Ten protokół wykorzystuje obrazowanie za pomocą arkusza świetlnego do badania funkcji skurczu serca u larw danio pręgowanego i uzyskania wglądu w mechanikę serca poprzez śledzenie komórek i interaktywną analizę.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie 4D Light-sheet skurczu serca danio pręgowanego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Danio pręgowany to intrygujący organizm modelowy, znany ze swojej niezwykłej zdolności do regeneracji serca. Badanie kurczącego się serca in vivo jest niezbędne do uzyskania wglądu w zmiany strukturalne i funkcjonalne w odpowiedzi na urazy. Jednak uzyskanie wysokiej rozdzielczości i szybkości 4-wymiarowych (4D, 3D przestrzennych + 1D temporalnych) obrazów serca danio pręgowanego w celu oceny architektury i kurczliwości serca pozostaje wyzwaniem. W tym kontekście, aby przezwyciężyć te ograniczenia techniczne, stosuje się własny mikroskop arkuszowy (LSM) i niestandardową analizę obliczeniową. Ta strategia, obejmująca budowę systemu LSM, synchronizację retrospektywną, śledzenie pojedynczych komórek i analizę kierowaną przez użytkownika, umożliwia zbadanie mikrostruktury i funkcji kurczliwości w całym sercu w rozdzielczości pojedynczej komórki w transgenicznych larwach danio pręgowanego Tg(myl7:nucGFP). Dodatkowo jesteśmy w stanie dodatkowo włączyć mikroiniekcję związków małocząsteczkowych w celu wywołania uszkodzenia serca w precyzyjny i kontrolowany sposób. Ogólnie rzecz biorąc, ramy te pozwalają śledzić zmiany fizjologiczne i patofizjologiczne, a także mechanikę regionalną na poziomie pojedynczej komórki podczas morfogenezy i regeneracji serca.
Wprowadzenie
Danio rerio danio pręgowany (Danio rerio) jest szeroko stosowanym organizmem modelowym do badania rozwoju, fizjologii i naprawy serca ze względu na jego przezroczystość optyczną, podatność genetyczną i zdolność regeneracyjną1,2,3,4. Po zawale mięśnia sercowego, podczas gdy zmiany strukturalne i funkcjonalne wpływają na wyrzut serca i hemodynamikę, ograniczenia techniczne nadal utrudniają badanie dynamicznego procesu podczas regeneracji serca z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną. Na przykład konwencjonalne metody obrazowania, takie jak mikroskopia konfokalna, mają ograniczenia pod względem głębokości obrazowania, rozdzielczości czasowej lub fototoksyczności w celu uchwycenia zmian dynamicznych i oceny funkcji skurczu serca podczas wielu cykli pracy serca5.
Mikroskopia arkuszowa stanowi najnowocześniejszą metodę obrazowania, która skutecznie rozwiązuje te problemy poprzez szybkie przesuwanie lasera przez komorę serca i przedsionek, uzyskując szczegółowe obrazy o zwiększonej rozdzielczości czasoprzestrzennej i znikomych efektach fotowybielania i fototoksyczności6,7,8,9,10,11.
Ten protokół wprowadza kompleksową strategię obrazowania, która obejmuje budowę systemu LSM, rekonstrukcję obrazu 4D, śledzenie komórek 3D i interaktywną analizę w celu uchwycenia i przeanalizowania dynamiki kardiomiocytów w całym sercu podczas wielu cykli pracy serca12. Dostosowany system obrazowania i metodologia obliczeniowa pozwalają śledzić mikrostrukturę mięśnia sercowego i funkcję kurczliwości na poziomie pojedynczej komórki u transgenicznych larw danio pręgowanego Tg(myl7:nucGFP). Ponadto związki małocząsteczkowe zostały dostarczone do zarodków za pomocą mikroiniekcji, aby ocenić uszkodzenie serca wywołane lekiem i późniejszą regenerację. Ta holistyczna strategia stanowi punkt wyjścia do badania in vivo strukturalnych, funkcjonalnych i mechanicznych właściwości mięśnia sercowego na poziomie pojedynczej komórki podczas rozwoju i regeneracji serca.
Protokół
Zgoda na to badanie została udzielona przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Teksańskiego w Dallas, na podstawie protokołu numer #20-07. Do niniejszego badania wykorzystano transgeniczne larwy danio pręgowanego Tg(myl7:nucGFP)12. Wszystkie dane pozyskiwane i przetwarzane po ich przetwarzaniu zostały przeprowadzone przy użyciu oprogramowania typu open source lub platform z licencjami badawczymi lub edukacyjnymi. Zasoby są dostępne u autorów na uzasadnione żądanie.
1. Hodowla danio pręgowanego i mikroiniekcja zarodków
Czas: 2 dni
- Utrzymuj i hoduj dorosłego danio pręgowanego poprzez standardowe procedury pielęgnacyjne i hodowlane. Szczegółowe metody można znaleźć w poprzednim raporcie13.
- Wykonaj mikroiniekcję zgodnie z ustalonym protokołem14. W niniejszym badaniu mikroiniekcję wykonano w stadium 1-2 komórek (zygoty).
UWAGA: Kluczowe znaczenie ma dokładne zidentyfikowanie tego etapu dla skutecznej mikroiniekcji i zapewnienia spójności rozwojowej. W fazie jednokomórkowej na żółtku tworzy się mała kopuła, która trwa zwykle około 12 minut. Po przejściu do etapu dwukomórkowego widoczne stają się dwie sąsiadujące ze sobą kopuły, a etap ten trwa przez około 45 minut po zapłodnieniu15. Bardziej szczegółowe informacje na temat budowy systemu można znaleźć w innych raportach lub protokołach12,16,17.
2. Przygotowanie i montaż zarodków/larw danio pręgowanego
Czas: 7 dni
- Przenieś zarodki 1 dzień po zapłodnieniu (dpf) do wody E3 z 0,2 mM 1-fenylo-2-tiomocznika (PTU) (patrz tabela materiałów), aby zapobiec tworzeniu się pigmentu.
- Zastępuj pożywkę świeżą wodą E3 z PTU codziennie aż do obrazowania LSM.
- Obrazuj zarodki lub larwy za pomocą mikroskopu stereoskopowego, aby zarejestrować ich rozwój w żądanych punktach czasowych od 0 do 7 dpf.
- Przygotowanie segmentowych probówek z fluorowanego etylenu i propylenu (FEP) o średnicy wewnętrznej 2 mm do osadzania larw danio pręgowanego w systemie LSM12.
UWAGA: Rurka FEP służy do zabezpieczania próbki materiałami dopasowującymi współczynnik załamania światła, które bardzo przypominają otaczające medium, takie jak woda. - Zaczynając od 3 dpf, przenieś ryby do roztworu trikainy o stężeniu 150 mg/l (MS-222) (patrz tabela materiałów) w celu unieruchomienia ryb przed obrazowaniem.
- Przygotować 0,8 % niskotopliwą agarozę z trikainą 150 mg/l i użyć pipety transferowej, aby przenieść znieczuloną rybę do agarozy, gdy ostygnie do temperatury pokojowej18.
- Użyj innej pipety transferowej, aby zamontować rybę z agarozą w probówkach FEP (Rysunek 1).
UWAGA: Aby upewnić się o minimalnym stresie u rozwijających się zarodków, przeprowadzono badania czynności serca przed i po stabilizacji, takie jak częstość akcji serca, pod obserwacją mikroskopową. Oceny te miały na celu zidentyfikowanie wszelkich istotnych różnic przed i po znieczuleniu tricainowym. Po utrwaleniu można również przeprowadzić dodatkowe badanie skóry i mięśni pod kątem nieprawidłowości w budowie serca, takich jak obrzęk. Stężenie tricainy odgrywa również kluczową rolę w obrazowaniu serca19, dlatego roztwór tricainy o stężeniu 150 mg/l został wykorzystany do obrazowania skurczu u larw danio pręgowanego w tym projekcie. Podczas gdy obecna synchronizacja retrospektywna pozwala nam rozwiązać problem nieregularnego bicia serca20, kompleksowe rozwiązanie do obrazowania 4D zaburzeń rytmu serca i obrazowania długoterminowego u danio pręgowanego jest nadal w fazie rozwoju.
3. Konfiguracja i konfiguracja systemu obrazowania arkuszy świetlnych
Czas: 3-14 dni
- Zbuduj własny system LSM oparty na cylindrycznej soczewce, wykorzystując systemy laserowe ze stałym przewodnikiem (DPSS) pompowane diodami o fali ciągłej o określonych długościach fal, takich jak 473 nm i 532 nm jako źródła oświetlenia (Rysunek 2A).
- Dostosuj kody sterujące LabVIEW (patrz tabela materiałów) do synchronizacji etapu próbki translacyjnej, oświetlenia arkusza świetlnego i ekspozycji kamery sCMOS w celu przechwytywania sekwencji obrazów.
UWAGA: Bardziej szczegółowe informacje na temat budowy systemu można znaleźć w innych raportach lub protokołach12,16,17. Zachęcamy grupy badawcze do poszukiwania możliwości współpracy z laboratoriami, które posiadają ugruntowaną wiedzę specjalistyczną w zakresie obrazowania optycznego podczas budowy systemu.
4. Przygotowanie i zbieranie danych do obrazowania danio pręgowanego
Czas: 1 dzień
- Kalibracja rozdzielczości przestrzennej systemu LSM i minimalizacja zmienności nieprzezroczystości na różnych głębokościach poprzez pomiar koralików fluorescencyjnych.
- Najpierw rozcieńczyć kulki fluorescencyjne (patrz tabela materiałów) o średnicy 0,53 μm do stężenia 1: 1,5 x 105 przy użyciu 0,8 % niskotopliwej agarozy i przenieść roztwór do segmentowej rurki FEP.
- Po drugie, użyj systemu LSM do zobrazowania koralików i zmierzenia funkcji rozrzutu punktowego (PSF) na całej próbce, sprawdzając rozdzielczość przestrzenną i wyrównanie systemu12.
UWAGA: W tym systemie analiza reprezentatywnych wyników dla całej szerokości przy połowie maksimum (FWHM) wskazuje na rozdzielczości poprzeczne i osiowe wynoszące odpowiednio 1,26 ± 0,15 i 2,48 ± 0,15 μm (n = 60 koralików). Sugeruje to spójną rozdzielczość przestrzenną na całej głębokości obrazowania.
- Przymocuj rurkę FEP z zamontowanymi larwami danio pręgowanego do 6-osiowego (x, y, z, skok, odchylenie i rolka) zmotoryzowanego stolika na próbki i zanurz probówki w komorze próbki wypełnionej wodą E3. Aby uniknąć rozpraszania światła przez woreczek żółtkowy i lepiej zlokalizować położenie serca, obróć larwę danio pręgowanego, aby zrobić zdjęcie od strony brzusznej (Rysunek 2B). W tym przypadku większość zarejestrowanych obrazów obejmowałaby zarówno komorę, jak i przedsionek (Rysunek 2C).
UWAGA: Biorąc pod uwagę, że obecne procedury obrazowania zwykle trwały krócej niż jedną godzinę na rybę i były przeprowadzane w środowisku o kontrolowanej temperaturze pokojowej, kontrola temperatury w komorze i regulacja poziomu tlenu są uważane za opcjonalne dla tego projektu. Jednak w przypadku długoterminowych badań obrazowania poklatkowego, szczególnie tych skoncentrowanych na procesach rozwojowych, sugeruje się ciągłe monitorowanie i regulację temperatury w temperaturze 27 °C w komorze próbki, aby zapewnić fizjologiczne środowisko danio pręgowanego i zapobiec wszelkim potencjalnym nieprawidłowościom rozwojowym. - Podłącz zmotoryzowany stolik na próbki do stacji roboczej i skonfiguruj wszystkie niezbędne parametry, w tym żądany tryb ruchu.
- Nawiąż połączenie między kamerą sCMOS a stacją roboczą. Dostosuj wszystkie niezbędne ustawienia, takie jak czas ekspozycji 5 ms i żądany obszar zainteresowania.
- Skonfiguruj liczbę sekwencji obrazów i ramek w dostosowanym programie sterującym LabVIEW.
- Włącz laser i rozpocznij obrazowanie LSM próbki. Kontynuuj proces, aż wszystkie sekwencje obrazów zostaną pomyślnie zarejestrowane.
- Nagraj 300 klatek jako sekwencję obrazów 2D, aby pokryć 3-5 cykli serca larwy z szybkością 200 klatek na sekundę. Na nagraniu uchwycono kurczliwość serca w płaszczyźnie selektywnej oświetlonej przez arkusz świetlny.
- Przesuwaj larwę z krokiem o wielkości 1 μm w poprzek oświetlenia arkusza świetlnego, aby wirtualnie przeciąć próbkę.
UWAGA: Rozmiar kroku stolika próbkowania powinien być ustawiony na podstawie rozdzielczości osiowej systemu arkuszy świetlnych, zgodnie z twierdzeniem o próbkowaniu Nyquista-Shannona12. - Powtórz krok 7, aby nagrać kolejną sekwencję obrazu nowego wycinka próbki, aż całe serce zostanie pokryte. Ogólnie rzecz biorąc, 100-200 sekwencji obrazów o wielkości kroku 1 μm zapewnia pokrycie całego serca larwy danio pręgowanego (Rysunek 2D).
UWAGA: Kroki 4.7-4.9 są kontrolowane przez program LabVIEW i automatycznie wykonywane przez system LSM (Rysunek 3). Biorąc pod uwagę dużą ilość generowanych danych obrazu, zalecana jest ustandaryzowana konwencja nazewnictwa sekwencji obrazów. Na przykład wyznacz foldery o nazwach takich jak "z-1", "z-2" itp., aby kategoryzować dane w różnych sekwencjach obrazów. W każdej sekwencji obrazy powinny być nazwane sekwencyjnie (np. "1", "2", ...), aby oznaczyć różne punkty czasowe. Całkowity czas na zamontowanie ryby, dostosowanie kąta obrazowania i zebranie wszystkich danych dla jednej larwy danio pręgowanego wynosi około 1 godziny.
5. Rekonstrukcja obrazu 4D z obliczeniami równoległymi
Czas: 1 dzień
UWAGA: Algorytm rekonstrukcji 4D opracowany przez naszą grupę oraz przykładowe dane są publicznie dostępne21. Metoda ta pozwala na zrekonstruowanie obrazu serca 4D na podstawie sekwencji obrazów zebranych w poprzednich krokach (tab. 1).
- Otwórz plik test_Parallel.m w programie MATLAB (patrz Spis materiałów). Określ lokalizację folderu, w którym przechowywane są sekwencje obrazów RAW w zmiennej "baseDir".
- Przypisz zmiennej "numOfSlice" łączną liczbę sekwencji obrazów (zwykle 100-150), a zmiennej "numOfImage" liczbę obrazów (zwykle 300-500) w każdej sekwencji.
- Sprawdź sekwencję obrazu, która pokazuje środkową płaszczyznę serca danio pręgowanego (na przykład 51. sekwencję ze 101 wszystkich sekwencji). Zidentyfikuj numery ramek pierwszego i czwartego skurczu w tej sekwencji i przypisz je do zmiennych systolicPoint_1st i systolicPoint_4th.
- Kliknij Uruchom, aby rozpocząć proces.
UWAGA: Długość cyklu pracy serca w każdej sekwencji obrazów zostanie najpierw określona przez program MATLAB poprzez porównanie podobieństwa (sumy kwadratów różnic) między obrazami w różnych punktach czasowych. Następnie cykl serca zostanie oszacowany przy użyciu średniej długości cyklu ze wszystkich sekwencji obrazu. Następnie punkty początkowe sekwencji obrazów w różnych lokalizacjach osiowych zostaną wyrównane przez program poprzez iteracyjne porównanie podobieństwa obrazu z pierwszej sekwencji obrazu do ostatniej sekwencji obrazu. - Sprawdź wyniki w folderze wyjściowym. Program zapisze obrazy jako pliki ".tif" ze znacznikami czasu. Każdy plik ".tif" to obraz serca 3D w określonym punkcie czasowym. Odstęp czasu między dwoma obrazami 3D jest równy ustawionemu czasowi ekspozycji.
UWAGA: Zrekonstruuj uzyskane obrazy z poprzednich kroków, aby zobrazować skurcze serca 4D (przestrzenne 3D + skroniowe 1D). Aby zwiększyć biegłość w badaniach o wysokiej przepustowości podczas synchronizacji retrospektywnej, podejście to umożliwia jednoczesne operacje obliczeniowe na procesorze graficznym poprzez wykorzystanie wielu rdzeni procesora za pośrednictwem zestawu narzędzi do obliczeń równoległych MATLAB i przekształcanie obrazów do formatu gpuArray.
6. 3D segmentacja komórek i śledzenie komórek
Czas: 1 dzień
- Pobierz pakiet 3DeeCellTracker (patrz Spis materiałów) i skonfiguruj środowisko Pythona22.
- Pobierz oprogramowanie do adnotacji ITK-SNAP23 (patrz Tabela materiałów) i użyj go do ręcznego oznaczania obrazu 3D serca w dwóch wybranych punktach czasowych, jednym przy rozkurczu komory, a drugim przy skurczu komorowym, w celu utworzenia zestawów danych treningowych i walidacyjnych.
UWAGA: Zastosowanie może mieć również inne oprogramowanie do etykietowania. - W Pythonie uruchom program treningowy 3DeeCellTracker i zainicjuj parametry noise_level (w tym przypadku 100), folder_path i modelu w funkcji TrainingUNet3D, aby ustawić predefiniowany model 3D U-Net.
- W programie MATLAB użyj programu imageDimConverter.m, aby przekonwertować i zmienić nazwę zestawu danych trenowania i walidacji na odpowiedni format ładowania.
- W języku Python załaduj zestawy danych trenowania i walidacji przy użyciu funkcji trainer.load_dataset() i trainer.draw_dataset().
- W Pythonie uruchom pierwszą część programu śledzącego 3DeeCellTracker i zainicjuj parametry.
UWAGA: Obejmuje to definiowanie parametrów obrazu w celu scharakteryzowania wymiarów obrazu, parametrów segmentacji w celu wyboru modelu uczenia maszynowego zastosowanego do segmentacji komórek oraz parametrów śledzenia w celu wybrania wstępnie wytrenowanych modeli głębokich sieci neuronowych stosowanych do rejestracji komórek. Przy pierwszym użyciu zaleca się zastosowanie modelu U-Net do segmentacji komórek i FFN+ PR-GLS do rejestracji komórek. Jest on potrzebny do przechowywania danych, modelu i wyników w folderach, które zostaną automatycznie utworzone w tym kroku. - W MATLAB użyj programu imageDimConverter.m, aby przekonwertować i zmienić nazwę wszystkich obrazów serca 3D na odpowiedni format i przenieść je do folderu danych utworzonego w ostatnim kroku.
- W Pythonie uruchom drugą część programu 3DeeCellTracker, aby rozpocząć segmentację.
- Po posegmentowaniu pierwszego obrazu 3D porównaj wynik segmentacji z obrazem RAW i wykonaj ręczną korektę, jeśli zostanie znaleziona nieprawidłowa segmentacja. Przenieś poprawioną segmentację do utworzonego folderu "/manual_vol1".
- W Pythonie uruchom trzecią część programu 3DeeCellTracker, aby posegmentować wszystkie obrazy.
- Użyj Amiry (patrz tabela materiałów), aby przeprowadzić wizualną ocenę wyników śledzenia, porównując pozycje śledzonych komórek z odpowiadającymi im surowymi obrazami. Jeśli wyniki testu nie są zadowalające, wznów procedurę od kroku 6.6, zastosuj alternatywny model uczenia maszynowego do segmentacji lub rejestracji komórek, a następnie ponownie rozpocznij proces śledzenia.
UWAGA: Po segmentacji dane etykiet komórek są domyślnie przechowywane jako obraz 8-bitowy (od 0 do 255), co oznacza, że tylko 256 skal jest dostarczanych jako etykiety do klasyfikacji komórek. Istnieją dwa rozwiązania tego problemu, gdy potrzebne są dodatkowe zajęcia. Jednym z rozwiązań jest ustawienie formatu danych etykiet komórek jako 16-bitowego obrazu w programie śledzącym, co spowoduje wykładnicze wydłużenie czasu przetwarzania, w tym przypadku o ponad dwa dni. Innym rozwiązaniem jest użycie programu "separateTrackingResults.py" do przetwarzania końcowego etykiet komórek, który oddzieli komórki tymi samymi etykietami na podstawie ich fizycznej lokalizacji i przypisze każdej komórce inną etykietę. Proces ten trwa w tym przypadku około 10 minut.
7. Analiza kurczliwości serca w trybie wirtualnej rzeczywistości
Czas: 1 dzień
- Uzyskaj wynik śledzenia komórek z poprzednich kroków.
- Ręcznie zweryfikuj dane i wybierz komórki o stałej intensywności obrazu we wszystkich woluminach (około 500 komórek z około 600).
- Użyj skryptu cellLabelsToObj.ipynb21, aby wygenerować siatkę powierzchni dla każdej pojedynczej komórki za pomocą oprogramowania 3D Slicer24 (patrz Tabela materiałów) i przypisz unikalny kod koloru do każdej komórki.
- Eksportuj każdy model 3D, składający się ze wszystkich komórek w jednym punkcie czasowym, jako pojedynczy plik .obj składający się z wielu podobiektów, któremu towarzyszy plik .mtl opisujący etykietę komórki.
- Zaimportuj modele do aparatu Unity, korzystając z licencji edukacyjnej, silnika programistycznego używanego do rozszerzonej rzeczywistości.
- Zastosuj dostosowane skrypty składające się z funkcji napisanych w języku C# do modeli i elementów interfejsu użytkownika, aby umożliwić wizualizację 4D i interaktywną analizę. Wykonaj interakcję VR, wykonując krok 7.7.
- Wejdź w interakcję z modelami w wirtualnej rzeczywistości (VR) za pomocą następujących funkcji (Rysunek 4):
- Zaznaczanie komórek: Zaznacz maksymalnie dwie komórki naraz i wyświetl ich trajektorie, prędkości, objętości, pola powierzchni i odległości względne.
- Wybór punktu czasowego: Wybierz określony punkt czasowy w danych, aby przeanalizować dane wyjściowe wybranych komórek, na przykład przy t = 0 ms podczas rozkurczu lub przy t = 200 ms podczas skurczu.
- Wstrzymanie czasowe: Zatrzymaj model dynamiczny, aby skupić się na zaznaczonych komórkach i ich danych wyjściowych.
- Kontrast: Moduluj kontrast między wybranymi komórkami a otaczającymi je komórkami w modelu.
Wyniki
Obecny protokół składa się z trzech głównych etapów: przygotowania i mikroiniekcji rybek zebrafish, obrazowania w arkuszu światła i 4D rekonstrukcji obrazu oraz śledzenia komórek i interakcji w VR. Dorosłe rybki zebrafish zostały dopuszczone do tarła, zebrano zapłodnione jaja i przeprowadzono mikroiniekcje zgodnie z potrzebami planowanych eksperymentów (Rysunek 1). Krok ten stanowi punkt wyjścia do badania zastosowań modelu zebrafish w analizie rozwoju i regeneracji serca, a także odgrywa kluczową rolę w późniejszym obrazowaniu i analizie. Kurczące się serce obrazowano na różnych etapach rozwoju (od 3 dpf do 7 dpf) przy użyciu systemu LSM zbudowanego na zamówienie, a następnie dopasowano sekwencje obrazów wzdłuż osi z, aby zrekonstruować 4D model serca zebrafish (Rysunek 2 oraz Rysunek 3). Modele te stanowią podstawę do pogłębionej charakterystyki fenotypowej i są kluczowe dla ujawnienia dynamiki morfologii i funkcji serca w czasie rozwoju. Poszczególne komórki w sercu zebrafish były śledzone, a ich ruch i interakcje kwantyfikowano za pomocą dostosowanej platformy VR. Porównano również prędkość i zmiany odległości względnej wybranych komórek w ciągu jednego cyklu serca w przedsionku i komorze, aby ocenić regionalną kurczliwość i zbadać lokalne odkształcenie (Rysunek 4). Regionalne odkształcenie określono na podstawie zmienności przemieszczenia między dwiema sąsiednimi komórkami mięśnia sercowego w obszarze zainteresowania. Skrócenie frakcyjne (FS) oraz frakcja wyrzutowa (EF) zostały oszacowane z wykorzystaniem metod opisanych w opublikowanej literaturze25. Równania dla FS i EF przedstawiają się następująco:
gdzie Dd i Ds to średnice komory (oś krótka, mierzone jako odległości między różnymi komórkami komory) odpowiednio w fazie końca rozkurczu i końca skurczu, a Vd i Vs to objętości komory (obliczone na podstawie średnic osi długiej i krótkiej komory) odpowiednio w fazie końca rozkurczu i końca skurczu.
Zestawione razem, wyniki te prezentują nową strategię integrującą fizjologię i inżynierię w celu ułatwienia obrazowania wolumetrycznego oraz interpretacji danych w modelach rybek zebrafish, co daje duże nadzieje na postępy w badaniu morfogenezy i mechaniki serca.
Rycina 1: Proces zbierania jaj i mikroiniekcji u rybek zebrafish.Proces obejmuje kopulację dorosłych rybek zebrafish, zbieranie zapłodnionych jaj oraz opcjonalne wykonanie mikroiniekcji. Podczas mikroiniekcji wcześniej dociągnięta szklana pipeta jest napełniana pożądanymi materiałami. Zapłodnione jaja są ustawione w prostych rzędach w szczelinach formy agarowej, prostopadle do igły. Mikroiniekcja jest przeprowadzana pod stałą obserwacją mikroskopową zarówno jaj, jak i końcówki igły. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
Rycina 2: Proces obrazowania arkuszem światła i rekonstrukcja obrazu 4D. (A) Schemat budowy własnego systemu obrazowania arkuszem światła. CL: soczewka cylindryczna. EO: obiektyw wzbudzenia. DO: obiektyw detekcyjny. TL: soczewka tubusowa. FL: filtr. CAM: kamera sCMOS. (B) Schemat danio prążkowanego zamocowanego w rurce FEP i zatopionego w agarozie. (C) Surowa sekwencja obrazów 2D zarejestrowana z larwy danio prążkowanego w 4 dpf. Zegar w lewym górnym rogu każdej klatki wskazuje fazę cyklu sercowego, zaczynając od końca skurczu. (D) Ilustracja retrospektywnej synchronizacji dla rejestracji obrazu 4D danio prążkowanego. Sekwencja obrazów wskazuje ciągły zapis na określonej głębokości wzdłuż osi z. Każda klatka w sekwencji obrazów jest reprezentowana przez czerwoną kropkę, a fazy początkowa i końcowa od końca rozkurczu do końca skurczu są zaznaczone żółtym prostokątem. (E) Modele serca zrekonstruowane w 4D z sekwencji obrazów 2D. Dpf: dni po zapłodnieniu. Rycina opracowana na podstawie Zhang et al.12. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Panel sterowania LabVIEW. (A) Ustawienia zastosowane w panelu sterowania obejmują konfigurację lasera, kamery, ścieżki obrazu oraz wzorca silnika. (B) Przykład surowego obrazu serca danio-pręgławki zarejestrowanego przez program LabVIEW. Pasek skali: 30 µm. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
Rysunek 4: Śledzenie komórek i interakcja w VR pomagają w ujawnieniu kurczliwości serca danio przebrzuchym. (A) Śledzone komórki serca danio przebrzuchym Tg(myl7:nucGFP) w 3 dpf. (B) Platforma VR zapewnia użytkownikom immersyjny podgląd i interaktywne doświadczenie 4D modelu serca danio przebrzuchym, umożliwiając wizualizację funkcji serca w czasie poprzez analizę zdefiniowaną przez użytkownika. (C) Po zebraniu pomiarów z platformy VR porównano zmiany prędkości i odległości względnej podczas jednego cyklu sercowego między wybranymi komórkami w 3 dpf i 7 dpf. Dwa pierwsze wykresy przedstawiają średnie zmiany prędkości w pięciu komórkach komory i pięciu komórkach przedsionka, a pozostałe ilustrują zmiany odległości względnej między trzema grupami komórek, tj. dwiema komórkami komory, komórką komory i komórką przedsionka oraz dwiema komórkami przedsionka. (D) Ocena funkcji serca danio przebrzuchym w 3 dpf i 7 dpf. W sercach danio przebrzuchym w 3 dpf śledzono łącznie 370 komórek, a w 7 dpf śledzono 580 komórek. Rysunek ten został zaadaptowany z pracy Zhang et al.12. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
| NAZWA | ZASTOSOWANIE | IDENTYFIKATOR | |
| Dostosowane programy i algorytmy | |||
| PSF.m | Obliczanie PSF na podstawie wyników pomiarów FWHM dla kulek fluorescencyjnych. | program MATLAB | |
| Obrazowanie 4D zebrafish.vi | W celu sterowania i synchronizacji sprzętu w systemie LSM. | program LabVIEW | |
| test_Parallel.m, itd. | W celu rekonstrukcji obrazów 4D z sekwencji obrazów 2D. | program MATLAB | |
| imageDimConverter.m | Aby przekonwertować dane obrazowe do określonego formatu w celu śledzenia komórek. | program MATLAB | |
| separateTrackingResults.py | Aby przetworzyć wyniki śledzenia komórek w celu rozdzielenia komórek o tych samych etykietach. | program w języku Python | |
| cellTracking_All.py | Aby wybrać komórki o stałej intensywności obrazu we wszystkich wolumenach. | Program w języku Python | |
| cellLabelsToObj.ipynb | Aby wygenerować siatkę powierzchniową dla każdej pojedynczej komórki za pomocą programu 3D Slicer. | Program w języku Python | |
| DynamicHeartModel.cs itp. | Aby stworzyć środowisko VR i wchodzić w interakcje z obiektami. | program w języku C# | |
| Projektowanie spersonalizowanego sprzętu | |||
| Komora pomiarowa wydrukowana w technologii 3D | Do stosowania z obiektywami imersyjnymi wodnymi. | Projektowanie w programie SolidWorks | |
| uchwyt do próbek wydrukowany w technologii 3D | Aby dopasować do stolika z próbką i unieruchomić próbkę. | projektowanie w programie SolidWorks | |
Tabela 1: Tabela spersonalizowanych zasobów. Kody próbek i dane zostały przesłane do Zenodo21.
Dyskusja
Integracja modelu danio pręgowanego z metodami inżynieryjnymi ma ogromny potencjał w zakresie badania in vivo zawału mięśnia sercowego, arytmii i wrodzonych wad serca. Wykorzystując swoją przezroczystość optyczną, zdolności regeneracyjne oraz genetyczne i fizjologiczne podobieństwa do ludzi, zarodki i larwy danio pręgowanego stały się szeroko wykorzystywane w badaniach 1,2,4. Doskonała rozdzielczość czasoprzestrzenna, minimalne fotouszkodzenia i możliwości sekcji optycznej obrazowania za pomocą arkuszy świetlnych wyróżniają go do badań 4D morfologii serca i funkcji skurczu u larw danio pręgowanego 12,26,27,28. Protokół ten wprowadza kompleksowe podejście, które integruje obrazowanie na arkuszu świetlnym, synchronizację retrospektywną, śledzenie komórek 3D oraz interaktywną platformę rzeczywistości wirtualnej (VR) do ocen ilościowych. Stanowi punkt wyjścia do uchwycenia i rekonstrukcji skurczu serca, śledzenia i ilościowego określania dynamiki komórkowej oraz oceny zmian strukturalnych, funkcjonalnych i mechanicznych podczas rozwoju i regeneracji serca. Metoda ta może być również wzmocniona przez wielokanałowe obrazowanie fluorescencyjne w celu śledzenia różnych typów komórek i linii w celu zbadania heterogeniczności komórkowej i interakcji międzykomórkowych. Podczas gdy dychotomia modelu danio pręgowanego od systemów ssaków i jego ograniczenie jako modelu ostrego wymagają starannego rozważenia, postępy w inżynierii genetycznej mogą pozwolić na opracowanie transgenicznych linii danio pręgowanego, które bardziej przypominają stany chorobowe człowieka, zwiększając w ten sposób wartość translacyjną wyników pochodzących z badań nad danio pręgowanym29.
Ta retrospektywna synchronizacja oparta na założeniu okresowego cyklu pracy serca służy do rekonstrukcji obrazów z arkuszy świetlnych kurczącego się serca danio pręgowanego. Zastosowanie tej metody w obrazowaniu za pomocą arkuszy świetlnych umożliwia wizualizację i analizę kurczącego się serca z prędkością ponad 200 objętości na sekundę. Aby sprostać wyzwaniu, jakie stwarza duża ilość danych w bieżącej analizie, zastosowano obliczenia równoległe z wielordzeniowymi procesorami i kartami graficznymi, co zaowocowało ponad dziesięciokrotną poprawą wydajności rekonstrukcji obrazu. Podczas synchronizacji retrospektywnej założono, że kardiomiocyty wracają do swoich pozycji wyjściowych z każdym uderzeniem serca. Chociaż założenie to jest stosunkowo bezpieczne, biorąc pod uwagę niską zmienność uderzeń serca obserwowaną u danio pręgowanego26 , jak pokazano na rysunkach 4C, pozostaje ono uproszczeniem, które może nie uwzględniać wszystkich niuansów biologicznych. Innowacje w obrazowaniu, takie jak fluorescencja kompresyjna i mikroskopia w polu świetlnym, mogą złagodzić skutki wynikające z tego założenia poprzez zmniejszenie nadmiarowości warstw.
Aby umożliwić dogłębną analizę skomplikowanego modelu serca 4D, opracowano ramy obliczeniowe obejmujące zarówno segmentację komórek opartą na 3DeeCellTracker, jak i platformę VR do badań kierowanych przez użytkownika. Nieodłączne możliwości tego frameworka, w tym wysoka wydajność i interaktywna manipulacja, pozwalają na ilościowe określenie zmiany prędkości komórkowej, badanie interakcji komórka-komórka oraz ocena regionalnej i globalnej mechaniki mięśnia sercowego, takiej jak skrócenie frakcyjne, frakcja wyrzutowa i szczep regionalny30 (Figura 4). Zwrócono uwagę na brak wcześniejszych ocen czynności serca danio pręgowanego przy 7 dpf w istniejącej literaturze. Jednak w porównaniu z danymi przy 3 dpf dostarczonymi przez innych badaczy, obecne wyniki są zgodne z wcześniejszymi wskazaniami na spadek zarówno frakcji wyrzutowej (EF), jak i frakcyjnego skrócenia (FS) w przedziale od 3 dpf do 7 dpf25,31. Te metody analityczne mają znaczny potencjał w zakresie wyjaśnienia dynamiki serca w modelach uszkodzeń serca danio pręgowanego12,25.
Ponieważ technologia i oprogramowanie VR zawierają unikalne funkcje, takie jak widzenie stereoskopowe i automatyczna rejestracja pozycji komórek, platforma ta pozwala na wciągającą i usprawnioną metodę selekcji określonych komórek i analizowania ich trajektorii w całym cyklu pracy serca. Wykorzystanie VR zapewnia intuicyjny sposób wykonywania złożonych zadań, takich jak segmentacja komórek i adnotacja, z większą wydajnością i dokładnością 32,33,34. Obsługuje również wielu użytkowników w korzystaniu z unikalnych narzędzi podczas wspólnej pracy nad dużymi, skomplikowanymi zestawami danych34. Chociaż długotrwałe korzystanie z VR może wywoływać skutki uboczne, takie jak zawroty głowy, można to złagodzić dzięki ulepszonej ergonomicznej konstrukcji i nieskrępowanym zestawom słuchawkowym. Ponadto, aby rozwiązać problem znacznej mocy obliczeniowej wymaganej do renderowania złożonych struktur biologicznych w czasie rzeczywistym, optymalizacja oprogramowania pod kątem natychmiastowego przetwarzania i wykorzystanie rozwiązań obliczeniowych opartych na chmurze może zwiększyć zdolność systemu do zarządzania skomplikowanymi wizualizacjami.
Dzięki ciągłemu rozwojowi urządzeń sprzętowych i mocy obliczeniowej, strategia ta może zostać rozszerzona o badanie zaburzeń rytmu serca w mięśniu sercowym zarówno na poziomie komórkowym, jak i tkankowym, co ostatecznie ma potencjał do rozwikłania mechanizmu leżącego u podstaw morfogenezy serca i przyspieszenia rozwoju interwencji terapeutycznych.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.
Podziękowania
Wyrażamy naszą wdzięczność dr Caroline Burns z Boston Children's Hospital za hojne podzielenie się transgenicznym danio pręgowanym. Dziękujemy Pani Elizabeth Ibanez za pomoc w hodowli danio pręgowanego w UT Dallas. Doceniamy również wszystkie konstruktywne uwagi dostarczone przez członków D-incubatora na UT Dallas. Praca ta była wspierana przez NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) i program UT Dallas STARS (Y.D.).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| RESOURCE< | strong>SOURCE/Reference | IDENTIFIER | |
| Modele zwierzęce | |||
| Tg(myl7:nucGFP) transgeniczny danio pręgowany | Burns Lab w Szpitalu Dziecięcym w Bostonie | ZDB-TGCONSTRCT-070117-49 | |
| Oprogramowanie oraz algorytmy | |||
| MATLAB | The MathWorks Inc. | R2023a | |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| Python | The Python Software Foundation | 3.9.0 | |
| Fiji-ImageJ | Schneider et al.18 | 1.54f | |
| 3DeeCellTracker | Chentao Wen et al.15 | v0.5.2 | |
| Jedność | Oprogramowanie Unity Inc. | 2020.3.2f1 | |
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
| 3D Slicer | Andriy Fedorov et al.17 | 5.2.1 | |
| ITK SNAP | Paul A Yushkevich et al.16 | 4 | |
| Light-sheet system | |||
| Cylindryczna soczewka | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| 4X Obiektyw oświetlający | Nikon | MRH00045 | |
| 20X Cel wykrywania | Olympus | 1-U2M585 | |
| sCMOS kamera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| Zmotoryzowany stolik XYZ | Thorlabs | PT3/M-Z8 | |
| Dwuosiowy stolik uchylny | Thorlabs | GN2/M | |
| Obrotowy silnik krokowy | Pololu | 1474 | |
| Koraliki fluorescencyjne | Spherotech | FP-0556-2 | |
| 473nm DPSS | Laser Laserglow | R471003GX | |
| 532nm DPSS | laser Laserglow | R531003FX | |
| Mikrowtryskiwacz i pompa próżniowa | |||
| Microinjector | WPI | PV850 | |
| Pompa próżniowa | Welch | 2522B-01 | |
| Wstępnie ciągnięte szklane pipety | WPI | TIP10LT | |
| Końcówka kapilarna do ładowania żelu | Bio-Rad | 2239912 | |
| Sprzęt do wirtualnej rzeczywistości | |||
| VR | Meta | Quest 2 | |
| 30mg/L roztwór PTU | |||
| PTU | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 1X E3 | - | - | |
| < mocny>1% agarozy< / mocny> | |||
| Niskotopliwa agaroza | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Woda dejonizowana | - | ||
| 10 g / l Roztwór podstawowy trikainy< / mocny> | |||
| Tricaine | Syndel | SYNC-M-GR-US02 | |
| Woda dejonizowana | - | ||
| wodorowęglan sodu | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| < strong> 150 mg / L roztwór roboczy trikainy< / strong> | |||
| 10 g / l Roztwór podstawowy trikainy | - | ||
| zdejonizowany woda | - | - | |
| 60X roztwór podstawowy E3 | |||
| Sodium Chloride | Lab Animal Resource Center (LARC), Uniwersytet Teksański w Dallas | NaCl | |
| Chlorek | potasu-KCL | ||
| Chlorek wapnia dwuwodny-CaCL | sub>2 x 2H2O | ||
| Siarczan magnezu heptahydrat-MgSO | sub>4 x 7H2O | ||
| RO Woda | - | - | |
| 1X roztwór roboczy E3 | |||
| 60X roztwór podstawowy E3 | Lab Animal Resource Center (LARC), Uniwersytet Teksański w Dallas | - | |
| Woda RO | - | ||
| 1% błękit metylenowy (opcjonalnie) | - | C16H18ClN3S |
Bibliografia
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat. Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Liu, J., Stainier, D. Y. R. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circ. Res. 110 (6), 870(2012).
- Ding, Y., Bu, H., Xu, X. Modeling inherited cardiomyopathies in adult zebrafish for precision medicine. Front. Physiol. 11, 599244(2020).
- Giardoglou, P., Beis, D. On zebrafish disease models and matters of the heart. Biomedicines. 7 (1), 15(2019).
- Zhang, X., Alexander, R. V., Yuan, J., Ding, Y. Computational analysis of cardiac contractile function. Curr. Cardiol. Rep. 24 (12), 1983-1994 (2022).
- Weber, M., Huisken, J. In vivo imaging of cardiac development and function in zebrafish using light sheet microscopy. Swiss Med. Wkly. 145 (51), w14227(2015).
- Vedula, V., et al. A method to quantify mechanobiologic forces during zebrafish cardiac development using 4-D light sheet imaging and computational modeling. PLOS Comput. Biol. 13 (10), e1005828(2017).
- Yalcin, H. C., Amindari, A., Butcher, J. T., Althani, A., Yacoub, M. Heart function and hemodynamic analysis for zebrafish embryos. Dev. Dyn. 246 (11), 868-880 (2017).
- Baek, K. I., et al. Advanced microscopy to elucidate cardiovascular injury and regeneration: 4D light-sheet imaging. Prog. Biophys. Mol. Biol. 138, 105-115 (2018).
- Salman, H. E., Yalcin, H. C. Advanced blood flow assessment in Zebrafish via experimental digital particle image velocimetry and computational fluid dynamics modeling. Micron. 130, 102801(2020).
- Sodimu, O., et al. Light sheet imaging and interactive analysis of the cardiac structure in neonatal mice. J. Biophotonics. 16 (5), e202200278(2023).
- Zhang, X., et al. 4D light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in zebrafish larvae. APL Bioeng. 7 (2), 026112(2023).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. Eugene. , University of Oregon Press. (2000).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. 25, e1115(2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. J. Opt. 20 (5), 053002(2018).
- Gualda, E. J., et al. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat. Methods. 10 (7), 599-600 (2013).
- Messerschmidt, V., et al. Light-sheet fluorescence microscopy to capture 4-dimensional images of the effects of modulating shear stress on the developing zebrafish heart. J Vis Exp. 138, e57763(2018).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J Clin Invest. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Zhang, X., et al. 4D light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in Zebrafish larvae. Zenodo. , (2023).
- Wen, C., et al. 3deecelltracker, a deep learning-based pipeline for segmenting and tracking cells in 3d time lapse images. Elife. 10, e59187(2021).
- Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
- Fedorov, A., et al. 3D Slicer as an image computing platform for the quantitative imaging network. Magn. Reson. Imaging. 30 (9), 1323-1341 (2012).
- Naderi, A. M., et al. Deep learning-based framework for cardiac function assessment in embryonic zebrafish from heart beating videos. Comput. Biol. Med. 135, 104565(2021).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nat. Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J. Clin. Invest. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Ding, Y., et al. Multiscale light-sheet for rapid imaging of cardiopulmonary system. JCI Insight. 3 (16), e121396(2018).
- Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab. Anim. Res. 37 (1), 1-29 (2021).
- Coelho-Filho, O. R., et al. Quantification of cardiomyocyte hypertrophy by cardiac magnetic resonance: implications on early cardiac remodeling. Circulation. 128 (11), 1225(2013).
- Zhang, B., et al. Automatic segmentation and cardiac mechanics analysis of evolving zebrafish using deep learning. Front. Cardiovasc. Med. 8, 675291(2021).
- Ding, Y., et al. Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics. JCI Insight. 2 (22), e97180(2017).
- Koger, C. R., Hassan, S. S., Yuan, J., Ding, Y. Virtual reality for interactive medical analysis. Front. Virtual Real. 3, 782854(2022).
- Yuan, J., et al. Extended reality for biomedicine. Nat. Rev. Methods Prim. 3 (1), 1-1 (2023).
Przedruki i uprawnienia
