Artykuł metodologiczny

Wstępna walidacja współrzędnych iniekcji stereotaktycznej za pomocą kriosekcji

DOI:

10.3791/66262

⸱

19 lipca 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University, School of Medicine, 2Key Laboratory of Anesthesiology (Shanghai Jiaotong University), Ministry of Education, 3Department of Anesthesiology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiaotong University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje praktyczną strategię przyspieszenia etapu weryfikacji współrzędnych iniekcji stereotaktycznej przed przeprowadzeniem śledzenia wirusa za pomocą barwników i zamrożonych skrawków.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stereotaktyczne wstrzyknięcie określonego obszaru mózgu stanowi podstawową technikę eksperymentalną w podstawowej neurobiologii. Naukowcy często opierają swój wybór parametrów iniekcji stereotaktycznej na atlasach mózgu myszy lub opublikowanych materiałach, w których wykorzystano różne populacje/wiek myszy i różne urządzenia stereotaktyczne, co wymaga dalszej walidacji parametrów współrzędnych stereotaktycznych. Skuteczność obrazowania wapnia, manipulacji chemogenetycznych i optogenetycznych zależy od precyzyjnej ekspresji genów reporterowych w obszarze zainteresowania, co często wymaga kilku tygodni wysiłku. Jest to więc czasochłonne zadanie, jeśli współrzędne docelowego obszaru mózgu nie zostaną wcześniej zweryfikowane. Stosując odpowiedni barwnik zamiast wirusa i wdrażając kriosekcję, naukowcy mogą obserwować miejsce wstrzyknięcia natychmiast po podaniu barwnika. Ułatwia to terminowe dostosowanie parametrów współrzędnych w przypadkach, gdy występują rozbieżności między rzeczywistym miejscem wstrzyknięcia a teoretycznym położeniem. Takie korekty znacznie zwiększają dokładność ekspresji wirusa w regionie docelowym w kolejnych eksperymentach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prawie wszystkie nowoczesne narzędzia neuromodulacji, w tym zapis wapnia in vivo, narzędzia optogenetyczne i chemogenetyczne, wymagają użycia współrzędnych stereotaktycznych do celowania w obszar zainteresowania mózgu1,2,3, tworząc podstawę manipulacji neuronalnej. Współrzędne stereotaktyczne dla obszarów mózgu myszy są zdefiniowane w odniesieniu do bregma i lambda, kostnych punktów orientacyjnych na czaszce, tworzących tak zwany stereotaktyczny układ współrzędnych wywodzący się z czaszki. Zarówno bregma, jak i lambda mogą służyć jako punkt zerowy współrzędnych trójwymiarowych. Trzy osie to przednio-tylna (AP), przyśrodkowo-boczna (ML) i grzbietowo-brzuszna (DV), reprezentująca osie y, x i z na cyfrowym wyświetlaczu instrumentów stereotaktycznych. Dla dobrze znanych obszarów mózgu parametry współrzędnych stereotaktycznych określonego obszaru można uzyskać z atlasów mózgu myszy 4 (np. Paxinos i mózg myszy Franklina we współrzędnych stereotaktycznych) i/lub opublikowanej literatury5,6. Jednak dalsza walidacja jest konieczna ze względu na różnice w sprzęcie stereotaktycznym oraz wiek/populacje myszy używanych przez różnych badaczy.

Struktura jest podstawą funkcji. Obwody neuronalne stanowią podstawę wielu funkcji mózgu, takich jak czynności poznawcze, emocje, pamięć, funkcje sensoryczne i motoryczne1. Etykietowanie struktury i manipulowanie aktywnością obwodów nerwowych jest niezbędne do zrozumienia funkcji określonego obwodu neuronalnego. W ciągu ostatnich dziesięcioleci znaczniki neuronowe ewoluowały przez wiele pokoleń; Wczesne badania przyjęły aglutyninę z kiełków pszenicy (WGA) i aglutyninę phaseolus vulgaris (PHA) jako znaczniki następcze, a fluorogold (FG), podjednostkę B toksyny (CTB), karbocyjaninę jako znaczniki wsteczne. Jednak w przeciwieństwie do znaczników wirusowych, te tradycyjne znaczniki neuronalne nie mogą integrować genów egzogennych z gospodarzem ani nie mają selektywności typu komórki. W dzisiejszych czasach strategia wirusowa stała się ważną propozycją podczas podstawowych badań neurobiologicznych. Do różnych celów badawczych można wybrać różne narzędzia wirusowe7,8. Istnieją wirusy nietranssynaptyczne, wirusy trans-multisynaptyczne (wsteczne i następcze) oraz wirusy transmonosynaptyczne (wsteczne i następcze). Każda kategoria zawiera kilka typów o odpowiednich cechach.

Proces podawania i wyrażania wirusa jest bardzo czasochłonny i zasobożerny, często trwa tygodnie, a nawet dłużej. Wśród różnych wektorów wirusowych, wirus związany z adenowirusem został zidentyfikowany jako obiecujący sposób dostarczania genów, zapewniający szerokie okno od 3 do 8 tygodni po wstrzyknięciu dla procedury eksperymentalnej7,8. W miarę rozwoju AAV analizę można przeprowadzić 2-3 tygodnie po podaniu9,10. Inne znaczniki obwodów neuronalnych, takie jak wirus wścieklizny rzekomej (PRV) i wirus wścieklizny (RV), również wymagają okresu śledzenia wynoszącego co najmniej 2-7 dni11,12,13,14,15. W związku z tym wstępna weryfikacja miejsca wstrzyknięcia przed obserwacją sygnałów fluorescencyjnych jest efektywna zarówno czasowo, jak i kosztowo.

Aby ułatwić prostą i szybką weryfikację stereotaktycznych zastrzyków, w tym badaniu, barwnik jest podawany przed wektorami wirusowymi, a kriosekcja umożliwia badaczom obserwację miejsca wstrzyknięcia i śledzenie go w ciągu 30 minut po wstrzyknięciu.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Animal Research Reporting In Vivo Experiments (ARRIVE) oraz National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Niniejsze badanie zostało zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Szpitala Renji, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Do niniejszego badania wykorzystano ośmiotygodniowe samce myszy C57BL/6J. Zwierzęta zostały pozyskane w celach handlowych (patrz Tabela Materiałów) i trzymane w standardowych klatkach (22 °C ± 2 °C, 12 godzin/12 godzin cykl światła/ciemności, pożywienie i woda ad libitum).

1. Wybór docelowych obszarów mózgu

UWAGA: To jest sterylna procedura. Upewnij się, że wszystkie narzędzia chirurgiczne są wysterylizowane. Spryskaj rękawice alkoholem przed kontaktem z narzędziami chirurgicznymi. Unikaj dotykania końcówki narzędzi lub obszaru operacyjnego rękawiczkami. Upewnij się, że mysz jest odpowiednio znieczulona przed rozpoczęciem zabiegu, sprawdzając, czy nie ma utraty odruchów prostowania i braku reakcji na stymulację skóry. Przed wierceniem i wstrzyknięciem należy ściśle monitorować częstość oddechów (60-220 oddechów na minutę, średnio 100-150 oddechów na minutę) oraz amplitudę oddechu (powinna być stała i nie powinna być zbyt płytka ani głęboka). Należy zwrócić uwagę na wszelkie istotne zmiany w częstości lub amplitudzie oddechów.

  1. Znieczulić mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym 1,25% tribromoetanolu (250 mg/kg) za pomocą igły 29 G. Zgolić włosy na czaszce, gdy zniknie odruch prostowania. Zamocuj mysz w ramie stereotaktycznej (patrz Tabela materiałów), mocując górne siekacze za pomocą zacisku na nos i stabilizując głowę za pomocą dwóch nauszników.
  2. Zastosuj maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu oczu. Zdezynfekuj skórę głowy, trzykrotnie przetrzymując ją Anerdian (roztwór dezynfekujący; patrz Tabela Materiałów). Wstrzyknąć podskórnie 0,2 ml 1% lidokainy za pomocą igły insulinowej 29 G, aby zapewnić miejscowe znieczulenie.
  3. Wykonaj nacięcie 0,5 cm za pomocą nożyczek do oczu, aby odsłonić czaszkę. Użyj bawełnianego wacika nasączonego 3%H2O2, aby wyszorować odsłoniętą czaszkę w celu usunięcia okostnej. Pozostaw czaszkę do wyschnięcia.
  4. Przymocuj wiertło do przyrządu stereotaktycznego. Wyreguluj pokrętła ramion stereotaktycznych, aby precyzyjnie ustawić końcówkę wiertła na bregmie za pomocą lupy i zarejestruj wartość osi z za pomocą cyfrowego wyświetlacza LCD.
    1. Wyreguluj pokrętła i ustaw końcówkę wiertła na lambdzie i zapisz wartość osi z. Wyreguluj nos clamp i nauszniki, aby zbliżyć dwie wartości z, i powtarzaj powyższe kroki, aż różnica między dwiema wartościami z będzie mniejsza niż 0.1 mm.
      UWAGA: Osie x, y i z na cyfrowym wyświetlaczu LCD odpowiadają odpowiednio osi przyśrodkowo-bocznej (ML), przednio-tylnej (AP) i grzbietowo-brzusznej (DV). Można uznać, że bregma i lambda znajdują się na tej samej płaszczyźnie poziomej, gdy różnica między dwiema wartościami z jest mniejsza niż 0,1 mm.
  5. Upewnij się, że mózg jest na poziomie lewo-prawo. Wyreguluj nauszniki przymocowane do ramy stereotaktycznej za pomocą tej samej skali. Weźmy na przykład jądro nakrywki bocznej, część brzuszną (LDTgV); jego współrzędne stereotaktyczne wynoszą -5,2 dla x, +0,8 dla y, -4,0 dla z, zgodnie z atlas16.
    1. Wyreguluj listwę douszną, aby wykonać wiertło na (-5.2, +0.8), aby zmierzyć wartość z w kierunku grzbietowo-brzusznym i przesuń wiertło do (-5.2, -0.8), aby zmierzyć wartość z.
      UWAGA: Uważa się, że lewy i prawy znajduje się na równym poziomie, gdy różnica między dwiema wartościami z jest mniejsza niż 0,2 mm. Pręty uszne muszą być włożone we właściwe miejsce, ponieważ zewnętrzny przewód słuchowy jest symetryczny. Jeśli różnica między dwiema wartościami Z jest większa niż 0,5 mm, wkładka douszna może zostać włożona w niewłaściwe miejsce.
  6. Ponownie ustaw wiertło na bregmie i ustaw trzy współrzędne na cyfrowym wyświetlaczu LCD na zero. Umieść wiertło nad obszarem zainteresowania, używając współrzędnych odniesienia. Rozpocznij ćwiczenie.
    1. Stopniowo opuszczaj wiertło za pomocą ramienia pionowego, aż wbije się w czaszkę. Usuń zanieczyszczenia i krew za pomocą bawełnianych wacików.
      UWAGA: Uważaj, aby nie uszkodzić tkanki mózgowej.

2. Przygotowanie roztworu barwnika i mikroiniekcja mózgu

  1. Pobrać 25 μl buforu ładującego SDS-PAGE zawierającego błękit bromofenolowy (patrz tabela materiałów) do probówki mikrowirówkowej o pojemności 200 μl. Dodać 50 μl ddH2O do probówki, aby przygotować roztwór barwnika.
  2. Przykryj okienko czaszki wacikiem zwilżonym solą fizjologiczną. Zapewnić drożność mikrostrzykawki poprzez wielokrotne zasysanie i wydychanie soli fizjologicznej. Załaduj 0,3 μl barwnika do mikrostrzykawki. Podłączyć strzykawkę i zmotoryzowany mikrowstrzykiwacz stereotaktyczny do ramienia stereotaktycznego.
  3. Umieść końcówkę strzykawki na bregmie i ustaw współrzędne na zero na cyfrowym wyświetlaczu LCD. Dopasuj igłę do obszaru zainteresowania zgodnie ze współrzędnymi odniesienia. Ustaw prędkość wtrysku na 0,1 μl/min i uruchom zmotoryzowany mikrowtryskiwacz, dostarczając 0,3 μl niebieskiego barwnika do obszaru docelowego. Pozostawić strzykawkę na miejscu przez co najmniej 10 minut przed powolnym wyjęciem wstrzykiwacza.
    UWAGA: U tych samych myszy można stosować barwniki o różnych kolorach, aby rozróżnić blisko położone regiony. Przetestuj inne barwniki pod kątem odpowiednich stężeń w oparciu o ich właściwości fizyczne. Zaleca się stosowanie formuły błękitu bromofenolowego i dokładne wypłukanie strzykawki przed i po użyciu, aby zapobiec zatorom. Dostosuj objętość wtrysku na podstawie dyfuzji barwnika.

3. Pobieranie tkanki mózgowej i kriosekcja

  1. Zwolnij mysz z ramki stereotaktycznej. Znieczulić mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym 50 mg/kg pentobarbitalu sodu za pomocą igły 29 G. Przymocuj mysz do płyty piankowej za pomocą taśmy.
  2. Otwórz obie strony klatki piersiowej, aby wywołać szybkie uduszenie. Wykonaj nacięcie 1-2 mm w prawym uszku przedsionka. Wprowadzić igłę infuzyjną do lewej komory. Wlej 20 ml wstępnie schłodzonego roztworu soli fizjologicznej i 20 ml mrożonego 4% roztworu paraformaldehydu.
  3. Odetnij głowę myszy nożyczkami do preparowania tkanek (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). Usuń skórę, wykonując nacięcie wzdłuż linii środkowej od szyi do nosa, a następnie odsłoń czaszkę. Usuń resztki mięśni na czaszce za pomocą kleszczy lub nożyczek.
  4. Umieść końcówkę jednego ostrza cienkich nożyczek między otworem wielkim a mózgiem, tak aby ostra krawędź była skierowana w stronę kości, na rostralnym końcu szwu środkowego strzałkowego. Przystąp do przesuwania i przecinania czaszki wzdłuż szwu środkowego strzałkowego. Użyj kleszczy, aby usunąć czaszkę, odsłaniając odsłonięty mózg.
    UWAGA: Zachowaj ostrożność, aby uniknąć uszkodzenia mózgu podczas operacji. Przed usunięciem wiórów kostnych ostrożnie odklej wszelkie opony mózgowe, które mogą być przyczepione do czaszki. Ten środek ostrożności jest kluczowy, aby zapobiec przypadkowemu pokrojeniu tkanki mózgowej podczas procesu.
  5. Włącz moc kriostatu rotacyjnego mikrotomu (patrz Tabela materiałów) i ustaw temperaturę komory na -20 °C. Wlej niewielką ilość związku OCT, aby równomiernie pokryć powierzchnię krążka próbki. Umieść go w komorze kriogenicznej i pozwól OCT zastygnąć.
  6. Przymocuj krążek do głowicy próbki. Zbliż ostrze do bloku i przytnij blok OCT, aby uzyskać płaską płaszczyznę równoległą do tarczy.
  7. Wytnij mózg w kierunku koronalnym z dala od miejsca wstrzyknięcia w formie do wycinania mózgu za pomocą ostrza do golenia. Umieść tkankę mózgową zawierającą miejsce wstrzyknięcia ściętą stroną do dołu na płaskiej płaszczyźnie OCT.
    1. Wlej OCT na mózg i włóż dysk do kriokomory, pozwalając blokowi próbki zestalić się. Wlewaj OCT kilkakrotnie na mózg, aż mózg zostanie całkowicie osadzony w OCT.
      UWAGA: Dodaj związek OCT warstwa po warstwie. Po zamrożeniu poprzedniej warstwy OCT wlej kolejną warstwę związku OCT na mózg.
  8. Przytnij blok próbki, aż obszar docelowy będzie się zbliżał. Wykonać kilka odcinków od poziomu miejsca wstrzyknięcia. Zebrać wycinki mózgu koronalnego na 6-dołkową płytkę zawierającą PBS o temperaturze pokojowej za pomocą małego pędzelka do pisania utrzymywanego w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Ustaw grubość cięcia na większą, aby przyciąć blok, a następnie ustaw grubość cięcia na 40 μm, gdy ostrze zbliża się do miejsca wstrzyknięcia. Jeśli używane są znaczniki obwodów neuronalnych, myszy nie są natychmiast uśmiercane. Umieść mysz w sterylnej, pooperacyjnej klatce rekonwalescencji na kocu grzewczym w celu odzyskania sprawności po znieczuleniu. Po przebudzeniu umieść myszy w oryginalnej klatce lub nowej klatce.

4. Obrazowanie

  1. Umyj OCT PBS o temperaturze pokojowej. Użyj pędzla, aby podnieść sekcje mózgu i umieścić je na szkiełku. Pozostaw sekcje do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej.
  2. Obserwuj wstrzyknięty obszar wizualnie lub użyj mikroskopu, gdy jądra docelowe są niewielkie. Porównaj lokalizację wstrzykniętego barwnika z odpowiadającym mu regionem w atlasie mózgu.
    UWAGA: Dostosuj wartości osi x, y i z zgodnie z kierunkiem i odległością odchylenia punktu wtrysku. Może być konieczne wielokrotne powtórzenie wszystkich kroków w tym protokole, aby dokładnie określić współrzędne.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie z powodzeniem zidentyfikowało miejsce wstrzyknięcia w ciągu 30 minut przy użyciu zademonstrowanej metody. Początkowo roztwór ładujący próbkę SDS-PAGE zawierający błękit bromofenolowy wstrzyknięto do LDTgV myszom C57/BL. Rysunek 1A przedstawia schematyczne przedstawienie wstrzykiwania roztworu barwnika. Rozkład niebieskiego barwnika w LDTgV jest zilustrowany na Rysunek 1B.

Błękit bromofenolowy został również wstrzyknięty do kory przedlimbicznej mPFC, kory podlimbicznej mPFC i ciała migdałowatego basomedialnego (BMA), aby ocenić uniwersalność tego protokołu. Jak pokazano na Rysunek 1C-E i Rysunek 2A, niebieski barwnik był rozprowadzany w korze przedlimbicznej mPFC, korze podlimbicznej mPFC i BMA.

Ponadto, wirus związany z adenowirusem przenoszący fluorescencyjne białko mCherry został wstrzyknięty do LDTgV (współrzędne zostały zweryfikowane za pomocą roztworu barwnika). Ekspresja wirusa trwała cztery tygodnie. Rozkład neuronów mCherry+ w LDTgV jest przedstawiony w Rysunek 2B.

figure-results-1
Rysunek 1: Wstrzykiwanie roztworu barwnika. (A) Schemat ideowy wstrzykiwania roztworu barwnika. (B) Dystrybucja niebieskiego barwnika w LDTgV. (C) Dystrybucja niebieskiego barwnika w korze przedlimbicznej mPFC. (D) Dystrybucja niebieskiego barwnika w korze podlimbicznej mPFC. (E) Dystrybucja niebieskiego barwnika w BMA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Rozkład niebieskiego barwnika i rozkład mCherry oglądane pod mikroskopem. (A) Rozkład niebieskiego barwnika w korze przedlimbicznej mPFC (10-krotne powiększenie, podziałka = 500 μm). (B) Reprezentatywny obraz rozkładu mCherry w regionie LDTgV uzyskany za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (10-krotne powiększenie, podziałka = 500 μm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule opisano stabilną strategię weryfikacji dokładności stereotaktycznych wstrzyknięćdo mózgu 5,6 szybciej i prościej przed śledzeniem wirusa, ale niezastąpiony aspekt ekspresji genu reporterowego w regionie mózgu ma kluczowe znaczenie dla znakowania regionów mózgu. Użyty przez nas niebieski barwnik pozwolił na natychmiastową wizualizację miejsca iniekcji.

Kilka kluczowych etapów tego protokołu przyczynia się do poprawy dokładności miejsca wstrzyknięcia. Po pierwsze, zapewnienie poziomu mózgu od lewej do prawej w instrumencie stereotaktycznym od kroku 1.5; Ten krok wymaga od operatorów zaznajomienia się z anatomią czaszki, upewnienia się, że nauszniki są umieszczone we właściwej pozycji. Skale na nausznikach i ramka stereotaktyczna służą również jako odniesienia. Po drugie, znalezienie dokładnego punktu zerowego, bregmy, w kroku 1.6 i kroku 2.3. Czasami znaczna rozbieżność we współrzędnych znalezionych w krokach 1.6 i 2.3 wynika ze znacznej różnicy w położeniu punktu zerowego. Może to spowodować, że igła mikroiniektora nie będzie w stanie przeniknąć przez okno czaszki. W takich przypadkach konieczne jest przemieszczenie punktu zerowego i w razie potrzeby utworzenie nowego okna czaszkowego. Mimo to nadal konieczne jest ponowne ustalenie punktu zerowego i ponowne znalezienie współrzędnych w kroku 2.3; Nie można bezpośrednio wprowadzić mikrostrzykawki z wcześniej wykonanego okienka czaszkowego.

W porównaniu z cięciem niezamrożonego mózgu w formie do wycinania mózgu myszy, strategia ta zapewnia dokładniejszy wynik, ponieważ blok próbki stałej zapobiega ściskaniu mózgu przez ostrze i powodowaniu przemieszczania barwnika z punktów wstrzyknięcia. Co więcej, sekcje mózgu przecięte przez plastra mózgu są stosunkowo grubsze i niemożliwe do zlokalizowania małych jąder mózgowych. Jednak w porównaniu ze standardowym procesem kriosekcji tkanki mózgowej 11,12,13,14,15, skróciliśmy czas przetwarzania o co najmniej 72 godziny, pomijając etapy odwodnienia, co spowodowało, że sekcje mózgu były bardziej kruche i trudniejsze do wychwycenia na szkiełku podstawowym, co stanowi główną słabość tego protokołu.

Podczas tworzenia okien czaszkowych do wstrzykiwania barwnika, mocne przymocowanie wiertła dentystycznego do ramienia stereotaktycznego, zamiast trzymania go w ręku, ułatwia kontrolowanie głębokości wiercenia za pomocą pokrętła precyzyjnej regulacji, zmniejszając w ten sposób możliwość uszkodzenia tkanki mózgowej.

Podsumowując, badanie to dostarczyło obiecującej metody wstępnej weryfikacji dokładnych współrzędnych stereotaktycznych przed śledzeniem wirusa, dzięki czemu późniejszy proces znakowania i śledzenia neuronów jest bardziej wiarygodny.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (grant nr 82101249 dla XY Sun), Chińska Fundacja Badań Podoktoranckich (grant nr 2022M722125 dla XY Sun). Shanghai Sailing Program (grant nr 21YF1425100 dla SH Chen). Specjalny Projekt Badań Klinicznych Miejskiej Komisji Zdrowia w Szanghaju (grant nr 202340088 dla J Zhou). Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (grant nr 82101262 dla X Zhang, grant nr 82101287 dla SH Chena).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1.0 &mikro; L, Strzykawka Neuros, Model 7001 KH, 32 G, Styl Punktowy 3Hamilton65458-01
200 μ L końcówki do pipetbiosharpBS-200-T
Strzykawka 20 mlUprzejmie grupuj
roztwór 3% H2O2Lircon Company
6-dołkowa płytkaShengyou Biotech20006
AnerdianLikang Zaawansowana technologicznie31001002
Płytka przeciwrolkowaLeica14047742497
BD insulina strzykawkaBecton,Dickinson and Company328421
Bend ząbkowane kleszcze preparacyjneJinzhongJD1050
Oprogramowanie wymiarów CellsensWacik
Fisher Scientific23-400-122
Dapi-Fluoromount-GSouthernbiotech0100-20
WiertłoLongxiang
Cienkie pędzleHWAHONG
Drobne nożyczkiJinzhongy00030
Mikroskopia fluorescencyjnaOlympusBX63
mikrotom do zamrażaniaLeicaCM1950
Kleszcze hemostatyczne proste z zębemJinzhongJ31010
Igła infuzyjna 0,7 mmUprzejmie proszę
Chlorowodorek lidokainy do wstrzykiwańHarvest Pharmaceutical Company71230803
Szkło powiększająceM& G Chenguang Stationery
Male C57 / BLmyszy Szanghajski Instytut Badań nad Planowanym Rodzicielstwem– Myszy laboratoryjne
koronalna forma do wycinków mózguRWD Life Science68713
Probówka do mikrowirówekbiosharpBS-02-P
Ostrza mikrotomuLeica819
Maść okulistycznaCisen Pharmaceutical CompanyG23HDM9M4S5
paraformaldehydBiosharpBL539A
Pompy perystaltyczneHarvard Apparatus70-4507
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiServicebioG4202
Piette 2-200 μ Lthermofisher4642080
SDS-PAGE ładowanie próbki zawierające błękit bromofenolowyBeyotimeP0015A
Ostrza do goleniaBFYING91560618
SlajdyCitotest Scientific188105
Aparat stereotaktycznyRWD Life Science68807
Kleszcze preparacyjne z prostymi zębamiJinzhongJD1060
Uchwyt strzykawkiRWD Life Science68206
Nożyczki do tkanekJinzhongJ21040
Związek Tissue-Tek OCTSakura4583
TribromoetanolAibei BiotechnologyM2910
bawełniany Olympus BK

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, D., et al. Brain-derived neurotrophic factor-mediated projection-specific regulation of depressive-like and nociceptive behaviors in the mesolimbic reward circuitry. Pain. 159 (1), 175(2018).
  2. Gan, Z., et al. Layer-specific pain relief pathways originating from primary motor cortex. Science. 378 (6626), 1336-1343 (2022).
  3. Laing, B. T., et al. Anterior hypothalamic parvalbumin neurons are glutamatergic and promote escape behavior. Curr Biol. 33 (15), 3215-3228 (2023).
  4. Perens, J., et al. Multimodal 3D mouse brain atlas framework with the skull-derived coordinate system. Neuroinformatics. 21 (2), 269-286 (2023).
  5. Adhikari, A., et al. Basomedial amygdala mediates top-down control of anxiety and fear. Nature. 527 (7577), 179-185 (2015).
  6. Tao, Y., et al. Projections from infralimbic cortex to paraventricular thalamus mediate fear extinction retrieval. Neurosci Bull. 37 (2), 229-241 (2021).
  7. Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-associated viral vectors in neuroscience research. Mol Ther Methods Clin Dev. 17, 69-82 (2020).
  8. Ansarifar, S., et al. Impact of volume and expression time in an aav-delivered channelrhodopsin. Mol Brain. 16 (1), 77(2023).
  9. Gonzalez, T. J., et al. Structure-guided AAV capsid evolution strategies for enhanced CNS gene delivery. Nat Protoc. 18 (11), 3413-3459 (2023).
  10. Sun, X. Y., et al. Two parallel medial prefrontal cortex-amygdala pathways mediate memory deficits via glutamatergic projection in surgery mice. Cell Rep. 42 (7), 112719(2023).
  11. Koren, T., et al. Insular cortex neurons encode and retrieve specific immune responses. Cell. 184 (25), 6211(2021).
  12. Poller, W. C., et al. Brain motor and fear circuits regulate leukocytes during acute stress. Nature. 607 (7919), 578-584 (2022).
  13. Huang, L., et al. A visual circuit related to habenula underlies the antidepressive effects of light therapy. Neuron. 102 (1), 128-142 (2019).
  14. Hu, Z., et al. A visual circuit related to the periaqueductal gray area for the antinociceptive effects of bright light treatment. Neuron. 110 (10), 1712-1727 (2022).
  15. Du, W., et al. Directed stepwise tracing of polysynaptic neuronal circuits with replication-deficient pseudorabies virus. Cell Rep Methods. 3 (6), 100506(2023).
  16. Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. 2nd ed. , Academic Press. (2001).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Stereotaxic InjectionCryosectioning ValidationBrain CoordinatesMouse BrainInjection Site VerificationBromophenol Blue DyeStereotaxic FrameCoronal Brain SlicesMicro Syringe InjectionRotary Microtome

Powiązane artykuły