Method Article

Wykrywanie i kwantyfikacja DNA wirusa zapalenia wątroby typu B w czasie rzeczywistym w oparciu o reakcję łańcuchową polimerazy

DOI:

10.3791/66249

⸱

December 15th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
13B BlackBio Biotech India Limited

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykrywanie i kwantyfikacja DNA wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) w czasie rzeczywistym oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) jest czułą i dokładną metodą diagnozowania i monitorowania zakażenia HBV. W tym miejscu przedstawiamy protokół detekcji DNA HBV i pomiaru wiremii w próbce.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wirus zapalenia wątroby typu B (HBV) jest istotną przyczyną chorób wątroby na całym świecie. Może prowadzić do ostrych lub przewlekłych infekcji, co sprawia, że osoby są bardzo podatne na śmiertelną marskość wątroby i raka wątroby. Dokładne wykrywanie i oznaczanie ilościowe DNA HBV we krwi ma zasadnicze znaczenie dla diagnozowania i monitorowania zakażenia HBV. Najpowszechniejszą metodą wykrywania DNA HBV jest PCR w czasie rzeczywistym, który można wykorzystać do wykrycia wirusa i oceny wiremii w celu monitorowania odpowiedzi na terapię przeciwwirusową. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół wykrywania i oznaczania ilościowego DNA HBV w ludzkiej surowicy lub osoczu przy użyciu zestawu opartego na PCR w czasie rzeczywistym z oznaczeniem IVD. Zestaw wykorzystuje startery i sondy, które są ukierunkowane na wysoce konserwatywny region rdzenia genomu HBV i mogą dokładnie określić ilościowo wszystkie genotypy HBV (A, B, C, D, E, F, G, H, I i J). Zestaw zawiera również endogenną kontrolę wewnętrzną w celu monitorowania ewentualnego zahamowania PCR. Test ten trwa 40 cykli, a jego granica wynosi 38 Ct. Do oceny ilościowej DNA HBV w próbkach klinicznych wraz z zestawem dostarczany jest zestaw 5 wzorców kwantyfikacji. Wzorce zawierają znane stężenia DNA specyficznego dla HBV, które są skalibrowane zgodnie z 4Międzynarodowym Standardem WHO dla DNA HBV dla testu kwasów nukleinowych (kod NIBSC 10/266). Wzorce są wykorzystywane do walidacji funkcjonalności amplifikacji DNA specyficznej dla HBV oraz do wygenerowania krzywej wzorcowej, umożliwiającej ilościowe określenie DNA HBV w próbce. DNA HBV wykryto przy użyciu zestawu do PCR. Wysoka czułość i powtarzalność zestawu sprawiają, że jest on potężnym narzędziem w laboratoriach klinicznych, pomagając pracownikom służby zdrowia w skutecznym diagnozowaniu i leczeniu zakażeń HBV.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wirus zapalenia wątroby typu B (HBV) jest częściowo dwuniciowym wirusem DNA z rodzaju Orthohepadnavirus i rodziny Hepadnaviridae1. Może wywołać przewlekłą infekcję, która utrzymuje się przez całe życie, potencjalnie prowadząc do marskości wątroby i raka wątrobowokomórkowego2,3,4. Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) w 2019 r. szacowana populacja 296 milionów ludzi żyła z przewlekłym wirusowym zapaleniem wątroby typu B, a każdego roku 1,5 miliona osób było nowo zakażonych5.

Identyfikacja i pomiar DNA HBV w próbkach surowicy lub osocza służy jako cenna metoda wykrywania osób z trwającym zakażeniem wirusowym zapaleniem wątroby typu B, oceny skuteczności leczenia przeciwwirusowego i przewidywania prawdopodobieństwa powodzenia leczenia6,7,8,9,10,11. Wysoki poziom wiremii wiąże się ze zwiększonym ryzykiem progresji chorób wątroby, w tym marskości i raka wątroby12,13. W związku z tym precyzyjny pomiar wiremii ma kluczowe znaczenie dla śledzenia postępu zakażenia HBV i informowania o decyzjach dotyczących leczenia.

Ilościowe testy PCR w czasie rzeczywistym mają wyższą czułość, szerszy zakres dynamiczny i dokładniejszą ocenę ilościową DNA HBV niż konwencjonalne techniki PCR14,15,16,17. Na rynku dostępnych jest kilka komercyjnych zestawów do diagnostyki molekularnej opartej na PCR w czasie rzeczywistym do oznaczania ilościowego DNA HBV w próbkach surowicy lub osocza. W tym miejscu opisujemy szczegółowy proces wykrywania i oznaczania ilościowego DNA HBV w ludzkiej surowicy lub osoczu przy użyciu dostępnego na rynku, oznaczonego IVD zestawu do PCR w czasie rzeczywistym. Zestaw jest szeroko stosowany18,19, tani, ale bardzo czuły test, a jego charakterystyka działania jest porównywalna z innymi dostępnymi na rynku zestawami z oznaczeniem CE18. Oprócz amplifikacji regionu docelowego HBV, w zestawie znajduje się również endogenny gen kontroli wewnętrznej, który weryfikuje jakość próbek, jakość wyekstrahowanego DNA, amplifikację PCR i ewentualne zahamowanie PCR.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie nie obejmowało żadnych uczestników ani próbek klinicznych. Jedynym wykorzystanym materiałem biologicznym był IV Międzynarodowy Standard WHO dla DNA HBV do badania kwasów nukleinowych (kod NIBSC 10/266). Norma ta jest publicznie dostępnym materiałem referencyjnym, który nie zawiera żadnych danych osobowych ani danych umożliwiających identyfikację. W związku z tym nie była wymagana żadna etyczna zgoda na to badanie.

1. Ekstrakcja DNA

  1. Wyodrębnij DNA wirusa z próbki ludzkiej surowicy lub osocza. Wyekstrahowane DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia w PCR.
    UWAGA: Zalecana objętość surowicy lub osocza do ekstrakcji DNA wynosi 500 μl, a objętość elucji wynosi 50 μl. W tym badaniu DNA wirusa zostało wyekstrahowane przy użyciu zestawu do ekstrakcji wirusowych kwasów nukleinowych (tabela materiałów).

2. PCR w czasie rzeczywistym

  1. Rozmrozić wszystkie odczynniki (Tabela 1) zestawu do PCR w czasie rzeczywistym w temperaturze pokojowej (RT; 15-25 °C) przed rozpoczęciem PCR. Po rozmrożeniu wymieszaj składniki przez wirowanie impulsowe przez 10 s z umiarkowaną prędkością i odwiruj przy 8 000 × g przez 15 s w temperaturze pokojowej. Trzymaj wszystkie rozmrożone składniki w bloku chłodzącym.
  2. Przygotowanie do reakcji
    1. Przygotować mieszaninę PCR zgodnie z tabelą 2. Obliczyć objętość odczynników, które należy dodać, na podstawie liczby próbek, wzorców i braku kontroli matrycy.
      UWAGA: Podczas przygotowywania mieszanki PCR należy dodać co najmniej 10% dodatkowej objętości każdego odczynnika (np. jeśli wymagane jest 10 reakcji, obliczyć dla 11 reakcji).
    2. Odpipetować 15 μl wyżej przygotowanej mieszanki PCR do każdej probówki PCR. Następnie dodać 15 μl wyekstrahowanej próbki DNA. Dodać 15 μl co najmniej jednego z wzorców dla HBV (HBV Standard 1-5) jako kontrolę pozytywną (PC) do wykrywania DNA HBV i 15 μl wody wolnej od nukleaz klasy PCR jako kontrolę ujemną (NC). Aby wygenerować krzywą wzorcową wymaganą do oceny ilościowej DNA HBV, należy użyć wszystkich 5 wzorców ilościowych dostarczonych z zestawem (HBV Standard 1-5) dla każdej serii PCR.
    3. Zamknij probówki, wymieszaj składniki przez wirowanie impulsowe przez 10 s z umiarkowaną prędkością i odwiruj przy 8 000 × g przez 15 s w temperaturze pokojowej przed przejściem do termocyklera. Upewnij się, że w mieszaninie reakcyjnej nie ma pęcherzyków, ponieważ może to zakłócać wykrywanie fluorescencji.
  3. Ustawienia programu
    1. Zaprogramuj termocykler, używając warunków cyklicznych zgodnie z zaleceniami w Tabeli 3.
  4. Wybór kanału/fluoroforu
    1. Wybierz barwniki fluorescencyjne dla powszechnie używanych platform PCR w czasie rzeczywistym, jak wspomniano w Tabeli 4.
  5. analiza danych
    1. Po zakończeniu przebiegu przeanalizuj wykres wzmocnienia w skali liniowej.
    2. Ustawienie progu
      1. Ustaw próg w fazie wykładniczej reakcji PCR. Zalecane wartości progowe dla zestawu podano w tabeli 5. Bądź konsekwentny w ustawieniu progu. Po ustaleniu optymalnego progu dla testu należy go konsekwentnie stosować dla wszystkich próbek dla danej maszyny do PCR. Pomoże to zapewnić, że wyniki są dokładne i powtarzalne.
        UWAGA: Jeśli próg jest ustawiony zbyt nisko, sygnał może być poniżej poziomu szumu, a wartość Ct będzie niewiarygodna. Jeśli próg jest ustawiony zbyt wysoko, sygnał może znajdować się w fazie plateau reakcji, gdzie wzmocnienie nie jest tak wydajne, a wartość Ct może być niedokładna.
    3. Odcięcia
      1. Uruchom zestaw na 40 cykli amplifikacji. Nie należy brać pod uwagę żadnego amplifikacji powyżej 38 cykli dla jakiejkolwiek interpretacji.
    4. Jakościowa analiza wyników
      1. Użyj zestawu do jakościowego wykrywania DNA HBV. Użyj Standard 2 jako PC z oczekiwanymi wartościami Ct na poziomie 20 ± 2 dla HBV i 24 ± 3 dla IC.
      2. Upewnij się, że żadna kontrola szablonu (NTC) nie wykazuje żadnego wzmocnienia zarówno dla celów HBV, jak i kontroli wewnętrznej (IC). Jeśli w reakcji NTC zachodzi reakcja amplifikacji, mogło dojść do zanieczyszczenia próbki.
      3. Ponieważ punkt odcięcia testu wynosi 38, należy rozważyć każdą amplifikację przed 38 Ct dla celu HBV jako próbkę dodatnią pod względem HBV. Jeżeli wszystkie kontrole spełniają wyżej wymienione wymagania, należy rozważyć próbkę zgodnie z interpretacją podaną w tabeli 6.
    5. Ilościowa analiza wyników
      1. Należy skorzystać z zestawu 5 wzorców kwantyfikacji znanych stężeń DNA specyficznego dla HBV, które są skalibrowane względem 4. międzynarodowego standardu WHO dla DNA HBV dla technik amplifikacji kwasów nukleinowych (NAT)20 (Tabela 7).
      2. Zastosuj te standardy, aby wygenerować krzywą standardową. Wykorzystaj krzywą standardową do ilościowego określenia DNA HBV w nieznanej próbce.
        UWAGA: Oprogramowanie do PCR w czasie rzeczywistym wygeneruje krzywą wzorcową przy użyciu wartości Ct uzyskanych dla celów HBV wszystkich 5 wzorców i odpowiadających im stężeń w jednostkach międzynarodowych na mikrolitr (IU/μL).
      3. Interpretuj wartości dla nieznanych próbek tylko wtedy, gdy nachylenie wzorców mieści się w przedziale od -3,1 do -3,6, wartość R2 wynosi od 0,99 do 1,0, wydajność PCR wynosi od 90% do 110% (0,9-1,1), a w kontroli ujemnej nie ma amplifikacji.
      4. Oprogramowanie obliczy stężenie każdej próbki z dodatnim wynikiem HBV w jednostkach międzynarodowych na mikrolitr (IU/μL). Aby obliczyć miano wirusa (konwersja IU/μL na jednostki międzynarodowe na mililitr [IU/ml]), użyj następującego równania:
        Wynik (IU/mL) = (Wynik [IU/μL] x Objętość elucji [μL])/ Objętość próbki (ml)
        UWAGA: Czwarta Międzynarodowa Norma WHO dla DNA HBV, kod NIBSC 10/266, została wyekstrahowana w celu oczyszczenia wirusowego DNA z 0,5 ml osocza, wymyta oczyszczone wirusowe DNA do 50 μl buforu elucyjnego i użyta z zestawem PCR jako próbka referencyjna wraz z 5 wzorcami HBV i NTC. Miano wirusa HBV w próbce referencyjnej (kod NIBSC 10/266) obliczono jako (6659 IU/μL x 50 μL)/0,5 ml = 6,65,900 IU/mL.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematyczny schemat procesu wykrywania i ilościowego oznaczania DNA HBV z ludzkiego osocza/surowicy jest pokazany w Rysunek 1. Wykres wzmocnienia Standard 2 (używany jako PC) i NTC zarówno dla HBV, jak i IC jest pokazany na Rysunek 2. Rysunek 3 pokazuje krzywe amplifikacji dla próbki z dodatnim wynikiem HBV, próbki ujemnej HBV i próbki z inhibicją. Krzywa amplifikacji, wartość Ct dla HBV i uzyskane stężenie HBV w jednostkach między...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kod NIBSC 10/266 został przypisany do jednostki 9,55 000 IU/ml po rozpuszczeniu w 0,5 ml wody wolnej od nukleaz, zgodnie z informacjami dla dostawców21. Można to uznać za próbkę dodatnią pod względem wysokiego obciążenia HBV. Miano wirusa HBV określone przez zestaw do wiremii użyty w tym badaniu wynosiło 6,65,900 IU/ml (ryc. 4). Ponieważ skuteczność ekstrakcji DNA w każdym zestawie do ekstrakcji DNA nie wynosi 100%, część DNA jest często tracona podczas procesu oczysz...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy są powiązani z Kilpest India Limited, producentem zestawu do pomiaru wiremii HBV użytego w tym badaniu.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Praveen, Kusum, Chandan, Isha, Rashmi, Babli, Shivani, Ankita i Shikha za ich pomoc techniczną.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4th Międzynarodowa norma WHO dla wirusa zapalenia wątroby typu B DNANIBSCKod NIBSC: 10/266Czwarta norma WHO dotycząca DNA wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV), kod NIBSC 10/266, jest przeznaczona do stosowania do kalibracji wtórnych odczynników referencyjnych stosowanych w technikach amplifikacji kwasów nukleinowych HBV (NAT).
Maszyny ABI do PCR w czasie rzeczywistym ThermoFisher ScientificABI 7500; QuantStudio 5To jest maszyna do PCR w czasie rzeczywistym 
HBV, HCV i HIV Multiplex 14/198NIBSCKod NIBSC: 14/198Jest to bardzo nisko dodatni odczynnik triplex do testów NAT zawierających wirusowe zapalenie wątroby typu B (HBV), zapalenie wątroby typu C (HCV) i ludzki wirus niedoboru odporności-1 (HIV-1)
Maszyna do PCR w czasie rzeczywistym QIAGENQiagenRotor-Gene QTo jest maszyna do PCR w czasie rzeczywistym 
Zestaw TRUPCR HBV do pomiaru wiremii Kilpest India Limited3B294Jest to zestaw oparty na PCR w czasie rzeczywistym używany w tym badaniu do wykrywania DNA HBV i określania wiremii
Zestaw do ekstrakcji wirusowych kwasów nukleinowych TRUPCRKilpest India Limited3B214Jest to zestaw do ekstrakcji DNA wirusa HBV z NIBSC: 10/266 i NIBSC: 14/198

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ryu, W. -S. Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. , Elsevier, Academic Press. (2016).
  2. Lin, X., et al. Chronic hepatitis b virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: Review of disease progression. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 20 (6), 833-843 (2005).
  3. Iloeje, U. H., et al. Predicting cirrhosis risk based on the level of circulating Hepatitis B viral load. Gastroenterology. 130 (3), 678-686 (2006).
  4. Huang, Y. -T., et al. Lifetime risk and sex difference of hepatocellular carcinoma among patients with chronic Hepatitis B and C. Journal of Clinical Oncology. 29 (27), 3643(2011).
  5. World Health Organization. World Health Organization fact sheet. , https://www.who.int/news-room/fact-sheets (2023).
  6. Watanabe, M., Toyoda, H., Kawabata, T. Rapid quantification assay of hepatitis b virus DNA in human serum and plasma by fully automated genetic analyzer mutaswako g1. PLoS One. 18 (2), e0278143(2023).
  7. Chan, H. L. -Y., et al. Viral genotype and Hepatitis B virus DNA levels are correlated with histological liver damage in HBeAg-negative chronic Hepatitis B virus infection. The American Journal of Gastroenterology. 97 (2), 406-412 (2002).
  8. Liu, C. J., et al. Viral factors correlate with Hepatitis B e antigen seroconverson in patients with chronic Hepatitis B. Liver International. 26 (8), 949-955 (2006).
  9. Liu, C. -J., et al. Role of Hepatitis B viral load and basal core promoter mutation in hepatocellular carcinoma in Hepatitis B carriers. The Journal of Infectious Diseases. 193 (9), 1258-1265 (2006).
  10. Yeo, W., et al. Hepatitis B viral load predicts survival of HCC patients undergoing systemic chemotherapy. Hepatology. 45 (6), 1382-1389 (2007).
  11. Yim, H. J., et al. Levels of Hepatitis B virus (HBV) replication during the nonreplicative phase: HBV quantification by real-time PCR in korea. Digestive Diseases and Sciences. 52, 2403-2409 (2007).
  12. Noh, R., et al. Clinical impact of viral load on the development of hepatocellular carcinoma and liver-related mortality in patients with hepatitis c virus infection. Gastroenterology Research and Practice. 2016, 7476231(2016).
  13. Mendy, M., et al. Hepatitis B viral load and risk for liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma in the Gambia, West Africa. Journal of Viral Hepatitis. 17 (2), 115-122 (2010).
  14. Abe, A., et al. Quantitation of Hepatitis B virus genomic DNA by real-time detection PCR. Journal of Clinical Microbiology. 37 (9), 2899-2903 (1999).
  15. Pas, S. D., Fries, E., De Man, R. A., Osterhaus, A. D., Niesters, H. G. Development of a quantitative real-time detection assay for Hepatitis B virus DNA and comparison with two commercial assays. Journal of Clinical Microbiology. 38 (8), 2897-2901 (2000).
  16. Ronsin, C., Pillet, A., Bali, C., Denoyel, G. R. -A. Evaluation of the cobas ampliprep-total nucleic acid isolation-cobas Taqman Hepatitis B Virus (HBV) quantitative test and comparison to the versant HBV DNA 3.0 assay. Journal of Clinical Microbiology. 44 (4), 1390-1399 (2006).
  17. Sum, S. S. M., Wong, D. K. H., Yuen, J. C. H., Lai, C. L., Yuen, M. F. Comparison of the cobas taqman™ HBV test with the cobas amplicor monitor™ test for measurement of Hepatitis B virus DNA in serum. Journal of Medical Virology. 77 (4), 486-490 (2005).
  18. Lall, S., Choudhary, M. C., Mahajan, S., Kumar, G., Gupta, E. Performance evaluation of TRUPCR® HBV real-time PCR assay for Hepatitis B virus DNA quantification in clinical samples: Report from a tertiary care liver centre. Virusdisease. 30 (2), 186-192 (2019).
  19. Garg, G., et al. Presence of entry receptors and viral markers suggest a low level of placental replication of Hepatitis B virus in a proportion of pregnant women infected with chronic Hepatitis B. Scientific Reports. 12 (1), 17795(2022).
  20. NIBSC-Code:10/266. Standard for Hepatitis B Virus (Hbv) DNA for Nucleic Acid Amplification Techniques (NAT). , 4th ed, National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). Potters Bar, UK. NIBSC Code: 10/266 (2016).
  21. Kim, H., Hur, M., Bae, E., Lee, K. A., Lee, W. I. Performance evaluation of cobas HBV real-time PCR assay on Roche cobas 4800 system in comparison with cobas Ampliprep/cobas Taqman HBV test. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 56 (7), 1133-1139 (2018).
  22. Madihi, S., Syed, H., Lazar, F., Zyad, A., Benani, A. Performance comparison of the artus HBV QS-RGQ and the CAP/CTM HBV v2.0 assays regarding HEPATITIS B virus DNA quantification. BioMed Research International. 2020, 4159189(2020).
  23. Nibsc-14/198. , National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). At: HBV, HCV and HIV multiplex 14/198 https://www.nibsc.org/ (2023).
  24. Guvenir, M., Arikan, A. Hepatitis B virus: From diagnosis to treatment. Polish Journal of Microbiology. 69 (4), 391-399 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hepatitis B VirusHBV DNAReal Time PCRViral Load QuantificationPCR KitDNA DetectionClinical SamplesStandard CurvePCR EfficiencySerological Tests

Related Articles