.

Jako dowód słuszności koncepcji, ten raport szczegółowo opisuje rozwój systemu potrójnego wykrywania cząsteczek wirusa SARS-CoV-2. SARS-CoV-2 składa się z czterech głównych białek, jednym z nich jest białko kolca (S), które składa się z dwóch podjednostek. Pierwsza podjednostka, S1, powoduje pierwotne wiązanie z ACE2 wyrażającym się w błonach komórkowych ludzkich. Druga podjednostka, S2, ułatwia wejście do komórki docelowej przez peptyd fuzyjny, tworząc pory w błonie komórki docelowej, przez które wirion może przedostać się przez15. Trzy pozostałe elementy budulcowe SARS-CoV-2 to nukleokapsyd (N), białko błonowe (M) i białko otoczki (E). Nukleokapsyd jest odpowiedzialny za pakowanie genomu wirusa poprzez tworzenie struktur rybonukleoproteinowych z RNA, podczas gdy białka błony i otoczki odgrywają kluczową rolę w składaniu wirusa.

Opisany tutaj test jest ukierunkowany na trzy niezależne epitopy podjednostki S1 wyrażone na powierzchni otoczki SARS-CoV-2. Stosuje się seryjne rozcieńczenia zarówno supernatantów komórkowych zakażonych SARS-CoV-2, jak i niezakażonych. Cząsteczki wirusa są wychwytywane przez mikrosfery sprzężone z ACE2, wiążące podjednostkę S1 na wirusie. Białko powierzchniowe wirusa S jest następnie wykrywane równolegle z dostępnym na rynku znakowanym fragmentem zmiennej jednołańcuchowej immunoglobuliny (scFv) i ludzkim przeciwciałem monoklonalnym anty-S1 (Hu-anty-S1) wraz z opracowanym przez nas scFv znakowanym FLAG. Hu-anty-S1 jest wykrywany przez pierwszy kanał (RP1) w układzie podwójnego reportera z pomarańczowym przeciwciałem anty-ludzkim IgG-Fc sprzężonym z pomarańczową R-fikoerytryną (PE), a scFv jest wykrywany przez drugi kanał (RP2) z niebieskim przeciwciałem anty-FLAG sprzężonym z niebieskim fioletem brylantowym 421 (BV421). Test cząsteczek wirusa jest reprezentowany w Rysunek 1.

Protokół

1. Koniugacja neutrawidyny i przeciwciał kontrolnych z mikrosferami magnetycznymi

UWAGA: Fluorescencyjnie barwione kulki magnetyczne (mikrosfery polistyrenowe o średnicy 6,5 μm z zatopionym magnetytem) z różnymi etykietami fluorescencyjnymi, wymienione w Tabeli Materiałów, są używane do generowania następujących koniugatów i kontroli koralików: (1) Biotynylowany rekombinowany ludzki ACE2 związany z koralikami sprzężony z linkerem neutrawidyny; (2) Biotyna związana z kulkami sprzężona z łącznikiem neutrawidyny; (3) Kozia IgG sprzężona bezpośrednio z koralikami; oraz (4) Koraliki niesprzężone. Białko, które ma być sprzężone z kulkami, powinno być wolne od azydku sodu, albuminy surowicy bydlęcej (BSA), glicyny, tris(hydroksymetylo)aminometanu (Tris), glicerolu lub dodatków zawierających aminy. Bufor aktywacyjny to 0,1 M Fosforan sodu jednozasadowy, bezwodny (NaH2PO4), pH 6. Kwas 2-morfolinoetanosulfonowy (MES; 50 mM) Bufor o pH 5 służy do rozcieńczania koniugatów. Bufor płuczący to PBS-T (1x PBS [sól fizjologiczna buforowana fosforanami], pH 7,4 + 0,05 % (v/v) Tween-20). Bufor magazynowy to 2,7 mg/ml odczynnik blokujący do testu ELISA (BRE) + 0,1% antybiotyków (tutaj ProClin 300).

  1. Usunąć sproszkowany sulfo-N-hydroksysulfosukcynimid (NHS) z lodówki i 65 mg wstępnie podzielonego chlorowodorku 1-etylo-3-[3-dimetyloaminopropylo]karbodimidu (EDC) z zamrażarki i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej (RT; 18-22 °C) przez 30 minut. Na tym etapie należy przechowywać zarówno NHS, jak i EDC w kopercie zawierającej kulki krzemionki, aby zapobiec hydrolizie z wilgoci atmosferycznej.
  2. Przygotuj mikrosfery do aktywacji i sprzężenia.
    UWAGA: Barwniki fluorescencyjne w mikrosferach są wrażliwe na światło, a kulki należy przechowywać w ciemności i w temperaturze lodówki (4-8 °C), gdy nie są aktywnie używane.
    1. Ponownie zawiesić 4 różne zapasy mikrosfer oznaczonych kolorem ID (12,5 x 106/ml) (tabela materiałów) poprzez krótkie wirowanie, sonikację lub obracanie (15 min przy 15-30 obr./min), zgodnie z kartą informacyjną produktu.
    2. Przenieść 40 μl każdej zawiesiny kulek (5 x 105 mikrosfer) do przypisanych studzienek półdołkowej, płaskodennej, 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania (tabela materiałów).
    3. Umyj koraliki magnetyczne.
      UWAGA: Etapy mycia można wykonywać ręcznie lub za pomocą automatycznej myjki do płyt.
      1. Dodać 80 μl/studzienkę buforu aktywacyjnego do kulek i unieruchomić kulki na magnetycznym separatorze płytkowym na 30 sekund. Odessać supernatant z mikrosfer, podczas gdy kulki są unieruchomione na magnetycznym separatorze płytkowym.
      2. Wyjąć płytkę do mikromiareczkowania z magnetycznego separatora płytkowego i ponownie zawiesić kulki w 50 μl buforu aktywacyjnego.
  3. Aktywuj kulki za pomocą Sulfo-NHS i EDC.
    1. Przygotować roztwór roboczy Sulfo-NHS o stężeniu 50 mg/ml w buforze aktywacyjnym w probówce do mikrofug o pojemności 1,5 ml. Zapas NHS należy włożyć do lodówki (4-8 °C), chronić przed wilgocią.
    2. Przygotować roztwór roboczy EDC o stężeniu 50 mg/ml w buforze aktywacyjnym w probówce do mikrofug o pojemności 1,5 ml. Rozpuścić przygotowane 65 mg porcje proszku EDC w 1,3 ml buforu aktywacyjnego.
      UWAGA: Sulfo-NHS i EDC zaczynają się hydrolizować i tracą aktywność po rozpuszczeniu. Unikaj przerywania procedury sprzęgania, dopóki NHS i EDC nie zostaną dodane do koralików. Nie należy przechowywać rozpuszczonych roztworów NHS lub EDC do późniejszego wykorzystania.
    3. Przygotuj roztwór aktywacyjny do aktywacji kulek poprzez wolumetryczne połączenie 20% roztworu podstawowego Sulfo-NHS (50 mg / ml), 20% roztworu podstawowego EDC (50 mg / ml) i 60% buforu aktywacyjnego. Do każdej reakcji aktywacji kulek (przy użyciu 5 × 105 kulek na reakcję) wymagany jest roztwór aktywacyjny o objętości 50 μl, a także dodatkowa objętość wystarczająca do zniwelowania strat związanych z pipetowaniem.
    4. Dodać 50 μl kompletnego roztworu aktywacyjnego do każdej studzienki zawierającej umyte kulki. Przy istniejącej wcześniej objętości zawiesiny kulek wynoszącej 50 μl w buforze aktywacyjnym na studzienkę, końcowe stężenie Sulfo-NHS wyniesie 5 mg / ml, a końcowe stężenie EDC również wyniesie 5 mg / ml.
    5. Uszczelnić płytkę reakcyjną mikrosfery jednorazowym klejem z tworzywa sztucznego lub folii uszczelniającej płytki i inkubować przez 20 minut na wytrząsarce orbitalnej (650 obr./min) w temperaturze pokojowej (18-22 °C) w ciemności.
  4. Zmyj nadmiar roztworu aktywacyjnego z kulek.
    1. Odwirować płytkę do mikromiareczkowania o masie 233 × g przez 1 min.
    2. Unieruchomić aktywowane kulki na magnetycznym separatorze płytkowym na 30 sekund. Usunąć zgrzewarkę do płytek i zassać supernatant z kulek unieruchomionych magnesem, gdy płytka mikromiareczkowania jest nadal umieszczona na separatorze magnetycznym.
    3. Wyjąć płytkę do mikromiareczkowania z separatora magnetycznego i dodać 100 μl buforu MES do każdej studzienki.
    4. Powtórz kroki 1.4.2-1.4.3 jeszcze jeden raz, w sumie dwa prania.
  5. Połącz neutrawidynę i kozią IgG (kontrolę) z odpowiednimi zestawami kulek. Przygotować wystarczającą ilość roztworów roboczych neutrawidyny i kozich IgG, planując 100 μl/reakcję i wystarczającą ilość dodatkowej ilości do uzupełnienia strat przy pipetowaniu, jak następuje:
    UWAGA: Białko neutrawidyny w proszku rozpuszcza się w ultraczystej wodzie, a następnie rozcieńcza do roztworu podstawowego o stężeniu 1 mg/ml z PBS przed podaniem do przechowywania/użycia (białko neutrawidyny nie jest bezpośrednio rozpuszczalne w PBS, ale jest rozpuszczalne w wodzie do ~10 mg/ml).
    1. Przygotować roztwór roboczy neutrawidyny o stężeniu 125 μg/ml w buforze MES w probówce o zawartości 1,5 ml o niskiej zawartości białka do mikrofuge.
    2. Przygotować roztwór roboczy przeciwciała kontrolnego IgG koziego o stężeniu 17,5 μg/ml w buforze MES.
    3. Przygotować płytkę do mikromiareczkowania zawierającą aktywowane kulki. Unieruchomij koraliki na magnetycznym separatorze płytkowym na 30 s. Trzymając płytkę do mikromiareczkowania nadal umieszczoną na separatorze magnetycznym, odessać supernatant z kulek unieruchomionych magnesem.
    4. Dodać 100 μl roztworu roboczego neutrawidyny (125 μg/ml) do odpowiednich studzienek zawierających kulki (dla sprzężenia neutrawidyna-biotyna i neutrawidyna-ACE2).
    5. Dodać 100 μl koziego roztworu roboczego IgG (17,5 μg/ml) do studzienki zawierającej kulki przypisane jako kontrole tylko dla kozich IgG.
    6. Dodać 100 μl buforu MES do dobrze przypisanych jako kontrolne niesprzężone kulki.
    7. Uszczelnić płytkę do mikromiareczkowania i inkubować przez 2 godziny na wytrząsarce orbitalnej (650 obr./min) w temperaturze suchej (18-22 °C) w ciemności. Po 1 godzinie inkubacji krótko zagrodzić płytkę, aby upewnić się, że kulki pozostają w zawiesinie.
  6. Umyj koraliki za pomocą PBS-T.
    1. Odwirować płytkę do mikromiareczkowania o masie 233 × g przez 1 min.
    2. Unieruchomij sprzężone koraliki na magnetycznym separatorze płytkowym na 30 s. Trzymając płytkę do mikromiareczkowania nadal umieszczoną na separatorze magnetycznym, odessać supernatant z kulek unieruchomionych magnesem.
    3. Wyjmij płytkę do mikromiareczkowania z separatora magnetycznego.
    4. Dodać 100 μl PBS-T do każdej studzienki zawierającej kulki.
    5. Powtórzyć kroki prania 1.6.2-1.6.4 jeden raz, co daje w sumie dwa prania z PBS-T.
  7. Przygotuj sprzężone koraliki do przechowywania.
    1. Unieruchomij sprzężone koraliki na magnetycznym separatorze płytkowym na 30 s. Trzymając płytkę do mikromiareczkowania nadal umieszczoną na separatorze magnetycznym, odessać supernatant z kulek unieruchomionych magnesem. Wyjmij płytkę do mikromiareczkowania z separatora magnetycznego.
    2. Dodaj 50 μl bufora do przechowywania każdego identyfikatora mikrosfery, aby ugasić pozostałą aktywność kulek.
    3. Inkubować płytkę do mikromiareczkowania w temperaturze lodówki (4-8 °C) w ciemności przez noc (16-22 h).
    4. Przenieś niesprzężone i sprzężone z kozią IgG zawiesiny kulek (50 μl) do odpowiednio oznakowanych 1,5 ml probówek mikrofuge o niskiej zawartości wiązania białka, w połączeniu z dwoma 100-μl płukania studzienek buforem magazynującym, aby zapewnić maksymalny odzysk kulek.
      UWAGA: Niesprzężone i kozie koraliki sprzężone IgG będą miały liczbę 5 × 105 w końcowej objętości 250 μL (tj. 2 × 103 koraliki/μL). Przechowuj probówki do mikrofug w temperaturze lodówki (4-8 °C) do czasu użycia.
  8. Zwiąż biotynylowany ACE2 i biotynę z kulkami sprzężonymi z neutrawidyną.
    1. Przygotować rekombinowany ludzki biotynylowany roztwór roboczy ACE2 o stężeniu 18 μg/ml ACE2 w 10 mM PBS. Na reakcję potrzebne będzie 100 μl. Przygotować roztwór roboczy biotyny o stężeniu 2,4 mg/ml biotyny w 10 mM PBS. Na reakcję potrzebne będzie 100 μl.
    2. Przygotować płytkę do mikromiareczkowania zawierającą mikrosfery sprzężone z neutrawidyną.
      1. Unieruchomij mikrosfery na magnetycznym separatorze płytkowym na 30 sekund. Trzymając płytkę do mikromiareczkowania nadal umieszczoną na separatorze magnetycznym, wyjmij uszczelniacz płytek i odessaj supernatant z mikrosfer unieruchomionych magnesem.
      2. Wyjąć płytkę do mikromiareczkowania z separatora magnetycznego i dodać 50 μl 10 mM PBS/studzienkę.
      3. Powtórz kroki 1.8.2.1-1.8.2.2 jeden raz.
    3. Dodać 100 μl roztworu roboczego biotynylowanego ACE2 do odpowiednich studzienek zawierających mikrosfery sprzężone z neutrawidyną. Dodać 100 μl roztworu roboczego biotyny do odpowiednich studzienek zawierających mikrosfery sprzężone z neutrawidyną.
    4. Uszczelnić płytkę do mikromiareczkowania i inkubować przez 1 godzinę na wytrząsarce orbitalnej (650 obr./min) w temperaturze suchej (18-22 °C) w ciemności.
  9. Umyj mikrosfery zgodnie z opisem w krokach 1.6.1-1.6.5.
  10. Przygotuj i przechowuj mikrosfery sprzężone z ACE2 i biotyną zgodnie z opisem w krokach 1.7.1-1.7.4.
    UWAGA: Biotynylowane kulki sprzężone z ACE2 i biotyną będą miały liczbę 5 × 105 w końcowej objętości 250 μL (tj. 2 × 103 kulki/μL).

2. Test koniugacyjny

  1. Przygotuj mieszaninę kulek, łącząc wszystkie cztery typy mikrosfer utworzonych w sekcji 1 (tj. biotynylowany ACE2 sprzężony z neutrawzyną, biotyna sprzężona z neutrawidyną, kozia IgG sprzężona i niesprzężona).
    UWAGA: Mikrosfery podstawowe przechowywano w ilości 2 × 103 kulek/μl i łączono w taki sposób, aby końcowe stężenie kulek w roboczej mieszaninie kulek wynosiło 40 kulek z każdego zestawu/μl.
    1. Obliczyć objętość roboczej mieszaniny kulek niezbędnej do badania (5 μl/reakcję), pozwalając na zniwelowanie strat związanych z pipetowaniem. Krótko zmieszaj każdą probówkę i połącz równe obliczone objętości każdej zawiesiny kulek w nowej probówce do mikrofugi o niskim poziomie wiązania białek. Stężenie kulek wynosi teraz 400 kulek z każdego zestawu/μl.
    2. Utwórz roboczą mieszaninę kulek, rozcieńczając połączoną zawiesinę kulek dodatkowo 10-krotnie za pomocą buforu do przechowywania (40 każdego zestawu/μl stężenia roboczego).
      UWAGA: Najpierw wykonaj niewielką ilość roboczej mieszanki kulek, aby oszacować liczbę mikrosfer/μl dla każdego ID.
  2. Inkubować mikrosfery z kozim przeciwciałem anty-ACE2.
    1. Odpipetować 5 μl roboczej mieszaniny kulek do 3 dołków płaskodennej, półdołkowej, 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania.
    2. Dodać 50 μl koziego anty-ACE2 (0,4 μg/ml rozcieńczonego w PBS-T, tabela materiałów) do 3 dołków zawierających kulki na płytce do mikromiareczkowania. Uszczelnić płytkę do mikromiareczkowania, odwirować i inkubować na wytrząsarce orbitalnej (650 obr./min) w temperaturze suchej (18-22 °C) przez 1 godzinę w ciemności.
  3. Pulsacyjnie przesuwać płytkę do mikromiareczkowania przy 233 × g przez 1 minutę i przemyć mikrosfery trzykrotnie PBS-T, jak opisano w ppkt 1.6.2-1.6.4.
  4. Inkubuj mikrosfery z przeciwciałami wykrywającymi.
    1. Odpipetować 5 μl roboczej mieszaniny kulek do 6 nowych dołków płytki do mikromiareczkowania.
    2. Przygotować 1 μg/ml każdej z roboczych mieszanin detekcyjnych: anty-koziej IgG PE, anty-mysiej IgG PE i anty-króliczej IgG PE w 3 oddzielnych probówkach o pojemności 1,5 ml, używając PBS-T jako rozcieńczalnika.
    3. Dodać 50 μl mieszanin detekcyjnych do 3 studzienek każdy, a anty-kozią IgG dodaje się do tych samych studzienek co anty-ACE2 z kroku 2.2.
    4. Uszczelnić, wirować i inkubować na wytrząsarce orbitalnej (650 obr./min) w temperaturze RT (18-22 °C) przez 30 min.
  5. Pulsacyjnie przesuwać płytkę przy stężeniu 233 × g przez 1 minutę i przemyć mikrosfery trzykrotnie PBS-T, jak opisano w 1.6.2-1.6.4.
  6. Dodaj 100 μl PBS-T i uruchom na przyrządzie do analizy przepływu z podwójnym reporterem z następującymi ustawieniami:
    Tryb: Podwójny reporter; Limit czasu: 45 s; Bramkowanie DD: 7500-17500; Minimalna liczba mikrosfer: 100 mikrosfer/zestaw (najniższa granica QC: 35 mikrosfer/zestaw).

3. Produkcja supernatantu komórkowego zakażonego SARS-CoV-2

Wirus SARS-CoV-2 rozprzestrzenia się w komórkach Vero E6 gospodarza (linia komórkowa nabłonka nerki małpy; ATCC; Tabela materiałów). Komórki Vero E6 są hodowane w zmodyfikowanej pożywce Eagles (MEM) w temperaturze 37°C w atmosferze o wilgotności 5%CO2 i wilgotności względnej 95%. Każdy litr MEM uzupełnia się 10 ml L-glutaminy (200 mM), 38 ml NaHCO3 (7,5%), 5 ml roztworu penicyliny/streptomycyny i 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FCS); Tabela materiałów.

UWAGA: Używaj odpowiednich procedur i sprzętu bezpieczeństwa biologicznego podczas obchodzenia się z SARS-CoV-2.

  1. Komórki Vero E6 są hodowane do zbiegu w dwóch kolbach do hodowli tkankowych o długości 150cm2. Zainfekuj jedną butelkę wirusem SARS-CoV-2, a drugą pozorowaną infekcję użyj jako kontroli.
  2. Wymieszaj około 100 000 zakaźnych cząstek SARS-CoV-2 typu dzikiego (WT) z 5 ml pożywki Eagles MEM.
  3. Odessać pożywkę z jednej kolby o średnicy 150cm2 i dodać 55 ml kompletnego MEM w celu wytworzenia niezakażonych supernatantów kontrolnych. Odessać pożywkę z drugiej kolby o długości150 cm2 i dodać mieszaninę wirusów do komórek. Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Delikatnie wstrząsać kolbą co 15 minut w celu rozprowadzenia wirusa.
  4. Dodać 50 ml kompletnej pożywki MEM do kolby z dodatkiem SARS-CoV-2 i inkubować komórki, aż zaobserwuje się efekty cytopatyczne, wizualnie oceniając kolby co 24 godziny
    UWAGA: Wystąpienie cytopatii powinno zająć około 3-4 dni po zakażeniu. Wpływ cytopatyczny na strukturę jednowarstwową komórki Vero E6 (np. retrakcja komórki, krenacja, zaokrąglenie, deadhezja, utrata ziarnistości wewnątrzcytoplazmatycznej, jawna liza) ocenia się jakościowo, obserwując komórki za pomocą mikroskopu ze światłem odwróconym, zgodnie z wytycznymi Międzynarodowej Organizacji Normalizacyjnej dotyczącymi badań cytotoksyczności in vitro16.
  5. Zebrać supernatant komórkowy z obu kolb i wirować przez 6 minut w temperaturze 253 × g do osadu na resztkach komórek.
  6. Inaktywowany promieniami UV wirus SARS-CoV-2 w supernatancie komórki
    1. Odpipetować 0,5 ml supernatantu na studzienkę do 12 dołków w 24-dołkowej płytce do mikromiareczkowania. Naświetlić promieniami UV płytkę do mikromiareczkowania, bez pokrywy, przez 30 s pod odpowiednią lampą ultrafioletową (tabela materiałów).
      UWAGA: Inaktywację wirusa w supernatancie komórkowym należy stwierdzić poprzez próbę namnażania wirusa w hodowlach komórkowych Vero E6.
  7. Porcję supernatantu komórkowego rozmieścić w probówkach o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
    UWAGA: Supernatant komórki może być przechowywany w temperaturze -80 °C.

4. Test: Wykrywanie cząsteczek wirusa SARS-CoV-2 w supernatancie komórki

  1. Przygotuj bufor do testów, mieszając 0,1% kazeiny, 0,5% alkoholu poliwinylowego, 0,8% poliwinylopirolidonu i 1% BSA (wszystkie w/v) (pH 7). Przygotować bufor do rozcieńczania próbki, przygotowując 10% królicze IgG w buforze do oznaczania.
  2. Obliczyć i przygotować objętość roboczej mieszaniny kulek (krok 2.1) niezbędną do badania (5 μl/reakcję), pozwalając na zniwelowanie strat związanych z pipetowaniem.
  3. Przygotować serię rozcieńczeń supernatantu. Obliczyć niezbędne objętości supernatantu. Oznaczyć każdy punkt rozcieńczenia w trzech dołkach dla każdego z pięciu scFv, co daje 15 dołków na punkt rozcieńczenia i typ próbki. Użyć 45 μl rozcieńczonych supernatantów w każdym dołku, co daje w sumie wymagane 675 μl; wystarczy pojedyncza probówka o pojemności 1,5 ml do mikrofiltrów dla każdego z supernatantów SARS-CoV-2 i kontrolnych.
    1. Supernatanty SARS-CoV-2 rozmrażać i supernatanty kontrolne w temperaturze 4 °C przez co najmniej 1 godzinę. Przechowywać supernatanty i ich rozcieńczenia w niskiej temperaturze (2–8 °C) do czasu użycia. Oznacz i ułóż osiem probówek do mikrofuge o pojemności 1,5 ml każda dla SARS-CoV-2 i supernatantów kontrolnych.
      UWAGA: Najwyższym badanym stężeniem będzie rozcieńczenie sklarowanego osadu w stosunku 1:1 (2-krotnie), z którego zostanie wykonana seria rozcieńczeń w stosunku 1:2 (3-krotnie) przy użyciu buforu do rozcieńczania próbki, przy czym najwyższe rozcieńczenie będzie miało miejsce w stosunku 1:1458. Ślepe próby zawierające bufor do rozcieńczania próbki służą wyłącznie jako kontrole bez stosowania supernatantu. W związku z tym badane rozcieńczenia każdego typu supernatantu (SARS-CoV-2 lub kontrola) będą 2, 6, 18, 54, 162, 486 i 1458-krotne, z kontrolą tylko buforową.
    2. Dodaj bufor do rozcieńczania próbki do oznakowanych probówek do mikrofuge. Probówki rozcieńczające 1:1 (2-krotnie) wymagają 600 μl buforu, a pozostałe probówki wymagają 800 μl buforu. Uzyskać najwyższe rozcieńczenie (1:1; 2-krotnie) każdego supernatantu, łącząc 600 μl supernatantu z 600 μl buforu do rozcieńczania próbki w odpowiednio oznakowanych probówkach, a następnie krótko wirując probówkę w celu wymieszania.
    3. Kontynuować serię, przenosząc kolejno 400 μl rozcieńczonych supernatantów w stosunku 1:1 (2-krotnie) do następnej probówki rozcieńczającej (tj. rozcieńczenie 6-krotne) i kontynuować 3-krotne rozcieńczenia, aż do uzyskania najniższego rozcieńczenia (1458-krotnie). Krótko zawirować każdy rozcieńczony supernatant przed przystąpieniem do następnego rozcieńczenia.
  4. Inkubować mikrosfery z supernatantem.
    1. Wirować wstępnie przygotowaną roboczą mieszaninę kulek przez 30 sekund w celu ponownego zawieszenia mikrosfer i dodać 5 μl mieszaniny kulek do każdego przypisanego dołka płaskodennej 384-dołkowej płytki do mikromiareczkowania.
      UWAGA: Można również stosować płytki 96-dołkowe.
    2. Dodać 45 μl przygotowanych rozcieńczeń supernatantu do wyznaczonych studzienek zawierających mikrosfery w płytce 384-dołkowej. Uszczelnić płytkę i inkubować przez noc (16-22 h) na wytrząsarce orbitalnej (650 obr./min) w temperaturze RT (18-22°C) w ciemności.
  5. Zmyć nadmiar supernatantu z koralików.
    1. Wyjmij płytkę do mikromiareczkowania z wytrząsarki orbitalnej i usuń uszczelniacz płytek. Odwirować płytkę o sile 931 x g przez 1 min.
    2. Unieruchomić kulki, umieszczając płytkę mikromiareczkowania na magnetycznym separatorze płytkowym na 30 sekund. Trzymając płytkę do mikromiareczkowania nadal umieszczoną na separatorze magnetycznym, usuń uszczelniacz płytek i odessaj supernatant z kulek unieruchomionych przez magnes.
    3. Wyjmij płytkę do mikromiareczkowania z separatora magnetycznego.
    4. Dodaj 60 μl PBS-T do każdej studzienki zawierającej kulki.
    5. Powtórzyć kroki prania 4.5.2-4.5.4 dwa razy, co daje w sumie trzy prania PBS-T.
  6. Przygotuj różne mieszaniny detekcyjne w oddzielnych probówkach o pojemności 1,5 ml. Każda mieszanina detekcyjna składa się z komercyjnego ludzkiego przeciwciała monoklonalnego anty-S1 (Hu-anty-S1) (1 μg/ml) i jednego z pięciu różnych scFvs znakowanych FLAG (1 μg/ml) (plik uzupełniający 1, tabela uzupełniająca 1 i tabela uzupełniająca 2) ukierunkowanych na białko kolca na cząsteczce SARS-CoV-2, rozcieńczone w buforze testowym (krok 4.1), co daje w sumie pięć różnych mieszanek wykrywających.
  7. Powtórz kroki 4.5.2-4.5.3. Ponownie zawiesić przemyte mikrosfery w 50 μl/studzienkę odpowiedniej mieszanki do wykrywania kolców specyficznej dla scFv. Uszczelnić płytkę do mikromiareczkowania i inkubować przez 1 godzinę na wytrząsarce orbitalnej (650 obr./min) w temperaturze suchej (18-22 °C) w ciemności.
  8. Odwirować płytkę do mikromiareczkowania o masie 931 × g przez 1 minutę. Nadmiar odczynnika do wykrywania kolców wypłukać z kulek. Wykonać trzy etapy płukania 60 μl PBS-T zgodnie z krokami 4.5.2-4.5.5.
  9. Inkubować mikrosfery z mieszaniną przeciwciał detekcyjnych fluorescencyjnych.
    1. Przygotować mieszaninę roztworów fluorescencyjnych składającą się z dostępnych w handlu anty-ludzkich IgG sprzężonych z PE wraz z przeciwciałem anty-FLAG sprzężonym z BV421 rozcieńczonym w buforze testowym, o stężeniach roboczych odpowiednio 0,2 μg/ml i 1 μg/ml. Na reakcję potrzeba 50 μl odczynnika do wykrywania fluorescencyjnego.
    2. Powtórz kroki 4.5.2-4.5.3. Zawiesić mikrosfery w 50 μl/studzienkę mieszaniny roztworu fluorescencyjnego. Uszczelnić płytkę do mikromiareczkowania i inkubować przez 30 minut na wytrząsarce orbitalnej (650 obr./min) w temperaturze suchej temperatury (18-22 °C) w ciemności.
  10. Obracać płytkę do mikromiareczkowania w temperaturze 931 × g przez 1 minutę. Nadmiar mieszanki roztworów fluorescencyjnych wypłukać z mikrosfer. Wykonać trzy etapy płukania 60 μl PBS-T zgodnie z krokami 4.5.2-4.5.5.
  11. Zawiesić mikrosfery w 60 μl PBS-T od ostatniego etapu mycia. Przeanalizuj płytkę w systemie analizy przepływu z podwójnym reporterem z ustawieniami opisanymi w kroku 2.6.

Wyniki

Test konjugacji
Test konjugacji wykazał, że IgG kozie oraz biotynylowane ACE2 z neutrawidyną zostały pomyślnie sprzężone z mikrosferami. Specyficzność detekcji w teście potwierdzono poprzez inkubację mikrosfer sprzężonych z ACE2 z przeciwciałami wtórnymi znakowanymi PE, wytworzonymi u różnych gatunków zwierząt (Rysunek 2). Nie zaobserwowano reaktywności krzyżowej między różnymi przeciwciałami detekcyjnymi. Po inkubacji mieszanin kulek z przeciwciałami kozimi anty-ACE2 + anty-kozimi IgG PE, wartość mediany intensywności fluorescencji (MFI; jednostki arbitralne) powyżej tła została wykryta zarówno dla mikrosfer sprzężonych z ACE2, jak i z IgG kozim, ale nie dla mikrosfer niesprzężonych (gołych) ani dla mikrosfer powlekanych biotyną. Jako kontrole negatywne w celu sprawdzenia obecności sygnałów fałszywie dodatnich zastosowano anty-mysie IgG PE oraz anty-królicze IgG PE. Po inkubacji z mikrosferami wygenerowano pomijalny sygnał fluorescencji, co wskazuje, że sygnały dodatnie dla ACE2 i IgG koziego były specyficzne.

Wykrywalność cząsteczek wirusa w supernatantach komórkowych
Kuleczki magnetyczne sprzężone z rekombinowanym ludzkim ACE2 wykorzystano do wychwytywania cząsteczek wirusa SARS-CoV-2 z supernatantów kultur komórek VeroE6 zakażonych oraz kontrolnych (bez wirusa), a następnie przeprowadzono jednoczesną detekcję dwóch różnych regionów białka kolca wirusa przy użyciu przeciwciała monoklonalnego oraz jednego z pięciu różnych scFv. W rozcieńczeniach supernatantów komórek zakażonych SARS-Cov-2 zaobserwowano sygnał zależny od stężenia w obu kanałach raportujących (RP1 i RP2) (Rysunek 3), co wskazuje, że zarówno komercyjne przeciwciało Hu-anti-S1, jak i poszczególne scFv wykrywały cząsteczkę wirusa związaną z mikrosferą sprzężoną z ACE2. W przypadku trzech z pięciu scFv wirus jest wykrywalny w rozcieńczeniach do 1:18 (scFv2, scFv3, scFv5); dla pozostałych dwóch scFv (scFv7 i scFv9) jest on wykrywalny do rozcieńczeń 1:6. Może to wynikać z różnego powinowactwa do celu. Jak pokazano na Rysunku 3 i w Tabeli 1, scFv3 zapewnia najwyższą intensywność MFI, a następnie kolejno scFv5, scFv2, scFv7 i scFv9.

W skali globalnej detekcja scFv daje niższe wartości MFI w porównaniu do Hu-anti-S1. Może to wskazywać na niższe powinowactwo, ale może być również artefaktem wynikającym z zastosowania różnych barwników fluorescencyjnych (PE i BV421). Innym trendem widocznym dla scFv7 i scFv9 jest fakt, że wartości MFI są nieco niższe również dla kanału RP1 (anti-spike) w porównaniu z pozostałymi trzema konfiguracjami. Może to sugerować, że scFv wykazują reaktywność krzyżową lub w inny sposób zakłócają oddziaływanie ACE2-Hu-anti-S1, co mogłoby również wyjaśnić słabszy sygnał w kanale RP2. W supernatancie niezakażonych komórek Vero E6 nie wykryto cząstek wirusowych ani w kanale RP1, ani w kanale RP2.

Mikrosfery sprzężone z neutrawidyną i biotyną, mikrosfery z IgG kozim oraz mikrosfery niesprzężone zostały wykorzystane jako koraliki kontrolne ujemne. Cząstki wirusa wyłapano za pomocą magnetycznych mikrosfer sprzężonych z ACE2, a następnie przetestowano przy użyciu komercyjnych ludzkich przeciwciał anty-spike w kanale reporterowym RP1 oraz różnych fragmentów scFv w kanale reporterowym RP2 (scFv wskazano w lewym górnym rogu każdego panelu). W żadnej z próbek zainfekowanych i niezainfekowanych nie wykryto cząstek wirusa.

Precyzja i powtarzalność testu
Aby ocenić precyzję testu, wszystkie warunki przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Dla każdego punktu rozcieńczenia obliczono współczynnik zmienności (CV) dla mikrosfer ACE2. Wszystkie obliczone wartości CV dla testu wyniosły poniżej 15%, przy czym najwyższy zmierzony CV wyniósł 13%, a najniższy 1% (Tabela 2). Jak widać na wykresie gęstości (Rysunek 4) dla kanału RP1, detekcja PE komercyjnego przeciwciała Hu-anti-S1 wykazuje wyższą precyzję, skoncentrowaną głównie wokół CV wynoszącego 3%. Kanał RP2, detekcja BV dla scFVs, wykazuje wyższe wartości CV. Jednakże, jak wynika z Tabeli 2, wyższy zakres CV jest spowodowany próbkami o niskim stężeniu cząstek wirusowych, takimi jak próba ślepa. Aby przetestować powtarzalność protokołu, test powtórzono dwukrotnie przez różnych operatorów, wykorzystując mieszaniny kulek przygotowane w różne dni oraz mniejszą objętość próbki (o 72% niższą). Zaobserwowano bardzo dobrą korelację Pearsona, mieszczącą się w zakresie od 0,98 do 1, zarówno dla kanału RP1, jak i RP2 (p-value < 0,01), co potwierdza powtarzalność testu oraz możliwość jego zastosowania w przypadku dostępności mniejszej ilości próbki (Rysunek 5). Ta technologia analizy przepływowej opiera się na „teorii analitu otoczenia” (ambient analyte theory)17, dzięki czemu test jest czuły na stężenie, ale nie na objętość.

Test wykrywania SARS-CoV-2; proces neutralizacji, metoda z mikrosferami ACE2, schemat wyników fluorescencji.
Rysunek 1: Analiza cząstek wirusa. (A) Nadnadaktyna komórkowa z zainfekowanych i niezinfekowanych komórek Vero E6 jest dodawana w rozcieńczeniach seryjnych do płytki 96- lub 384-dołkowej, wraz z magnetycznymi mikrosferami sprzężonymi z neutrawidyną, a następnie połączonymi z biotynjlowanym ludzkim ACE2 lub biotyną. Nesprzężone mikrosfery połączone z goat-IgG oraz gołe mikrosfery są wykorzystywane jako kontrole negatywne wraz z mikrosferami sprzężonymi z neutrawidyną i biotyną. (B>) Powstałe kompleksy mikrosfery-cząstka wirusa są wykrywane za pomocą koktajlu detekcyjnego składającego się z Hu-anti-S1 oraz jednego z różnych scFv z tagiem FLAG. Następnie dodaje się mieszaninę fluorescencyjną z przeciwciałem anti-human IgG PE skierowanym przeciwko Hu-anti-S1 oraz anti-FLAG Brilliant Violet 421 skierowanym przeciwko scFv. (C>) Trzylaserowy system podwójnej detekcji emituje laser czerwony, zielony i fioletowy w celu wykrycia kompleksu mikrocząsteczek. Laser czerwony wykrywa barwnik mikrosfery, natomiast lasery zielony i fioletowy wykrywają odpowiednio anti-S1 oraz scFv. Wygenerowane dane są następnie analizowane. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres słupkowy testu koniugacji przeciwciał z wynikami MFI; przeciwciała anty-ACE2, detekcja IgG koziego.
Rysunek 2: Wykres potwierdzenia koniugacji. Mieszaniny kulek składały się z czterech różnych identyfikatorów mikrosfer, z których każda była sprzężona z innym białkiem: neutrawidyna-biotyna-ACE2 (ACE2), niesprzężona mikrosfera (Bare Bead), neutrawidyna-biotyna (Biotin) oraz IgG kozie (Goat IgG). W teście koniugacji zastosowano trzy różne konfiguracje fluoroforów detekcyjnych, mianowicie: przeciwciała kozie anty-ACE2 + anty-IgG kozie PE, anty-IgG mysie PE oraz anty-IgG królicze PE. Oś Y przedstawia średni zmierzony sygnał MFI (median fluorescence intensity; jednostki dowolne) dla każdej mikrosfery w trzech różnych warunkach. Oś X przedstawia zastosowane różne przeciwciała wychwytujące. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Wiązanie białka scFv ACE2; wykres rozcieńczenia w funkcji średniej intensywności fluorescencji (MFI); analiza VeroE6.
Rysunek 3: Multipleksowa detekcja białek powierzchniowych. Oś Y: Średnie MFI (mediana intensywności fluorescencji; jednostki arbitraryjne ± odchylenie standardowe) dla każdej próbki, analizowanej w trzech powtórzeniach na warunek. Oś X: Punkty rozcieńczeń seryjnych supernatantu komórkowego. Kolor pomarańczowy: Cząstki wirusa w supernatancie z komórek Vero E6 zainfekowanych SARS-CoV-2 WT, wykryte za pomocą ludzkich przeciwciał anty-spike + anty-ludzkich PE (fikoerytryny). Kolor niebieski: Supernatant z komórek Vero E6 zainfekowanych SARS-CoV-2 WT, wykryty za pomocą różnych scFv + anty-FLAG Brilliant Violet 421. Kolor szary: Supernatant z niezinfekowanych komórek, wykryty za pomocą ludzkich przeciwciał anty-spike + anty-ludzkich PE. Kolor czarny: Supernatant z niezinfekowanych komórek, wykryty za pomocą pięciu różnych scFv + anty-FLAG Brilliant Violet 421. Cząstki wirusa zostały wychwycone za pomocą mikrosfer magnetycznych sprzężonych z ACE2 i przebadane przy użyciu komercyjnych ludzkich przeciwciał anty-spike w kanale reporterowym RP1 oraz za pomocą różnych scFv w kanale reporterowym RP2 (scFv jest wskazane w lewym górnym rogu każdego panelu). W żadnej z próbek niezinfekowanych nie wykryto cząstek wirusa. Epitop będący celem scFv3 wykazywał najwyższą powinowatość. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres rozkładu CV%, częstotliwość względem CV%, porównanie dwóch kanałów danych RP1 i RP2.
Rysunek 4: Wykres dyspersji wariancji. Oś Y przedstawia częstotliwość zdarzeń, a oś X pokazuje współczynnik zmienności (CV) w procentach dla każdego powtórzenia różnych próbek. RP1 i RP2 to pierwszy i drugi kanały reporterowe, które wykrywają fluorescencję związaną odpowiednio z fykoerytryną i Brilliant Violet 421. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres analizy korelacji log(MFI) w cytometrii przepływowej, porównanie danych RP1 i RP2.
Rysunek 5: Macierz korelacji serii pomiarowych. (A,B) Oś Y: macierz korelacji Pearsona w skali log10 pomiędzy trzema oddzielnymi seriami pomiarowymi, przeprowadzonymi przez trzech różnych operatorów i z użyciem różnych mieszanin kulek. W trzeciej serii zastosowano mniejszą objętość próbki. Histogramy przedstawiają rozkład różnych klastrów zmiennych na podstawie zmierzonego MFI. (A) Korelacja dla kanału reporterowego RP1 pomiędzy różnymi seriami. (B) Korelacja dla kanału reporterowego RP2 pomiędzy różnymi seriami. MFI=mediana intensywności fluorescencji w jednostkach arbitralnych. ***p < 0,001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

DetekcjaReaktywność
scFv2++
scFv3+++
scFv5++
scFv7+
scFv9+
Ludzkie przeciwciała anty-Spike IgG++++

Tabela 1: Ranking scFv w detekcji na podstawie intensywności MFI uzyskanej w krzywych wzorcowych.

RP1 (PE)RP2 (BV421)
Rozcieńczanie próbkizakres CV [%]zakres CV [%]
Pusty3–112–13
1:14581–72–7
1:4564–63–8
1:1623–63–7
1:542–42–4
1:182–41–4
1:62–61–6
1:21–51–3

Tabela 2: Zakres CV% (średnia/odchylenie standardowe × 100) dla każdego punktu rozcieńczenia supernatantu zainfekowanego SARS-CoV-2 dla kanałów reporterowych RP1 i RP2.

Plik uzupełniający 1: Generowanie fragmentu zmiennego pojedynczego łańcucha (scFv) immunoglobuliny. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Przesiewowe badanie par scFv i Fab przeciwko szeregowym rozcieńczeniom rekombinowanego białka Spike (RBD). Aby ocenić wydajność różnych peptydów detekcyjnych, zastosowano 12 kombinacji białka spike i Fab jako przeciwciała przechwytujące w buforze z dodatkiem rekombinowanego RBD. W ramach detekcji wykorzystano dziesięć (10) scFv skierowanych przeciwko różnym epitopom białka spike. W zależności od wydajności pary przechwytywanie-detekcja, oznaczone zostały one jako nieudane (-) lub udane (+). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Przesiewowe badanie par scFv i Fab przeciwko seryjnym rozcieńczeniom supernatantu z komórek Calu-3 zainfekowanych SARS-CoV-2. W celu oceny wydajności różnych peptydów detekcyjnych, w supernatancie z komórek Calu-3 zainfekowanych SARS-CoV-2 zastosowano 12 kombinacji białka kolca i Fab jako elementy wychwytujące. W roli detekcyjnej wykorzystano dziesięć (10) scFv nakierowanych na różne epitopy białka kolca. W zależności od wydajności pary wychwytującej-detekcyjnej, zostały one oznaczone jako nieudane (-) lub udane (+). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Wykazano, że technologia multipleksowa oparta na koralikach jest cenną platformą do wysokowydajnego wykrywania patogenów w wielu zastosowaniach klinicznych. Wysoka elastyczność platformy, oparta na zasadach cytometrii przepływowej, pozwala na celowanie w przeciwciała, białka i kwasy nukleinowe 18,19,20,21,22, multipleksując setki analitów jednocześnie. Jednak, zgodnie z naszą wiedzą, technologia ta nie była wcześniej stosowana do wykrywania nienaruszonych cząstek wirusa. W tym raporcie technologia została zastosowana do wykrywania nienaruszonych cząstek wirusa poprzez celowanie w trzy niezależne epitopy powierzchniowe SARS-CoV-2.

Otoczkowe wirusy RNA wykazują wysokie podobieństwo strukturalne do pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV), małych błon fosfolipidowych przenoszących wirusowe RNA i białka wraz z białkami gospodarza23. Testy immunologiczne typu sandwich były wcześniej stosowane do wykrywania EV przy użyciu pary przeciwciał skierowanych przeciwko dwóm odrębnym białkom powierzchniowym24,25. Ograniczenie testów kanapkowych do jednoczesnego wykrywania tylko dwóch białek zostało usunięte dzięki podejściu multipleksowemu, które pozwala na jednoczesne wykrywanie więcej niż dwóch białek na reakcję.

Opisany tutaj trzylaserowy system detekcji z podwójnym reporterem jest jak dotąd najbardziej zaawansowanym instrumentem do analizy przepływu opartym na kulkach. W odniesieniu do systemów odczytu z pojedynczym reporterem, podwójny reporter (kanały RP1 i RP2) umożliwia równoległe wykrywanie trzech białek/epitopów powierzchniowych. Celowanie w wiele białek powierzchniowych i epitopów wirusa zapewnia dokładniejsze odwzorowanie obciążenia białkami wirusa, co poza potwierdzeniem, że wirus jest w rzeczywistości nienaruszony, otwiera również możliwość dalszego badania antygenów powierzchniowych wirusa i mechanizmów interakcji między wirusem a białkiem gospodarza.

Podczas pandemii COVID-19 znaczenie szybkiej identyfikacji osób będących nosicielami aktywnych cząstek wirusa było ważne w wysiłkach na rzecz powstrzymania rozprzestrzeniania się wirusa. Genomowe RNA jest wykrywane za pomocą ilościowego RT-PCR niezależnie od jego pochodzenia (nienaruszone cząsteczki wirusa lub wolne). Jednak tylko nienaruszona otoczka z dostępnym białkiem S może pośredniczyć w wejściu do komórki i późniejszej replikacji wirusa. Wcześniejsze badania z wykorzystaniem chipów mikroprzepływowych w próbkach pobranych od pacjentów wykazały, że wykrywanie nienaruszonych cząstek wirusa w połączeniu z testami w miejscu opieki nad pacjentem umożliwiłoby częste testowanie i wzmocniony nadzór nad rozprzestrzenianiem się choroby, w tym bardziej świadomy wybór osób, które mają zostać poddane kwarantannie26. Zastosowanie multipleksowanego testu opartego na mikrosferze pozwoliłoby na zaprojektowanie testów mających na celu badanie przesiewowe wielu wirusów i ich wariantów antygenów powierzchniowych, uzyskując dokładniejszy obraz rozprzestrzeniania się wirusa w populacji.

Wirometria przepływowa to najnowsze osiągnięcie cytometrii przepływowej mające na celu analizę cząstek wirusa. Pomimo zdolności do wykrywania dyskretnych cząstek wirusa, analiza małych wirusów stanowi aktualny problem dla wirometrii przepływowej27,28. Podobnie jak opisana tu metoda, wirometria przepływowa polega na wychwytywaniu nienaruszonych wirionów przez nanocząstki złota sprzężone z przeciwciałami. Ograniczenia obu metod obejmują (i) zależność od odczynników o wysokim powinowactwie do wychwytywania i wykrywania antygenu o ekspresji powierzchniowej, na który celują mikrosfery lub nanocząstki, (ii) ograniczoną zdolność do rozróżniania cząstek wirusa od pęcherzyków zewnątrzkomórkowych oraz (iii) brak standardów prawidłowej kwantyfikacji cząstek.

Komórki wydzielają EV do swojego otoczenia, a po zakażeniu wirusem mogą również wydzielać wiriony, które są podobnej wielkości jak EV i mogą ostatecznie wyrażać te same antygeny29. Ponieważ EV będą miały podobny skład błon co wirus, może być trudno odróżnić je od siebie przy użyciu wyłącznie metod opartych na powinowactwie, takich jak podejście z podwójnym laserem i pojedynczym reporterem. Jednak opisane tutaj strategie charakteryzują się większą pojemnością multipleksu, co umożliwia szersze i głębsze badanie składu białek cząstek. Metody oparte na przepływie umożliwiają śledzenie dyskretnych cząstek, co daje możliwości cyfrowej kwantyfikacji. Jedną ze strategii rozwiązania problemu kwantyfikacji w naszej metodzie byłoby użycie dobrze scharakteryzowanych syntetycznych pęcherzyków wyrażających interesujące nas antygeny jako cząstki wirusopodobne (VLP) do przygotowania krzywych standardowych.

Powszechną drogą wnikania i wychodzenia SARS-CoV-2 z komórek gospodarza jest interakcja wirusa i błony komórkowej gospodarza 2,15. W tym procesie prawdopodobieństwo, że białka błony błonowej gospodarza zostaną włączone do powierzchni wirusa, jest wysokie. Poprzez badania przesiewowe wbudowanych białek gospodarza można śledzić drogę infekcji i potencjalnie przewidywać przebieg choroby u pacjentów o różnym ryzyku, co pozwala na wcześniejsze decyzje dotyczące leczenia. Pozwala również na charakterystykę wirusów w różnych partiach próbek w laboratoriach badawczych. Można to dokładniej zbadać, badając, czy różne cechy są związane z różnymi poziomami zakaźności wirusa oraz przeprowadzając badania przesiewowe przeciwciał i cząsteczek leków, które są ukierunkowane na białka powierzchniowe wirusa.

Ważnym aspektem opisanej metody jest to, że opiera się ona na powinowactwie odczynników do wychwytywania i wykrywania w stosunku do ich docelowych białek na wirusie. Wybór odczynników do pomiaru powinowactwa jest zatem czynnikiem decydującym o wydajności testu. Możliwe, że wiele odczynników powinowactwa powinno być przesiewanych i testowanych pod kątem wychwytywania i wykrywania, aby wybrać te o najwyższym powinowactwie. W tym przypadku wstępnie oceniono wydajność dziesięciu scFv i dwunastu fragmentów Fab przy użyciu rekombinowanego RBD i na cząstkach wirusa z supernatantu komórek nabłonka płuc Calu-3 zakażonych SARS-Cov-2 (komórki VeroE6 wykorzystano do hodowli/oceny cytotoksyczności we wszystkich kolejnych badaniach). Anty-FLAG PE został użyty do wykrycia scFv oznaczonych FLAG (Tabela Uzupełniająca 1 i Tabela Uzupełniająca 2). Następnie wybrano pięć najlepiej działających scFv, które miały być zastosowane w teście z podwójnym reporterem, wraz z komercyjnym Hu-anty-S1 (Tabela 1), na supernatantach z zakażonych komórek nabłonka nerki VeroE6 afrykańskiej zielonej małpy.

Kolejnym czynnikiem decydującym o powodzeniu protokołu jest wybrana procedura dla sprzężenia mikrosfery. Metoda sprzęgania powinna być skuteczna, a jednocześnie utrzymywać epitopy konformacyjne lub reszty aminokwasowe biorące udział w wiązaniu białek w stanie nienaruszonym i niezmodyfikowanym. W tym przypadku zastosowano reakcję EDC-NHS w celu sprzężenia neutrawidyny bezpośrednio z mikrosferami, dostosowując wcześniej opisany protokół30 i układ neutrawidyna + biotyna do wiązania rekombinowanego ACE2 ze sprzężonymi mikrosferami. Można testować i porównywać alternatywne metody sprzęgania i ich skuteczność. Na koniec zaobserwowano, że różne znakowane fluorescencyjnie odczynniki detekcyjne (np. anty-FLAG PE (fikoerytryna) i anty-FLAG Brilliant Violet 421) mogą powodować różne poziomy MFI, które mogą wpływać na czułość testu.

Podsumowując, opisana metoda pozwala na wykrycie nienaruszonych cząstek wirusa w roztworze, przy zastosowaniu strategii podwójnego reportera. Równoległa analiza trzech determinantów powierzchniowych dostarcza bardziej szczegółowego narzędzia do charakteryzowania cząstek wirusa i ostatecznie odróżniania ich od innych EV (np. niezawierających antygenów wirusowych). Strategia ta jest alternatywą dla wirometrii przepływowej. Chociaż obecne podejście nie rozróżnia rozmiarów cząstek, strategie kulek magnetycznych wykorzystujące mikrosfery oznaczone kolorami oferują szersze możliwości w profilowaniu antygenów powierzchniowych i projektowaniu eksperymentalnym poprzez analizę o wysokiej wydajności i przepustowości. Test wykazuje wysoką precyzję i solidność i może być rozszerzony na analizę dowolnego rodzaju pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i każdego innego rodzaju biocząstek eksponujących antygeny powierzchniowe w płynach ustrojowych lub innych płynnych matrycach. Było to badanie potwierdzające słuszność koncepcji, które wykazało użyteczność stosowania scFvs jako jednego odczynnika do wykrywania w analizie multipleksowej wielu epitopów białkowych na cząsteczkach wirusa. Konieczne są przyszłe badania w celu określenia specyficznych cech scFvs (np. powinowactwa wiązania, reaktywności krzyżowej z innymi odczynnikami i celami), jeśli mają być one stosowane do celów ilościowych lub klinicznych.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy w SciLifeLab, Szwecja, zespołowi Affinity Proteomics-Stockholm Scilifelab Unit za opracowanie i zastosowanie opisanej tutaj metody, Human Antibody Therapeutics Unit za dostarczenie odczynników scFvs i Fab, oraz Jonasowi Klingströmowi za komórki VeroE6 zakażone izolatami SARS-CoV-2 pochodzącymi z próbek klinicznych. Autorzy dziękują dr Sherry Dunbar, MBA z Luminex Corporation (Austin, Teksas) za wsparcie badawcze oraz Mattowi Silvermanowi, mgr inż. Biomedical Publishing Solutions (Panama City, Floryda; mattsilver@yahoo.com) za pomoc naukową i pisarską. Prace te zostały wsparte środkami Fundacji Knuta i Alice Wallenbergów oraz Laboratorium Nauki dla Życia (SciLifeLab) (VC2020-0015 dla Claudii Fredolini i Franceski Chiodi oraz VC-2022-0028 dla Claudii Fredolini).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ACE2-BiotinAcro Biosystems (Newark, DE)AC2-H82E6-25 ugConc: 340 µ g / mL, LOT#BV35376-203HFI-2128
IgG przeciw kozom, PE sprzężone z PEJackson ImmunoResearch (West Grove, PA) 705-116-147Gatunek żywiciela: Osioł 
Anty-ludzkie IgG R-PE Life Technologies/Thermo Fisher (Waltham, MA)H10104Stężenie: 0,15 mg/mL, LOT#2079224, Gatunek gospodarza: Goat
Anti-Mouse IgG, JacksonImmunoResearch (West Grove, PA) sprzężony z PE (West Grove, PA) 115-116-146Gatunek żywiciela: Koza 
Anty-królicze IgG, sprzężone z PE Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA) 111-116-144Gatunek żywiciela: Koza 
BiotinThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA)20RUO100 mM, pH 10 Conc. 1 mg/mL
Kazeina blokująca w PBSThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA)37528LOT#VD301372
Odczynnik blokujący do ELISA (BRE)Roche (Bazylea, Szwajcaria)11112589001
Brilliant Violet 421 anty-DYKDDDDK Przeciwciało znacznikowe (Anti-FLAG) 0,2 mg/ml, szczur IgG2a, λBioLegend (Amsterdam, Holandia)637321
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Saveen & Werner (Limhamn, Szwecja)B2000-500LOT#04D5865
EDC (chlorowodorek 1-etylo-3-[3-dimetyloaminopropylo]karbodimidu)Proteochem (Hurricane, UT)C1100-custom (65 mg)LOT# MK3857
Surowica cielęca płodu (FCS)Gibco/Thermo Fisher (Waltham, MA)10270-106
Kozie przeciwciało poliklonalne anty-ACE2R& D Systems/Bio-Techne (Minneapolis, MN)AF933Gatunek żywiciela: Koza 
Goat IgGBethyl Labs (Montgomery, TX)P50-200LOT#P50-200-6
L-glutaminaThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA)25030024
Probówki do mikrofug o niskim poziomie wiązania 1,5 ml VWR (Radnor, PA)525-0133
MagPlex-C MicrospheresLuminex Corporation (Austin, TX)MC10XXX-01
Pożywki tkankowe MEMGibco/Thermo Fisher (Waltham, MA)21430-020
Mikropłytka, 96-dołkowa, polistyren, półpowierzchniowa, przezroczystaGreiner Bio-One (Kremsmü nster, Austria)675101
NaHCO3Gibco/Thermo Fisher (Waltham, MA)25080-060
Neutravidin Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA)31000LOT#UK292857
Tabletki PBSMedicago AB (Uppsala, Szwecja)09-9400-100LOT#272320-01
Penicylina/StreptomycynaGibco/Thermo Fisher (Waltham, MA)15140122
Poli(alkohol winylowy)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 
PoliwinylopirolidonSigma-Aldrich (St. Louis, MO) 437190
ProClin 300Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 48915-U
Rabbit IgGBethyl Labs (Montgomery, TX)P120-301LOT#12
scFv-FAb1Własna produkcjaHuman Antibody Therapeutics Unit, Scilifelab, Szwecja. Monoklonalny scFv. Stężenie: 0,12 mg/ml.
scFv-FAb2Własna produkcjaHuman Antibody Therapeutics Unit, Scilifelab, Szwecja. Monoklonalny scFv. Stężenie w partii1: 0,38 mg/ml. Partia stężenia2: 0,45 mg/ml
scFv-FAb3ProdukcjaHuman Antibody Therapeutics Unit, Scilifelab, Szwecja. Monoklonalny scFv. Stężenie: 0,34 mg/ml.
scFv-FAb4Własna produkcjaHuman Antibody Therapeutics Unit, Scilifelab, Szwecja. Monoklonalny scFv. Stężenie: 2,85 mg/ml.
scFv-FAb5Własna produkcjaHuman Antibody Therapeutics Unit, Scilifelab, Szwecja. Monoklonalny scFv. Stężenie: 2,7 mg / ml.
Cząstki zakaźne SARS-CoV-2, izolat szwedzkiProdukcja własna Szwedzka Agencja Zdrowia Publicznego
Przeciwciało kolca SARS-CoV-2 (Hu-anty-S1)Novus Biologicals (Centennial, CO)NBP2-90980 Przeciwciało monoklonalne. Stężenie: 1 mg/ml. Gospodarz: Człowiek. Klon: CR3022. Izotyp: IgG1 Kappa. LOT#T201B06
Fosforan sodu jednozasadowy, bezwodnySigma-Aldrich (St. Louis, MO) S3139
Sulfo-NHS (N-hydroksysulfosukcynimid)Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA)24510LOT# XH321563
TweenThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA)BP337-50LOT#194435
Lampa ultrafioletowaVilber Lourmat GmbH (Eberhardzell, Niemcy)VL-215. GDługość fali = 254 nm; 2 &razy; 15-watowe żarówki
Ogniwa Vero E6ATCC (Manassus, VA)CRL-1586
xMAP INTELLIFLEX DR-SE (dual-reporterowy przyrząd do pomiaru przepływu)Luminex Corporation (Austin, TX)INTELLIFLEX-DRSE-RUO
360627 własna

Bibliografia

  1. Rey, F. A., Lok, S. M. Common features of enveloped viruses and implications for immunogen design for next-generation vaccines. Cell. 172 (6), 1319-1334 (2018).
  2. V'kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).
  3. Burnie, J., et al. Flow virometry quantification of host proteins on the surface of HIV-1 pseudovirus particles. Viruses. 12 (11), 1296(2020).
  4. Gentili, M., et al. Transmission of innate immune signaling by packaging of cGAMP in viral particles. Science. 349 (6253), 1232-1236 (2015).
  5. Modrow, S., Falke, D., Truyen, U., Schätzl, H. Viruses: Definition, Structure, Classification. In Molecular Virology. , Springer. Berlin, Heidelberg. 163-181 (2013).
  6. Trinh, K. T. L., Do, H. D. K., Lee, N. Y. Recent advances in molecular and immunological diagnostic platform for virus detection: A review. Biosensors. 13 (4), 490(2023).
  7. Zamora, J. L. R., Aguilar, H. C. Flow virometry as a tool to study viruses. Methods. 134-135, 87-97 (2018).
  8. Graham, H., Chandler, D. J., Dunbar, S. A. The genesis and evolution of bead-based multiplexing. Methods. 158, 2-11 (2019).
  9. Byström, S., et al. Affinity proteomic profiling of plasma for proteins associated to area-based mammographic breast density. Breast Cancer Research. 20 (1), 14(2018).
  10. Rudberg, A. -S., et al. SARS-CoV-2 exposure, symptoms and seroprevalence in healthcare workers in Sweden. Nature Communications. 11 (1), 5064(2020).
  11. Liu, J., et al. Multiplex reverse transcription PCR Luminex assay for detection and quantitation of viral agents of gastroenteritis. Journal of Clinical Virology. 50 (4), 308-313 (2011).
  12. Gadsby, N. J., Hardie, A., Claas, E. C. J., Templeton, K. E. Comparison of the Luminex respiratory virus panel fast assay with in-house real-time PCR for respiratory viral infection diagnosis. Journal of Clinical Microbiology. 48 (6), 2213-2216 (2010).
  13. Lorenzen, E., et al. Multiplexed analysis of the secretin-like GPCR-RAMP interactome. Science Advances. 5 (9), (2019).
  14. Angeloni, S., Cameron, A., Pecora, N. D., Dunbar, S. A rapid, multiplex dual reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (170), e62487(2021).
  15. Jackson, C. B., Farzan, M., Chen, B., Choe, H. Mechanisms of SARS-CoV-2 entry into cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (1), 3-20 (2022).
  16. International Standardization Organization. ISO10993-5 Biological evaluation of medical devices - Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. International Standardization Organization. , Geneva, Switzerland. Available from: https://nhiso.com/wp-content/uploads/2018/05/ISO-10993-5-2009.pdf (2009).
  17. Poetz, O., et al. Sequential multiplex analyte capturing for phosphoprotein profiling. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (11), 2474-2481 (2010).
  18. Dunbar, S. A., Vander Zee, C. A., Oliver, K. G., Karem, K. L., Jacobson, J. W. Quantitative, multiplexed detection of bacterial pathogens: DNA and protein applications of the Luminex LabMAP system. Journal of Microbiological Methods. 53 (2), 245-252 (2003).
  19. Taniuchi, M., et al. Multiplex polymerase chain reaction method to detect Cyclospora, Cystoisospora, and Microsporidia in stool samples. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 71 (4), 386-390 (2011).
  20. Wu, M., et al. High-throughput Luminex xMAP assay for simultaneous detection of antibodies against rabbit hemorrhagic disease virus, Sendai virus, and rabbit rotavirus. Archives of Virology. 164 (6), 1639-1646 (2019).
  21. Dias, D., et al. Optimization and validation of a multiplexed Luminex assay to quantify antibodies to neutralizing epitopes on human papillomaviruses 6, 11, 16, and 18. Clinical and Vaccine Immunology. 12 (8), 959-969 (2005).
  22. Opalka, D., et al. Simultaneous quantitation of antibodies to neutralizing epitopes on virus-like particles for human papillomavirus types 6, 11, 16, and 18 by a multiplexes lumina assay. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 108-115 (2003).
  23. Nolte-'T Hoen, E., Cremer, T., Gallo, R. C., Margolis, L. B. Extracellular vesicles and viruses: Are they close relatives. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (33), 9155-9161 (2016).
  24. Ohmichi, T., et al. Quantification of brain-derived extracellular vesicles in plasma as a biomarker to diagnose Parkinson's and related diseases. Parkinsonism & Related Disorders. 61, 82-87 (2019).
  25. Ter-Ovanesyan, D., et al. Framework for rapid comparison of extracellular vesicle isolation methods. Elife. 10, e70725(2021).
  26. Gamage, S. S. T., et al. Microfluidic affinity selection of active SARS-CoV-2 virus particles. Science Advances. 8 (39), (2022).
  27. Renner, T. M., Tang, V. A., Burger, D., Langlois, M. -A. Intact viral particle counts measured by flow virometry provide insight into the infectivity and genome packaging efficiency of moloney murine leukemia virus. Journal of Virology. 94 (2), e01600-01619 (2020).
  28. Niraja, S., et al. A flow virometry process proposed for detection of SARS-CoV-2 and large-scale screening of COVID-19 cases. Future Virology. 15 (8), 525-532 (2020).
  29. Lippé, R. Flow virometry: A powerful tool to functionally characterize viruses. Journal of Virology. 92 (3), e01765(2018).
  30. Drobin, K., Nilsson, P., Schwenk, J. M. Highly multiplexed antibody suspension bead arrays for plasma protein profiling. Methods in Molecular Biology. 1023, 137-145 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Profilowanie białek powierzchniowychepitopy cząsteczek wirusowychwielobarwna cytometria przepływowacząsteczki SARS-CoV-2immunowychwyt na kuleczkach magnetycznychdetekcja białka Spikemapowanie epitopów przeciwciałinterakcja gospodarz-wiruswysokoprzepustowe przesiewanie
Profilowanie epitopów białek powierzchniowych na cząsteczkach wirusa za pomocą strategii multipleksu dual-reporter
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.