Optymalizacja wizualizacji transportu aksonalnego ładunków endogennych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej u żywych Caenorhabditis elegans

Summary

Artykuł opisuje optymalizację parametrów akwizycji mikroskopii fluorescencyjnej w celu wizualizacji aksonalnego transportu endogennych znakowanych ładunków w rozdzielczości pojedynczego neuronu u żywego nicienia.

Abstract

Transport aksonalny jest warunkiem koniecznym do dostarczenia białek aksonalnych z miejsca ich syntezy w ciele komórki neuronalnej do miejsca przeznaczenia w aksonie. W konsekwencji utrata transportu aksonalnego upośledza wzrost i funkcję neuronów. Badanie transportu aksonalnego poprawia zatem naszą wiedzę na temat biologii komórek neuronalnych. Dzięki niedawnym ulepszeniom w edycji genomu CRISPR Cas9, endogenne znakowanie ładunków aksonalnych stało się dostępne, umożliwiając wyjście poza ektopową wizualizację transportu opartą na ekspresji. Jednak etykietowanie endogeniczne często odbywa się kosztem niskiej intensywności sygnału i wymaga strategii optymalizacji w celu uzyskania wiarygodnych danych. W tym miejscu opisujemy protokół optymalizujący wizualizację transportu aksonalnego poprzez omówienie parametrów akwizycji i podejścia wybielającego w celu poprawy sygnału endogennego znakowanego ładunku na rozproszonym tle cytoplazmatycznym. Stosujemy nasz protokół, aby zoptymalizować wizualizację prekursorów pęcherzyków synaptycznych (SVP) znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) RAB-3, aby podkreślić, w jaki sposób precyzyjne dostrojenie parametrów aksonalnych może poprawić analizę endogennie znakowanego ładunku aksonalnego w Caenorhabditis elegans (C. elegans).

Introduction

Przez całe życie, neurony polegają na transporcie aksonalnym, aby dostarczyć białka, lipidy i inne cząsteczki z ciała komórki do ich miejsca docelowego w aksonie. W związku z tym upośledzenie transportu aksonalnego wiąże się z utratą funkcji neuronów i często bierze udział w patologii zaburzeń neurodegeneracyjnych^1,2. W związku z tym zrozumienie mechanizmów, które leżą u podstaw transportu aksonalnego, jest bardzo interesujące.

Kilka dekad badań nad transportem aksonalnym ujawniło wiele ważnych informacji na temat molekularnej maszynerii, która pośredniczy w tym transporcie, ich składu, a także mechanizmów regulacyjnych. Transport aksonalny dalekiego zasięgu zachodzi w cytoszkielecie mikrotubul, który składa się z częściowo nakładających się na siebie polimerów mikrotubul, które są zwykle zorientowane z plusem końcem na zewnątrz w aksonach³. W związku z tym w transporcie następczym pośredniczą białka motoryczne, które idą do dodatniego końca mikrotubul, kinezyny, podczas gdy transport wsteczny zależy od silnika dyneiny skierowanego na koniec ujemny. Chociaż ujawniono wiele aspektów transportu, w przypadku wielu białek aksonalnych nadal pozostaje niejasne, w jaki sposób są one ładowane do maszyn transportowych, jak zorganizowane są poszczególne pakiety transportowe i jak ten transport jest regulowany³.

Transport aksonalny był początkowo badany w eksperymentach radioznakowania, w których znakowane radioaktywnie aminokwasy były wstrzykiwane do przedziału somatycznego, gdzie były włączane do powstających białek endogennych i mogły być śledzone w czasie w przedziale aksonalnym za pomocą autoradiografii⁴. Chociaż eksperymenty ze znakowaniem radioaktywnym pozwoliły na badanie transportu aksonalnego białek endogennych in vivo, nie pozwalają na bezpośrednie śledzenie zachowania poszczególnych ładunków w celu uzyskania mechanistycznych wglądów⁴. Ograniczenie to udało się przezwyciężyć dzięki zastosowaniu mikroskopii fluorescencyjnej. Jednak transport aksonalny często nie jest wizualizowany na endogennych białkach, ale zamiast tego przez ekspresję fluorescencyjnie znakowanej kopii. Szczególnie w przypadku białek o niskiej ekspresji, nadekspresja zapewnia wyższe natężenia sygnału, co umożliwia wizualizację, najlepiej z rozdzielczością pojedynczego neuronu. Co więcej, ektopowa ekspresja białka znakowanego fluorescencyjnie pozwala uniknąć potrzeby i wyzwań związanych z edycją genomu. Z drugiej strony, argumentowano, że zachowanie ładunku wyrażonego ektopowo może różnić się od zachowania endogennego ładunku ⁵.

Ostatnie ulepszenia w edycji genomu ułatwiły dostęp do endogennych strategii znakowania. W związku z tym niższa intensywność sygnału stała się głównym ograniczeniem w badaniu transportu aksonalnego ładunku przez ekspresję ektopową zamiast znakowania endogennego. Staranne rozważenie strategii etykietowania endogenicznego w połączeniu z optymalizacją warunków akwizycji może przezwyciężyć to wyzwanie.

Nicienie stanowią doskonały model badawczy do badania transportu aksonalnego in vivo, ze względu na ich przejrzystość i łatwość manipulacji genetycznych. W tym protokole opisujemy strategię badawczą mającą na celu wizualizację transportu aksonalnego białek endogennych z rozdzielczością pojedynczego neuronu u żywych Caenorhabditis elegans. Wizualizujemy transport aksonalny prekursorów pęcherzyków synaptycznych za pomocą szczepu generowanego przez Jorgensen Lab⁶, w którym GTPaza RAB związana z pęcherzykami, RAB3, jest endogennie znakowana GFP w neuronie ruchowym DA9. Pytając, w jaki sposób małe adaptacje różnych parametrów akwizycji i fotowybielania mogą poprawić wizualizację poszczególnych zdarzeń transportowych, protokół dostarcza pomysłów na optymalizację warunków obrazowania.

Protocol

Szczegółowy protokół dotyczący konserwacji i przygotowania nicieni do obrazowania żywych komórek znajduje się w pracy S.Niwa ⁷.

1. Generowanie szczepów robaków

Oprócz generowania szczepów nicieni, Caenorhabditis Genetics Center (CGC)⁸ zawiera rosnącą kolekcję szczepów nicieni z endogennie fluorescencyjnie znakowanymi białkami, które można uzyskać bezpośrednio z ich strony internetowej.

1. Wybór strategii znakowania fluorescencyjnego
   1. Użyj szczepu nicienia MTS1161, który zawiera allel rab-3 (ox699) ⁶, aby uwidocznić endogenny GFP oznaczony RAB-3 w neuronze ruchowym DA9 (szczep zostanie zdeponowany w CGC). Aby zobrazować inne białka aksonalne, wygeneruj szczep nicieni z endogennym oznakowanym białkiem, korzystając z protokołu edycji CRISPR Cas9 z Mello Lab⁹.
      UWAGA: MTS1161 wykorzystuje podejście rekombinacyjne do specyficznego endogennego znakowania komórki RAB-3 za pomocą znacznika GFP⁶. Powszechne alternatywne podejście opiera się na odtworzeniu białka fluorescencyjnego z podziałem, co jest zalecane dla białek o szczególnie niskiej ekspresji, ponieważ zwiększa liczbę kopii fluorescencyjnych na białko endogenne poprzez użycie wielu podzielonych kopii fluorescencyjnych¹⁰. Liczbę kopii można początkowo oszacować na podstawie zestawów danych transkryptomu ze strony internetowej CenGen (https://cengen.shinyapps.io/CengenApp/) ¹¹.
2. Wybór neuronu do wizualizacji transportu aksonalnego
   1. W MTS1161 szczepu wizualizuj RAB-3 w neuronie ruchowym DA9 (patrz Rysunek 1). W przypadku innych ładunków aksonalnych, zwłaszcza białek o niskiej ekspresji, zidentyfikuj neuron, w którym poziomy ekspresji analizowanego białka są najwyższe, korzystając ze strony internetowej CenGen.
      UWAGA: Projekt CenGen (cengen.org) stanowi doskonałe źródło informacji online do oszacowania poziomów ekspresji interesującego białka w wielu neuronach nicienia w oparciu o duży zestaw danych transkryptomicznych obejmujący wszystkie 302 neurony układu nerwowego C. elegans^12,13.

2. Postępowanie z robakami i przygotowanie do obrazowania

1. Nicienie należy utrzymywać na trawniku z bakteriami (szczep: OP50) wysiewanymi na płytkach pożywki wzrostowej nicieni w temperaturze 20 °C i hodowanymi do wieku 1 dnia do osiągnięcia dorosłości w celu obrazowania.
   UWAGA: Pomiar transportu aksonalnego na określonym etapie wieku jest ważny, ponieważ tempo transportu spada wraz ze starzeniem się w różnych ładunkach aksonalnych, klasach neuronów i organizmach^{14,15,16,17,18-Nicienie} w stadium larwalnym L4 lub 1 dzień po osiągnięciu dorosłości zostały wykorzystane w większości artykułów i dlatego oferują największe zestawy danych do porównań.
2. Przygotuj nicienie do obrazowania żywych komórek: Wykonaj wszystkie kolejne kroki za pomocą mikroskopu stereoskopowego, aby zwizualizować i poradzić sobie z robakami.
   1. Przenieś nicienie do kropli 0,5 mM lewamizolu za pomocą platynowego drucianego szpikulca i inkubuj nicienie przez 20 minut w kropli.
   2. Ostrożnie umieść 10-20 nicieni z kropelki lewamizolu w 12 μl kropli pożywki M9 na 10% agarozowym (rozpuszczonym w pożywce M9) plastrze na szkiełku podstawowym za pomocą wykałaczki do włosów. Szczegółowa procedura przygotowania plastra z 10% agarozy znajduje się w protokole S.Niwa⁷.
      UWAGA: Zamontowanie małej liczby nicieni jest wystarczające, ponieważ tylko kilka zwierząt zostanie zobrazowanych na szkiełku, zanim zwierzęta zaczną cierpieć z powodu niedotlenienia.
   3. Umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu kropli (22 mm x 22 mm lub 18 mm x 18 mm). W celu transportu obrazowania w aksonie DA9 należy umieścić akson blisko szkiełka nakrywkowego. W tym celu należy obrócić szkiełko nakrywkowe o 45° po umieszczeniu go na wierzchu plastra agarowego, aby przetoczyć zwierzęta na plecy.
   4. Uszczelnij przestrzeń między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem podstawowym lepkim żelem, takim jak wazelina. Zapobiegnie to wysychaniu plastra agarozy, co może spowodować dryfowanie nicieni poza pole obrazowania.
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby obchodzić się ze zwierzętami tak delikatnie, jak to możliwe. Zbyt wysokie stężenie lewamizolu lub fizyczne uszkodzenie robaka może upośledzać transport aksonalny. Łagodne drgania ogona podczas sesji obrazowania są dobrym znakiem, że zwierzę pozostaje w dobrym stanie. Zwierzęta pozostają zdrowe i mogą nawet wyzdrowieć z plastra agarozowego po sesji obrazowania.

3. Mikroskopia żywych komórek

UWAGA: Dokładne wartości parametrów akwizycji mogą się różnić między mikroskopami. Jednak trendy dla każdego parametru akwizycji powinny być niezależne od użytego mikroskopu. W tym protokole zastosowano mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem, który był wyposażony w oddzielną linię laserową do wybielania (szczegółowe informacje na temat mikroskopu znajdują się w Tabeli materiałów). Zielona fluorescencja była wzbudzana przez laser o długości fali 488 nm, a emisja była filtrowana przez filtr emisyjny ET525/36. Wybielanie wykonano za pomocą linii laserowej o długości fali 488 nm.

1. Upewnij się, że temperatura w pomieszczeniu lub, jeśli dostępna jest kontrolowana temperatura, jest ustawiona na stałą temperaturę. W przypadku nicieni ustaw temperaturę na 20 °C.
2. Zamontuj szkiełko i użyj soczewki obiektywu o powiększeniu 4x-20x, aby zlokalizować nicienie na szkiełku i zapamiętać pozycje. Przełącz się na obiektyw o powiększeniu 63x, aby uzyskać obraz.
3. Zrób pojedynczy obraz, aby sprawdzić początkowe parametry akwizycji. Śledź intensywność sygnału w polu widzenia za pomocą histogramu intensywności oprogramowania do akwizycji. Wartości intensywności powinny obejmować najniższą trzecią część maksymalnego sygnału, który kamera może wykryć. Unikaj nasycenia pikseli. Zwiększ intensywność lasera wzbudzającego, jeśli natężenie sygnału jest zbyt niskie.
   UWAGA: Nie używaj lasera o zbyt dużej intensywności wzbudzenia, ponieważ wybiela on białko fluorescencyjne podczas filmu poklatkowego.
4. Zmień parametr akwizycji i kroki tutaj, aby zoptymalizować wykrywanie sygnału fluorescencji.
   1. Realizacja etapu wybielania: Wybielanie obszaru aksonu, który ma być analizowany za pomocą linii lasera 488 nm (moc: 15 mW) dla etapu bielenia. Dąż do skuteczności wybielania na poziomie co najmniej 90%. Określ skuteczność wybielania, porównując intensywność sygnału w regionie przed i po etapie wybielania.
      UWAGA: Bielenie wzmacnia sygnał poruszających się cząstek poprzez obniżenie sygnału pochodzącego z cząstek stacjonarnych, a także z sygnału pochodzącego z frakcji cytoplazmatycznej białka w tle. Ładunek błoniasty, taki jak RAB-3 na prekursorach pęcherzyków synaptycznych, ma niską frakcję cytoplazmatyczną, tak że etap bielenia tylko nieznacznie poprawia sygnał pakietu transportowego na tle cytoplazmatycznym (Figura 2A, D). Jednak bielenie poprawia śledzenie poszczególnych zdarzeń transportowych na większe odległości i umożliwia ilościowe określenie czasów pauzy (Rysunek 2A).
   2. Binning: Użyj kategoryzacji 2 x 2, aby zwiększyć intensywność sygnału poszczególnych zdarzeń transportowych. Binning łączy tablice pikseli w jeden większy piksel. Zmniejszy to rozdzielczość przestrzenną, ale zwiększy intensywność sygnału poszczególnych zdarzeń transportowych i jest szczególnie pomocne w przypadku cząstek przyciemnionych (Rysunek 2B,D).
   3. Czas ekspozycji: Zwiększ czas ekspozycji, aby zwiększyć intensywność sygnału. Wydłużenie czasu ekspozycji zwiększa intensywność sygnału próbki kosztem uzyskania niższej rozdzielczości czasowej dla zdarzeń transportowych. W tym eksperymencie użyj rozdzielczości czasowej od 300 ms do 700 ms między kolejnymi punktami czasowymi (czas ekspozycji 100-500 ms), aby śledzić poszczególne zdarzenia transportu RAB-3. (Rysunek 2C,D)
5. Nagrywanie poklatkowe: Zrób film poklatkowy trwający co najmniej 1-3 minuty, w zależności od intensywności sygnału białka, a także częstotliwości poszczególnych zdarzeń transportowych. Po zarejestrowaniu upływu czasu przejdź do następnego zwierzęcia. Zwierzęta na slajdzie nie powinny być obrazowane przez więcej niż 30 minut, aby upewnić się, że zarejestrowane zwierzęta są w dobrym stanie.
   UWAGA: Delikatne drgania ogona zwierzęcia podczas nagrywania wskazują, że zwierzę nadal żyje.

4. Analiza danych o transporcie aksonalnym

UWAGA: Użyj ImageJ/Fiji¹⁹ do kolejnych kroków analizy obrazu. Fidżi jest w stanie odczytywać dane za pomocą wszystkich popularnych pakietów oprogramowania do mikroskopii.

1. Generowanie kimografu
   1. Importuj dane: Zaimportuj plik danych poklatkowych na Fidżi. W przypadku, gdy nie można zaimportować danych na Fidżi, wyeksportuj nagranie czasu jako plik tiff z pakietu oprogramowania, a następnie załaduj go na Fidżi.
   2. Korekcja dryfu: Sprawdź, czy segment zwierzęcia/aksonu poruszył się, czy nieznacznie dryfował podczas akwizycji obrazu. Popraw ruch zwierząt lub dryfowanie, uruchamiając wtyczkę StackReg²⁰. Podczas uruchamiania wtyczki wybierz transformację Sztywna bryła.
   3. Ręczne generowanie kimografu: Szczegółowa procedura krok po kroku znajduje się w Rysunek 3. Wykorzystaj film z korekcją dryfu, aby wygenerować kimograf. Użyj narzędzia Linia segmentowana i dostosuj szerokość linii, aby dopasować ją do średnicy aksonu, klikając dwukrotnie lewym przyciskiem myszy ikonę linii segmentowanej, aby narysować linię wzdłuż segmentu aksonu, który będzie analizowany. Uruchom wtyczkę ImageJ/Fiji Kymoreslicewide, aby wygenerować kimograf i wykorzystać maksymalną wartość intensywności na całej szerokości linii w ustawieniach parametrów.
      UWAGA: Zachowanie spójności w kierunku rysowania linii (np. zawsze proksymalnie do dystalnego aksonu lub odwrotnie) upraszcza śledzenie kierunku ruchu wstecz w kimografach.
2. Analiza parametru transportu
   1. Oblicz parametr transportu: numer zdarzenia, prędkość, długość biegu i czas trwania pauzy z kimografu, postępując zgodnie z kolejnymi krokami.
      1. Śledzenie zdarzeń transportu w kimografie: Użyj narzędzia Linia prosta, aby śledzić poszczególne zdarzenia transportu na kimografie. Zapisz każdą linię w menedżerze ROI i śledź wszystkie zdarzenia transportowe w kimografie. Wybierz następujące parametry pomiaru w ImageJ/Fiji: Obszar, Prostokąt ograniczający, Średnia wartość szarości, Średnica Fereta.
      2. Oblicz parametr transportu: Wklej tabelę wyników do arkusza kalkulacyjnego i użyj następujących kolumn sekcji wyników do obliczenia:
         Długość serii: Pomnóż szerokość (w pikselach) przez rozdzielczość kamery (np. x μm/pxl), aby określić długość serii w μm.
         Prędkość: długość biegu/czas trwania biegu. Aby określić czas trwania zdarzenia ruchu w sekundach, pomnóż wysokość (w pikselach) przez czas akwizycji między kolejnymi punktami czasowymi (np. x s/piksel).
         Czas pauzy: Czas trwania pomiędzy dwoma kolejnymi ruchami, przy których prędkość wynosi 0,
         Numer zdarzenia: Łączną liczbę zdarzeń można znormalizować do całkowitej długości kimografu w celu określenia liczby zdarzeń na minutę i segmentu długości aksonu. Zdarzenia można dalej podzielić na następcze i wsteczne zdarzenia transportowe. Aby określić kierunkowość każdego zdarzenia ruchu, użyj narzędzia Kąt Fereta. W kimografach, które początkowo zostały wygenerowane przez narysowanie linii odcinkowej od bliższej do dystalnej, a zdarzenia transportu następczego w kimografie są skierowane od prawej do lewej, kąt Fereta < 90 ° będzie wskazywał zdarzenie następcze, a >90 ° wsteczne, w przeciwnym razie będzie odwrotnie.

Results

Przegląd systemu modelowego i procedury pomiarowej
Aby zobrazować transport aksonalny prekursorów pęcherzyków synaptycznych, prześledziliśmy endogenny GFP oznaczony RAB-3. Tutaj korzystamy z niedawno wygenerowanego szczepu GFP::Flip-on::RAB-3 class⁶, w którym ekspresja rekombinazy Flippazy pod promotorem specyficznym dla komórki (glr-4p) znakuje endogenny RAB-3 w neuronach ruchowych DA9. DA9 jest dwubiegunowym neuronem ruchowym, którego ciało komórkowe znajduje się w tylnej części zwierzęcia po stronie brzusznej, blisko odbytu (Ryc. 1A). Zawiera krótki dendryt, który biegnie do przodu wzdłuż brzusznego rdzenia nerwowego i długi akson, który biegnie z tyłu, tworzy spoidło, a następnie biegnie do przodu wzdłuż grzbietowego rdzenia nerwowego, gdzie tworzy mimochodem synapsy, które unerwiają mięsień grzbietowy i neuron VD^22,23,24. Wizualizujemy transport aksonalny w obszarze asynaptycznym; większość zdarzeń transportowych można uchwycić za pomocą pojedynczej płaszczyzny ogniskowej (Rysunek 1A). Wstępny etap fotowybielania jest wdrażany w celu zmniejszenia tła nieruchomych pęcherzyków w tym obszarze, które często mają tendencję do zatrzymywania się w tym obszarze (Rysunek 1B). Filmy poklatkowe są nagrywane w ciągu 3 minut, a sygnał RAB-3 wzdłuż obszaru asynaptycznego jest nanoszony na wykres kimograficzne w celu wyodrębnienia poszczególnych zdarzeń transportowych (Rysunek 1C).

Dostosowywanie parametru akwizycji w celu optymalizacji wizualizacji transportu aksonalnego
Aby przezwyciężyć niską intensywność sygnału wielu endogennie fluorescencyjnych białek znakowanych, należy zoptymalizować parametry akwizycji mikroskopu. Aby uzyskać solidną kwantyfikację zdarzeń transportowych, intensywność sygnału poszczególnych zdarzeń transportowych musi być jak najjaśniejsza na tle cytoplazmatycznym lub zatrzymującym się, nieruchomym ładunku. Prekursory pęcherzyków synaptycznych często zatrzymują się w obszarze asynaptycznym w odrębnych pulach pęcherzyków, co zakłóca wykrywanie nowych pęcherzyków przychodzących i utrudnia śledzenie ich śladów transportowych⁷.

Pojedynczy początkowy etap wybielania fluorescencji może znacznie zredukować sygnał fluorescencyjny pochodzący z puli pęcherzyków, aby zwiększyć wykrywanie ruchu nowych pęcherzyków przychodzących (Rysunek 2A). Etap bielenia tylko nieznacznie wzmocnił sygnał poruszających się pęcherzyków RAB-3 w stosunku do intensywności tła cytoplazmatycznego, prawdopodobnie dlatego, że frakcja cytoplazmatyczna RAB-3 jest bardzo niska (Ryc. 2D).

Użycie binningu zapewnia dodatkową warstwę do poprawy sygnału na tle poszczególnych zdarzeń transportowych poprzez połączenie tablicy pikseli w jeden piksel. Binning 2 x 2 zmniejszy o połowę rozdzielczość przestrzenną (tutaj ze 108,33 nm/piksel do 216,7 nm/piksel), która jest nadal wystarczająca do śledzenia pojedynczych cząstek transportujących RAB-3 (Rysunek 2B), ale znacznie poprawia intensywność sygnału poszczególnych pęcherzyków ( Rysunek 2D). O ile nie jest wymagana bardzo wysoka rozdzielczość przestrzenna, kategoryzacja może być również stosowana do wizualizacji wielu innych ładunków aksonalnych.

Następnie zapytaliśmy, jak zmiany w czasie ekspozycji mogą poprawić intensywność sygnału pojedynczych zdarzeń transportowych. W szczególności uwzględniliśmy czas ekspozycji w analizie, aby wykazać również, że czas ekspozycji do 500 ms z 700 ms między kolejnymi punktami czasowymi obrazowania nadal zapewnia rozdzielczość czasową, w której można śledzić prekursory pęcherzyków synaptycznych (Rysunek 2C, D).

Generowanie i analizowanie kymografów za pomocą Fiji
Aby wygenerować kimograf i przeanalizować poszczególne zdarzenia transportowe, wykonaj następujące kroki w Rysunek 3.

Rysunek 1: Przegląd systemu modelowego do wizualizacji transportu aksonalnego endogennego fluorescencyjnego RAB-3. (A) Górny panel: Przegląd nicienia ze wskazaną osią tylno-przednią i brzuszno-grzbietową. Neuron ruchowy DA9 jest oznaczony kolorem niebieskim. Panel środkowy: Powiększ obszar z ramką pokazany w górnym panelu ze wskazanym podziałem na przedziały DA9. Synapsy en passant są zilustrowane kolorem zielonym, * oznacza odbyt. Zauważ, że akson kontynuuje się w grzbietowym rdzeniu nerwowym, dopóki nie przejdzie przez srom. Czerwone pole wskazuje obszar strefy asynaptycznej. Dolny panel: Obraz z mikroskopii konfokalnej endogennego GFP oznaczonego RAB-3 w proksymalnym aksonie w pojedynczej płaszczyźnie ogniskowej. Należy zauważyć, że w regionie asynaptycznym znajdują się pęcherzyki o dłuższej przerwie RAB-3, chociaż większość klastrów sygnałowych RAB-3 znajduje się w regionie synaptycznym. Region asynaptyczny jest obramowany na czerwono. Skala: 20 μm. (B) Reprezentatywne obrazy nagrania poklatkowego w celu wizualizacji transportu aksonalnego. Aby zwiększyć identyfikowalność poszczególnych cząstek transportowych w stosunku do cząstek stacjonarnych, region asynaptyczny jest początkowo poddawany fotowybielaniu. Dolne panele w fioletowym obszarze z ramkami pokazują przykład ruchu następczego (pomarańczowy grot strzałki) i wstecznego (niebieski grot strzałki). Panele od góry do dołu reprezentują kolejne punkty czasowe. (C) Nagranie poklatkowe w (B) zostało wykreślone jako kimograf (2D reprezentacja czasu nad pozycją). Linie ukośne reprezentują zdarzenia ruchu, w których nachylenie wskazuje prędkość. Pionowe linie pokazują zdarzenia stacjonarne. Fioletowe pole to powiększenie kimografu w celu podkreślenia zdarzeń transportowych, które są również pokazane w (B) oraz śledzone są zdarzenia transportu następczego (pomarańczowego) i wstecznego (niebieskiego). Przerywane pionowe linie wskazują zdarzenia wstrzymane. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Optymalizacja etapów i parametrów akwizycji w celu poprawy wizualizacji endogennego ładunku aksonalnego. Endogenne GFP::RAB-3 zostały uwidocznione w strefie asynaptycznej aksonu DA9, wykonując zdjęcia pojedynczej płaszczyzny ogniskowej na konfokalnym mikroskopie z wirującym dyskiem. Kimografy zostały pozyskane w celu wizualizacji indywidualnych zdarzeń transportowych w kierunku następczym (od prawej do lewej) i wstecznym (od lewej do prawej) (AC). (A) Kimografy pokazują zdarzenia transportu RAB3 bez (lewe kimografie) lub ze zintegrowanym etapem bielenia. Należy zauważyć, że etap bielenia poprawia wizualizację zdarzeń wstrzymania (oznaczonych żółtymi grotami strzałek) między kolejnymi zdarzeniami transportu (pomarańczowe groty strzałek). (B) Implementacja binningu 2 x 2 pomaga poprawić intensywność sygnału słabych zdarzeń transportu RAB3. Obrazy zostały uzyskane przy czasie naświetlania 300 ms, a stopniowe zwiększanie czasu ekspozycji (z 100 ms po lewej stronie do 500 ms po prawej stronie) pomaga poprawić intensywność sygnału poszczególnych zdarzeń transportowych. Obrazy uzyskano w binningu 2 x 2 i przy użyciu wstępnego etapu fotowybielania. Wszystkie kimografy wyświetlają łączny czas trwania wynoszący 3 minuty i są rysowane w tej samej skali, dzięki czemu kimografy z mniejszą liczbą punktów czasowych akwizycji ze względu na dłuższy upływ czasu między kolejnymi punktami obrazowania mają krótszą całkowitą długość kimografu. (D) Kwantyfikacja natężenia sygnału dla każdego zdarzenia transportowego po odjęciu fluorescencji tła od kimografów w (A-C). Zwróć uwagę, że binning i etap wybielania fotograficznego zostały uzyskane przy czasie naświetlania 300 ms. Porównanie statystyczne z zastosowaniem n zdarzeń dla 100 ms (n_zdarzeń = 27 w n_zwierząt = 2), 200 ms (n_zdarzeń = 30 w n_zwierząt = 2), 300 ms (n_zdarzeń = 88 w n_zwierząt = 6), 500 ms (n_zdarzeń = 12 w n_zwierząt = 1), 300 ms bez (w.o.) binningu (n_zdarzeń = 31 w n_zwierząt = 3), 300 ms z (w) binningu (n_zdarzeń = 88 w n_zwierząt = 6) i 300 ms, 2 x 2 kategoryzacje z bieleniem (n_zdarzeń = 88 w n_zwierząt = 6) i bez bielenia. Każdy punkt danych reprezentuje intensywność sygnału pojedynczego zdarzenia transportu RAB-3 po odjęciu tła (cytoplazmy aksonu) w jednym punkcie czasowym wzdłuż jego śladu, który został wybrany losowo. Czas naświetlania porównano za pomocą testu Kruskala-Wallisa, a następnie wielokrotnego porównania Dunna, binning i wybielanie zdjęć porównano za pomocą testu Manna-Whitneya parami. Słupki błędów wskazują odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Procedura krok po kroku do generowania kimografu i mierzenia indywidualnych zdarzeń transportowych. (A) Po załadowaniu nagrania wideo na Fidżi, narzędzie do segmentacji linii jest używane do śledzenia linii wzdłuż długości segmentu aksonalnego, który będzie analizowany. (B) Kymograf (prawy panel) jest generowany za pomocą wtyczki Kymoreslicewide z parametrami przedstawionymi w lewym panelu. (C) Poszczególne zdarzenia transportowe są śledzone za pomocą narzędzia linii liniowej i zapisywane w menedżerze ROI. Prawy panel pokazuje ustawienia pomiaru, które są używane do generowania tabeli wyników. (D) Wyniki w tabeli służą do obliczenia parametru transportu. Pola wskazują ważne parametry, które są opisane w sekcji metod protokołu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Ograniczenia metody i metody alternatywne
W tym protokole zoptymalizowaliśmy parametry akwizycji, aby uwidocznić transport aksonalny endogennie znakowanego RAB-3, który jest związany z prekursorami pęcherzyków synaptycznych. Aby uwidocznić RAB-3, wykorzystaliśmy niedawno opublikowany szczep⁶ FLIP-on::GFP::RAB-3 i wyraziliśmy rekombinazę Flippazy pod promotorem specyficznym dla komórki (glr-4p)²⁵. Ta strategia pozwala nam znakować RAB-3 pojedynczym fluoroforem GFP. RAB-3 jest stosunkowo łatwy do wizualizacji, ponieważ jest silnie eksprymowany i silnie wzbogacony w prekursory pęcherzyków synaptycznych, dzięki czemu poszczególne zdarzenia transportowe mają jasną intensywność sygnału w porównaniu z niskim sygnałem, który pochodzi z tła cytoplazmatycznego. Inne białka aksonalne mogą wymagać dodatkowych strategii optymalizacyjnych poza ustawieniami mikroskopii, aby umożliwić wizualizację zdarzeń transportowych. Szczególnie w przypadku białek o niskiej ekspresji, system split-GFP stanowi doskonałą alternatywę. W tym systemie GFP₁₁ jest wprowadzany do endogennego locus białka będącego przedmiotem zainteresowania, a GFP_1-10 ulega ekspresji z promotora specyficznego dla komórki. Dużą zaletą tego systemu jest niewielki rozmiar matrycy naprawy DNA (około 70 nukleotydów), która musi zostać wprowadzona genomowo, co sprawia, że rekombinacja homologiczna jest bardziej wydajna w porównaniu z wstawieniem ORF całego znacznika fluorescencyjnego^26,27. Ze względu na jego mały rozmiar, wiele fragmentów GFP₁₁ może być wprowadzanych do endogennego białka, co zwiększa liczbę odtworzonych fluoroforów GFP na białko, a tym samym wzmacnia sygnał fluorescencyjny białka endogennego, a tym samym pakietu transportowego²⁸.

Oprócz znakowania białka za pomocą podejścia split-GFP lub GFP, można wykorzystać inne genetycznie kodowane fluorofory, które mają unikalne zalety i wady dotyczące ich właściwości fotochemicznych, które zostały niedawno porównane²⁹. Co więcej, fluorofory chemiczne o bardziej fotostabilnych właściwościach mogą być używane przez endogenne znakowanie białka będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą znacznika HALO lub SNAP³⁰.

Szczególnie w przypadku białek cytoplazmatycznych, które są obfite w całym aksonie, konieczne może być podejście do znakowania warunkowego. Niedawno zwizualizowaliśmy taki ładunek, endogenną spektrynę, za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu czasowo kontrolowanego znakowania, aby uwidocznić tylko nowe zsyntetyzowane białka spektrynowe. W przypadku warunkowego znakowania z rozdzielczością pojedynczego neuronu, połączyliśmy ekspresję rekombinazy sterowaną szokiem cieplnym z systemem podzielonego GFP³¹.

Jeśli celem badawczym jest zrozumienie transportu organelli, ekspresja domeny białkowej, która wiąże się z organellami, może stanowić alternatywę dla ektopowej ekspresji białka o pełnej długości.

Krytyczne kroki w protokole
Staranne przygotowanie w celu optymalizacji wizualizacji białka w oparciu o oczekiwane poziomy ekspresji, a także wybór optymalnej strategii znakowania jest szczególnie ważne dla pomyślnej wizualizacji endogennych znakowanych białek. Poziomy ekspresji większości białek w wielu neuronach można oszacować na podstawie transkryptomicznego zestawu danych z Cengen¹³. Oczekiwana niska intensywność sygnału zdarzeń transportowych dla białek o niskiej ekspresji lub cytoplazmatycznych może być poprawiona przez dołączenie wielu kopii fluoroforu. Należy jednak pamiętać, że w przypadku każdego eksperymentu z etykietowaniem należy zachować ostrożność, aby nie zakłócić funkcji znakowanego białka. W przypadku, gdy znany jest fenotyp odpowiadającego mu mutanta, ważne jest, aby sprawdzić, czy etykietowanie nie generuje tego fenotypu. W przypadkach, gdy nie jest znany fenotyp, wymagane są alternatywne podejścia, które różnią się w zależności od przypadku.

Krytycznym krokiem w obrazowaniu zdarzeń transportu aksonalnego jest stan zdrowia zwierzęcia. Zwierzęta powinny być traktowane tak delikatnie, jak to możliwe w celu przygotowania obrazu, jak również podczas obrazowania (np. użycie wykałaczki do włosów zamiast metalowego drutu do przenoszenia sparaliżowanych zwierząt, zminimalizowanie czasu inkubacji w środku paraliżującym, zminimalizowanie czasu obrazowania w celu uniknięcia fototoksyczności).

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów
Chociaż zamierzamy zoptymalizować wizualizację transportu aksonalnego białek endogennych, strategie optymalizacji parametrów akwizycji mają również zastosowanie do białek eksprymowanych ektopowo. Zwłaszcza, jeśli endogenne poziomy ekspresji są zbyt niskie, aby uwidocznić zdarzenia transportowe, ektopowa ekspresja białka może stanowić alternatywę.

W przypadku, gdy nie można zarejestrować żadnych zdarzeń związanych z transportem pomimo silnego natężenia sygnału endogennego znakowanego białka, zwierzęta mogą znajdować się w niezdrowym stanie. Można temu zaradzić, przygotowując zwierzęta do mikroskopii w ramach łagodniejszych procedur przygotowawczych (np. skrócenie czasu inkubacji w środku paraliżującym). Alternatywnie zdarzenia transportowe mogą być rzadkie, a 3-minutowe nagranie wideo może nie wystarczyć do uchwycenia zdarzeń. Uchwycenie rzadkich zdarzeń transportowych można zoptymalizować poprzez wydłużenie czasu trwania nagrania wideo, zwiększenie liczby obrazowanych zwierząt lub obrazowanie zwierząt na innym etapie rozwoju, na którym zdarzenia transportowe mogą być częstsze.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Szkiełka nakrywkowe (22 mm x 22 mm, nr 1); Szkło nakrywkowe ze złotą uszczelką	Thomas Scientific	6672A14
Levamisole	ChemCruz	sc-205730
Mikroskop: mikroskop odwrócony Nikon Ti2, głowica skanująca Yokogawa CSU-W1 SoRa, kamera Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS, obiektyw zanurzeniowy Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1,4 NA, skaner fotostymulacyjny Nikon o długości fali 488 nm z filtrem emisyjnym ET525/36	Mikroskop
Oprogramowanie NIS elements AR	Nikon		dla aparatu Nikon Ti2
Zwykłe, wstępnie oczyszczone szkiełka mikroskopowe	Thermo Scientific	420-004T
Szczep nicieni	Źródło identyfikatora
rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)	Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)	MTS1161	Zostanie zdeponowany w CGC (https://cgc.umn.edu/)