Ten protokół opisuje półautomatyczną ścieżkę mającą na celu poprawę wydajności i zdolności przetwarzania oraz kriokonserwacji plemników zagrożonych gatunków koralowców, mającą na celu zabezpieczenie różnorodności genetycznej i wsparcie wysiłków na rzecz odbudowy rafy.
Artykuł metodologiczny
Półautomatyczny przepływ pracy do krioprezerwacji nasienia koralowców w celu wsparcia biobankowania i akwakultury
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rafy koralowe stoją w obliczu kryzysu, ponieważ częstotliwość bielenia spowodowanego ociepleniem oceanów wzrasta, co skutkuje śmiercią koralowców na rafach na całym świecie. Wynikająca z tego utrata różnorodności genetycznej i różnorodności biologicznej może zmniejszyć zdolność koralowców do przystosowania się do zmieniającego się klimatu, dlatego wysiłki na rzecz zachowania istniejącej różnorodności są niezbędne, aby zmaksymalizować zasoby dostępne do odbudowy rafy teraz i w przyszłości. Najskuteczniejszym podejściem do długoterminowego zabezpieczenia genetyki jest kriokonserwacja i biobankowanie, które pozwala na przechowywanie żywych próbek w zamrożonych próbkach w temperaturach kriogenicznych w ciekłym azocie w nieskończoność. Kriokonserwacja plemników koralowców jest możliwa od 2012 roku, ale sezonowy charakter rozmnażania koralowców oznacza, że działania biobanków są ograniczone do zaledwie kilku nocy w roku, kiedy następuje tarło. Poprawa wydajności procesów przetwarzania plemników koralowców i krioprezerwacji jest zatem niezbędna do maksymalizacji tych ograniczonych możliwości biobankowania. W tym celu postanowiliśmy zoptymalizować ścieżki przetwarzania krioprezerwacji plemników koralowców, opierając się na istniejących technologiach i tworząc półautomatyczne podejście w celu usprawnienia oceny, obsługi i kriokonserwacji plemników koralowców. Proces, który łączy w sobie wspomaganą komputerowo analizę nasienia, kriowiale z kodami kreskowymi i serię połączonych automatycznych arkuszy danych do jednoczesnej edycji przez wielu użytkowników, poprawia wydajność zarówno przetwarzania próbek, jak i zarządzania metadanymi w terenie. Dzięki integracji z przekrojowymi programami badawczymi, takimi jak Program Odbudowy i Adaptacji Raf w Australii, kriokonserwacja może odgrywać kluczową rolę w programach odbudowy raf na dużą skalę, ułatwiając genetyczne zarządzanie populacjami akwakultury, wspierając badania mające na celu zwiększenie tolerancji termicznej i zapobiegając wyginięciu gatunków koralowców. Opisane procedury zostaną wykorzystane przez praktyków kriokonserwacji koralowców i biobankowania na rafach na całym świecie i zapewnią model przejścia technologii kriokonserwacji z laboratoriów badawczych do zastosowań na dużą skalę.
Wprowadzenie
Rafy koralowe na całym świecie doświadczają utraty gatunków koralowców, populacji i różnorodności genetycznej z powodu ocieplenia oceanów i zakwaszenia spowodowanego zmianami klimatu, zmniejszając żywotność tych krytycznych siedlisk i wpływając na gatunki, które wspierają1,2. Najskuteczniejszym podejściem do długoterminowego zabezpieczenia genetyki jest kriokonserwacja i biobankowanie, które pozwala na przechowywanie zamrożonych żywych próbek w temperaturach kriogenicznych w ciekłym azocie w nieskończoność3. Opracowanie w 2012 r. metod kriokonserwacji plemników koralowców4 umożliwiło po raz pierwszy biobankowanie genetyki tych gatunków i doprowadziło do powstania pierwszego biorepozytorium genetyki koralowców w 2012 r. 5. Od tego czasu ten protokół kriokonserwacji został jeszcze bardziej udoskonalony6 i wykorzystany do zabezpieczenia genetyki ponad 50 gatunków koralowców na całym świecie, z których 30 pochodzi z Wielkiej Rafy Koralowej w Australii7. Kriokonserwowane plemniki koralowców mogą generować zdrowe koralowce, które rozwijają się normalnie i były wykorzystywane do ułatwiania eksperymentów wspomaganego przepływu genów w Australii8 i Caribbean9. Chociaż obecnie opracowywane są technologie umożliwiające kriokonserwację złożonych typów tkanek, takich jak larwy10 i dorosłe tkanki koralowców11,12, kriokonserwacja plemników koralowców jest obecnie najbardziej znanym narzędziem dostępnym do rutynowego biobankowania genetyki koralowców.
Wraz ze wzrostem wpływu na populacje koralowców, kilka krajów zainicjowało zakrojone na szeroką skalę programy wspierające odbudowę i adaptację raf koralowych (np. Program Odbudowy i Adaptacji Rafy [RRAP] w Australii13) lub w celu zabezpieczenia pozostałych zagrożonych populacji koralowców (np. Florida Coral Rescue w USA14). W kontekście tych programów, kriokonserwacja może być postrzegana jako technologia wspomagająca, wspierająca badania i produkcję koralowców na dużą skalę, a także zabezpieczająca istniejącą różnorodność genetyczną i zapobiegająca wyginięciu. Kriokonserwacja plemników może umożliwić większą kontrolę nad reprodukcją między populacjami, które są fizycznie lub czasowo oddzielone, i może pozwolić na genetyczne zarządzanie stadem lęgowym w celu selekcji pożądanych cech, takich jak tolerancja termiczna lub odporność na choroby8. Do tej pory biobankowanie plemników koralowców było prowadzone na stosunkowo małą skalę w celu wsparcia zarządzania różnorodnością biologiczną7, więc pewien poziom zwiększenia skali będzie wymagany, jeśli takie biobankowanie ma osiągnąć swój potencjał w ramach tych większych programów odbudowy raf. Podobnie jak w przypadku wszystkich działań związanych z odbudową raf koralowych opartych na rozmnażaniu koralowców, główną przeszkodą w zwiększaniu wysiłków związanych z biobankowaniem jest ograniczony okres, w którym gamety koralowe są dostępne, ponieważ tarło u większości gatunków budujących rafy zbiega się z pełnią księżyca późną wiosną i wczesnym latem15, co oznacza, że gamety są dostępne do kriokonserwacji i biobankowania tylko przez kilka nocy w roku. Co więcej, w regionach, w których dochodzi do masowego tarła, np. na Wielkiej Rafie Koralowej, zazwyczaj wiele gatunków składa ikrę jednocześnie lub w odstępie kilku godzin tej samej nocy15. W związku z tym konieczne są ulepszenia szlaku krioprezerwacji plemników, aby zwiększyć skalę i wydajność przetwarzania, aby zmaksymalizować zdolność biobankowania podczas tych krótkich rocznych okien tarła, zapewniając jednocześnie integralność próbek i powiązanych metadanych.
Kriokonserwacja i biobankowanie plemników koralowców obejmują kilka kluczowych etapów, od zbierania gamet podczas tarła do dostępu próbek do repozytorium biologicznego i bazy danych (Rysunek 1). Proces ten rozpoczyna się od oddzielenia plemników od komórek jajowych (u gatunków hermafrodytów) lub pobrania plemników ze słupa wody (u gatunków gonochorycznych), po czym następuje ocena ruchliwości i koncentracji plemników. Plemniki są następnie łączone z krioprotektantem (stężenie końcowe 10% v/v, sultlenek dimetylu, DMSO) w przefiltrowanej wodzie morskiej (FSW) i schładzane w temperaturze -20 °C/min w specjalnie zaprojektowanym urządzeniu chłodzącym4. Wczesne iteracje tego procesu opierały się na wizualnej ocenie ruchliwości i koncentracji plemników za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym i zliczania hemocytometrów, drukowaniu i etykietowaniu probówek podczas przetwarzania próbek do krioprezerwacji, ręcznym pipetowaniu próbek nasienia do kriowiali i chłodzeniu na specjalnie zaprojektowanym pływającym stojaku16. Zastosowanie komputerowej analizy nasienia (CASA)17 oraz opracowanie urządzenia chłodzącego wydrukowanego w 3D6 poprawiło wydajność i niezawodność krioprezerwacji plemników koralowców, ale ścieżka przetwarzania próbek nasienia pozostała w dużej mierze taka sama od momentu jej powstania. Chociaż podejście to jest odpowiednie do przetwarzania próbek z umiarkowanej liczby kolonii i gatunków w noc tarła, w przypadku dużych objętości i liczby kolonii (np. pojedynczych próbek z >10 kolonii na raz), istnieją wąskie gardła w ścieżce kriokonserwacji, które utrudniają przetwarzanie próbek w odpowiednim czasie (tj. w ciągu 2 godzin od uwolnienia plemników) bez pogorszenia potencjału płodności próbki. Chociaż dostępne są systemy transportu płynów na dużą skalę dla kriowiali (np. Thomas et al.18), są one zazwyczaj przeznaczone do przetwarzania dużych partii (tj. wiele stojaków kriowialnych) i nie nadają się do transportu i użytku w terenie, więc nie są opłacalne dla tego zastosowania. W związku z tym niniejsze badanie miało na celu poprawę efektywności kriokonserwacji plemników koralowców poprzez wprowadzenie przenośnych, niedrogich urządzeń i metod automatyzacji na kluczowych etapach ścieżki przetwarzania, aby zmaksymalizować liczbę próbek, które można skutecznie kriokonserwować w noc tarła.
Protokół
Metody opisane tutaj mogą być używane do przetwarzania i krioprezerwacji plemników zarówno hermafrodytycznych jak i gonochorycznych gatunków koralowców. Ogólne wprowadzenie i podstawowe informacje na temat tarła koralowców i pobierania gamet do kriokonserwacji nasienia dla obu trybów reprodukcji można znaleźć na Smithsonian's National Zoo & Conservation Biology Institute Coral Coral Cryopreservation Training Course19. Opisane metody zostały opracowane przede wszystkim przy użyciu gamet z kolonii Acropora millepora zebranych z grupy wysp Keppel w Woppaburra Sea Country oraz z Davies Reef w Bindal Sea Country, na Wielkiej Rafie Koralowej w Australii. Wszelkie zbieranie i wykorzystywanie koralowców i gamet odbywało się za dobrowolną, uprzednią i świadomą zgodą Tradycyjnych Opiekunów odpowiednich Krajów Morskich. Odczynniki i sprzęt używany do tego badania są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przed tarłem - kontrola systemu i przygotowanie roztworu aktywującego plemniki oraz kriodyluentu
- Upewnij się, że skaner kodów kreskowych jest naładowany, aktywny i ustawiony na wprowadzanie danych arkusza kalkulacyjnego jako poziomego wprowadzania komórek. Zapoznaj się z instrukcją obsługi czytnika kodów kreskowych, aby dostosować to ustawienie.
- Przygotuj skoncentrowane roztwory podstawowe do aktywacji plemników koralowców dla CASA.
UWAGA: Podczas pracy z chemikaliami do przygotowania roztworu aktywacyjnego należy nosić rękawiczki jednorazowe.- Przygotować 30% roztwór podstawowy albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (5 ml), rozpuszczając 1,5 g BSA w 4 ml sterylnej, oczyszczonej wody do hodowli tkankowych za pomocą podgrzewacza do probówek ustawionych na 37 °C lub trzymając probówkę w złożonych dłoniach, okresowo delikatnie obracając (nie potrząsać fiolką).
- Po znalezieniu w roztworze uzupełnić do końcowej objętości (5 ml) za pomocą wody z hodowli tkankowej, oznaczyć probówkę datą i oznaczyć "30% BSA w H2O".
- Przechowywać w lodówce (4 °C) do 2 tygodni.
- Przygotuj 60 ml roztworu podstawowego kofeiny (25 ml), rozpuszczając 0,2913 g kofeiny w 24 ml przefiltrowanej wody morskiej (FSW).
- Po znalezieniu w roztworze uzupełnić do końcowej objętości (25 ml) za pomocą FSW, oznaczyć probówkę datą i zaznaczyć "60 mM kofeiny w FSW".
- Przechowywać w lodówce do 1 miesiąca.
UWAGA: Maksymalna rozpuszczalność kofeiny w FSW wynosi około 71 mM.
- Przygotuj roztwór roboczy aktywacji plemników dla próbek nasienia o stężeniu ~109 plemników/ml (0,9% BSA + 12 mM kofeiny w FSW).
- Aby uzyskać 10 ml roztworu roboczego, połącz 2,0 ml 60 ml podstawowego roztworu kofeiny + 0,3 ml 30% roztworu podstawowego BSA + 7,7 ml FSW.
- Oznacz probówkę datą i "roztwór roboczy aktywacji plemników - 0,9% BSA + 12 mM kofeiny".
- Przygotować każdego dnia stosowania, przechowywać w temperaturze pokojowej (19-30 °C), a niewykorzystany roztwór wyrzucić pod koniec dnia.
- Przygotuj roztwory krioprotekcyjne (kriodiluenty). Upewnij się, że podczas obchodzenia się z krioprotektantem DMSO.
należy nosić rękawiczki jednorazowe. UWAGA: FSW przygotowuje się z różnymi stężeniami krioprotektantu w zależności od początkowego stężenia plemników w próbce i pożądanego końcowego stężenia plemników w kriokonserwowanych podwielokrotnościach. Podczas przygotowywania kriodyluentu należy upewnić się, że FSW jest porcjowany do probówki o pojemności 50 ml przed dodaniem DMSO.- Zbierz surową wodę morską z systemu zbiorników, w którym trzymane są koralowce przed tarłem (zasolenie ~35 ppt).
- Filtruj surową wodę morską za pomocą systemu filtracji typu butelkowego podłączonego do pompy próżniowej z zamontowanym niepirogenicznym filtrem membranowym 0,2 μm.
- Aby uzyskać stężenie plemników ≥2 × 109 plemników/ml, przygotuj 20% DMSO w FSW, łącząc 10 ml DMSO + 40 ml FSW w probówce o pojemności 50 ml.
- Aby uzyskać stężenie plemników <2 × 109 plemników/ml, przygotuj 30% DMSO w FSW, łącząc 15 ml DMSO + 35 ml FSW w probówce o pojemności 50 ml.
- Oznacz probówkę datą i stężeniem DMSO, tj. 30% DMSO lub 20% DMSO.
- Przygotować w każdym dniu stosowania, przechowywać w temperaturze pokojowej (19-30 °C) i wyrzucić niewykorzystany roztwór pod koniec każdego dnia.
UWAGA: Mieszanie DMSO i FSW powoduje reakcję egzotermiczną, a kriodiluent należy przygotować na długo przed użyciem, aby umożliwić schłodzenie do temperatury pokojowej. FSW może być przechowywany w temperaturze 4 °C w celu przygotowania kriodyluentu w celu zrównoważenia tego wytwarzania ciepła.
- Przygotuj rejestrator danych termopary.
- Aby zmierzyć przybliżoną szybkość chłodzenia każdej serii kriokonserwacji, umieść kriowial zawierający 10% DMSO w FSW z sondą termopary włożoną przez pokrywę w szczelinie na próbki stojaka do krioprezerwacji obok próbek nasienia.
- Aby zrobić fiolkę z termoparą, przebij lub stopij mały otwór w nasadce kriowiala z kodem kreskowym i włóż termoparę typu K lub T przez otwór. Dociśnij końcówkę sondy termopary do poziomu tak, aby znajdowała się na środku próbki po napełnieniu fiolki, utrzymując końcówkę sondy wyśrodkowaną w fiolce, aby uniknąć kontaktu z wewnętrzną ścianką fiolki. Uszczelnij nasadkę i przytrzymaj sondę termopary na miejscu za pomocą gorącego kleju.
- Zakładając jednorazowe rękawiczki, napełnij kriowial z kodem kreskowym objętością 10% DMSO w FSW równą objętości próbki nasienia przeznaczonej do kriokonserwacji.
- Przygotuj świeże 10% DMSO w FSW i codziennie napełniaj fiolki z termoparą.
2. Przygotowanie i ocena nasienia
- W przypadku gatunków hermafrodytycznych (np. gatunków Acropora) należy zebrać wiązki gamet z powierzchni wody za pomocą pipety transferowej o pojemności 3 ml i umieścić je w oznakowanej probówce o pojemności 50 ml w proporcji 5 ml wiązek gamet na 5 ml wody morskiej (10 ml objętości całkowitej).
- W przypadku gatunków gonochorycznych należy pobrać plemniki z okolic ujścia polipa za pomocą pipety transferowej o pojemności 3 ml i umieścić próbkę w oznakowanej probówce o pojemności 50 ml, a następnie przejść bezpośrednio do kroku 2.8.
UWAGA: Rękawiczki jednorazowe nie są konieczne do pobierania i obchodzenia się z próbkami gamet, ale można je nosić, jeśli jest to preferowane. Ręce należy dokładnie umyć świeżą wodą lub zmienić rękawiczki między każdą próbką gamet, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. - W przypadku gatunków hermafrodytycznych należy mieszać wiązki plemnika i jaja, delikatnie obracając próbkę ręcznie, aż wiązki się rozpadną.
UWAGA: Niektóre gatunki Montipora mają toksynę w jajach, więc należy pozwolić im się powoli rozpadać przy minimalnym poruszeniu, aby uniknąć uszkodzenia plemników. - Pozostaw próbkę na 2 minuty w stojaku na probówki, aby jaja mogły wypłynąć na powierzchnię, a plemniki osiadły (jaja utworzą różowo-brązową warstwę na powierzchni, a poszczególne jaja będą widoczne; patrz Rysunek 1i).
- Aby oddzielić plemniki i usunąć zanieczyszczające komórki jajowe, delikatnie odessaj plemniki z dna probówki za pomocą czystej pipety do przenoszenia o pojemności 3 ml.
- Przenieś próbkę nasienia do sitka do komórek o wielkości 100 μm umieszczonego na nowej sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Próbka powinna łatwo przepływać przez filtr. Postukaj w filtr, aby przyspieszyć przepływ próbki, a w razie potrzeby można użyć czystej pipety transferowej do pobrania pozostałej próbki ze spodu filtra. Wyjmij filtr, a następnie luźno przykryj rurkę, aby umożliwić wymianę powietrza.
- Oznacz przefiltrowaną próbkę nasienia identyfikatorem kolonii i przenieś próbkę do stacji roboczej oceny nasienia.
- Otwórz plik automatycznego arkusza danych biobanku koralowców (plik uzupełniający 1). W zakładce oceny plemników wprowadź metadane kolonii koralowców (kolumny A-H).
- Przygotuj plemniki do oceny CASA.
- Dobrze wymieszać próbkę nasienia i pobrać 10 μl podwielokrotności do pustej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,8 ml.
- Natychmiast dodaj kroplami 0,390 ml roztworu roboczego do aktywacji plemników przez 10-20 s, delikatnie mieszając plemniki z roztworem. Daje to stosunek rozcieńczenia 1:39 (plemnik: roztwór, v/v) (lub współczynnik rozcieńczenia 40), który zapewnia odpowiednie stężenie do oceny CASA (~50 ×10 6/ml), jeśli stężenie surowych plemników wynosi ~2 × 109 plemników/ml. Odwróć probówkę 5 razy i przesuń pokrywę probówki przed otwarciem, aby osadzać roztwór na dnie probówki.
UWAGA: Stężenie plemników dla CASA powinno mieścić się w zakresie 8-50 × 106/ml, aby umożliwić dokładne śledzenie plemników17. Do podwielokrotności surowego nasienia można dodać dodatkowy roztwór roboczy aktywacji plemników, aby w razie potrzeby zmniejszyć stężenie. Ponownie oblicz stopień rozcieńczenia i wprowadź tę wartość do arkusza kalkulacyjnego. W przypadkach, gdy wiele próbek musi być przetwarzanych jednocześnie, probówki do mikrowirówek o pojemności 1,8 ml można wstępnie naładować 0,390 ml roztworu roboczego do aktywacji plemników z 10 μl porcji próbki nasienia dodanymi bezpośrednio do niej, a następnie dobrze wymieszać, odwracając probówkę o 10× i przesuwając pokrywkę probówki przed otwarciem.
- Oceń ruchliwość plemników i stężenie aktywowanej próbki za pomocą komputerowej analizy nasienia wspomaganej (CASA), jak opisano w Zuchowicz et al.17, umieszczając 4 μl aktywowanej zawiesiny plemników w komorze liczącej Maklera20 lub poprzez ocenę wizualną i liczbę hemocytometrów pod mikroskopią kontrastu fazowego, jak opisano w Hagedorn et al.4.
UWAGA: Komorę Maklera i szkiełko nakrywkowe należy dobrze oczyścić 70% etanolem, a następnie wodą destylowaną i przetrzeć niestrzępiącą się chusteczką między próbkami. - Wprowadź współczynnik rozcieńczenia plemników używany do oceny CASA i wprowadź dane wyjściowe CASA dla stężenia plemników (miliony/ml), całkowitej ruchliwości (%) i ruchliwości postępowej (%) do automatycznego arkusza danych.
UWAGA: Dodatkowe wskaźniki CASA, w tym średnia prędkość ścieżki (VAP), prędkość prostoliniowa (VSL) i prędkość krzywoliniowa (VCL), mogą być opcjonalnie uwzględnione w automatycznym arkuszu danych lub pobrane z zapisanych plików CASA później. - Zapisz stężenie plemników na przefiltrowanej probówce z próbką nasienia i przenieś próbkę do stacji roboczej kriokonserwacji w tej samej kolejności, w jakiej następuje rozbicie i przetwarzanie wiązki.
3. Rozcieńczanie plemników i równoważenie krioprotektantu
- Na stacji roboczej do krioprezerwacji otwórz ten sam plik arkusza automatycznego arkusza danych biobankowania koralowców, z którego korzysta stacja robocza do oceny nasienia, i wybierz kartę Kriokonserwacja. Sprawdź etykietę probówki z próbką nasienia i zidentyfikuj odpowiedni wpis, sprawdzając identyfikator kolonii (kolumna C). Jeśli nie uzyskujesz dostępu do tego samego pliku automatycznego arkusza danych jednocześnie między stacjami roboczymi, ręcznie wprowadź dane do identyfikatora kolonii (kolumna C) i stężenie plemników (kolumna F) w automatycznym arkuszu danych.
- Za pomocą pipety serologicznej zmierzyć objętość próbki nasienia, pobierając próbkę do pipety i wyrzucając ją z powrotem do tej samej probówki; wprowadzić wartość w kolumnie E.
- Należy sprawdzić w automatycznie obliczonej kolumnie I wymagane stężenie krioprotektantu oraz w kolumnie H pod kątem objętości kriodyluentu, który ma zostać dodany (tabela 1).
- Uruchom minutnik na 10 minut i za pomocą pipety serologicznej natychmiast rozpocznij dodawanie kriodyluentu, kroplami, przy ciągłym delikatnym mieszaniu próbki, upewniając się, że do obsługi DMSO noszone są jednorazowe rękawiczki.
- Zapisz czas dodawania kriodoluentu w kolumnie P.
| Koncentracja plemników | Kriodyluent | Współczynnik rozcieńczenia (plemniki: kriodiluent) | Końcowe stężenie DMSO w próbce nasienia (%) |
| < 2 × 109/ml | 30% DMSO w FSW | 2:1 | 10% |
| ≥ 2 × 109/ml | 20% DMSO w FSW | 1:1 | 10% |
Tabela 1: Stężenie kriodyluentu i proporcje rozcieńczenia dla kriokonserwacji plemników koralowców, na podstawie oceny całkowitego stężenia plemników w próbce, która ma być kriokonserwowana.
4. Kriokonserwacja nasienia
- Przeczytaj kolumnę K, aby określić, ile kriowiali należy wypełnić. Jest ona obliczana automatycznie na podstawie całkowitej objętości plemników i pożądanej objętości na fiolkę (w większości przypadków 1 ml). Podczas 10-minutowego okresu inkubacji należy przejść przez kroki od 4.2 do 4.6.
- Odkręć sterylne kriowiale z kodami kreskowymi i umieść nakrętki na czystej/sterylnej powierzchni.
- Opcjonalnie: Napisz przebieg # na każdym kriowiale za pomocą trwałego markera; może to pomóc w szybkiej identyfikacji próbki w celu dołączenia do biobanku.
- Za pomocą pipety serologicznej i pipety do porcjowania ustawionych na żądaną objętość próbki (1 ml), podwielokrotne próbki przenosić do niezakorkowanych kriowiali z kodami kreskowymi i fiolek z kapsułkami.
- Umieścić jedną fiolkę z termoparą i wszystkie pełne fiolki z próbkami na pustym stojaku kriogenicznym w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że powierzchnia oznaczona kodem kreskowym jest skierowana na zewnątrz na wszystkich fiolkach.
- W razie potrzeby umieść dodatkowe atrapy kriowialiów zawierających 10% DMSO w FSW we wszystkich pustych miejscach na stojaku kriogenicznym, aby upewnić się, że wszystkie miejsca są zajęte.
- Wprowadź numer uruchomienia do automatycznego arkusza danych (kolumna U) i zeskanuj numer seryjny stojaka kriogenicznego (kod QR) w kolumnie V.
- Umieść kursor w odpowiedniej komórce kolumny Z i zeskanuj fiolkę z termoparą, a następnie wszystkie probówki kriowialne, które są załadowane na stojak (kolumna AA i kolejne). Należy unikać przechylania stojaka na bok, aby upewnić się, że próbka nie dostanie się do gwintu fiolki.
- Podczas skanowania sprawdź, czy dane są wprowadzane do właściwej komórki i czy wszystkie kriowiale zostały zeskanowane raz.
- Odłożyć załadowane i zeskanowane stojaki na pozostałą część okresu równowagi krioprotektantu i przygotować naczynie chłodzące do kriokonserwacji.
- Napełnij naczynie chłodzące kriostojak ciekłym azotem do odpowiedniego, z góry ustalonego poziomu niezbędnego do chłodzenia w temperaturze około −20 °C/min.
UWAGA: Azot należy stosować tylko w dobrze wentylowanych pomieszczeniach, ponieważ istnieje ryzyko uduszenia. Podczas pracy z ciekłym azotem należy nosić obuwie z zakrytymi palcami, okulary ochronne/osłony twarzy i rękawice kriogeniczne. Szczegółowe informacje na temat obchodzenia się z ciekłym azotem i jego stosowania można znaleźć w wytycznych instytucjonalnych. - Pod koniec 10-minutowego okresu równoważenia krioprotektantu podłącz sondę termopary do rejestratora danych i rozpocznij nagrywanie, a następnie delikatnie umieść pełny stojak kriogeniczny w naczyniu chłodzącym i załóż pokrywkę.
- Zapisz czas rozpoczęcia w kolumnie Q.
- Gdy fiolka z termoparą wskaże na rejestratorze -80 °C lub mniej, schłodzić próbki w ciekłym azocie, przenosząc wkładkę kriogeniczną do kąpieli z ciekłym azotem w oddzielnym naczyniu, takim jak pudełko polistyrenowe.
- Wyjmij kriowiale ze stojaka i przenieś je do suchego transportera w celu przetransportowania do biorepozytorium.
Wyniki
Kroki przedstawione w niniejszym protokole opierają się na oryginalnych metodach krio konserwacji plemników koralowców opisanych przez Hagedorn et al.4 oraz późniejszych udoskonaleniach wprowadzonych przez Zuchowicz et al.6, wprowadzając kluczowe ulepszenia zwiększające efektywność przetwarzania plemników na potrzeby krio konserwacji i biobankowania. Zastosowanie krio probówek z kodami kreskowymi oraz automatycznej pipety do rozdzielania próbek upraszcza procedurę pakowania plemników, eliminując konieczność drukowania i ręcznego etykietowania probówek, a także zmniejsza obciążenie związane z ręcznym pipetowaniem dużej liczby próbek. Co istotne, usprawnienia te skracają również czas potrzebny na przygotowanie próbek do krio konserwacji z około 8-10 min do mniej niż 5 min. W połączeniu z wykorzystaniem systemu CASA ulepszenia te zmniejszają liczbę personelu wymaganego do efektywnego biobankowania plemników koralowców z 4-6 osób w oryginalnych metodach do zaledwie dwóch osób przy zastosowaniu obecnego protokołu. Ponadto użycie krio probówek z kodami kreskowymi oznacza, że każda probówka posiada unikalny identyfikator, dzięki czemu każda z nich może być śledzona w bazie danych z większą precyzją niż w poprzedniej metodzie z wykorzystaniem etykiet drukowanych partiami.
Testy terenowe protokołu przeprowadzone podczas dwóch zdarzeń tarła w sezonie tarła na Wielkiej Rafie Barierowej w Australii w 2022 roku doprowadziły do kriokonserwacji i biobankowania 389 próbek z 57 kolonii 5 gatunków przez dwóch operatorów (jedna osoba odpowiedzialna za CASA, jedna osoba za kriokonserwację), przy wsparciu jednej dodatkowej osoby pomagającej w rozdzielaniu wiązek i separacji plemników w razie potrzeby. Podczas zdarzenia tarła w listopadzie 2022 roku na Konomie (wyspa North Keppel) w Queensland w Australii, dwóch operatorów w ciągu 2 h poddało kriokonserwacji 150 próbek z 24 kolonii Acropora millepora. Wydajne przetwarzanie i kriokonserwacja tak dużego wolumenu próbek pochodzących z tak licznych kolonii koralowców były możliwe przede wszystkim dzięki skróceniu czasu przygotowania próbek oraz uproszczeniu transferu metadanych między stanowiskami pracy.
Dalsze testowanie procedury podczas tarła w grudniu 2023 roku wykazało, że w przypadku plemników koralowców komora licznikowa Maklera zapewnia dokładniejsze dane dotyczące ruchliwości i stężenia w porównaniu do dostępnych komercyjnie jednorazowych szkiełek z mocowaną przykrywką, powszechnie stosowanych w systemach CASA. Komora licznikowa Maklera została zwalidowana dla systemu CASA przy użyciu dostępnych komercyjnie lateksowych mikrokulek o znanym stężeniu, z objętością próbki 4 µL i standardowymi ustawieniami CASA17 stosowanymi dla plemników koralowców. Analizy te wykazały spójne wyniki z niską zmiennością (44,5 ± 0,7 milion/mL), które mieściły się w oczekiwanym zakresie stężeń (46,0 ± 7,0 milion/mL) podanym przez producenta (Rycina 2). Porównanie danych CASA dla Acropora millepora zebranych przy użyciu komory licznikowej Maklera oraz szkiełek z mocowaną przykrywką wykazało istotną różnicę w liczbie stężeń plemników między tymi dwoma typami komór (P = 0,002; Rycina 2), przy czym szkiełka z mocowaną przykrywką rejestrowały mniej niż połowę stężenia określonego za pomocą komory licznikowej Maklera. Tendencję tę zaobserwowano również w próbkach plemników dwóch innych gatunków koralowców (dane nieprzedstawione). Testy przeprowadzone w grudniu 2023 roku nie wykazały również istotnych różnic w stężeniach po rozmrożeniu plemników całkowitych, ruchliwych lub progresywnie ruchliwych w próbkach kriokonserwowanych przy użyciu rozcieńczenia 1:1 z 20% DMSO lub rozcieńczenia 1:2 (plemniki: kriorozcieńczalnik) z 30% DMSO (Rycina 3).
Rycina 1: Schemat przepływu pracy stosowany do półautomatycznej obróbki plemników koralowców w celu kriosprzechowywania oraz przykłady mobilnego sprzętu używanego w terenie. (A) Pakiety gamet koralowców są zbierane w stosunku 5 mL pakietów na 5 mL FSW i rozbijane w celu oddzielenia komórek jajowych od plemników (i). Metadane kolonii są wprowadzane do automatycznego arkusza danych (ii), a wyizolowana próbka plemników jest oceniana przy użyciu komputerowej analizy plemników (CASA) (iii). Parametry jakości plemników są dodawane do automatycznego arkusza danych w celu obliczenia ilości dodanego 20% lub 30% DMSO w FSW (iv), a rozcieńczona próbka jest rozdzielana do probówek kriogenicznych z kodami kreskowymi (v). Probówki kriogeniczne są umieszczane w statywie kriogenicznym i skanowane do automatycznego arkusza danych (vi), a następnie schładzane z prędkością −20 °C/min do −80 °C (vii). Próbki są następnie gwałtownie schładzane w ciekłym azocie i przenoszone do suchych pojemników transportowych w celu przekazania do Taronga CryoDiversity Bank (viii). (B) Przykład stacji CASA (po lewej) i stacji kriosprzechowywania (po prawej) ustawionych w odległym punkcie terenowym w sali lekcyjnej w Konomie Environmental Education Centre. (C) Przykład laboratoryjnej, wysokowydajnej stacji kriosprzechowywania skonfigurowanej do obsługi wielu statywów kriogenicznych w Australian Institute of Marine Science National Sea Simulator. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 2: Porównanie dwóch różnych opcji szkiełek z komorą do pomiaru stężenia plemników koralowca. (A) Porównanie pomiarów całkowitego stężenia plemników u Acropora millepora (n = 3 osobniki) przy użyciu komory licznej Maklera oraz dostępnych komercyjnie szkiełek z komorą o stałej grubości. Kolumny przedstawiają średnią ± SEM; gwiazdki oznaczają istotną różnicę (P = 0,002). (B) Walidacja komory licznej Maklera przy użyciu dostępnych komercyjnie lateksowych mikrokulek o znanym stężeniu i standardowych ustawieniach CASA dla plemników koralowców. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Stężenia całkowitej liczby plemników, plemników ruchliwych lub plemników o ruchliwości progresywnej w próbkach po rozmrożeniu. Porównanie stężeń całkowitej liczby plemników, plemników ruchliwych i plemników o ruchliwości progresywnej po rozmrożeniu w zależności od zastosowania 20% lub 30% DMSO w FSW w celu uzyskania końcowego stężenia 10% DMSO do krio konserwacji. Próbki od n = 3 osobników podzielono na 2 aliquoty, z czego jeden aliquot krio konserwowano z dodatkiem 20% DMSO w stosunku 1:1, a drugi aliquot rozcieńczono do <2 × 109/mL za pomocą FSW i krio konserwowano z dodatkiem 30% DMSO w stosunku 1:2 (plemniki: krio rozcieńczalnik). Słupki przedstawiają średnią ± SEM. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Plik uzupełniający 1: Plik automatycznego arkusza danych dla biobankowania koralowców. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Półautomatyczna ścieżka przetwarzania opisana w tym protokole pozwala na wydajne przetwarzanie i krioprezerwację plemników koralowców w celu zabezpieczenia genetyki przed zagrożonymi gatunkami oraz wsparcia wysiłków na rzecz odbudowy rafy i adaptacji. Motywacją do opracowania tego protokołu był brak istniejących systemów dostosowanych do wymagań przepustowości kriokonserwacji plemników koralowców i stosowania kriotechnik, ponieważ wysokowydajne systemy przetwarzania krioprezerwacji nasienia są zwykle oparte na pakowaniu próbek w słomki francuskie o pojemności 0,25 ml lub 0,5 ml21,22. Dla porównania, kriofiale są na ogół albo używane na małą skalę do przetwarzania o niskiej przepustowości (np. kriokonserwacja próbek laboratoryjnych do badań23,24), albo w wysokoprzepustowych systemach przetwarzania próbek masowych przy użyciu drogiego, nieprzenośnego sprzętu (np. przetwarzanie kultur komórkowych dla przemysłu18,25). Zbadaliśmy również potencjał zastosowania systemu automatycznego usuwania nasadek kriowialnych w celu usprawnienia usuwania i wymiany nasadek kriowialnych, ale systemy były dostępne tylko dla pojedynczych kriowialiów lub całych stojaków kriowialnych, więc nie stanowiły opłacalnego rozwiązania. Obecnie na całym świecie istnieje kilka grup, które korzystają z protokołu kriokonserwacji opracowanego przez Hagedorna i wsp.4 w celu zabezpieczenia różnorodności genetycznej koralowców i ważne jest, aby prace te były kontynuowane na większej liczbie raf na całym świecie. W związku z tym, głównym czynnikiem branym pod uwagę przy opracowywaniu obecnego protokołu była potrzeba wykorzystania opłacalnych i dostępnych technologii, które mogłyby być łatwo wdrożone przez te inne grupy i które nie byłyby zbyt kosztowne dla nowych grup chcących rozpocząć krioprezerwację plemników koralowców.
Kluczowym elementem opisywanego protokołu jest ulepszona obsługa przykładowych metadanych za pośrednictwem połączonych arkuszy kalkulacyjnych w programie Microsoft Excel. Wprowadzanie danych jest na ogół proste, ale należy zauważyć, że edycja informacji w automatycznych arkuszach danych powinna odbywać się tylko poprzez usuwanie i ponowne wprowadzanie informacji, ponieważ szybkie funkcje (np. Ctrl + C, Ctrl + V) do edycji danych mogą potencjalnie wpłynąć na jednoczesne wprowadzanie danych przez innych użytkowników i mogą powodować problemy z łączeniem danych między arkuszami kalkulacyjnymi. Ważnym składnikiem metadanych jest niepowtarzalny identyfikator (tj. identyfikator kolonii), który jest powiązany z kolonią dawcy i który jest dołączany do próbki na wszystkich etapach ścieżki przetwarzania. Istotne jest, aby probówki z próbkami były wyraźnie oznaczone identyfikatorem kolonii w momencie pobierania wiązki oraz aby informacje te były dokładnie przepisywane na wszystkie nowe probówki, do których próbka jest przenoszona podczas przygotowania (np. podczas filtrowania w celu oddzielenia komórek jajowych i plemników lub w celu dodania kriodiluentu). Chociaż protokół umożliwia automatyczne przesyłanie informacji o jakości próbki od operatora CASA do stacji roboczej kriokonserwacji, problemy mogą wystąpić, gdy zasięg Internetu lub Wi-Fi jest słaby. W przypadku wystąpienia opóźnień w przesyłaniu danych zaleca się, aby obie stacje robocze pracowały w trybie offline i utrzymywały oddzielne automatyczne arkusze danych, które można później uzgodnić. Kluczowymi informacjami wymaganymi przez operatora kriokonserwacji są identyfikator kolonii i stężenie próbki, dlatego zaleca się, aby operator CASA zapisał stężenie próbki na probówce z próbką jako kopię zapasową, aby zapewnić, że informacje te są pod ręką do przygotowania do kriokonserwacji, jeśli wystąpi opóźnienie w przesyłaniu lub pobieraniu metadanych między komputerami.
Wybór skanera kodów kreskowych i kriowialiów z kodami kreskowymi używanych w tym protokole może być zróżnicowany w zależności od budżetu i dostępności produktu; Jest jednak kilka kluczowych elementów, które należy wziąć pod uwagę przy ich doborze. Skaner kodów kreskowych powinien mieć możliwość dostosowania ustawień, w szczególności możliwość zmiany specyfikacji wprowadzania danych i kierunku wprowadzania danych. Automatyczne arkusze danych używane w tym protokole wykorzystują wprowadzanie poziome, ale w niektórych przypadkach (np. przystąpienie do biobanku lub do innych zastosowań laboratoryjnych) może być wymagane wejście pionowe, dlatego ważne jest, aby tę funkcję można było dostosować. Chociaż protokół może być używany zarówno z kodami kreskowymi 1D, jak i 2D, zaleca się, aby wybrane kriowiale miały komponent czytelny dla człowieka (np. kody kreskowe 1D zazwyczaj zawierają unikalny numer), aby umożliwić kontrolę krzyżową wprowadzania próbki podczas krioprezerwacji. Oprócz wprowadzania próbek, skaner kodów kreskowych może być używany do automatyzacji wprowadzania niektórych pól metadanych poprzez tworzenie i drukowanie kodów QR dla informacji, które powtarzają się w próbkach (np. nazwy gatunków, daty i lokalizacje raf) przed tarłem. Informacje te można następnie szybko i łatwo wprowadzić do automatycznych arkuszy danych poprzez zeskanowanie za pomocą skanera kodów kreskowych. Co więcej, poprzez dołączenie kodów kreskowych z numerami seryjnymi do każdego stojaka kriogenicznego i sondy termopary, możliwe jest również powiązanie każdej serii kriokonserwacji z określonym zestawem urządzeń w bazie danych, co jest przydatne do kontroli jakości i identyfikacji komponentów wymagających naprawy lub wymiany.
Czynnikami ograniczającymi w przetwarzaniu są często czas spędzony na oczekiwaniu na rozpad wiązek oraz czas potrzebny na przefiltrowanie i oddzielenie plemników od komórek jajowych przed CASA i krioprezerwacją. Tam, gdzie to możliwe, zaleca się przetwarzanie próbek w kolejności, w jakiej wiązki się rozpadają; Dalszy wzrost wydajności można jednak osiągnąć dzięki strategicznemu zarządzaniu zamówieniami przetwarzania próbek. Na przykład, jeśli w jednej kolonii znajduje się 5 lub mniej kriowialiów ze względu na małą objętość próbki (tj. mniej niż 3 ml plemników na kolonię) lub niskie stężenie plemników wymagające rozcieńczenia kriodyluentem w stosunku 2:1 (tj. mniej niż 2 × 109/ml), lepiej jest dodać kriodyluent do dwóch próbek kolonii w tym samym czasie, aby można je było uruchomić razem na tym samym stojaku kriogenicznym (całkowita liczba dostępnych # slotów = 11), zamiast uruchamiać je osobno z manekinami wypełniającymi puste miejsca. Dodatkowo możliwe jest jednoczesne uruchamianie wielu stojaków kriogenicznych (dla próbek o objętości >6 ml) pod warunkiem, że zadba się o to, aby wszystkie procesy mogły zostać zakończone w ciągu 10-minutowego czasu równoważenia kriodoiluentu, co może jeszcze bardziej zwiększyć przepustowość próbki. Jednak w przypadku uruchamiania wielu stojaków kriogenicznych lub łączenia wielu kolonii na jednym stojaku kriogenicznym należy zadbać o to, aby metadane kriokonserwacji były przypisane do właściwej próbki w automatycznym arkuszu danych, zwłaszcza jeśli próbki są kriokonserwowane w innej kolejności niż ich ocena CASA.
Oprócz opracowania półautomatycznego przepływu pracy, niniejszy opis protokołu zawiera również dwa porównania metodologiczne związane z koncentracją plemników, które mają na celu poprawę wyników analizy nasienia i kriokonserwacji. Ogólnie rzecz biorąc, zebranie 5 ml wiązek gamet w porównaniu z 5 ml wody morskiej (całkowita objętość 10 ml) spowoduje stężenie plemników na poziomie lub wyższym niż 2 × 109 komórek/ml, ale zdarzają się sytuacje, w których stężenie plemników może być niższe z powodu różnic gatunkowych lub rozpadu wiązek podczas pobierania. Zastosowanie kriodiluentu DMSO o wyższym stężeniu (30% v/v) zmniejsza ilość, o jaką rozcieńcza się plemniki, aby zminimalizować różnice w stężeniu plemników w kriowiale między partiami. Co ważne, zastosowanie 30% DMSO do osiągnięcia końcowego stężenia DMSO nie wpływa na parametry stężenia ani ruchliwości po rozmrożeniu, jak pokazują reprezentatywne dane na rysunku 3. Drugie porównanie metodologiczne stanowi alternatywę dla jednorazowych szkiełek nakrywkowych ze stałą komorą nakrywkową zwykle stosowanych w CASA. Głównym wyzwaniem związanym z używaniem dostępnych na rynku szkiełek do analizy plemników koralowców jest to, że mogą one wpływać na dokładność oceny ruchliwości ze względu na przyklejanie się plemników do powłoki szkiełka. Zastosowanie rozwiązania aktywacyjnego rozwiązuje ten problem w wielu, ale nie we wszystkich próbkach, dlatego nadal zaleca się wykonanie oddzielnej analizy CASA pod kątem ruchliwości przy użyciu zwykłego szkiełka, aby zapewnić niezawodność i spójność. Zastosowanie komory liczącej Maklera eliminuje konieczność oddzielnej analizy stężenia i ruchliwości oraz potencjalnie poprawia dokładność pomiarów stężenia (rysunek 2), dlatego zaleca się stosowanie jej z obecnym protokołem. Biorąc pod uwagę tę rozbieżność w pomiarach stężenia, o której informowano wcześniej20, ważne jest, aby zawsze zapisywać szczegóły preparatu w bazie danych wraz z danymi dotyczącymi jakości nasienia oraz, w miarę możliwości, zachować spójność w rodzaju stosowanego szkiełka komorowego, aby zminimalizować różnice między partiami i pomóc w zapewnieniu wiarygodnych obliczeń stosunku plemników do komórek jajowych do zapłodnienia.
Opisany w niniejszym dokumencie półautomatyczny proces zapewnia ustandaryzowaną i wydajną ścieżkę kriokonserwacji i biobankowania nasienia z zagrożonych gatunków koralowców przy jednoczesnym zachowaniu bezpieczeństwa biologicznego i jakości próbki. Opisany protokół jest łatwy do przeniesienia i stosunkowo niedrogi do wdrożenia w programach na całym świecie, które pracują nad zabezpieczeniem istniejącej różnorodności koralowców za pomocą krioprezerwacji, co będzie niezbędne do zapobiegania wymieraniu i maksymalizacji zasobów dostępnych dla wysiłków na rzecz odbudowy rafy teraz i w przyszłości.
Oświadczenia
Autorzy podają, że nie ma sprzecznych interesów, które można by zadeklarować.
Podziękowania
Dziękujemy Tradycyjnym Właścicielom Konomie, ludowi Woppaburra, za zgodę na wypróbowanie systemu opisanego w tym artykule podczas tarła w kraju w listopadzie 2022 roku, a także Centrum Edukacji Ekologicznej Konomie za korzystanie z ich obiektów. Chcielibyśmy również podziękować za wsparcie dla pracowników Australijskiego Instytutu Nauk o Morzu i naukowców, którzy ułatwili zbieranie i tarło kolonii w ramach Narodowego Symulatora Morskiego. Praca ta została podjęta w ramach podprogramu kriokonserwacji (RRAP-CP-01) dla Programu Odbudowy i Adaptacji Rafy, partnerstwa między Reef Trust rządu australijskiego a Fundacją Wielkiej Rafy Koralowej, przy dodatkowym wsparciu ze strony Taronga Conservation Society Australia, Taronga Conservation Science Initiative i innych filantropów wspierających Fundację Taronga.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Ovation ALI-Q 2 VS Pipette Controller - Pipeta do porcjowania | Vistalab | 2100-1005 | Obsługa płynów – pomiar objętości nasienia, dodawanie roztworu krioprotektantu, porcjowanie próbek do kriowiofiliów |
| Pipety serologiczne 5 ml (luzem) | Thermo Scientific | Nunc 170355 | Obsługa płynów – pomiar objętości nasienia, dodawanie roztworu krioprotektantu, porcjowanie próbek do kriowiofilii |
| 10 ml pipety serologiczne (luzem) | Thermo Scientific | Nunc 170356 | Postępowanie z płynami – pomiar objętości nasienia, dodawanie roztworu krioprotektantu, porcjowanie próbek do kriowiofilii |
| P2 0,2– 2 i mikro; Pipetor L | Gilson | F144054M | Przygotowanie roztworów aktywujących plemniki i obchodzenie się z próbkami nasienia do oceny stężenia i motoryki |
| P10 1– 10 &mikro; Pipetor L | Gilson | F144055M | Przygotowanie roztworów aktywujących plemniki i postępowanie z próbkami nasienia do oceny stężenia i motoryki |
| P20 2– 20 &mikro; Pipetor L | Gilson | F144056M | Przygotowanie roztworów aktywujących plemniki i postępowanie z próbkami nasienia do oceny stężenia i motoryki |
| P200 20– 200 i mikro; Pipetor L | Gilson | F144058M | Przygotowanie roztworów aktywujących plemniki i postępowanie z próbkami nasienia do oceny stężenia i motoryki |
| P1000 100– 1000 &mikro; Pipetor L | Gilson | F144059M | Przygotowanie roztworów aktywujących plemniki i postępowanie z próbkami nasienia w celu oceny koncentracji i motoryki |
| Pompa próżniowa | Millipore | WP6122050 | Przygotowanie przefiltrowanej wody morskiej do przygotowania roztworu |
| System filtracji butelkowej wielokrotnego użytku | Thermo Scientific | DS0320-5045 | Przygotowanie przefiltrowanej wody morskiej do przygotowania |
| roztworu0,22-&mikro; m Krążki filtracyjne, mieszane estry celulozy | Merck Millipore | GSWP04700 | Przygotowanie przefiltrowanej wody morskiej do przygotowania roztworu |
| Filtrowana woda morska | N/A | – | Pożywka bazowa do aktywacji plemników i roztworów krioprotekcyjnych |
| Dimetylosulfotlenek (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | Krioprotektant chemiczny stosowany w końcowym stężeniu 10% v/v w przefiltrowanej wodzie morskiej do kriokonserwacji nasienia |
| Kofeina | Sigma-Aldrich | C0750 | Służy do aktywacji ruchliwości plemników |
| Frakcja szoku cieplnego BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | Stosowany w celu zminimalizowania przylegania plemników do CASA dobrze zjeżdża |
| się z rurkami 15 ml - w stojakach | Thermo Scientific | 339651 | Przygotowanie roztworu aktywującego plemniki |
| 50 ml probówki w stojakach | Thermo Scientific | 339653 | Do pobierania wiązek gamet i przefiltrowanych próbek nasienia |
| Pipety transferowe | Thermo Scientific | Samco 202PK | Do wspomagania pobierania wiązek gamet z powierzchni wody |
| 100-&mikro; m Kosze filtracyjne | Fisher Scientific | 22363549 | Aby wykluczyć komórki jajowe podczas oddzielania próbki nasienia |
| Stojaki Eppendorf | Interpath | 511029 | Rozcieńczanie i aktywacja plemników w celu oceny koncentracji i motoryki |
| Eppendorf 1,5 ml probówka Eppendorf | 30120086 | Rozcieńczanie i aktywacja plemników w celu oceny koncentracji i motoryki | |
| Szkiełka nakrywkowe szklane 18x18 mm | Marka | 4700 45 | Ocena koncentracji i ruchliwości plemników za pomocą mikroskopii fazowej |
| Szkiełka podstawowe zwykłe, wstępnie oczyszczone, 75x25 mm | Corning | 2947 | Ocena koncentracji i ruchliwości plemników za pomocą mikroskopii fazowej |
| Hemocytometr | Hausser Scientific | 1492 | Ocena koncentracji i ruchliwości plemników za pomocą mikroskopii fazowej |
| Szkiełka podstawowe CASA (Leja 20-µ m 4 komora, SC-20-01-04-B) | IMV Technologies | 025107 | Ocena koncentracji i ruchliwości plemników za pomocą Komputerowej Analizy Wspomaganej Nasienia (CASA |
| )Komora do liczenia plemników Maklera (CASA) | IVFStore | SM-373 | Ocena koncentracji i ruchliwości plemników za pomocą Komputerowej Analizy Nasienia Wspomaganego Komputerowo (CASA) |
| Kulki do liczenia koralików accu-bead® | Hamilton-Thorne | 710111 | Ocena koncentracji i ruchliwości plemników za pomocą Komputerowej Analizy Nasienia (CASA) |
| System CASA + laptop | Hamilton Thorne | Ceros II | Ocena stężenia i ruchliwości plemników za pomocą Komputerowej Analizy Nasienia (CASA) |
| Okulary ochronne | Ogólne | – | Środki ochrony indywidualnej do stosowania podczas pracy z DMSO i ciekłym azotem |
| Fartuch laboratoryjny | Długi rękaw, na całej długości | – | Środki ochrony osobistej do stosowania podczas pracy z DMSO i ciekłym azotem |
| Rękawice kriogeniczne (para) | Tempshield | Mid-Arm | Środki ochrony osobistej do stosowania podczas pracy z DMSO i ciekłym azotem |
| Średnie kleszcze | Ogólne | – | Do usuwania kriokonserwowanych próbek ze stojaków kriogenicznych i manipulowania próbkami w ciekłym azocie |
| Skaner kodów kreskowych (kompatybilny z 2D) | Zebra | DS2278 | Do odczytu kodów kreskowych 1D i 2D na kriofiolach do zarządzania próbkami |
| Fiolka CryoStorage 2,0 mL, gwint zewnętrzny, z nakrętką, 2D SafeCode (DataMatrix/ECC200), liniowa i czytelna dla człowieka | Eppendorf | 30079434 | Kriowialne kriowialne do kriokonserwacji próbek nasienia |
| Stojak kriowialny | Simport | T315 | Stojak do przechowywania kriowialiów, z podstawą blokującą, aby umożliwić zdejmowanie i zamykanie jedną ręką |
| Stojaki do zamrażania | Niestandardowe | – | System kriokonserwacji zaprojektowany specjalnie dla plemników koralowców, wykorzystujący wydrukowane w 3D i łatwo dostępne komponenty. Lista części i instrukcja montażu są dostępne w Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005) |
| Pokrywa stojaka do zamrażania | Custom | – | System kriokonserwacji zaprojektowany specjalnie dla plemników koralowców, wykorzystujący wydrukowane w 3D i łatwo dostępne komponenty. Lista części i instrukcja montażu są dostępne w Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005) |
| Termos zamrażający – 1,5 litra 18/8 Dwuścienny próżniowy pojemnik na żywność ze stali nierdzewnej | Isosteel | VA-9683 | System kriokonserwacji zaprojektowany specjalnie dla plemników koralowców, wykorzystujący wydrukowane w 3D i łatwo dostępne komponenty. Lista części i instrukcja montażu są dostępne w Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005) |
| Zegary laboratoryjne | Generic | – | Do pomiaru czasu równoważenia krioprotektantu przed kriokonserwacją |
| Kąpiel azotowa 9L | BelArt | M16807-9104 | Do hartowania próbek podczas kriokonserwacji i przetrzymywania próbek podczas sortowania i przenoszenia |
| Rejestrator danych termopary - wielokanałowy | Omega | HH520 | Monitorowanie temperatury podczas kriokonserwacji w celu określenia szybkości zamarzania i punktu końcowego |
| Sonda termopary – Typ K | Omega | 5SC-TT-K-30-36 | Monitorowanie temperatury podczas kriokonserwacji w celu określenia szybkości zamarzania i punktu końcowego |
| Długopisy kriogeniczne/kolorowe długopisy | stałe Staedtler Lumocolor | 318 | Opcjonalnie do znakowania pokryw kriowialnych w celu pomocy w zarządzaniu próbkami |
| Dry Shipper - ładowany | Taylor Wharton | CXR100 lub CX500 | Do przenoszenia kriokonserwowanych próbek z terenów/miejsc zbiórki do biorepozytorium dla składowanie |
Bibliografia
- Eakin, C. M., Sweatman, H. P. A., Brainard, R. E. The 2014-2017 global-scale coral bleaching event: Insights and impacts. Coral Reefs. 38 (4), 539-545 (2019).
- Anthony, K., et al. New interventions are needed to save coral reefs. Nature Ecology & Evolution. 1 (10), 1-3 (2017).
- Wildt, D. E. Genome resource banking for wildlife research, management, and conservation. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 41 (4), 228-234 (2000).
- Hagedorn, M., et al. Preserving and using germplasm and dissociated embryonic cells for conserving Caribbean and Pacific coral. PLoS ONE. 7 (3), e33354(2012).
- Hagedorn, M., et al. First frozen repository for the Great Barrier Reef coral created. Cryobiology. 65 (2), 157-158 (2012).
- Zuchowicz, N., Daly, J., Lager, C., Williamson, O., Hagedorn, M. Freezing on the beach: A robust coral sperm cryopreservation design. Cryobiology. 101, 135-139 (2021).
- Hobbs, R. J., et al. A decade of coral biobanking science in Australia - transitioning into applied reef restoration. Frontiers in Marine Science. , 9(2022).
- Daly, J., et al. Cryopreservation can assist gene flow on the Great Barrier Reef. Coral Reefs. 41, 455-462 (2022).
- Hagedorn, M., et al. Assisted gene flow using cryopreserved sperm in critically endangered coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (38), e2110559118(2021).
- Daly, J., et al. Successful cryopreservation of coral larvae using vitrification and laser warming. Scientific Reports. 8, 1-10 (2018).
- Daly, J., et al. The first proof of concept demonstration of nanowarming in coral tissue. Advanced Sustainable Systems. , (2023).
- Powell-Palm, M. J., et al. Cryopreservation and revival of Hawaiian stony corals via isochoric vitrification. Nature Communications. 14, 4859(2023).
- Reef Restoration and Adaptation Program. , Available from: https://gbrrestoration.org (2023).
- Florida Coral Rescue. , Available from: https://myfwc.com/research/habitat/coral/disease/rescue (2023).
- Harrison, P. L. Coral reefs: An ecosystem in transition. , Chapter 6 59-85 (2011).
- Hagedorn, M., Carter, V. L. Cryobiology: Principles, species conservation and benefits for coral reefs. Reproduction, Fertility and Development. 28 (8), 1049(2016).
- Zuchowicz, N., et al. Assessing coral sperm motility. Scientific Reports. 11, 61(2021).
- Thomas, D. Evaluation of an automated cryovial dispensing system for cell banking. Genetic Engineering & Biotechnology News. 37 (17), 22-23 (2017).
- Coral cryopreservation training course. , Available from: https://nationalzoo.si.edu/center-for-species-survival/coral-cryopreservation-training-course (2023).
- Bailey, E., et al. Validation of sperm counting methods using limits of agreement. Journal of Andrology. 28 (3), 364-373 (2007).
- Hu, E., Yang, H., Tiersch, T. R. High-throughput cryopreservation of spermatozoa of blue catfish (Ictalurus furcatus): Establishment of an approach for commercial-scale processing. Cryobiology. 62 (1), 74-82 (2011).
- Pickett, B. W., Berndtson, W. E. Preservation of bovine spermatozoa by freezing in straws: A review. Journal of Dairy Science. 57 (11), 1287-1308 (1974).
- Westbrook, C. E., Daly, J., Bowen, B., Hagedorn, M. Cryopreservation of the collector urchin embryo, Tripneustes gratilla. Cryobiology. 15, 104865(2024).
- Maria, A. N., et al. Use of cryotubes for the cryopreservation of Tambaqui fish semen (Colossoma macropomum). Cryobiology. 70 (2), 109-114 (2015).
- Fuchs, Y. F., et al. Next-generation biobanking: Employing a robotic system for automated mononuclear cell isolation. Biopreservation & Biobanking. 21 (1), 106-110 (2023).
Przedruki i uprawnienia
