Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowa ocena przesiewowa wytwarzania reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu barwnika fluorescencyjnego Dihydroethidium (DHE)

7.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66238

⸱

19 stycznia 2024

 , 
1Department of Pathology, University of New Mexico, 2Department of Chemical and Biological Engineering, University of New Mexico

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje nowatorską metodę ilościowego oznaczania wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu dihydroetydydy (DHE) jako sondy barwnika fluorescencyjnego przy użyciu wysokoprzepustowego podejścia przesiewowego. W protokole opisano metody oceny ilościowej wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) w trzech różnych liniach komórkowych raka wątrobowokomórkowego.

Streszczenie

Reaktywne formy tlenu (ROS) odgrywają kluczową rolę w regulacji metabolizmu komórkowego w procesach fizjologicznych i patologicznych. Fizjologiczna produkcja ROS odgrywa kluczową rolę w przestrzennej i czasowej modulacji normalnych funkcji komórkowych, takich jak proliferacja, sygnalizacja, apoptoza i starzenie się. Natomiast przewlekła nadprodukcja ROS jest odpowiedzialna za szerokie spektrum chorób, takich jak między innymi nowotwory, choroby układu krążenia i cukrzyca. Kwantyfikacja poziomów ROS w dokładny i powtarzalny sposób jest zatem niezbędna do zrozumienia normalnej funkcjonalności komórek. Metody obrazowania fluorescencyjnego do charakteryzowania wewnątrzkomórkowych gatunków ROS są powszechnym podejściem. Wiele protokołów obrazowania ROS w literaturze wykorzystuje barwnik dioctanu 2'-7'-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA). Jednak barwnik ten cierpi na znaczne ograniczenia w jego użyciu i interpretowalności. Obecny protokół demonstruje zastosowanie sondy fluorescencyjnej z dihydroetydydą (DHE) jako alternatywnej metody ilościowego określania całkowitej produkcji ROS w warunkach wysokiej przepustowości. Wysokowydajna platforma obrazowania, CX7 Cellomics, została wykorzystana do pomiaru i ilościowego określenia produkcji ROS. Badanie to przeprowadzono w trzech liniach komórkowych raka wątrobowokomórkowego - HepG2, JHH4 i HUH-7. Protokół ten zawiera szczegółowy opis różnych procedur związanych z oceną ROS w komórkach, w tym - przygotowanie roztworu DHE, inkubację komórek z roztworem DHE oraz pomiar intensywności DHE niezbędnej do scharakteryzowania produkcji ROS. Protokół ten pokazuje, że barwnik fluorescencyjny DHE jest solidnym i powtarzalnym wyborem do charakteryzowania wewnątrzkomórkowej produkcji ROS w sposób wysokoprzepustowy. Wysokoprzepustowe podejścia do pomiaru produkcji ROS mogą być pomocne w różnych badaniach, takich jak toksykologia, badania przesiewowe leków i biologia raka.

Wprowadzenie

Reaktywne formy tlenu (ROS) to grupa naturalnie występujących, wysoce reaktywnych i czasowo niestabilnych rodników chemicznych powstałych jako część normalnego metabolizmu komórkowego w komórkach. ROS odgrywa kluczową i istotną rolę w modulacji prawidłowych procesów fizjologicznych i biochemicznych zachodzących w komórkach1,2. Głównym źródłem produkcji ROS w komórkach jest szlak mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów (ETC) w ramach normalnego cyklu bioenergetycznego. Istotnymi dodatkowymi źródłami produkcji ROS są reakcje enzymatyczne, takie jak komórkowe oksydazy NADPH w komórkach. Metabolizm cząsteczek żywności (np. glukozy) zachodzi poprzez szlak fosforylacji oksydacyjnej w macierzy mitochondrialnej. Wyjściowy poziom produkcji ROS jest niezbędny do regulacji normalnych fizjologicznych procesów sygnalizacji komórkowej. Wiadomo, że wiele kluczowych cząsteczek białka, które są częścią metabolicznych szlaków sygnałowych glukozy (np. Akt i PTEN), reaguje na wewnątrzkomórkowe poziomy ROS. Ponadto ROS są wytwarzane przez różne enzymy wewnątrzkomórkowe, takie jak oksydaza ksantynowa, syntaza tlenku azotu i składniki peroksysomalne jako część komórkowych szlaków enzymatycznych1,2. W przeciwieństwie do naturalnych źródeł ROS, niektóre czynniki środowiskowe, takie jak ksenobiotyki, czynniki zakaźne, światło UV, zanieczyszczenia, palenie papierosów i promieniowanie, również prowadzą do nadmiernej produkcji ROS, które są kluczowym czynnikiem napędzającym wewnątrzkomórkowy stres oksydacyjny1,3. Podwyższony komórkowy stres oksydacyjny może powodować uszkodzenia natywnych biomolekuł wewnątrz komórki, takich jak lipidy, białka i DNA, powodując różne choroby, takie jak rak, cukrzyca, choroby układu krążenia, przewlekłe stany zapalne i zaburzenia neurodegeneracyjne1,3,4. Dlatego dokładne pomiary ROS są niezbędne do zrozumienia mechanizmów komórkowych zaangażowanych w patofizjologię chorób wywołanych stresem oksydacyjnym.

Ze względu na krótki czas produkcji i eliminacji ROS wewnątrz komórek, ilościowe pomiary różnych rodników ROS pozostają wyzwaniem. Metody takie jak elektronowy rezonans paramagnetyczny (EPR)5, wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa (HPLC) i obrazowanie oparte na sondzie fluorescencyjnym są wykorzystywane do pomiaru różnych komórkowych ROS6. Podczas gdy metody takie jak EPR i HPLC dają ilościowo dokładne oszacowania, metody te wiążą się ze zniszczeniem morfologii przestrzennej komórki i zwykle mają postać globalnych i masowych pomiarów próbki. W przeciwieństwie do tego, metody oparte na obrazowaniu, takie jak metody oparte na sondzie fluorescencji, zachowują morfologię komórkową i kontekst przestrzenny generacji ROS. Jednak specyficzność różnych sond fluorescencyjnych dla różnych typów rodników ROS nie została dobrze ustalona7,8. Kilka sond fluorescencyjnych, takich jak dihydroethidium (DHE), dioctan dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA), dihydrorhodamina (DHR), dimetyloantracen (DMA), 2,7-dichlorodihydrofluresceina (DCFH), 1,3-difenylozobenzofuran (DPBF) i MitoSox są dostępne do wykrywania ROS. W ostatnich dziesięcioleciach DHE, MitoSox i DCFH-DA są powszechnie stosowanymi barwnikami fluorescencyjnymi do pomiaru ROS w komórkach i tkankach8,9. DCFH-DA jest szeroko stosowanym barwnikiem do wykrywania wewnątrzkomórkowegoH2O2i stresu oksydacyjnego. Pomimo popularności DCFH-DA, wiele wcześniejszych badań wykazało, że nie można go wiarygodnie wykorzystać do pomiaru wewnątrzkomórkowych poziomówH2O2i innych poziomów ROS8,9,10,11,12,13,14.

Natomiast sonda fluorescencyjna dihydroethidium (DHE) wykazuje specyficzną reakcję na wewnątrzkomórkowy rodnik ponadtlenkowy (O2-). Chociaż rodnik ponadtlenkowy jest jednym z wielu gatunków ROS obserwowanych w komórkach, jest ważnym rodnikiem biorącym udział w redukcji metali przejściowych, konwersji do nadtlenoazotanu i tworzeniu wodoronadtlenków, wśród innych efektów wewnątrzkomórkowych. DHE jest szybko wychwytywany przez komórki i ma emisję fluorescencji w czerwonym zakresie długości fal15. W reakcji z rodnikiem ponadtlenkowym, DHE tworzy czerwony produkt fluorescencyjny, 2-hydroksyetydynę (2-OH-E+). Tak więc, DHE może być uważany za specyficzną sondę do wykrywania ponadtlenkowego. Jednak DHE może również ulegać niespecyficznemu utlenianiu za pomocą ONOO- lub OH., H2O2i cytochromu c, tworząc drugi produkt fluorescencji, etydynę E+, który może zakłócać mierzone poziomy 2-OH-E+. Jednak te produkty 2-OH E+ i E+, w połączeniu, reprezentują główną część wszystkich komórkowych gatunków ROS obserwowanych wewnątrz komórki po zabarwieniu DHE. E+ interkaluje się z DNA, znacznie zwiększając jego fluorescencję8,9,10,11,13,14,15,16. Ponieważ widma fluorescencji etydyny i 2-hydroksyetydy różnią się tylko nieznacznie, większość poziomów ROS obserwowanych w komórce wtórnych do produkcji ponadtlenkowej można wykryć i zmierzyć za pomocą produktów fluorescencyjnych DHE. Te gatunki ROS są identyfikowane za pomocą wzbudzenia o długości fali 480 nm i emisji o długości fali 610 nm15,16,17.

Oprócz wyboru konkretnej sondy detekcyjnej ROS, ważne jest, aby wybrać czułą metodę wykrywania do pomiaru wewnątrzkomórkowego ROS. Dokładna ocena wewnątrzkomórkowych poziomów ROS jest zatem kluczem do identyfikacji zaburzonych stanów równowagi redoks występujących w komórkach chorych lub komórkach, które były narażone na różne stresory środowiskowe, takie jak promieniowanie, związki toksykologiczne i czynniki genotoksyczne18. Ponieważ ROS jest powszechnie występującym zjawiskiem w komórkach, które jest odpowiedzialne za regulację różnych czynności sygnalizacji komórkowej, niezbędne są solidne metody wykrywania ROS. Aby umożliwić tak wysokoprzepustową ocenę produkcji ROS w komórkach, protokół ten wykorzystuje platformę przesiewową o wysokiej zawartości (HCS) do pomiaru gatunków ROS. Obecny protokół pozwala na wysokoprzepustową analizę wewnątrzkomórkowej produkcji ROS, co ma kluczowe znaczenie w wielu badaniach toksykologicznych19. Protokół ten ma na celu zapewnienie łatwego i wszechstronnego rozwiązania do wykrywania i pomiaru wewnątrzkomórkowych ROS w przylegających komórkach raka wątrobowokomórkowego. Odczynniki chemiczneH2O2i menadionu są stosowane jako silne stymulatory ROS do pomiaru względnych poziomów produkcji ROS w kontrolowanych i wysokoprzepustowych warunkach. Protokół ten można dostroić w celu pomiaru produkcji ROS w komórkach przylegających i nieprzylegających w odpowiednich warunkach, w razie potrzeby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórkowa

  1. Wysiewaj badane komórki (komórki raka wątrobowokomórkowego HepG2, HUH7 i JHH4) na 96-dołkową płytkę o gęstości wysiewu 10 000 komórek/dołek w końcowej objętości wysiewu 200 μl na dołek.
    1. Przed hodowlą komórek HepG2 należy pokryć 96 dołków płytkowych kolagenem typu IV (50 μg/ml) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT). Aby uniknąć zestalenia kolagenu podstawowego, umieść roztwór podstawowy w lodzie, a następnie rozpocznij proces rozcieńczania do pożądanego stężenia.
    2. Po 2 godzinnym okresie inkubacji odessać nadmiar kolagenu i trzykrotnie umyć studzienki 1x PBS.
  2. Hodować komórki w zmodyfikowanym podłożu Eagle (DMEM) firmy Dulbecco przez noc w temperaturze 37 °C i stężeniu 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze.
  3. Następnego dnia lub po osiągnięciu zbiegu 80%-90%, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej, należy potraktować komórki odpowiednioH2O2(nieleczone, 250 μM, 500 μM, 750 μM i 1000 μM) i menadionem (nieleczone, 25 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM) przez 30 minut, aby wywołać reprezentatywny stres oksydacyjny.
  4. Alternatywnie, można zdecydować się na badanie komórek z użyciem pożądanej substancji badanej z wyboru, zdolnej do wywołania stresu oksydacyjnego w komórkach.

2. Przygotowanie roztworu podstawowego i rozcieńczonego do barwienia komórek DHE

  1. Przygotować roztwór podstawowy DHE (5 mg/ml lub 15,9 mM), rozpuszczając 5 mg DHE w 1 ml DMSO.
  2. Rozcieńczyć roztwór podstawowy DHE podwójnie destylowaną wodą w autoklawie do końcowego stężenia 100 μM.
  3. Aby uniknąć procesu zamrażania i rozmrażania barwnika (który z czasem może uszkodzić właściwości fluorescencyjne), należy przygotować kilka porcji w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml o stężeniu 100 μM i przechowywać je w temperaturze -20 °C.
  4. Aby osiągnąć końcowe stężenie robocze 10 μM, należy użyć podwielokrotności stężenia 100 μM DHE i rozcieńczyć ją wstępnie podgrzaną pożywką DMEM.
    UWAGA: Roztwór roboczy musi być przygotowany świeży w dniu eksperymentu.
  5. Wirować roboczy roztwór barwnika fluorescencyjnego przez 5-10 sekund, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie barwnika.

3. Proces barwienia DHE

  1. Usunąć pożywkę zawierającą lek lub substancję badaną z każdej studzienki i przemyć ją delikatnie raz za pomocą 1x PBS lub DMEM.
    UWAGA: Podczas wykonywania etapów dodawania lub przemywania w eksperymencie ważne jest, aby unikać bezpośredniego kontaktu między komórkami a pipetorem. Można to osiągnąć poprzez delikatne pipetowanie PBS wzdłuż boków studzienek, aby zminimalizować potencjalne uszkodzenia mechaniczne komórek. Upewnienie się, że pipetor nie styka się bezpośrednio z komórkami, pomoże utrzymać integralność i żywotność komórek przez cały czas trwania eksperymentu.
  2. Dodać 100 μl pożywki DMEM zawierającej 10 μM DHE (roztwór roboczy) do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  3. Po 30 minutowym okresie inkubacji usunąć pożywkę zawierającą DHE i delikatnie umyć każdą studzienkę trzy razy solą fizjologiczną buforowaną 1x fosforanem (PBS). Można to zrobić za pomocą pipety wielokanałowej, aby zapewnić szybką realizację.
  4. Dodaj 200 μl 1x PBS do każdej studzienki z barwnikiem barwiącym jądrowym Hoechst 33342 przez 10 minut w temperaturze stężonej temperatury.
  5. Usunąć roztwór do barwienia jądrowego Hoechst 33342 ze studzienki i dodać 200 μl 1x PBS do każdej studzienki.
    UWAGA: Aby uzyskać stałe komórki, postępuj zgodnie z tym samym protokołem, co w przypadku żywych komórek, z jednym dodatkowym krokiem polegającym na dodaniu 4% PFA przez 5 minut po leczeniu i barwieniu DHE. Usuń roztwór PFA i umyj komórki 1x PBS. Następnie inkubuj komórki z barwnikiem barwiącym jądro przez 10 minut.
  6. Przenieś płytkę na platformę przesiewową o wysokiej zawartości, mikroskopię fluorescencyjną lub czytnik płytek w celu jak najszybszego uzyskania obrazu.

4. Akwizycja obrazu i pomiar intensywności

  1. Załadunek płyt
    1. Otwórz oprogramowanie Cellomics CX7 do przesiewania o wysokiej zawartości (HCS) w celu uzyskania danych.
    2. Ostrożnie skalibruj platformę obrazowania zgodnie ze specyfikacjami producenta z wyprzedzeniem za pomocą specjalnej płytki 96-dołkowej do użytku, aby uniknąć zamglonych lub rozmytych obrazów w danych.
      UWAGA: Płytki wielodołkowe od różnych dostawców mogą mieć różne właściwości materiałowe i mogą wpływać na jakość uzyskiwanych ostatecznych obrazów.
    3. Po kalibracji należy zapisać parametry systemu specyficzne dla marki płyty w bazie danych przyrządu i ponownie wykorzystać je do przyszłego pozyskiwania danych.
    4. Ostrożnie umieścić płytkę z przygotowanymi próbkami na podgrzewanym stoliku systemu obrazowania HCS. Upewnij się, że płytka jest bezpiecznie umieszczona i we właściwej orientacji do obrazowania na uchwycie mikropłytki (tj. zlokalizuj etykietę oznaczoną A1 na stoliku czytnika, a następnie obróć mikropłytkę tak, aby położenie studzienki A1 pasowało do rogu z naklejką).
    5. Delikatnie dociśnij mikropłytkę, aby upewnić się, że opiera się płasko o stolik. Nierównomierne wypoziomowanie płytki w systemie HCS może prowadzić do błędów w pozyskiwaniu obrazu.
    6. Po umieszczeniu blachy na miejscu naciśnij i przytrzymaj Ctrl, a następnie kliknij Ctrl-OK w oknie dialogowym Załaduj/Rozładuj blachę w oprogramowaniu.
  2. Dobór parametrów obrazowania
    1. W systemie obrazowania HCS otwórz tryb Target Activation w interfejsie bioaplikacji Cellomics i utwórz nowy protokół przy użyciu dwukanałowego protokołu konfiguracji zgodnego z (a) barwieniem jądrowym i (b) akwizycją danych sondy fluorescencyjnej DHE. W obecnym protokole filtry 386_BGSRS_BGSRS, 480_BGS_RS i 386_BGS_RS były używane odpowiednio do (a) barwienia jądrowego Hoechst 33342, (b) całkowitej produkcji ROS i (c) wykrywania rodników ponadtlenkowych. Wybór tych filtrów był podyktowany specyficznym nakładaniem się właściwości emisyjnych każdego barwnika (DAPI i DHE) użytego w ramach tego protokołu.
      UWAGA: Konwencja nazewnictwa filtrów, np. 386-23_BGRFRN_BGRFRN, odnosi się do wzbudzenia próbki światłem 386 nm o szerokości pasma 23 nm, po którym następuje filtr dichroiczny, który przepuszcza światło niebieskie (B), zielone (G), czerwone (R), dalekie czerwone (FR) i bliską podczerwień (N) w określonych zakresach długości fal, a 386_BGS_RS odnosi się do filtra emisyjnego, który przepuszcza światło o długości fali emisji BGS i RS po dichroiku.
    2. W razie potrzeby określ cele procesu akwizycji obrazu w interfejsie protokołu oprogramowania, takie jak powiększenie 10x lub 20x.
    3. Wybierz odpowiednie powiększenie obiektywu w zależności od pożądanego poziomu szczegółowości obrazowania i rozdzielczości niezbędnych do eksperymentu. Jednak rozdzielczość każdego celu jest stała. Szczegółowość w wyższej rozdzielczości będzie wymagała zmiany celu na platformie. W obecnym protokole używany jest obiektyw 20x, 0,45 NA, który jest częścią platformy przesiewowej o wysokiej zawartości używanej w tym protokole.
      UWAGA: Obiektyw 20x stanowi dobry kompromis między szczegółowością rozdzielczości obrazowania a szybkością akwizycji niezbędną do uchwycenia zmian ROS w czasie. Można wybrać obiektywy o większym powiększeniu (np. 40X), jednak doprowadzi to do wydłużenia czasu akwizycji.
    4. Określ ustawienia ekspozycji kamery do akwizycji obrazu, takie jak czas ekspozycji, łączenie kamery w kategoryzację i interwał stosu z, zgodnie z określonymi wymaganiami protokołu.
      UWAGA: Czas ekspozycji (często w milisekundach) różni się w zależności od siły sygnału i czułości określonych użytych fluoroforów. Może się to również nieznacznie różnić w zależności od eksperymentu w zależności od stężenia barwnika i jakości barwienia. W obecnym protokole parametry akwizycji są ustalone w następujący sposób - Target % - 35%, tryb akwizycji obrazu - 1104 x 1104 (z binningiem 2x2), a obiektyw 20x, 0,45 NA. Parametry te mogą być ustalane zgodnie ze szczególnymi warunkami doświadczalnymi.
  3. Parametry konfiguracji obrazowania
    UWAGA: Po ustawieniu parametrów obrazowania proces zbierania obrazu może zostać zainicjowany za pomocą interfejsu oprogramowania.
    1. Parametry kolekcji obrazów
      1. Zidentyfikuj główny obiekt śledzący będący przedmiotem zainteresowania (jądro komórek) za pomocą różnych algorytmów dostępnych w instrumencie (optyka - izodane, stała i trójkąt).
        UWAGA: W niniejszym protokole stosowana jest metoda isodanych do identyfikacji i oznaczania obiektu podstawowego.
      2. Podziel obiekt na segmenty (jeśli istnieje) według kształtu lub parametru intensywności.
      3. Zweryfikuj obiekt podstawowy na podstawie żądanych parametrów rozmiaru, kształtu i intensywności unikalnych dla każdego typu komórki.
      4. Następnie zdefiniuj "obszar zainteresowania" (ROI) wokół tego obiektu podstawowego.
        UWAGA: ROI jest kluczowym parametrem pozyskiwania danych, który określa miejsce, w którym intensywność barwnika fluorescencyjnego jest identyfikowana jako spójna i powtarzalna we wszystkich typach komórek. ROI określa kluczowe parametry (takie jak intensywność barwnika), które są mierzone dla każdego głównego obiektu śledzącego (tj. komórki) w różnych kanałach instrumentu. ROI można zdefiniować w postaci koła lub pierścienia wokół jądra każdej komórki. Oprogramowanie HCS automatycznie uzyskuje intensywność markera barwnika fluorescencyjnego DHE w kanale 2 w granicach zwrotu z inwestycji dla każdej komórki, która jest segmentowana i analizowana w sposób zautomatyzowany.
      5. Ustaw okrąg o średnicy 20 μm wokół głównego obiektu (jądra). Odległość 20 μm została wybrana w tym badaniu na podstawie przybliżonych rozmiarów różnych linii komórkowych użytych w tym protokole (HepG2, JHH-4 i HUH-7). Pierścień ROI o średnicy 20 μm wokół komórek uzyskał intensywność fluorescencji w sposób spójny i powtarzalny.
        UWAGA: Kluczowym parametrem przy wyborze ROI jest zdolność do odpowiedniego pokrycia obszaru komórki; rozmiar okrągłego zwrotu z inwestycji zależy od rozmiaru komórki. Większe ogniwa mogą wymagać większego zwrotu z inwestycji i odwrotnie, aby uzyskać mniejszy zwrot z inwestycji. Parametry te należy określić z wyprzedzeniem dla każdego typu ogniwa i barwnika fluorescencyjnego, który jest przedmiotem zainteresowania.
  4. Charakterystyka populacji i wybór cech do przechowywania
    1. Po zdefiniowaniu różnych parametrów akwizycji w protokole obrazowania HCS należy przełączyć system HCS w tryb akwizycji danych.
    2. Parametry akwizycji obrazu dla tego protokołu zostały ustawione w następujący sposób: limit skanowania wynoszący 1000 komórek/studzienkę, z minimalnym wymaganiem 10 obiektów (komórek) na pole.
      UWAGA: Liczba pól ocenianych dla każdej studni została określona na podstawie końcowej liczby komórek, która osiągnęła liczbę 1000. System HCS kontynuuje przeszukiwanie różnych miejsc w studni, aż uzyska docelową populację 1000 komórek/studzienkę. Szybkość akwizycji zależy zatem od konfluencji i całkowitej liczby komórek obecnych w każdym dołku 96-dołkowej płytki. W obecnym protokole całkowita i średnia intensywność kanału 2 (reprezentująca rodniki ponadtlenkowe i całkowitą produkcję ROS) została pobrana z każdego odwiertu w celu dalszych analiz.
  5. Przechwytywanie, przetwarzanie i analiza obrazu
    1. Po dostosowaniu i sfinalizowaniu parametrów akwizycji obrazu rozpocznij proces skanowania dla każdej płytki 96-dołkowej.
      UWAGA: System obrazowania Cellomics CX7 umożliwia badania przesiewowe o wysokiej zawartości i zautomatyzowaną analizę próbek o różnych parametrach, w tym produkcję ROS w komórkach w sposób wysokoprzepustowy. Oprócz produkcji ROS, system HCS jest w stanie dostarczyć dodatkowych cennych informacji o różnych parametrach, takich jak morfologia komórki, lokalizacja subkomórkowa i wiele innych interesujących cech komórkowych. Po zoptymalizowaniu pod kątem akwizycji platforma obrazowania HCS pozwala na kompleksową, jakościową i ilościową charakterystykę parametrów komórek w solidny sposób.
    2. Po zakończeniu procesu skanowania uruchom oprogramowanie View Analysis i wyeksportuj różne parametry danych ilościowych w formacie .csv w celu przeprowadzenia dodatkowej analizy.
    3. Korzystając z oprogramowania innych firm, skopiuj i wklej różne interesujące Cię wartości ilościowe w celu przeprowadzenia dodatkowych analiz.
      UWAGA: W obecnym protokole oprogramowanie GraphPad Prism zostało użyte do analizy wartości intensywności DHE w odpowiedzi na indukowany stres oksydacyjny spowodowany ekspozycją naH2O2i menadion.
  6. Dane i analiza statystyczna
    1. Obliczyć średnią średnią intensywność kanału 2 (reprezentującą całkowite wartości ROS i rodniki ponadtlenkowe).
      UWAGA: Wszystkie eksperymenty mające na celu obliczenie wartości intensywności powtórzono trzykrotnie z 6 powtórzeniami na warunek na każdym poziomie dawkowania.
    2. Wykonaj jednoczynnikowy test ANOVA lub test t, aby zmierzyć różnice w wartościach intensywności między różnymi warunkami testowymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dihydroetydium (DHE) jest fluorescencyjnym barwnikiem reagującym na nadtlenek anionorodnikowy, który dostarcza specyficznych informacji na temat wewnątrzkomórkowych stanów ROS. Barwnik DHE emituje naturalnie niebieską fluorescencję w cytoplazmie. Jednakże, w wyniku oddziaływania z rodnikami ponadtlenkowymi, przekształca się on w 2-hydroksyetydium, które emituje fluorescencję w zakresie fal czerwonych (>550 nm) (Rysunek 1). Barwnik DHE jest łatwo transportowany do wnętrza komórek i do jądr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym badaniu ustalono protokół oceny wewnątrzkomórkowej reaktywnej produkcji tlenu (ROS) napędzanej ponadtlenkami przy użyciu barwnika fluorescencyjnego dihydroetydyny (DHE) w systemie przesiewowym o wysokiej zawartości. Większość obecnych protokołów dostępnych w literaturze wykorzystuje DCFH-DA jako sondę obrazowania fluorescencyjnego do ilościowego oznaczania gatunków ROS. Jednak wiele badań wykazało, że DCFH-DA nie jest idealną sondą do pomiaru wewnątrzkomórkowego ROS. Różne powody postulowane dla nieprzydatności DCF...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

RK i RRG były wspierane przez grant z UNM Center for Metals in Biology and Medicine (CMBM) poprzez grant NIH NIGMS P20 GM130422. RRG zostało wsparte przez pilotażową nagrodę z grantu NM-INSPIRES P30 1P30ES032755. Wsparcie rdzenia obrazowania dla instrumentu CX7 Cellomics zostało zapewnione przez rdzenie centrum AIM ufundowane przez grant NIH P20GM121176. Chcielibyśmy podziękować dr Sharinie Desai i dr Li Chen za ich nieocenioną pomoc w kwestiach technicznych związanych z korzystaniem z platformy obrazowania CX7 Cellomics.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki wirówkowe 1,5 ml Firma VWR 20170-038 
Płytka 96-dołkowa Gwiazda Corning 07-200-90 
Cellomika Cx7ThermoFisher 
Kolagen Zaawansowana biomatryca   5056 
DHE (Dihydroethidium) ThermoFisher D1168 
DMEM Sigma   6046 
FBS Firma VWR 97068-085 
GraphPad PrismGraphPadVersion 6.0
Linia komórkowa HepG2ATCC
Hoechst ThermoFisher 33342 
Linia komórkowa HUH7ATCC
Nadtlenek wodoru Sigma 88597 
Linia komórkowa JHH4ATCC
Menadione Sigma M5625 
HCSDCX7LEDPRO

Bibliografia

  1. Juan, C. A., et al. The chemistry of reactive oxygen species (ros) revisited: Outlining their role in biological macromolecules (DNA, Lipids and Proteins) and induced pathologies. Int J Mol Sci. 22 (9), 4642(2021).
  2. Magnani, F., et al. Structure and mechanisms of ROS generation by NADPH oxidases. Curr Opin Struct Biol. 59, 91-97 (2019).
  3. Collin, F. Chemical basis of reactive oxygen species reactivity and involvement in neurodegenerative diseases. Int J Mol Sci. 20 (10), 2407(2019).
  4. Uttara, B., et al. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Curr Neuropharmacol. 7 (1), 65-74 (2009).
  5. Dikalov, S. I., et al. Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes. Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).
  6. Wang, Q., et al. Measurement of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial ROS in AMPK knockout mice blood vessels. Methods Mol Biol. 1732, 507-517 (2018).
  7. Griendling, K. K., et al. Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).
  8. Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).
  9. Gomes, A., et al. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
  10. Halliwell, B., et al. Free radicals in biology and medicine. , Oxford University Press, Oxford Academic. USA. (2015).
  11. Cho, S., et al. Fluorescence-based detection and quantification of features of cellular senescence. Methods Cell Biol. 103, 149-188 (2011).
  12. Dikalov, S. I., et al. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxid Redox Signal. 20 (2), 372-382 (2014).
  13. Kalyanaraman, B., et al. Recent developments in detection of superoxide radical anion and hydrogen peroxide: Opportunities, challenges, and implications in redox signaling. Arch Biochem Biophys. 617, 38-47 (2017).
  14. Robinson, K. M., et al. Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (41), 15038-15043 (2006).
  15. Zielonka, J., et al. Detection of 2-hydroxyethidium in cellular systems: a unique marker product of superoxide and hydroethidine. Nat Protoc. 3 (1), 8-21 (2008).
  16. Nazarewicz, R. R., et al. Rapid and specific measurements of superoxide using fluorescence spectroscopy. J Biomol Screen. 18 (4), 498-503 (2013).
  17. Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).
  18. Ameziane-El-Hassani, R., et al. Detection of reactive oxygen species in cells undergoing oncogene-induced senescence. Oncogene-Induced Senescence: Methods Protoc. 1534, 139-145 (2017).
  19. Abraham,, et al. High content screening applied to large-scale cell biology. Trends Biotechnol. 22 (1), 15-22 (2004).
  20. Criddle, D. N., et al. Menadione-induced reactive oxygen species generation via redox cycling promotes apoptosis of murine pancreatic acinar cells. J Biol Chem. 281 (52), 40485-40492 (2006).
  21. Goffart, S., et al. The type and source of reactive oxygen species influences the outcome of oxidative stress in cultured cells. Cells. 10 (5), 1075(2021).
  22. Kurutas, E. B. The importance of antioxidants which play the role in cellular response against oxidative/nitrosative stress: current state. Nutr J. 15 (1), 71(2015).
  23. Shad, K. F., Das, T. K. Introductory Chapter: Role of Fenton and Haber-Weiss Reaction in Epilepsy. Epilepsy-Seizures without Triggers. IntechOpen. , (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Fluorescencja dihydroetydiumpomiar wewnątrzkomórkowych ROSkomórki raka hepatokomórkowegoobrazowanie fluorescencyjneprzesiew toksykologicznydetekcja ponadtlenkuCellomics CX7przesiew leków
Wysokoprzepustowa ocena przesiewowa wytwarzania reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu barwnika fluorescencyjnego Dihydroethidium (DHE)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.