Izolacja pierwotnych komórek glejowych Müllera siatkówki myszy

Komórki Müllera (MCs) są głównymi i najliczniejszymi komórkami glejowymi występującymi w tkance siatkówki. Są kluczowymi graczami w zapewnianiu integralności strukturalnej i funkcji metabolicznych w siatkówce¹. Strategiczna struktura MC jest rozłożona na całej grubości siatkówki, zapewniając w ten sposób wsparcie siatkówki. Oprócz właściwości podobnych do rusztowań, pełnią funkcje metaboliczne dla neuronów siatkówki, dostarczając im substratów energetycznych, w tym glukozy i mleczanu. Funkcje te są kluczowe dla utrzymania zdrowych funkcji neuronalnych. Doniesiono, że upośledzone MC przyczyniają się do różnych chorób siatkówki, w tym zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem, retinopatii cukrzycowej i jaskry^2,3. MC mogą być endogennymi źródłami komórkowymi terapii regeneracyjnej w klasie retina1. Stanowią one również znaczną część siatkówki, a mocne dowody sugerują, że u kilku gatunków komórki te mogą być stymulowane do zastępowania brakujących neuronów². Korzystnie współpracują z neuronami, a stożkowato rozgałęzione końcówki komórek Müllera gęsto odsłaniają naczynia krwionośne i łączą składniki nerwowe siatkówki. W celu utrzymania rozwoju neuronów i plastyczności neuronalnej, komórki Müllera działają jak miękki substrat dla neuronów, chroniąc je przed urazami mechanicznymi³. Dodatkowo, w warunkach patologicznych, komórki Müllera mogą różnicować się w progenitory neuronalne lub komórki macierzyste, które replikują lub regenerują utracone fotoreceptory i neurony^2,3,4. Komórki Müllera zachowują cechy komórek macierzystych siatkówki, w tym różne poziomy potencjału do samoodnawiania i różnicowania^5,6. Komórka glejowa Müllera ma znaczącą linię siatkówki, która wytwarza czynniki neurotroficzne, wychwytuje i przetwarza neuroprzekaźniki, przestrzennie buforuje jony i utrzymuje barierę krew-siatkówka, aby utrzymać siatkówkę w homeostazie^7,8,9. Podkreśla to potencjał komórek Müllera jako obiecującego narzędzia w terapiach komórkowych w leczeniu chorób związanych ze zwyrodnieniem siatkówki. Komórki Müllera są pierwotnymi komórkami glejowymi rozmieszczonymi w siatkówce, łączącymi się zarówno z neuronami, jak i naczyniami krwionośnymi. Odgrywają kluczową rolę ochronną, zapewniając niezbędne wsparcie strukturalne i metaboliczne w celu utrzymania żywotności i stabilności komórek siatkówki. Niestety, w literaturze można znaleźć bardzo niewiele protokołów pierwotnej izolacji komórek Müllera z siatkówki < sup class="xref">10^,11.

Prezentujemy ulepszone podejście do niezawodnego izolowania i hodowli pierwotnych komórek Müllera myszy. Protokół ten został wykorzystany w naszej grupie do wyizolowania komórek Müllera od myszy C57BL/6 typu dzikiego i myszy transgenicznych^12,13. Do tego protokołu wykorzystuje się myszy w wieku od 5 do 11 dni, bez preferencji płciowych. Komórki zostały pasażowane do 4 razy; jednak w P4 przestają przylegać do kolby i trudno jest wyhodować zdrową kulturę. Hodowla jest często zanieczyszczona komórkami nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), dlatego komórki powinny być pasażowane co najmniej raz przed wykonaniem jakichkolwiek dodatkowych eksperymentów na linii komórkowej. Pasażowanie pozwala na dalszą izolację od zanieczyszczeń. W związku z tym przedstawiony protokół oferuje szybki i skuteczny sposób izolowania mysich komórek Müllera, który może być następnie wykorzystany jako niezawodna platforma do badania celów terapeutycznych i oceny potencjalnych metod leczenia chorób siatkówki¹⁴.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach były zgodne z oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych i zostały przeprowadzone zgodnie z naszym protokołem zwierzęcym zatwierdzonym przez Komitet Instytutu Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) oraz zasady Uniwersytetu Oakland (numer protokołu 2022-1160)

1. Przygotowanie podłoża i roztworu

1. Przygotować roztwór do badania oka z komórek Müllera, uzupełniając zmodyfikowane podłoże Dulbecco Eagle Medium (DMEM, szczegóły w tabeli materiałów) penicyliną/streptomycyną w rozcieńczeniu 1:1000. Na przykład na 10 ml DMEM dodaj 10 μl penicyliny/streptomycyny.
   UWAGA: Jest to prosty przygotowany nośnik bez surowicy. Należy również podgrzać całe podłoże w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przed użyciem go do hodowli komórkowych.
2. Przygotuj kompletną pierwotną pożywkę do wzrostu komórek Müllera, uzupełniając DMEM 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS, inaktywowaną termicznie) i 1% penicyliną/streptomycyną. Na przykład (500 ml pożywki DMEM + 50 ml FBS + 5 ml penicyliny/streptomycyny).
3. Przygotuj 0,05% roztwór trypsyny-EDTA z kolagenazą IV o stężeniu 200 U/ml (Trypsin-EDTA służy do rozpuszczenia obliczonej ilości proszku kolagenazy IV w celu osiągnięcia wymaganego stężenia).

2. Wyłuszczenie

1. Etycznie poddaj mysz eutanazji za pomocą inhalacji CO₂ zgodnie z wytycznymi IACUC.
   1. Krótko mówiąc, umieść zwierzę (zwierzęta) w komorze CO₂ w celu wprowadzenia 100% CO₂ przy szybkości napełniania 30-70% objętości / min komory CO₂, aby osiągnąć cel, jakim jest szybka utrata przytomności w ciągu 2-3 minut przy minimalnym stresie myszy.
   2. Ponieważ myszy są w młodym wieku (~10 dni), należy wykonać zwichnięcie szyjki macicy jako drugorzędną metodę zapewnienia prawidłowej eutanazji.
2. Po wysterylizowaniu obszaru roboczego 70% etanolem umieść mysz na sterylnym podkładce.
3. Wyodrębnij oczy, umieszczając ramiona pęsety z tyłu oka, delikatnie pociągając za obszar oczodołu i wyłuszczając oczy, wywierając nacisk pęsetą w stylu 5/45 na obszar oczodołu, aby spowodować wytrzeszcz.
   UWAGA: Przed preparacją wysterylizuj narzędzia do preparowania 70% etanolem, a następnie roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym.
4. Upewnij się, że nerw wzrokowy jest nadal połączony z okiem, powoli wyłuszczając oko. Upewnij się, że nerw wzrokowy (wizualnie identyfikowany jako biały sznur) znajduje się za okiem.
   UWAGA: Ten krok nie musi być wykonywany pod mikroskopem i może być wykonany na wysterylizowanej stole.

3. Leczenie wyłuszczonych oczu

1. Przykryj probówkę wirówkową o pojemności 15 ml folią aluminiową i napełnij probówkę 10 ml roztworu do pomiaru komórek Müllera.
2. Wypreparowane oczy umieścić w 15 ml probówce zawierającej roztwór do oczu z komórek Müllera i pozostawić je na noc lub około 18 godzin w temperaturze pokojowej.
3. Po 18 godzinach zdekantować roztwór do oczu i krótko przepłukać oczy 2-3 ml podgrzanego (37 °C) roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
4. Zdekantować PBS i przesunąć oczy na 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 10 ml roztworu trypsyny. (przygotowane w kroku 1.3).
   UWAGA: Trypsyna jest stosowana na całe wyłuszczone oko, działając jako środek dysocjacyjny ułatwiający oddzielanie komórek od warstw siatkówki podczas sekcji. Wypreparowana siatkówka ma wiele komórek, w tym komórki RPE, które są lepkie i najprawdopodobniej zanieczyszczą hodowlę komórek Müllera¹⁴. Badania mikroskopowe jednoznacznie wykazały, że po 5 dniach izolacji (podczas pierwszej zmiany podłoża) komórki RPE oderwały się od płytki i obumarły¹³. Pożywką stosowaną do izolacji RPE jest DMEM/F-12, o innym składzie niż DMEM (stosowany w izolacji komórek Müllera), zawierająca pirogronian sodu i niską zawartość glukozy.
5. Umieścić naczynie w inkubatorze i inkubować przez 1,5 do 2 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
6. Po inkubacji przenieść oczy na 60-milimetrową szalkę Petriego zawierającą około 5 ml kompletnej pierwotnej pożywki do wzrostu komórek Müllera.

4. Sekcja

UWAGA: Ta procedura musi być przeprowadzona w sterylnym środowisku okapu hodowlanego. Dlatego konieczne jest dokładne wysterylizowanie powierzchni okapu 70% alkoholem, wraz ze wszystkimi narzędziami i mikroskopem preparacyjnym. Warto zauważyć, że film został nagrany na zewnątrz maski dla lepszej widoczności i wyraźniejszych celów demonstracyjnych.

1. Umieść mały kawałek wysterylizowanej tkanki laboratoryjnej w naczyniu, aby ustabilizować oczy podczas sekcji. Umieść oczy pod mikroskopem preparacyjnym, aby rozpocząć sekcję.
   UWAGA: Zastosowanie tkanki laboratoryjnej ułatwia manewrowanie oczami w naczyniu wypełnionym płynem (kompletne podłoże), zapewniając precyzyjną sekcję.
2. Użyj nożyczek Vannas i pęsety w stylu M5S, aby usunąć tkankę łączną, mięśnie zewnątrzgałkowe i nerw wzrokowy.
   1. Chwyć oko pęsetą w stylu M5S i wykonaj nacięcie w sekcji ora serrata nożyczkami Vannas lub igłą lub igłą strzykawki.
      UWAGA: Między przednią a tylną częścią oka znajduje się jasnoniebieska okrągła linia zwana ora serrata, która może być używana jako punkt orientacyjny dla dokładnego kierunku podczas sekcji.
   2. Chwyć nacięcie pęsetą typu M5S i pociągnij lub oderwij rogówkę z tylnej części oka. Wprowadzaj małe przyrosty, aby upewnić się, że integralność siatkówki pozostaje nienaruszona.
      UWAGA: Te kroki mają na celu usunięcie przedniej części oka (rogówki, tęczówki i soczewki) z tylnej części muszli oka (siatkówki nerwowej i pigmentowej).
   3. Aby zachować integralność warstw siatkówki, delikatnie pociągnij i usuń nabłonek barwnikowy siatkówki z siatkówki nerwowej. Siatkówka nerwowa powinna być wolna od jakichkolwiek czarnych plamek, aby zapewnić jak największą czystość izolacji, ponieważ warstwa RPE jest zwykle lepka i przyczepiona do siatkówki neuronalnej.
   4. Pokrój wypreparowaną siatkówkę nerwową na małe kawałki przed zebraniem jej na płytkę, aby zapewnić jednorodne rozprowadzenie komórek na płytce.
3. Umieść siatkówki nerwowe w kolbie T25 zawierającej 4 ml kompletnej pierwotnej pożywki do wzrostu komórek Müllera.
4. Na koniec umieścić kolbę w inkubatorze i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .

5. Hodowla pierwotnych komórek glejowych Müllera

1. Nie przesuwaj kolby przez 3-5 dni, aby pobudzić wzrost komórek.
2. Zmieniaj pożywkę po piątym dniu, a następnie co drugi dzień, aż komórki zlewają się w 90%.

6. Pasażowanie pierwotnych komórek glejowych Müllera

1. Odessać pożywkę do hodowli komórek Müllera, a następnie 2 ml przemywania do PBS i odessać PBS. Dodaj 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA (1x) lub tyle, aby pokryć płytkę.
2. Inkubować przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej.
3. Upewnij się, że komórki są odłączone od płytki pod mikroskopem. Następnie zebrać zawiesinę komórkową i dodać 4 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) kompletnej pożywki do wzrostu komórek Müllera (przygotowanej w kroku 1.2) do probówki zbiorczej.
4. Wirować przez 7 minut przy 300 x g. Po zaessaniu supernatantu ponownie zawiesić osad w 10 ml kompletnej pierwotnej pożywki do wzrostu komórek Müllera. Ponieważ liczba komórek może się różnić w zależności od liczby wypreparowanych oczu, dlatego lepiej jest policzyć komórki przed wysiewem i inkubacją. Zalecana gęstość wysiewu wynosi 3,0 x 10⁶ komórek w kolbie T75.
   UWAGA: Komórki mogą być pasażowane do 4-5 razy. Jednak najbardziej spójne wyniki eksperymentu uzyskuje się po 1-2 przejściach.

7. Immunofluorescencja

UWAGA: Użyj protokołu immunofluorescencji, aby wybarwić i zweryfikować specyficzność komórek Müllera. Oto krótki przegląd protokołu immunofluorescencyjnego. Ten krok jest wykonywany po pierwszym fragmencie¹².

1. Zasiej komórki w szkiełku do hodowli komórek (30 000 komórek na studzienkę dla szkiełka z 8 dołkami).
2. Hodować wyizolowane komórki przez 24–48 godzin w kompletnej pożywce Müllera (przygotowanej w kroku 1.2) w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
3. Odessać pożywkę i umyć szkiełko komory 250-300 μl 1x PBS na każdym dołku, gdy komórki są zlewające się w 80-90%.
4. Umieść szkiełko na 10 do 15 minut w 250-300 μl 4% paraformaldehydu na każdym dołku, a następnie przemyj PBS/TX-100 (5 minut każdy/3 razy).
5. Dodać bufor blokujący na 1 godzinę w temperaturze 37 °C (patrz tabela materiałów).
6. Odessać roztwór blokujący, a następnie dodać pierwszorzędowe przeciwciała specyficzne dla komórek Müllera, aby potwierdzić czystość wyizolowanych komórek za pomocą syntetazy glutaminy i wimentyny^5,12. Inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C (przy stężeniu przeciwciał 1:100-1:200 w buforze blokującym w objętości 150-200 μl/szkiełko). Umyj szkiełko praniami PBS/TX-100 (5 i 10 min każde).
   UWAGA: Przeciwciała te zostały wybrane, ponieważ są cechami charakterystycznymi do identyfikacji komórek Müllera i zapewniają sukces i czystość hodowli komórek Müllera.
7. Dodać przeciwciało drugorzędowe (o stężeniu przeciwciała w zakresie 1:1000 w buforze blokującym w 150–200 μl/szkiełko) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Następnie umyj PBS/Triton X-100 trzy razy (po 5-10 minut).
8. Nałóż kroplę podłoża montażowego DAPI, aby oznaczyć jądra przed przykryciem szkiełka nakrywkowego. Unikaj pęcherzyków powietrza podczas zakładania szkiełka nakrywkowego.
9. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby sprawdzić szkiełko i zrobić zdjęcia (patrz Tabela materiałów).
   UWAGA: Komórki są zlokalizowane z DAPI na ex/em 359/461 przy 10-krotnym powiększeniu, aby zlokalizować komórki; Większe powiększenie może uchwycić komórki. Inne długości fal zależałyby od wybranego koloru. Kolor zielony (GFP)- ex/em 488/510. Kolor czerwony (Cy3)- ex/em 555/569.

Walidacja specyficzności, czystości i funkcji barierowej izolowanych komórek Müllera
Aby potwierdzić żywotność, morfologię i charakterystyczne cechy wyizolowanych komórek Müllera, komórki badano pod mikroskopem świetlnym. Zarejestrowano obrazy P0 i P1 (Rysunek 1A). Aby sprawdzić zanieczyszczenie wyizolowanych komórek Müllera komórkami RPE i potwierdzić ich czystość, przeprowadzono barwienie immunofluorescencyjne (IF) przy użyciu przeciwciał specyficznych dla markera komórkowego RPE, RPE65. Jako kontrolę pozytywną zastosowano ludzkie komórki barwnikowe siatkówki (ARPE -19). Komórki RPE barwione RPE65 (czerwone i niebieskie do barwienia jądrowego) są pokazane w Rysunek 1B (dolny panel). Przeciwciała specyficzne dla RPE65 nie zabarwiały izolowanych komórek Müllera (Figura 1B, górny panel). Fakt, że RPE65 zabarwił komórki ARPE-19 (na czerwono) i nie zabarwił izolowanych komórek, wskazuje, że izolowane komórki nie są komórkami RPE. Obecność pirogronianu i niskiego poziomu glukozy w pożywce stwarza niekorzystne warunki do wzrostu komórek RPE. W związku z tym, nawet w przypadku zanieczyszczenia komórek RPE, w końcu oderwą się one od kolby.

Ponadto, aby potwierdzić tożsamość wyizolowanych komórek, użyto barwienia immunofluorescencyjnego komórek Müllera dla specyficznych markerów komórek Müllera, aby potwierdzić udaną izolację komórek Müllera. Użyto pośredniego białka filamentu cytoszkieletu zwanego wimentyną12,13. Dodatkowo wykorzystano również syntetazę glutaminy (GS), która katalizuje reakcję kondensacji glutaminianu i amoniaku w celu wytworzenia glutaminy, jako kluczowej funkcji komórek Müllera glejowych siatkówki5.

Łącznie, izolowane komórki zabarwione negatywnie dla RPE65 (czerwony, Rysunek 1B), pozytywny dla wimentyny (zielony, Rysunek 1C) i GS (zielony, Rysunek 1D). Barwienie IF potwierdza pomyślną izolację (czystość i swoistość) wyizolowanych komórek Müllera. Rysunek 1E, to kontrola ujemna dla wimentyny (górny panel) i GS (dolny panel), potwierdzająca specyficzność przeciwciał.

Rysunek 1: Walidacja izolacji komórek Müllera (czystość i swoistość). (A) Obraz z mikroskopii świetlnej dla pasaży: morfologia przejścia zero(P0)i(P1). (B) Barwienie immunologiczne RPE65 połączone z barwieniem jądrowym DAPI. (C) Barwienie immunologiczne wimentyny z barwieniem jądrowym DAPI w dużym powiększeniu. (D) Barwienie immunologiczne GS przy tym samym dużym powiększeniu. E) kontrole ujemne w celu potwierdzenia swoistości barwienia wimentyną i przeciwciałami GS. Podziałka = odpowiednio 300 μm, 300 μm, 50 μm, 20 μm, 20 μm, 50 μm, 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają do dyspozycji oświadczeń o konflikcie interesów, które miałyby związek z treścią niniejszego artykułu.