Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mysi lewy klamra płucny Hilar Clamp Urazu Reperfuzyjnego Niedokrwienia Płuc

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66232

⸱

12 kwietnia 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiothoracic Surgery, Washington University, St. Louis

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Protokół przedstawia wykonalną, niezawodną i powtarzalną metodę zaciskania wnęki lewej płucy, która może być wykorzystana do badania uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego płuc w modelach mysich.

Streszczenie

Niedokrwienne uszkodzenie reperfuzyjne (IRI) podczas przeszczepu płuc jest głównym czynnikiem ryzyka powikłań po przeszczepie, w tym pierwotnej dysfunkcji przeszczepu, ostrego i przewlekłego odrzucenia przeszczepu oraz śmiertelności. Wysiłki mające na celu zbadanie podstaw IRI doprowadziły do opracowania wiarygodnego i powtarzalnego mysiego modelu zaciskania wnęki w lewym płucu. Model ten polega na zabiegu chirurgicznym wykonywanym na znieczulonej i zaintubowanej myszy. Wykonywana jest torakotomia lewa, a następnie ostrożna mobilizacja płuc i wypreparowanie lewej wnęki płucnej. Zacisk wnękowy polega na odwracalnym podwiązaniu szwem wnęki płucnej za pomocą węzła ślizgowego, który zatrzymuje dopływ tętniczy, odpływ żylny i przepływ powietrza przez lewe oskrzela pniowe. Reperfuzja rozpoczyna się od starannego usunięcia szwu. Nasze laboratorium wykorzystuje 30 minut niedokrwienia i 1 godzinę reperfuzji dla modelu eksperymentalnego w obecnych badaniach. Jednak te okresy czasu mogą być modyfikowane w zależności od konkretnego pytania eksperymentalnego. Bezpośrednio przed ofiarą, gazometrię krwi tętniczej można pobrać z lewej komory po 4-minutowym okresie zaciskania prawej wnęki, aby upewnić się, że uzyskane wartości PaO2 są przypisywane wyłącznie uszkodzonemu lewemu płucu. Opisujemy również metodę pomiaru wynaczynienia komórek za pomocą cytometrii przepływowej, która polega na dożylnym wstrzyknięciu przeciwciała znakowanego fluorochromem specyficznego dla badanej komórki (komórek) przed uśmierceniem. Lewe płuco można następnie pobrać do cytometrii przepływowej, zamrożonej lub utrwalonej, immunohistochemii zatopionej w parafinie i ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy. Ta technika zacisku wnękowego pozwala na szczegółowe badanie mechanizmów komórkowych i molekularnych leżących u podstaw IRI. Reprezentatywne wyniki wskazują na zmniejszone natlenienie lewego płuca i histologiczne dowody uszkodzenia płuc po zaciśnięciu wnęki. Technika ta może być łatwo nauczona i odtworzona przez personel z doświadczeniem mikrochirurgicznym i bez niego, co prowadzi do wiarygodnych i spójnych wyników oraz służy jako szeroko stosowany model do badania IRI płuc.

Wprowadzenie

IRI podczas przeszczepu narządu jest głównym czynnikiem ryzyka pierwotnej dysfunkcji przeszczepu i późniejszych epizodów odrzucenia przeszczepu1,2. Podczas przeszczepu ciepły czas niedokrwienia definiuje się jako okres od zacisku krzyżowego aorty dawcy do rozpoczęcia zimnej perfuzji i od usunięcia narządu z lodu do implantacji narządu. Czas przechowywania w chłodni jest definiowany jako okres czasu od rozpoczęcia zimnej perfuzji do usunięcia narządu z ice3. Ciepłe niedokrwienie jest bardziej szkodliwe dla późniejszego funkcjonowania narządów niż zimne niedokrwienie4,5,6, a jego mechanizmy uzasadniają dalsze badania w modelach przedklinicznych. Dodatkowo, przeszczepienie narządu od dawcy po śmierci sercowej (DCD) wiąże się z dłuższym ciepłym czasem niedokrwienia niż tradycyjne dawstwo po śmierci mózgu (DBD)7. Chociaż wykorzystanie dawców DCD może rozszerzyć pulę dawców i zwiększyć wykorzystanie płuc, potrzebne są dalsze badania przedkliniczne w celu oceny wpływu ciepłego niedokrwienia na czynność płuc po przeszczepie. Poniżej opisujemy model ciepłego IRI u myszy przez lewy zacisk wnęki płucnej.

W ciągu ostatnich kilku lat opracowano i dostosowano kilka zwierzęcych modeli zaciskania wnęk płuc i które mogą obejmować użycie atraumatycznego zacisku mikronaczyniowego8,9,10,11,12,13, opaska uciskowa Rumel 14,15, lub podwiązanie szwów 16 jako zacisk wnękowy. Istotą zacisku wnękowego jest to, że musi on być odwracalny i powodować minimalne lub żadne uszkodzenie struktur wnęki, aby można było osiągnąć reperfuzję. Tutaj opisujemy naszą technikę zaciskania wnęki u myszy, która polega na odwracalnym podwiązaniu szwem lewej wnęki płucnej za pomocą węzła ślizgowego. Ta metoda zamyka dopływ tętnicy płucnej, odpływ żylny oraz przepływ powietrza do i z oskrzeli głównych. Główną zaletą węzła ślizgającego się na zacisku naczyniowym, klipsie lub opasce uciskowej jest to, że klatkę piersiową można zamknąć podczas długotrwałych okresów niedokrwienia, minimalizując w ten sposób niewyczuwalne straty płynów i ciepła u myszy. Udostępniamy protokół do uzyskania wiarygodnych pomiarów gazometrii krwi tętniczej (ABG) oraz do pomiaru wynaczynienia komórek po zaciśnięciu wnęki.

Ta technika zacisku wnękowego zajmuje ważne miejsce w szerszym badaniu transplantacji płuc. W porównaniu z modelami ortotopowymi płuc na małych zwierzętach, technika klamry wnękowej może izolować efekty IRI bez dodawania chirurgicznego urazu zespolenia lub allogeniczności17. Dodatkowo, technika zacisku wnękowego może być łatwiejsza i szybciej opanowana niż przeszczep płuc myszy. W rzeczywistości, przy użyciu technik zacisku wnękowego, w ciągu ostatniej dekady zidentyfikowano kilka ważnych mechanizmów w patogenezie IRI, takich jak TLR4, oksydaza NADPH i receptor adenozyny A2A14,18,19,20. W poniższym protokole przedstawiamy wiarygodną, możliwą do nauczenia i powtarzalną metodę zaciskania wnęki jako narzędzia do badania IRI płuc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie badania zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Washington University School of Medicine. Zwierzęta otrzymały humanitarną opiekę zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, 8 th edition21 przygotowanym przez Narodową Akademię Nauk i opublikowanym przez National Institutes of Health, oraz Zasadami opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi sformułowanymi przez National Society for Medical Research.

1. Znieczulenie i intubacja

  1. Wybierz mysz, która waży co najmniej 25 g. Ułatwi to intubację ze względu na większy otwór między strunami głosowymi.
  2. Wstrzyknąć mysz dootrzewnowo mieszaninę ketaminy (dawka 100 mg/kg masy ciała) i ksylazyny (dawka 10 mg/kg masy ciała). Mieszaninę tę należy załadować do strzykawki o pojemności 1/2 ml z igłą 1/2 cala 29G. Odczekaj około 5 minut, aż ketamina zacznie działać - mysz nie powinna wykazywać spontanicznych ruchów i nie reagować na uszczypnięcie palca u nogi, co potwierdza odpowiednie znieczulenie.
  3. Buprenorfinę należy wstrzyknąć podskórnie (dawka 0,05 mg/kg masy ciała) przed zabiegiem chirurgicznym w celu dodatkowej kontroli bólu.
  4. Nałóż maść okulistyczną bez leku na oba oczy, aby uniknąć wysuszenia rogówki podczas zabiegu.
  5. Ogol mysz maszynką do strzyżenia nad lewą klatką piersiową i plecami (patrz Rysunek 1A), rozciągając się na brzuch, jeśli planowana jest laparotomia (patrz krok 5.3).
  6. Po znieczuleniu myszy należy przeprowadzić intubację przy użyciu preferowanej konfiguracji intubacji, a pozostałą część procedury pod mikroskopem na rozgrzanej macie w temperaturze ~37 °C (w celu utrzymania normotermii u myszy).
  7. Po uzyskaniu odpowiedniego widoku strun głosowych włóż domowej roboty wprowadzacz (patrz rysunek uzupełniający 1) z krzywizną na końcu do 1-calowego angiocewnika 20G, który jest używany jako rurka dotchawicza (ETT). Poprowadź końcówkę wzmacniacza, a następnie ETT między strunami głosowymi i obok nich.
    UWAGA: Ważne jest, aby uwidocznić ETT przechodzący przez struny głosowe, aby uniknąć fałszywej intubacji do przełyku. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć uszkodzenia strun głosowych podczas intubacji (tj. liczba prób intubacji powinna być ograniczona do 5, a ETT nie powinna być przyspieszona, jeśli napotkany jest opór).
  8. Po włożeniu ETT wyjmij wprowadzacz i podłącz ETT do respiratora dla małych zwierząt. Obserwuj symetryczne uniesienie klatki piersiowej, aby potwierdzić prawidłową intubację dotchawiczą. Ustawienia respiratora powinny wynosić 100-105 oddechów na minutę i frakcję wdychanego tlenu 100%. Objętość oddechowa wynosi 0,35 ml, a dodatnie ciśnienie końcowo-wydechowe wynosi 1 cm H2O.
    UWAGA: Upewnij się, że klatka piersiowa, a nie brzuch, unosi się, ponieważ przypadkowa intubacja przełyku doprowadzi do śmierci, jeśli nie zostanie szybko skorygowana.
  9. Po potwierdzeniu, że jest na swoim miejscu, zabezpiecz ETT 5 cm paskiem 1-calowej jedwabnej taśmy wokół nosa myszy, zapewniając odpowiedni kontakt z ETT i nosem, aby ETT nie wysunął się z ust (patrz Rysunek 1B-C).
  10. Aby utrzymać odpowiednie znieczulenie przez cały czas trwania zabiegu, należy podać 1%-1,5% izofluranu zgodnie z przepływem tlenu.

2. Torakotomia

  1. Ustaw mysz w prawej bocznej pozycji odleżynowej, z obiema przednimi łapami przyklejonymi do lewego górnego rogu, prawą tylną łapą przyklejoną do lewego dolnego rogu, a lewą tylną łapą przyklejoną taśmą do prawego dolnego rogu (patrz Rysunek 2G dla tapingu).
  2. Zdezynfekuj skórę na lewej klatce piersiowej co najmniej 3 naprzemiennie jodem powidonu, a następnie zastosuj 70% alkohol.
  3. Wykonaj nacięcie nad4-tą przestrzenią międzyżebrową od przedniej linii pachowej do tylnej linii pachowej, używając nożyczek, aby otworzyć leżącą nad nią skórę (patrz Rysunek 2A). Czwarta przestrzeń międzyżebrowa znajduje się około 1 cm poniżej pachy w linii środkowej pachy.
  4. Aby zminimalizować utratę krwi, należy skrzepnąć widoczne naczynia krwionośne w warstwie podskórnej i mięśniowej za pomocą ręcznego długopisu kauterycznego.
  5. Podziel ostro mięśnie najszersze grzbietu i zębate przednie za pomocą nożyczek wzdłuż nacięcia skóry (patrz Ryc. 2B).
    6. Używając cienkich zakrzywionych kleszczy, ostrożnie podnieś 4. żebro (uważając, aby nie uszkodzić leżącego poniżej płuca) i wykonaj precyzyjne cięcie cienkimi nożyczkami tuż nad 5. żebrem, aby wejść do 4. przestrzeni międzyżebrowej (patrz Rysunek 2C).
  6. Wykonaj torakotomię powyżej 5. żebra, a nie poniżej 4. żebra, aby uniknąć uszkodzenia międzyżebrowego pęczka nerwowo-naczyniowego.
    7. Gdy ujemne ciśnienie w jamie opłucnej zostanie utracone, a płuco wycofa się ze ściany klatki piersiowej, przedłuż torakotomię do przodu i do tyłu w 4. przestrzeni międzyżebrowej tuż nad 5. żebrem (patrz "xfig">Rysunek 2D-E).
  7. Cała długość nacięcia powinna być na tyle długa, aby odsłonić całe płuco, zwykle ~1 cm.
    UWAGA: Krwawienie z tętnicy sutkowej wewnętrznej może wystąpić, jeśli torakotomia jest zbyt wysunięta do przodu - w przypadku jej wystąpienia należy ją kauteryzować, aby uniknąć nadmiernej utraty krwi.
  8. Zastosuj dwa zwijacze żeber, aby rozłożyć przestrzeń żeber, pozwalając na okno robocze o szerokości co najmniej 1cm2 w celu odpowiedniej wizualizacji (patrz Rysunek 2F-G).

3. Zastosowanie zacisku hilar

  1. Za pomocą dwuramiennych aplikatorów z bawełnianą końcówką zmobilizuj lewe płuco, unosząc je do pozycji głowowej, a następnie tępo dzieląc półprzezroczyste dolne więzadło płucne (patrz Rysunek 3A-B).
    UWAGA: Jeśli jest to trudne do wykonania bez rozerwania płuca, dolne więzadło płucne można również ostro podzielić za pomocą cienkich nożyczek.
  2. Odbij płuco do przodu, aby można było uwidocznić tylną lewą wnękę płucną. Przytnij kawałek jedwabnego krawata 6-0 na ~10 cm i umieść środek tego krawata za wnęką (patrz Rysunek 3C).
  3. Następnie odwróć lewe płuco do tyłu, aby położyć się na krawatie i pociągnij oba końce opaski do przodu (patrz Rysunek 3D).
  4. Za pomocą dwóch wolnych końców (A i B) krawata zawiąż dwustronny węzeł ślizgowy za pomocą kleszczy i zakrzywionego zacisku na komary. Patrz szczegółowy opis w krokach 3.4.1 i 3.4.2. Ciepły czas niedokrwienny rozpoczyna się po zawiązaniu węzła. Lewe płuco nie powinno już napełniać się przy każdym oddechu respiratora po zawiązaniu węzła. Powinien stać się bladobiały, co oznacza zatrzymanie perfuzji.
    UWAGA: Należy zwrócić uwagę, aby upewnić się, że węzeł znajduje się pośrodku wnęki, unikając przypadkowego zaplątania lewego przedsionka centralnie, a miąższu płuca bocznie (patrz Ryc. 3F).
    1. Trzymając zacisk w ręce dominującej i kleszcze w ręce niedominującej, przytrzymaj koniec A kleszczami i raz owiń punkt środkowy A wokół zamkniętego zacisku (patrz Rysunek 3E).
    2. Chwyć punkt środkowy B za pomocą zacisku i pociągnij obiema rękami, aby zacisnąć węzeł. Nie pozwól, aby koniec B przeciągnął się przez węzeł, co spowodowałoby, że węzeł byłby nieodwracalny. Po zawiązaniu węzła, B powinien mieć pętelkę wychodzącą z węzła, podczas gdy A powinien być prosty (patrz Rysunek 3F). Węzeł można rozwiązać, pociągając za koniec B.
  5. Potwierdź odpowiednią okluzję oskrzeli poprzez ręczne zamknięcie rurki odpływowej z ETT do respiratora, co powinno spowodować, że lewe płuco nie napełni się (patrz Rysunek 3G). Niedrożność naczyń zakłada się przy niedrożności oskrzeli ze względu na zwiększoną zapadalność tętnicy płucnej i żył w porównaniu z oskrzelami chrzęstnymi.
  6. Po założeniu klamry wnękowej należy zamknąć nacięcie skóry jednym prostym przerywanym szwem za pomocą nylonowego szwu 6-0, aby zminimalizować niewyczuwalne straty płynów w okresie ciepłego niedokrwienia.

4. Zwolnienie zacisku hilar

  1. Po pożądanym okresie ciepłego niedokrwienia zwolnij węzeł, delikatnie pociągając za krótki wolny koniec jedwabnego krawata (B z Rysunek 3F i krok 3.4). Rozpocznij czas reperfuzji po zwolnieniu slipknot.
    UWAGA: Po zwolnieniu opaski, wentylację płuc można potwierdzić poprzez ponowne ręczne zamknięcie odpływu ETT, co powinno teraz spowodować rozszerzenie lewego płuca. Ponownie, perfuzja jest implikowana z napompowaniem płuca, jednak może być również potwierdzona przez zaróżowienie płuc (patrz Rysunek 4A).
  2. W okresie reperfuzji zamknij klatkę piersiową w trzech warstwach, aby zminimalizować niezauważalne straty. Najpierw zamknij przestrzeń 4żebra pojedynczym szwem nylonowym 6-0, z jednym ugryzieniem tuż nad 4 żebrem i jednym ugryzieniem tuż nad 6 żebrem (patrz Rysunek 4B-C). Zawiąż to przy maksymalnym napompowaniu płuc, aby zminimalizować ryzyko jatrogennej odmy opłucnowej (patrz Rysunek 4D-E).
  3. Następnie zamknij warstwę mięśniową za pomocą prostego ściegu biegowego z nylonowym szwem 6-0.
  4. Na koniec zamknij nacięcie skóry prostym przerywanym szwem nylonowym 6-0 (patrz Rysunek 4F). Unikaj zakładania szwów na skórę ze względu na ryzyko, że obudzone zwierzęta będą skubać w ich nacięciu i doprowadzą do całkowitego rozejścia się rany.
  5. Od tego momentu płuco może być bezpośrednio pobrane pod koniec pożądanego czasu reperfuzji. Jeśli wymagana jest ocena ABG, zobacz krok 5. Jeśli pożądane jest dodatkowe wstrzyknięcie dożylne przed uśmierceniem, patrz krok 6. Jest to operacja terminalna.
  6. Jeśli czas reperfuzji ma być dłuższy niż kilka godzin, wyłącz izofluran, aby umożliwić myszowi obudzenie się ze znieczulenia i ekstubację. Kryteria ekstubacji obejmują drganie ze szczypaniem łapy oraz spontaniczne oddychanie i ruch. Wybudzenie myszy ze znieczulenia ketaminą i izofluranem trwa zwykle 30-45 minut. To jest operacja przetrwania.
    1. W przypadku operacji przetrwania należy wstrzyknąć podskórnie 1 ml ciepłej soli fizjologicznej, aby uwzględnić utratę płynów po operacji. Buprenorfinę należy wstrzykiwać (dawka 0,05 - 0,1 mg/kg masy ciała) podskórnie przed zabiegiem chirurgicznym w celu kontroli bólu. Znieczulenie powtarzać co 4-6 godzin przez co najmniej 3 dni po zabiegu. Rozważ blokadę bupiwakainy wzdłuż nacięcia w celu dodatkowej kontroli bólu.

5. Ocena ABG

UWAGA: Jeśli pożądany jest pomiar ABG, najlepiej uzyskać go poprzez aspirację krwi tętniczej z lewej komory. Aby upewnić się, że ABG odzwierciedla tylko czynność lewego płuca, tę krew tętniczą należy pobrać po około 4 minutach od zaciśnięcia prawej wnęki22,23, w którym to czasie tylko lewe płuco wykonuje natlenienie i wentylację.

  1. Jeśli mysz została obudzona ze znieczulenia po zacisku wnękowym, ponownie znieczulij i zaintubuj mysz zgodnie z krokiem 1.
  2. Około 15-20 minut przed końcem pożądanego czasu reperfuzji ustaw mysz na wznak, zabezpieczając wszystkie cztery kończyny taśmą.
    UWAGA: Przed zakończeniem reperfuzji należy przeznaczyć wystarczająco dużo czasu na wykonanie następujących kroków. Konkretny czas otwarcia brzucha i klatki piersiowej będzie się różnić w zależności od chirurga i jego doświadczenia.
  3. Wykonaj laparotomię w linii środkowej od kości łonowej do mieczykowatego, nacinając nożyczkami skórę, a następnie ścianę brzucha wzdłuż kresy białej (patrz Ryc. 5A-B).
  4. Na wyrostku mieczykowatym przedłuż laparotomię w lewo i w prawo do przedniej linii pachowej, zgodnie z krzywizną dolnego żebra (patrz Rysunek 5C).
  5. Od brzucha naciąć przeponę przednią w linii środkowej, aby wejść do klatki piersiowej, uważając, aby nie wejść zbyt głęboko, aby uniknąć uszkodzenia serca (patrz Rysunek 5D-E). Następnie przedłuż nacięcie przedniej przepony w lewo i w prawo do przedniej linii pachowej, wzdłuż dolnego żebra (patrz biała przerywana linia w Rysunek 5D).
  6. Podziel obustronne żebra wzdłuż przedniej linii pachowej, rozciągając się w górę w kierunku pachy, aby utworzyć torakotomię z klapką. Następnie odbija się przednia ściana klatki piersiowej (mostek i obustronne żebra przednie), co pozwala na pełne odsłonięcie serca i obustronnych płuc (patrz białe przerywane linie w Rysunek 5F).
  7. Nałóż zacisk na przednią ścianę klatki piersiowej, która jest odwrócona do cefalada, aby ułatwić wycofanie. Cofnij membranę w dół za pomocą zakrzywionego zacisku na komary w linii środkowej, aby poprawić wizualizację klatki piersiowej (patrz Rysunek 5F).
  8. Aby w pełni zmobilizować prawe płuco (które ma 4 płaty), zwróć płat dodatkowy, który rozciąga się poza linię środkową, do lewej klatki piersiowej z powrotem do prawej klatki piersiowej (patrz Rysunek 5G-H). Do lewej klatki piersiowej przylega cienkie więzadło - podziel je albo tępo za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką, albo ostro za pomocą nożyczek.
    UWAGA: Ten płat akcesorium przecina linię środkową z tyłu do żyły głównej dolnej (IVC), dlatego należy uważać, aby nie uszkodzić IVC podczas tego manewru.
  9. Gdy wszystkie płaty zostaną zwrócone do prawej klatki piersiowej, odbij całe prawe płuco do przodu i umieść kolejny jedwabny krawat 6-0 (przycięty do ~10 cm) z tyłu prawej wnęki. Następnie umieść prawe płuco z powrotem w klatce piersiowej nad krawatem.
  10. Zawiąż kolejny węzeł wokół prawej wnęki, stosując tę samą technikę, która została opisana w kroku 3.4, zwracając uwagę na otoczenie wszystkich czterech płatów prawego płuca. Ten krok prawego zacisku wnękowego powinien być zaplanowany na około 4 minuty przed zakończeniem reperfuzji.
  11. Pokryj igłę 1/2 cala 31G na strzykawce tuberkulinowej o pojemności 1 cm3 około 200 μl heparyny 1000 jednostek/ml. W tym celu należy pobrać objętość heparyny i kilkakrotnie pociągnąć tłok do przodu i do tyłu 3-4 razy, aby heparyna pokryła całe wnętrze strzykawki. Ma to na celu zminimalizowanie ryzyka krzepnięcia zasysanej krwi podczas transportu ze stanowiska operacyjnego do maszyny ABG.
  12. Po 4 minutach zaciskania prawej wnęki należy pobrać krew tętniczą z lewej komory do strzykawki pokrytej heparyną (patrz Rysunek 5I). Należy uważać, aby nie przebić przegrody komorowej i przypadkowo nie zassać krwi żylnej prawej komory. Istnieje wyraźna różnica w kolorze między ciemniejszą prawą komorą a jaśniejszą lewą komorą (patrz Figura 5I). Ustawić igłę pod kątem w kierunku lewej szyjki. Może być konieczne wielokrotne nakłucie w celu uzyskania wystarczającej ilości krwi do uruchomienia ABG (~150 μL).
    UWAGA: Podczas 4 minut prawego zacisku wnękowego mysz może zacząć wykazywać agonalny oddech, który zwiastuje zbliżającą się śmierć. W takim przypadku należy szybko pobrać krew tętniczą przed zatrzymaniem krążenia. Nie ma możliwości odessania krwi z niebijącego serca.
  13. Uruchom krew tętniczą na maszynie ABG, aby uzyskać między innymi nasycenie tlenem, ciśnienie parcjalne tlenu, ciśnienie parcjalne dwutlenku węgla. Poddaj mysz eutanazji po pobraniu ABG i/lub leczeniu przeciwciałami (patrz krok 6).

6. Dożylne wstrzyknięcie przeciwciał w celu pomiaru wynaczynienia komórek

UWAGA: Ta technika może być użyta do określenia wynaczynienia komórek poprzez wstrzyknięcie dożylnie przeciwciał znakowanych fluorochromem do IVC przed złożeniem ofiary, a następnie analizę cytometryczną przepływową, jak wcześniej opublikowano18. Krótko mówiąc, neutrofile wewnątrznaczyniowe można odróżnić od neutrofili śródmiąższowych za pomocą przeciwciał anty-Ly6G specyficznych dla neutrofili. Znakowany izotiocyjanianem fluoresceiny (znakowany FITC) anty-Ly6G (klon 1A8) wstrzykuje się dożylnie 5 minut przed uśmierceniem, co oznacza krążące wewnątrznaczyniowe neutrofile. Stężenie zastosowanego przeciwciała FITC-Ly6G wynosi 100 ng rozcieńczonego w 200 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Następnie, po przygotowaniu zawiesiny pojedynczej komórki z lewego płuca do cytometrii przepływowej, wszystkie neutrofile są znakowane allofikocyjaniną (znakowaną APC) anty-Ly6G (klon 1A8). Tak więc neutrofile APC-Ly6G+FITC-Ly6G+ są wewnątrznaczyniowe, podczas gdy APC-Ly6G+FITC-Ly6G- są pozanaczyniowe lub śródmiąższowe. Technikę tę można dostosować na przykład do monocytów z przeciwciałami anty-Ly6C, limfocytów B z przeciwciałami anty-CD19.

  1. Załaduj pożądane przeciwciało do strzykawki o pojemności 3/10 cm3 z igłą 5/16 cala 31G, uważając, aby zminimalizować pęcherzyki powietrza w strzykawce. Tę metodę należy stosować do wstrzykiwań dożylnych do IVC w kroku 6.5.
  2. Wykonaj laparotomię zgodnie z krokami 5.3-5.4.
  3. Po laparotomii wykonaj rotację trzewną w prawo przyśrodkową za pomocą dwóch spiczastych aplikatorów z bawełnianą końcówką. U myszy odbywa się to poprzez wypatroszenie całego jelita na lewo od brzucha, co pozwoli na wyraźny widok IVC (patrz Rysunek 6A).
  4. Usuń tłuszcz pokrywający IVC tępo za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką.
  5. Wstrzyknąć roztwór przeciwciała do IVC przez nakłucie dożylne (patrz Ryc. 6B). Po wyjęciu igły należy natychmiast delikatnie docisnąć wacikiem do miejsca nakłucia żyły, aż do uzyskania hemostazy (zwykle około 2-3 min).
  6. Z powrotem wypatroszone jelito należy umieścić w jamie brzusznej nad wacikiem, aby kontynuować wywieranie nacisku na IVC (patrz Rysunek 6C).
  7. Wykonaj torakotomię z klapką zgodnie z krokami 5.5-5.7, aby pobrać lewe płuco. Pozwól, aby przeciwciała miały co najmniej 5 minut na ogólnoustrojową cyrkulację przed złożeniem w ofierze i zbiorem. Poddaj mysz eutanazji po pobraniu ABG i/lub leczeniu przeciwciałami.

7. Barwienie histologiczne (H&E)

  1. Po utrwaleniu formaliny i zatopieniu parafiny w lewym płucu oraz przecięciu do grubości 5 μm, należy odparafinować szkiełko w ksylenie (dwa 10-minutowe płukania).
  2. Odwodnić w sekwencyjnych płukaniach etanolem: 2x 5 min mycie 100%, 1x 2 min mycie 95% i 1x 2 min mycie 70% etanolem. Następnie spłucz w wodzie dejonizowanej.
  3. Zabarwić szkiełko hematoksyliną przez 2-4 minuty, a następnie myć wodą dejonizowaną przez 5 minut lub do momentu, gdy będzie czyste. Dokładny czas barwienia hematoksyliną będzie musiał być zoptymalizowany pod kątem tkanki i pożądanej intensywności barwienia jądrowego.
  4. Myć w roztworze definiującym przez 30 sekund w celu rozróżnienia plam, następnie myć w wodzie przez 2 minuty. Myć w roztworze tworzącym niebieski kolor przez 30 s, a następnie myć w wodzie przez 2 minuty.
  5. Odwodnić dalej, zanurzając się w 95% etanolu 15x. Zabarwić w eozynie na 1 min.
  6. Odwodnić się przez 2 minuty płukania etanolem (2x), a następnie przez 2 minuty mycie ksylenem (2x). Nałożyć media montażowe i szkiełko nakrywkowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po zacisnięciu lewego wnęki płuca, ciśnienie parcjalne tlenu w krwi tętniczej (PaO2) przypisane do lewego płuca wynosi ~100 mmHg, co jest wartością znacznie niższą w porównaniu do ~500 mmHg po torakotomii pozorowanej (Rycina 7A, n=6-7). Należy zauważyć, że torakotomie pozorowane przeprowadzono u myszy B6, a pomiar gazometrii krwi tętniczej wykonano po 4 min zacisnięcia prawej wnęki, co reprezentuje wartości przypisane wyłącznie do lewego płuca. Barwienie H&E lewego płuca z zac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisujemy technikę zaciskania wnęki, która polega na nałożeniu węzła ślizgowego na lewą wnękę, który zamyka tętnicę płucną i żyły oraz oskrzela w celu wywołania ciepłego niedokrwienia, a następnie reperfuzji. Po zaciśnięciu wnęki lewe płuco może zostać pobrane do różnych technik eksperymentalnych, takich jak histologia, cytometria przepływowa, sekwencjonowanie masowe lub pojedyncze komórki oraz ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy. Dodatkowo krew i śledziona mogą być wykorzystywane do badania skutków ogólnoustrojowych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie informują o żadnych istotnych ujawnieniach.

Podziękowania

Ta praca nie otrzymała żadnej konkretnej dotacji od żadnej agencji finansującej w sektorze publicznym, komercyjnym czy non-profit.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Leki
10% roztwór jodu powidonuAplicareNDC 52380-0126-2Do środka dezynfekującego
Buprenorfina 1,3 mg/mlFidelis Animal HealthNDC 86084-100-30Do kontroli bólu
CarprofenCronus PharmaNDC 69043-027-18Do kontroli bólu
Heparyna 1000 jednostek/mlSagentNDC 25021-404-01Do pozyskiwania krwi tętniczej
Izofluran 1%-1,5%Sigma Aldrich26675-46-7Do znieczulenia
Chlorowodorek ketaminy 100 mg/mlVedcoNDC 50989-996-06Do znieczulenia
Puralube Weterynaryjna maść do oczuMedi-Vet.com11897Aby zapobiec wysuszeniu oczu
Ksylazyna 20 mg / mlAkornNDC 59399-110-20Do kontroli bólu
Narzędzia i instrumenty
Argent High Temp Fine Tip Cautery PenMcKesson231Do koagulacji naczyń krwionośnych
Zakrzywiony zacisk na komaryFine Science Tools13009-12Do zabiegu chirurgicznego
Drobne zakrzywione kleszczeFine Science Tools11274-20Do chirurgii procedura
Cienkie nożyczkiFine Science Tools15040-11Do zabiegu chirurgicznego
Konfiguracja zacisku do intubacjiFine Science Tools18374-44, 18144-30Do trzymania myszy pionowo za język podczas intubacji. Patrz rysunek uzupełniający 1A. 
Magnetyczne zwijacze żeberFine Science Tools18200-01, 18200-10Do retrakcji torakotomii. Stabilizator magnetyczny i zwijacz powinny być połączone rurką z mikrolateksu poniżej.
Światłowód z tworzywa sztucznego klasy optycznej bez osłony, 500 i mu; mEdmund Optics02-532Aby wykonać wprowadzacz do rurki dotchawiczej. Patrz rysunek uzupełniający 1B. Długość tego światłowodu o długości 1,5 cala powinna mieć kawałek jedwabnej taśmy przymocowany do jednego końca. Następnie może być stosowany jako wprowadzacz do rurki dotchawiczej. Koniec wprowadzacza powinien być lekko zakrzywiony.
Maszynka do strzyżenia Power Pro UltraOster078400-020-001Do strzyżenia włosów
NożyczkiFine Science Tools14370-22Do zabiegu chirurgicznego
Poduszka grzewcza dla małych zwierzątK& H Produkty dla zwierząt Podgrzewanapodkładka Thermo-PeepAby utrzymać normotermię Wentylator
dla małych zwierzątHarvard Apparatus55-0000Do wentylacji (TV 0,35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%)
Rurka z gumy lateksowej Spearit Micro (1/8 średnicy zewnętrznej, 1/16 średnicy wewnętrznej)Amazon.comhttps://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1Do zwijania torakotomia
Profil statystyczny Analizator parametrów krytycznych krwi Prime Critical CareNova Biomedicalhttps://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx
ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33
2aM8WGPiUVhicPQZ
Wj2AaAqhDEALw_wcB   		Do cofnięcia torakotomii
Prosty zaciskFine Science Tools13008-12Do zabiegu chirurgicznego
Kleszcze prosteFine Science Tools91113-10Do zabiegu chirurgicznego
Mikroskop chirurgicznyWild Heerbruggnie jest już produkowanyDo intubacji i zabiegu chirurgicznego; zaleca się wymianę na mikroskopy chirurgiczne Leica
Supplies
½ strzykawka cc z igłą ½ cal 29GMcKesson942665Do wstrzykiwania ketaminy/ksylazyny dootrzewnowo
½ calowa igła 31G na strzykawce tuberkulinowej o pojemności 1 cm3McKesson16-SNT1C2705Do aspiracji krwi tętniczej z lewej komory
1-calowy cewnik dożylny 20GTerumoSROX2025CADo rurki dotchawiczej (ETT)
1-calowy jedwab taśmaDurapore3M ID 7100057168Do przyklejania ETT do nosa i zabezpieczania kończyn
Strzykawka 3/10 cc z igłą 5/16 cala 31GMcKesson102-SN310C31516PDo wstrzykiwania przeciwciał do żyły głównej dolnej
monofilamentowy 6-0 na igle P-10McKessonS697GXDo zamykania torakotomii, warstwy mięśniowej i skóry
6-0 jedwabny krawatSpecjalizacje chirurgiczne WyglądSP102Do wykonania slipknot na zacisk wnękowy
Spiczaste aplikatory z bawełnianą końcówkąSolon56225Do manipulowania płucami i do rozwarstwiania
szew

Bibliografia

  1. Bharat, A., et al. Immunological link between primary graft dysfunction and chronic lung allograft rejection. Ann Thorac Surg. 86 (1), 189-195 (2008).
  2. Daud, S. A. Impact of immediate primary lung allograft dysfunction on bronchiolitis obliterans syndrome. Am J Respir Crit Care Med. 175 (5), 507-513 (2007).
  3. Halazun, K. J., Al-Mukhtar, A., Aldouri, A., Willis, S., Ahmad, N. Warm ischemia in transplantation: search for a consensus definition. Transplant Proc. 39 (5), 1329-1331 (2007).
  4. Warnecke, G., et al. Warm or cold ischemia in animal models of lung ischemia-reperfusion injury: is there a difference . Thorac Cardiovasc Surg. 52 (3), 174-179 (2004).
  5. Hasenauer, A., et al. Effects of cold or warm ischemia and ex-vivo lung perfusion on the release of damage associated molecular patterns and inflammatory cytokines in experimental lung transplantation. J Heart Lung Transplant. 40 (9), 905-916 (2021).
  6. Iskender, I., et al. Effects of warm versus cold ischemic donor lung preservation on the underlying mechanisms of injuries during ischemia and reperfusion. Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).
  7. Santos, P., Teixeira, P. J. Z., Moraes Neto, D. M., Cypel, M. Donation after circulatory death and lung transplantation. J Bras Pneumol. 48 (2), e20210369(2022).
  8. Moskowitzova, K., et al. Mitochondrial transplantation enhances murine lung viability and recovery after ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 318 (1), L78-L88 (2020).
  9. Nakata, K., et al. Functional blockage of S100A8/A9 ameliorates ischemia-reperfusion injury in the lung. Bioengineering (Basel). 9 (11), 673(2022).
  10. Nakata, K., et al. Protective effects of anti-HMGB1 monoclonal antibody on lung ischemia reperfusion injury in mice. Biochem Biophys Res Commun. 573, 164-170 (2021).
  11. Wang, Q., Li, Y., Wu, C., Wang, T., Wu, M. Aquaporin-1 inhibition exacerbates ischemia-reperfusion-induced lung injury in mouse. Am J Med Sci. 365 (1), 84-92 (2023).
  12. Gielis, J. F., et al. A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: tricks of the trade. J Surg Res. 194 (2), 659-666 (2015).
  13. Zhang, X., et al. Mitogen-activated protein kinases regulate HO-1 gene transcription after ischemia-reperfusion lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283 (4), L815-L829 (2002).
  14. Sharma, A. K., et al. Adenosine A2A receptor activation on CD4+ T lymphocytes and neutrophils attenuates lung ischemia-reperfusion injury. J Thorac Cardiovasc Surg. 139 (2), 474-482 (2010).
  15. Yang, Z., Sharma, A. K., Linden, J., Kron, I. L., Laubach, V. E. CD4+ T lymphocytes mediate acute pulmonary ischemia-reperfusion injury. J Thorac Cardiovasc Surg. 137 (3), discussion 702 695-702 (2009).
  16. Sayah, D. M., et al. Neutrophil extracellular traps are pathogenic in primary graft dysfunction after lung transplantation. Am J Respir Crit Care Med. 191 (4), 455-463 (2015).
  17. Okazaki, M., et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 6 (7), 1672-1679 (2007).
  18. Hsiao, H. M. Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta. J Clin Invest. 128 (7), 2833-2847 (2018).
  19. Sharma, A. K., Mulloy, D. P., Le, L. T., Laubach, V. E. NADPH oxidase mediates synergistic effects of IL-17 and TNF-alpha on CXCL1 expression by epithelial cells after lung ischemia-reperfusion. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306 (1), L69-L79 (2014).
  20. Zanotti, G., et al. Novel critical role of Toll-like receptor 4 in lung ischemia-reperfusion injury and edema. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297 (297), L52-L63 (2009).
  21. National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. , The National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  22. Saito, M., et al. Pirfenidone alleviates lung ischemia-reperfusion injury in a rat model. J Thorac Cardiovasc Surg. 158 (1), 289-296 (2019).
  23. Tanaka, S., et al. Protective effects of Imatinib on ischemia/reperfusion injury in rat lung. Ann Thorac Surg. 102 (5), 1717-1724 (2016).
  24. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  25. Koletsis, E., et al. In situ cooling in a lung hilar clamping model of ischemia-reperfusion injury. Exp Biol Med (Maywood). 231 (8), 1410-1420 (2006).
  26. Hermsen, R., et al. Genomic landscape of rat strain and substrain variation. BMC Genomics. 16 (1), 357(2015).
  27. Beck, J. A., et al. Genealogies of mouse inbred strains. Nat Genet. 24 (1), 23-25 (2000).
  28. Liao, W. I., et al. A mouse model of orotracheal intubation and ventilated lung ischemia reperfusion surgery. J Vis Exp. (187), 64383(2022).
  29. Murata, T., Nakazawa, H., Mori, I., Ohta, Y., Yamabayashi, H. Reperfusion after a two-hour period of pulmonary artery occlusion causes pulmonary necrosis. Am Rev Respir Dis. 146 (4), 1048-1053 (1992).
  30. Ukita, R., et al. A large animal model for pulmonary hypertension and right ventricular failure: Left pulmonary artery ligation and progressive main pulmonary artery banding in sheep. J Vis Exp. (173), 62694(2021).
  31. Wang, Q., et al. Induction of right ventricular failure by pulmonary artery constriction and evaluation of right ventricular function in mice. J Vis Exp. (147), 59431(2019).
  32. Welbourn, C. R., et al. Pathophysiology of ischaemia reperfusion injury: central role of the neutrophil. Br J Surg. 78 (6), 651-655 (1991).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Murine Left Pulmonary Hilar Clamp Model of Lung Ischemia Reperfusion Injury
Posted by JoVE Editors on 7/09/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66232

Przeglądaj więcej artykułów

Zaciskanie wnęki płucauszkodzenie płuc u myszyekstrawasacja neutrofilirekrutacja limfocytów Bcytometria przepływowaprocedura torakotomiigazometria krwi tętniczejmodel transplantacji płuc
Mysi lewy klamra płucny Hilar Clamp Urazu Reperfuzyjnego Niedokrwienia Płuc
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.