Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zmodyfikowane warunkowanie strachu w celu wywołania zachowań związanych z lotem u myszy

1.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66266

⸱

15 grudnia 2023

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Kanazawa Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Aby badać zachowania związane z lotem w kontekście strachu, wprowadzamy zmodyfikowany protokół warunkowania strachu. Protokół ten zapewnia, że myszy konsekwentnie wykazują zachowania związane z lotem podczas prezentacji wskazówek w warunkowaniu strachu.

Streszczenie

Odpowiednia manifestacja zachowania obronnego w sytuacji zagrożenia jest kluczowa dla przetrwania. Dominująca teoria sugeruje, że aktywne zachowanie obronne, takie jak skakanie lub szybkie rzucanie się, wyraża się w warunkach wysokiego zagrożenia lub rzeczywistego zagrożenia, podczas gdy pasywne zachowanie obronne, takie jak zamrożenie, jest wyrażane, gdy zagrożenie jest przewidywane, ale nieuchronność zagrożenia jest stosunkowo niska. W klasycznym warunkowaniu strachu badani zazwyczaj wykazują zamrożenie jako uwarunkowaną reakcję obronną, z niewielką ekspresją aktywnego zachowania obronnego w większości przypadków. Tutaj wprowadzamy zmodyfikowaną procedurę warunkowania strachu dla myszy, aby obserwować przejście od zamrożenia do lotu i odwrotnie, obejmującą pięć powtarzających się par bodźców warunkowych (CS; ciągły ton, 8 kHz, 95 dB SPL (poziomy ciśnienia akustycznego)) i bodźców bezwarunkowych (US; wstrząs stopą, 0,9 mA, 1,0 s) przez dwa dni. Ta zmodyfikowana procedura warunkowania strachu wymaga stosunkowo dużej liczby sesji kondycyjnych i dni kondycjonowania, ale nie wymaga wstrząsu stopy o wysokiej intensywności w celu umiarkowanego wyrażenia zachowania podczas lotu. Używanie tego samego kontekstu do warunkowania i istotnych prezentacji CS jest niezbędne do wywołania zachowań związanych z lotem. Ta zmodyfikowana procedura warunkowania strachu jest wiarygodną metodą obserwacji aktywnych zachowań obronnych u myszy, dając możliwość wyjaśnienia subtelnych mechanizmów i cech takich zachowań w kontekście strachu.

Wprowadzenie

Odpowiedni dobór zachowań obronnych w zagrażających okolicznościach jest kluczowy dla przetrwania wszystkich zwierząt. Zachowania obronne stopniowo zmieniają się z jednego na drugi w zależności od bliskości zagrożenia, na przykład przejście między zachowaniami zamrażającymi i uciekającymi1,2,3. Rozregulowanie tych zachowań jest często obserwowane w różnych zaburzeniach psychicznych4. Zespół stresu pourazowego (PTSD) jest jednym z takich zaburzeń charakteryzujących się przesadnymi zachowaniami obronnymi, takimi jak reakcje paniki na niezagrażające bodźce4.

Klasyczne warunkowanie strachu u gryzoni jest powszechnie używane jako model dla PTSD5,6,7, ale gryzonie nie wyrażają zachowań związanych z ucieczką (paniką) w tym modelu8. W związku z tym klasyczny model warunkowania strachu, często określany jako "model PTSD u gryzoni", nie ma uzasadnienia dla PTSD u ludzi, szczególnie w przypadku uchwycenia objawów ucieczki lub paniki, które nie zostały dobrze zbadane.

Ostatnio, kilka zmodyfikowanych protokołów warunkowania strachu skutecznie wykazało, że gryzonie wykazują zachowanie podczas tych procedur. Na przykład, powtarzające się skojarzenia bodźca warunkowego (CS) i bodźca bezwarunkowego (US) siedem razy w ciągu dnia pozwoliły samicom szczurów wykazywać zachowania związane z rzucaniem się podobne do zachowań związanych z lotem9. W dwudniowym warunkowaniu strachu przy użyciu szeregowych bodźców złożonych (SCS; składających się z tonu, po którym następuje hałas), myszy zaczęły wykazywać zachowania podczas lotu podczas części prezentacji SCS dotyczącej hałasu10,11,12. Szczegółowy opis metody SCS znajduje się w protokole report13. Trzydniowe warunkowanie strachu za pomocą SCS również działało na szczury, wywołując zachowania związane z lotem14. Jednak te nowe protokoły mają pewne ograniczenia. Na przykład zastosowanie seryjnej prezentacji cue nie pozwala na wykluczenie wpływu estymacji bliskości na zachowania obronne. W przypadku siedmiokrotnego związku CS-US u szczurów, większość reakcji ucieczki zaobserwowano u samic, a nie u samców.

W świetle tych rozważań, wprowadzamy zmodyfikowany protokół warunkowania strachu dla myszy, aby badać zachowania podczas lotu w kontekście strachu. Samce myszy konsekwentnie wykazują zachowania związane z lotem podczas naszego zmodyfikowanego warunkowania strachu. W tym protokole najważniejszy ton jest używany jako CS zamiast SCS. Dodatkowo, wymagane jest co najmniej pięć par CS-US w ciągu dnia przez co najmniej dwa dni, wraz z nasileniem strachu przez uwarunkowany kontekst. Protokół zapewnia kolejną opcję badania zachowań w locie, uzupełniając poprzednie protokoły, w zależności od celu badawczego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół został przeprowadzony zgodnie z wytycznymi Japońskiego Towarzystwa Fizjologicznego i otrzymał zgodę Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Medycznego Kanazawa (2021-32). Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ARRIVE. Do badania wykorzystano dorosłe samce myszy C57BL/6J (w wieku 3-6 miesięcy) i wcześniej potwierdzono, że myszy te wykazywały zachowania związane z lotem opisane w tym manuskrypcie15.

1. Przygotowanie zwierząt

    Myszy trzymane w
  1. grupach (3-4 w klatce; utrzymywane w temperaturze 23-27 °C; w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność; zapewnione ad libitum dostęp do pożywienia i wody) do rozpoczęcia eksperymentów.
  2. Indywidualnie trzymaj każdą mysz w klatce z pleksiglasu (14 cm × 21 cm × 12 cm) przez co najmniej 3 dni przed poddaniem się temu zmodyfikowanemu warunkowaniu strachu.

2. Ustawianie narzędzi/sprzętu

  1. Pole warunkowania strachu (Rysunek 1A)
    1. Wykorzystaj komorę kondycjonującą strach (25 cm × 25 cm × 25 cm) zamkniętą w pudełku tłumiącym dźwięk (67 cm × 53 cm × 55 cm) (patrz tabela materiałów).
    2. Wymagane są dwa konteksty (A i B). Dla kontekstu A stwórz czarno-białe paski na ścianach, przyklejając biały plastikowy karton z czarnymi taśmami (3 cm szerokości, 4 na tablicy). Na podłogę użyj białej, gładkiej plastikowej deski.
    3. Przetrzyj ściany i podłogę heptanolem (1%) przed każdą sesją.
      UWAGA: Nie jest używany aktywny system wentylacji. Czyszczenie alkoholem pod koniec sesji zmniejsza zapach heptanolu.
    4. W przypadku kontekstu B spraw, aby ściany wyglądały na całkowicie czarne, usuwając tablicę użytą w kontekście A. Podłoga jest podłogą siatkową.
      UWAGA: Nie ma specyficznego zapachu poza lekkim zapachem alkoholu do czyszczenia.
    5. Oświetl pudełko doświadczalne za pomocą górnej białej diody elektroluminescencyjnej (LED, 240 luksów) (patrz Tabela materiałów).
  2. Ohyda
    1. Podłącz wstrząs do mieszania (patrz Tabela materiałów) do podłogi kratowej wykonanej z prętów ze stali nierdzewnej. Służy to do zapewnienia wstrząsów stopy. Intensywność wstrząsów stopy została ustawiona na 0,9 mA zgodnie z popularnymi metodami warunkowania strachu10,11,12,13.
  3. Generator dźwięku
    1. Umieść głośnik (patrz Tabela materiałów) na suficie. Wszystkie bodźce akustyczne są wzmacniane.
    2. Cyfrowo modyfikuj i kalibruj ogólne amplitudy każdego bodźca, aby uzyskać poziomy ciśnienia akustycznego (SPL, re: 20 μ Pa) z przodu głośnika o długości 5 cm za pomocą mikrofonu 1/4 cala. Prezentuj ciągły dźwięk przebijający się przez ten głośnik.
      UWAGA: Kalibracja głośnika dźwięku ma kluczowe znaczenie dla zbadania delikatnego wpływu bodźca dźwiękowego na zachowania obronne podczas tego zmodyfikowanego warunkowania strachu.
  4. przetwornik
    1. Umieść podłogę komory testowej na przetworniku (patrz Tabela materiałów) w celu wykrycia wibracji. Sygnał z przetwornika jest przesyłany do karty dźwiękowej o częstotliwości próbkowania 8 kHz w celu zarejestrowania drgań behawioralnych.
  5. Kamera wideo
    1. Umieść kamerę CMOS (patrz Tabela materiałów) na suficie, aby śledzić ruchy obiektu i nagrywać dźwięk w pudełku do kondycjonowania.
  6. System wyzwalania
    1. Użyj oprogramowania dźwiękowego (patrz Tabela materiałów) do wyzwalania dźwięków lub wstrząsów stopą w zaplanowanym czasie.
      UWAGA: Każdy dostępny na rynku stymulator będzie w tym celu działał.

3. Eksperyment behawioralny

  1. Zaplanuj cztery dni procedur warunkowania strachu: habituacja (1 dzień, 5 prób), warunkowanie (2 dni, 5 prób każda) i sesje testowe/wygaszające (1 dzień, 5 lub 15 prób). Interwały międzypróbne wahały się między 60-75 s (Rysunek 1B).
    UWAGA: Najlepiej włączyć dziesięć lub więcej osób do grupy, aby uzyskać wiarygodne tendencje behawioralne. W zależności od celu badania wymagane są dwie lub trzy grupy.
    1. Podczas sesji kondycjonowania przedstaw bodziec bezwarunkowy (US) (1 s, 0,9 mA) natychmiast po zakończeniu bodźca warunkowego (CS) (ciągły impuls tonów, 8 kHz, 20 s, 95 dB SPL), jak pokazano na Rysunek 1B. Dostarcz pięć par CS-US w ciągu jednego dnia kondycjonowania.
    2. Po zakończeniu 5. wstrząsu stopą pozostaw obiekt w kontekście na 1 minutę przed powrotem do klatki domowej. Przetrzyj komorę 70% alkoholem do czyszczenia po każdym teście behawioralnym.
      UWAGA: Intensywność CS i US może być modyfikowana w zależności od celu badania. Poprzednie raporty wykazały, że większa intensywność CS wyzwala bardziej aktywne zachowania obronne niż łagodniejsze 15. Dni kondycjonowania mogą być również wydłużone.
  2. Indukuj zachowania podczas lotu podczas prezentacji CS zgodnie z harmonogramem wymienionym poniżej.
    UWAGA: W tym eksperymencie stosuje się cs (95 dB SPL) i US (0,9 mA).
    1. W dniu 1 należy poddać uczestników 5 badaniom klinicznym z użyciem samego CS w kontekście A.
    2. W dniach 2 i 3 pacjenci z 5 badaniami asocjacyjnymi CS-US w kontekście B.
    3. W dniu 4 wystaw uczestników na 5 prób samych CS podczas sesji przypomnieniowej w kontekście B. W przypadku testowania wymierania pamięci, wystaw badanych na 15 prób samych CS.
      UWAGA: Aby przetestować stabilność pamięci, pomocne będzie przedłużenie sesji wygaszania o 2-3 dni. Ponadto, testowanie pamięci tydzień później zamiast w dniu 4 może dostarczyć dodatkowego potwierdzenia stabilności pamięci.

4. Analiza zachowań defensywnych

UWAGA: Analizowany jest ruch, procent zamrożenia i liczba skoków podczas prezentacji CS. Szczegóły opisane są poniżej. Jeśli to możliwe, lepsza byłaby analiza w sposób podwójnie ślepy.

  1. Zsynchronizuj chronometraż wydarzeń w filmie i czas bodźców (CS i US) za pomocą początku dźwięku zarejestrowanego w filmie.
  2. Wykorzystaj niestandardowy kod, aby obliczyć zarówno uśrednione, jak i całkowite ruchy myszy na podstawie różnicy w środku masy sylwetki obiektu w różnych klatkach.
    UWAGA: Do tego pomiaru używana jest dowolna jednostka, ponieważ prędkość ruchu zależy od częstotliwości próbkowania filmu.
  3. Aby zmierzyć procent zamarzania, użyj sygnału przetwornika w czasie.
    1. Wstępne przetwarzanie sygnałów przetwornika za pomocą filtra pasmowo-przepustowego 20-500 Hz.
    2. Obliczyć średnią kwadratową amplitudy sygnału przetwornika w czasie dla każdego przedziału 50 ms.
    3. Ustaw próg amplitudy sygnału, aby wykryć okres bezruchu. Czas unieruchomienia to okres sygnału krótszy niż próg przez ponad 1 s.
    4. Ręcznie zmierz czas zamrażania, oglądając wideo.
    5. Dostosuj próg amplitudy sygnału dla zamrożenia, porównując ręcznie zmierzony procent zamrożenia i procent obliczony na podstawie sygnału przetwornika.
  4. Policz liczbę skoków ręcznie z plików wideo.
    UWAGA: Liczenie rzutek będzie również przydatne w ocenie reakcji lotu.

5. Analiza statystyczna

  1. Ustaw istotność statystyczną na p < 0,05.
  2. W celu porównania między wieloma grupami i wieloma czynnikami przeprowadź wielokierunkową ANOVA, a następnie testy post-hoc. Jeśli testowany jest określony dzień harmonogramu kondycjonowania, wykonaj wiele testów porównawczych lub testów permutacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiono wyniki uzyskane podczas zmodyfikowanego warunkowania lękowego u samców myszy (C57BL/6J; w wieku 3-6 miesięcy), zgodnie z harmonogramem przedstawionym na Rysunku 1C. Eksperyment został zaprojektowany w celu zbadania, w jaki sposób warunkowany kontekst wpływa na ekspresję zachowań ucieczkowych. Przypisano dwie grupy: Grupę 1 (n = 10) oraz Grupę 2 (n = 10). W eksperymencie zastosowano CS (95 dB SPL) oraz US (0,9 mA).

W dniu 1. wszystkie myszy zostały po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zmodyfikowany protokół warunkowania strachu przedstawiony w tym artykule jest stabilną metodą badania zachowań związanych z lotem w kontekście strachu. Stosując ten protokół, odkryliśmy, że zachowania ucieczki myszy w kontekście strachu są wywoływane przez istotne bodźce i zależą od kontekstu. Charakterystyka zachowania w locie nie została dobrze zbadana, ponieważ nie istniał odpowiedni protokół do obserwacji zachowań w locie. Protokół ten będzie jedną z odpowiednich metod badania aktywnych zachowań obronnych w kontekści...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez KAKENHI Grants JP22K15795 (dla T.F.), JP22K09734 (dla N.K.), JP21K07489 (dla R.Y.), Kanazawa Medical University (C2022-3, D2021-4, dla R.Y.) i The Naito Foundation (dla T.F.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Głośnik audioFostexFT17H
WzmacniaczSonyTA-F500
CMOSkamera Sanwa Supply Inc.CMS-V43BK
Komora kondycjonująca strachPanlab S.L.U.LE116
Granulat spożywczyNosanLabo MR standard
LEDYamazenLT-B05N
MikrofonACOtyp 4156N
Wstrząsacz do mieszaniaPanlab S.L.U.LE 100-26
Karta dźwiękowaBehringerUMC202
Oprogramowanie dźwiękoweOprogramowanie SyntrilliumCool Edit 2000
PrzetwornikPanlab S.L.U.LE 111

Bibliografia

  1. Fanselow, M. S., Lester, L. S. Evolution and learning. , Psychology Press. 185-212 (1988).
  2. Fanselow, M. S. Neural organization of the defensive behavior system responsible for fear. Psychonomic Bulletin & Review. 1 (4), 429-438 (1994).
  3. Mobbs, D., Headley, D. B., Ding, W., Dayan, P. Space, time, and fear: Survival computations along defensive circuits. Trends in Cognitive Sciences. 24 (3), 228-241 (2020).
  4. Black, D. W., Grant, J. E. Dsm-5 guidebook: The essential companion to the diagnostic and statistical manual of mental disorders. American Psychiatric Pub. , (2014).
  5. Bienvenu, T. C., et al. The advent of fear conditioning as an animal model of post-traumatic stress disorder: Learning from the past to shape the future of ptsd research. Neuron. 109 (15), 2380-2397 (2021).
  6. Johnson, L. R., Mcguire, J., Lazarus, R., Palmer, A. A. Pavlovian fear memory circuits and phenotype models of ptsd. Neuropharmacology. 62 (2), 638-646 (2012).
  7. Yehuda, R., Ledoux, J. Response variation following trauma: A translational neuroscience approach to understanding ptsd. Neuron. 56 (1), 19-32 (2007).
  8. Ledoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23 (1), 155-184 (2000).
  9. Gruene, T. M., Flick, K., Stefano, A., Shea, S. D., Shansky, R. M. Sexually divergent expression of active and passive conditioned fear responses in rats. Elife. 4, e11352(2015).
  10. Fadok, J. P., et al. A competitive inhibitory circuit for selection of active and passive fear responses. Nature. 542 (7639), 96-100 (2017).
  11. Hersman, S., Allen, D., Hashimoto, M., Brito, S. I., Anthony, T. E. Stimulus salience determines defensive behaviors elicited by aversively conditioned serial compound auditory stimuli. Elife. 9, e53803(2020).
  12. Trott, J. M., Hoffman, A. N., Zhuravka, I., Fanselow, M. S. Conditional and unconditional components of aversively motivated freezing, flight and darting in mice. Elife. 11, e75663(2022).
  13. Borkar, C. D., Fadok, J. P. A novel pavlovian fear conditioning paradigm to study freezing and flight behavior. Journal of Visualized Experiments. 167, e61536(2021).
  14. Totty, M. S., et al. Behavioral and brain mechanisms mediating conditioned flight behavior in rats. Scientific Reports. 11 (1), 8215(2021).
  15. Furuyama, T., et al. Multiple factors contribute to flight behaviors during fear conditioning. Scientific Reports. 13 (1), 10402(2023).
  16. Cain, C. K. Avoidance problems reconsidered. Current Opinion in Behavioral Sciences. 26, 9-17 (2019).
  17. Ledoux, J. E., Moscarello, J., Sears, R., Campese, V. The birth, death and resurrection of avoidance: A reconceptualization of a troubled paradigm. Molecular Psychiatry. 22 (1), 24-36 (2017).
  18. Bouchekioua, Y., et al. Serotonin 5-ht2c receptor knockout in mice attenuates fear responses in contextual or cued but not compound context-cue fear conditioning. Translational Psychiatry. 12 (1), 58(2022).
  19. Bouchekioua, Y., Nishitani, N., Ohmura, Y. Conditioned lick suppression: Assessing contextual, cued, and context-cue compound fear responses independently of locomotor activity in mice. Bio-Protocol. 12 (23), e4568(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Modified Fear Conditioning for Inducing Flight Behaviors in Mice
Posted by JoVE Editors on 5/17/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66266

Tagi

Zachowanie obronnezachowanie zamarciazachowanie myszybod ce warunkowebod ce bezwarunkowezaburzenia l kowemodel PTSDneuronauka behawioralna
Zmodyfikowane warunkowanie strachu w celu wywołania zachowań związanych z lotem u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.