Oznaczanie ilościowe Acanthamoeba spp. Ruchliwość

Podsumowanie

Ta procedura opisuje, jak wizualizować, śledzić i określać ilościowo Acanthamoeba spp. Ruchliwość.

Streszczenie

Zapalenie rogówki Acanthamoeba to poważna infekcja oka, która stanowi wyzwanie w leczeniu i może prowadzić do ślepoty. Pomimo swojej wszechobecności i potencjalnego zanieczyszczenia soczewek kontaktowych po ekspozycji na wodę, naturalne zachowanie tego patogenu pozostaje nieuchwytne. Zrozumienie wzorców ruchowych Acanthamoeba może dostarczyć nam informacji o tym, w jaki sposób kolonizuje soczewki kontaktowe i zanieczyszcza rogówkę pacjenta. Na szczęście Acanthamoeba spp. są widoczne w mikroskopii jasnego pola przy 4-krotnym powiększeniu. Poprzednie techniki zostały opracowane w celu ilościowego określenia ruchliwości Acanthamoeba w odniesieniu do efektów cytopatycznych lub niedostatecznej ekspozycji na pole elektryczne. W tym miejscu opisujemy metodę śledzenia i ilościowego oznaczania Acanthamoeba spp. Ruchliwość długoterminowa (od godzin do dni), która jest protokołem mającym zastosowanie do wielu szczepów ameby, powierzchni i stanu odżywienia ameby. Procedura ta służy do określenia wielu kwantyfikacji ruchliwości rdzenia, takich jak odległość, prędkość, uwięzienie i kierunkowość, które są niezbędne do monitorowania różnych etapów infekcji, proliferacji lub zmiany zachowania.

Wprowadzenie

Badania nad Acanthamoeba znacznie wzrosły w ostatnich latach ze względu na zwiększoną częstość występowania zapalenia rogówki Acanthamoeba (AK), które jest infekcją pasożytniczą po przyczepieniu Acanthamoeba do rogówki¹. Podczas gdy ogniska AK można przypisać niewłaściwej pielęgnacji soczewek kontaktowych lub nieskutecznym rozwiązaniom do pielęgnacji soczewek kontaktowych^2,3,4,5, obecnie nie ma wymagań dotyczących wykazania skuteczności dezynfekcji Acanthamoeba dla jakiegokolwiek produktu na rynku. Jednak w środowisku naukowym i organizacjach normalizacyjnych trwają wysiłki mające na celu zbadanie protokołów niezbędnych do ilościowego określenia skuteczności dezynfekcji produktów do pielęgnacji soczewek kontaktowych^6,7. Ponadto, ze względu na podobieństwo w aspektach komórkowych i funkcjonalnych do ludzkich makrofagów, zauważono, że Acanthamoeba odgrywa znaczącą rolę w żywieniu i rozprzestrzenianiu innych ludzkich patogenów⁸, oprócz chorobotwórczości, jaką niesie ze sobą sama ameba.

Ostatnio opisano techniki, które były w stanie określić ilościowo ruchliwość Acanthamoeba - która generalnie nie podlega w dużym stopniu ruchom Browna^9,10 - w odniesieniu do efektów cytopatycznych lub niedostatecznej ekspozycji na pole elektryczne^9,11, a także postępy w analizie ruchliwości w badaniach nad gigantycznymi wirusami z użyciem Acanthamoeba jako możliwy do śledzenia wektor wirusowy^12,13. W ciągu ostatnich 20 lat nastąpiła również stała i znacząca poprawa w śledzeniu komórek i cząstek przy użyciu nowych programów, takich jak oprogramowanie do obrazowania użyte tutaj, oraz nowych algorytmów i technologii głębokiego uczenia¹⁴. Jest to jednak stosunkowo nowa i rozwijająca się dziedzina nauki dotycząca badań laboratoryjnych, zastosowań klinicznych i standardów przemysłowych, a także brakuje opublikowanych danych dotyczących metod wizualizacji i śledzenia tej ameby, szczególnie w celu ilościowego określenia zmian w zachowaniu po przestrzeganiu soczewek kontaktowych lub w trakcie lub po dezynfekcji soczewek kontaktowych. Inne dziedziny, które rozszerzyły się o długoterminowy monitoring wizualny, wspierały te wysiłki^15,16,17. Ze względu na z natury trudną naturę Acanthamoeba - w tym ogólną odporność na plazmidy (które mogą nadawać fluorescencję), zdolność ameba do konsumowania i niszczenia standardowych barwników komórkowych oraz unikalny zewnętrzny skład białka - co utrudnia znakowanie przeciwciał - metody dostępne dla innych komórek, które uwidaczniają je w warunkach innych niż obrazowanie w jasnym polu, były bezużyteczne w tym organizmie. Tak więc ilościowe określenie ruchliwości tej ameby wykazało znaczący dodatek do tej dziedziny. Korzystając z opisanej tutaj metody, udało nam się ustalić, że ameba pozostaje ruchliwa przez co najmniej 12 godzin bez składników odżywczych¹⁸ i że ameba, która została poddana procesowi dezynfekcji i przestaje się poruszać podczas dezynfekcji, może odzyskać swoją ruchliwość po dezynfekcji, jeśli nie zostanie w pełni zlizowana¹⁹.

Ten protokół szczegółowo opisuje, jak wizualnie śledzić i określać ilościowo ruchliwość ameb pod mikroskopem. Podstawowe kroki to zarejestrowanie ameby w jasnym polu przy użyciu odpowiedniej ostrości i czasu między obrazami, przekształcenie obrazów w binarne za pomocą oprogramowania do obrazowania, a następnie użycie wtyczki śledzącej oprogramowania do obrazowania, aby ustawić parametry eksperymentalne i śledzić każdą amebę w celu określenia wymaganych pomiarów, takich jak prędkość, odległość i uwięzienie. Następnie możliwe jest ilościowe określenie chemotaksji ameby lub populacji ameb w celu określenia kierunkowości. Kluczowym wkładem tej metody jest wizualizacja i ilościowe określenie zachowania ameb podczas różnych stanów wsparcia żywieniowego, przylegania do powierzchni, wyzwania dezynfekcji lub innych zmian środowiskowych, takich jak współżycie z hodowlą komórek ssaków.

Protokół

1. Przygotowanie Acanthamoeba

UWAGA:Ten protokół został zweryfikowany dla ATCC 50655, 30872, 50702, 30010, 30461, 50370, 50703, 30137, PRA-115 i PRA-411. Jest to patogen BSL2 i powinien być badany w kapturze BSL2 i laboratorium.

1. Stwórz główną kulturę z fiolki z próbką lub przygotowanej wtyczki²⁰, napełniając kolbę T75 30 ml pożywki AC6 i aseptycznie dodaj do niej jedną zatyczkę lub zawartość fiolki z próbką. Inkubować kolbę przez 3-5 dni w temperaturze 26-30 °C, aż kolba osiągnie 50-80% zlewania się.
2. Przejdź komórki dzień wcześniej, zanim będą potrzebne do stworzenia jednorodnej populacji trofozoitów.
   1. W zależności od potrzeb szczepu, potrząśnij i/lub energicznie uderz w kulturę mistrzowską 2x, aby usunąć przylegające trofozoity.
   2. Napełnij kolbę T75 30 ml pożywki AC6. Dodaj 2 ml kultury głównej do przejścia. Inkubować kolbę przez 18-24 h w temperaturze 26-30 °C.
3. Przed zbiorem należy dokonać oględzin populacji trofozoitów w 4-krotnym powiększeniu w mikroskopie. Upewnij się, że trofozoity są przylegające i jednolite.
4. Energicznie uderz w kolbę 2x, aby usunąć przylegające trofozoity. Wlej zawartość do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
5. Wirować probówkę o masie 500 x g przez 5 minut w zbalansowanej wirówce, aby granulować amebę. Odlać lub odpipetować pożywkę sklarowaną nad osadem i wyrzucić. Rozcieńczyć osad w 2-10 ml 1/4 roztworu Ringera.
6. Odwirować próbkę. Dodać 10 μl próbki do jednorazowego hemocytometru i policzyć jtk/ml Acanthamoeba.
7. Na podstawie liczby hemocytometrów rozcieńczyć osad ameby do stężenia 7,5 x 10³ komórek/ml w 1/4 roztworu Ringera.
8. Ameba nasienna na powierzchni, która może być szklanym, plastikowym lub nieodżywczym agarem, oraz o różnych kształtach studzienek w zależności od potrzeb eksperymentalnych, jak opisano poniżej.
   1. Płytka 96-dołkowa: Zasiej każdą studzienkę 200 μl zawiesiny Acanthamoeba i zamknij płytkę pokrywką.
   2. Płytka 48-dołkowa: Zasiej każdą studzienkę 1 ml zawiesiny Acanthamoeba i zamknij płytkę pokrywką.
   3. Komórka przepływowa: Powoli dodawaj 4 ml zawiesiny Acanthamoeba przez sterylne porty sterylnej aluminiowej celi przepływowej, unikając pęcherzyków w komorze. Zacisnąć porty zamknięte po dodaniu zawieszenia.
9. Przed obrazowaniem należy odczekać, aż ameba przylgnie do powierzchni przez co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem zapisu mikroskopowego.

2. Wizualizacja i nagrywanie Acanthamoeba

1. Wizualizuj amebę w 4-krotnym powiększeniu w jasnym polu. Tło powinno być jasnoszare, a ameba powinna być. Dostosuj światło i ostrość tak, aby ameba była pełnymi cieniami, a nie półprzezroczystymi (a więc, lekko nieostrymi, Rysunek 1.).
   UWAGA: Optymalne powiększenie to 4x do śledzenia z kilku powodów: Ameby, które opuszczają lub wchodzą w pole widzenia podczas śledzenia, nie powinny być uwzględniane w analizie danych, więc mniejsze powiększenie najlepiej wspiera maksymalną liczbę ameb uwzględnionych w analizie w danym okresie. Ameba powinna pojawiać się jako ciągłe czarne kółka w jasnym polu, aby przekształcić je w binarne w celu analizy śledzenia. Najłatwiej jest to osiągnąć przy mniejszym powiększeniu, ponieważ większe powiększenia łatwo ujawniają półprzezroczystą naturę i wewnętrzne struktury ameby. Ogólnie rzecz biorąc, więcej ameb można uchwycić w jednym polu widzenia w mniejszym powiększeniu, co wspiera bardziej niezawodną analizę danych.
2. Ustaw programy nagrywające w oprogramowaniu do obrazowania tak, aby rejestrowały obraz w regularnych odstępach czasu w celu śledzenia ameby. Najdłuższy czas między obrazami, który pozwoli na dokładne śledzenie, to 30 s, optymalny czas dla rozmiaru pliku i szczegółów śledzenia jest sugerowany na 12 s lub 24 s.
3. Ameby mogą być śledzone przez wiele dni na raz, ale należy pamiętać o rozmiarze pliku, jaki stworzy ten rodzaj nagrania i nieodłącznej trudności w manipulowaniu bardzo dużymi plikami. Aby tego uniknąć, nagrywaj ameby dla odcinków czasu w określonych odstępach czasu. Na przykład nagrywaj przez 1 godzinę co 12 godzin przez 5 dni.
4. Jeśli pozwala na to mikroskop i program, rejestruj wiele dołków podczas jednej sesji, używając współrzędnych XY dołków płytkowych lub wielu lokalizacji komory przepływowej. W razie potrzeby zszyj ze sobą wiele sekcji jednej studzienki lub komory przepływowej, aby uzyskać większe pole widzenia przy 4-krotnym powiększeniu.
   UWAGA: Jedynym ograniczeniem liczby lokalizacji, które można zarejestrować, jest to, jak szybko stolik mikroskopu może poruszać się między lokalizacjami w czasie interwału obrazu (np. robienie zdjęcia co 12 s, 24 s itd.). Nie jest to jednak wymagane, a filmy śledzące wykonane z jednej lokalizacji mogą nadal mieć wystarczającą liczbę ścieżek do solidnej analizy statystycznej. W tym badaniu użyto mikroskopu Nikon Eclipse Ti-U, a zautomatyzowany ruchomy stolik wykorzystano do rejestrowania obrazów w wielu studzienkach jednocześnie. Jednak każdy mikroskop z programowalną funkcją nagrywania będzie działał. Mikroskop musi być podłączony do komputera i mieć możliwość zapisywania obrazów na programie lub dysku twardym.

3. Analiza wielkości ameby

1. Otwórz plik mikroskopu w oprogramowaniu do obrazowania. Otworzą się opcje importu formatów biologicznych. W oknie dialogowym upewnij się, że spełnione są następujące warunki: Wyświetlanie stosu; Widok z: Selection-Hyperstack; Zarządzanie pamięcią: zaznacz opcję Użyj stosu wirtualnego; Tryb koloru: Domyślny.
2. Upewnij się, że żadne z pozostałych menu rozwijanych ani pól wyboru nie jest aktywne. Kliknij przycisk OK.
3. Otwórz opcje serii bioformatów. Wybierz, która seria jest potrzebna. Jeśli w danym momencie rejestrowana jest tylko jedna lokalizacja, prawdopodobnie będzie w tym miejscu tylko jedna opcja. Kliknij przycisk OK.
4. Wybierz opcję Obraz > Duplikuj, aby zduplikować pojedynczą studnię, z którą pracuje się w danym momencie, wybierając tylko jeden kanał C i tylko jeden kanał Z.
5. Od tego momentu pracuj tylko ze zduplikowanym obrazem do manipulacji i analizy, a nie z oryginałem. Wybierz opcję Obraz > Wpisz > 8-bitowy. Wybierz Proces> odejmij tło.
6. Ustaw toczącą się kulę na 10.0. Sprawdź jasne tło. Sprawdź paraboloidę ślizgową.
7. Wybierz opcję Proces> Zwiększ kontrast. Ustaw nasycone piksele na 0,1% dla trofozoitów lub 0,3% dla grupy komórek i agregatów.
8. Wybierz opcję Obraz > Dostosuj próg > (domyślnie > czarno-biały). Otworzy się proces Make Binary. Wybierz opcję Domyślne i zaznacz opcję Czarne tło (z opcji Maski binarne).
9. Wybierz próg agresywnie, tak aby większość punktów tła nie była widoczna, ale widoczna była pewna część każdej ameby.
10. Jeśli oprogramowanie do obrazowania odwróciło obraz, a tło jest białe, a ameba jest, przejdź do Edytuj > odwróć, aby naprawić to na czarnym tle i białej amebie.
11. Wybierz Proces> Binarny > Zamknij, w przypadku, gdy komórki mają niewielką przestrzeń w błonie zewnętrznej z powodu braku ostrości lub ruchliwości komórki.
12. Wybierz opcję Process > binary > Fill Holes (Wypełnij otwory). Usuń artefakty inne niż ameby, korzystając z narzędzi do rysowania kształtów i funkcji Edycja > Wypełnienie. Jeśli w tym momencie tło jest białe, a ameba, wybierz opcję Edytuj > Odwróć. W tym momencie obraz powinien reprezentować obrazy binarne w Rysunek 2.
13. Aby zarejestrować rozmiar każdej ameby, wybierz Analizuj > Analizuj cząstki. Rozmiar zestawu: 10-Nieskończoność, Korkularność: 0-1, Pokaż: Nic. Sprawdzaj tylko, wyświetlaj wyniki i podsumowuj.
14. Zapisz wyświetlone pliki CSV. Wybierz opcję Plik > Zapisz jako > Tiff i edytuj nazwę zgodnie z żądaną specyfikacją.

4. Przygotowanie plików mikroskopowych do śledzenia (analiza ruchliwości)

1. Otwórz plik mikroskopu w oprogramowaniu do obrazowania. Otworzą się opcje importu formatów biologicznych.
2. W oknie dialogowym upewnij się, że spełnione są następujące warunki: Wyświetlanie stosu; Wyświetl za pomocą: Selection-Hyperstack. Aby zarządzać pamięcią, zaznacz opcję Użyj stosu wirtualnego. Kliknij przycisk OK.
3. Otworzą się opcje serii Bio-Formats. Wybierz, która seria jest potrzebna. Jeśli w danym momencie rejestrowana jest tylko jedna lokalizacja, prawdopodobnie będzie w tym miejscu tylko jedna opcja. Kliknij przycisk OK.
4. Wybierz Obraz > duplikat. Od tego momentu pracuj tylko nad zduplikowaną sekcją wideo, zamiast pracować nad oryginalnym plikiem.
   UWAGA: Zduplikuj fragment filmu, który jest śledzony w tym czasie. Aby to zrobić, trzeba znać ramki, które odpowiadają minutom wymaganym do przeprowadzenia eksperymentu. Na przykład, jeśli ktoś chce śledzić^{1 godzinę i} robi zdjęcia co 24 sekundy, powinno być 150 klatek w 1^godzinie. Dlatego 1 godzina będzie klatkami 1-150, 2 godzina będzie 151-300 i tak dalej.
5. Wybierz Obraz > Wpisz > 8-bitowy. Wybierz Procesuj > odejmij tło. Ustaw toczącą się piłkę na 10.0.
6. Sprawdź jasne tło. Sprawdź paraboloidę ślizgową. Wybierz opcję Process > Enhance Contrast (Przetwarzaj Zwiększ kontrast i ustaw ją na 0,1%.
7. Zaznacz wszystkie wycinki x# (na przykład wszystkie 150 wycinków). Usuń zaznaczenie opcji Normalizuj. Wybierz opcję Obraz > Dostosuj próg > (domyślnie > czarno-biały).
8. Otworzy się proces Make Binary. Wybierz opcję Domyślne. Sprawdź czarne tło (masek binarnych).
9. Proguj agresywnie, więc większość plam tła nie jest widoczna, ale niektóre części ameby są widoczne. Na tym etapie, jeśli tło jest białe, a ameba, wybierz opcję Edytuj > Odwróć. Tło powinno być czarne, a ameba powinna być biała.
10. Wybierz opcję Process > Binary > Close (Zamknij). Wybierz opcję Process > binary > Fill Holes (Wypełnij otwory). Wybierz opcję Plik > Zapisz jako > Tiff i edytuj nazwę zgodnie z żądaną specyfikacją. Plik jest teraz gotowy do śledzenia.

5. Analiza ruchliwości za pomocą śledzenia

1. W oprogramowaniu do obrazowania z plikiem tiff, który jest potrzebny do otwarcia śledzenia, przejdź do Wtyczki > Śledzenie > Trackmate. Otworzy się wersja Trackmate.
2. Wybierz pozycję Dalej. Wybierz detektor LoG z menu rozwijanego detektora. Ustaw szacowaną średnicę plamki: 35,0 mikronów, próg 1,0. Odznacz Użyj filtru mediany i Wykonaj lokalizację subpikseli.
3. Kliknij przycisk Podgląd na pierwszym, środkowym i końcowym plasterku. Upewnij się, że wszystkie ameby są ujęte w fioletowym okręgu i że nie uwzględniono defektów tła ani artefaktów.
4. Wybierz pozycję Dalej. Rozpocznie się przetwarzanie, a wykonanie tego kroku może potrwać kilka minut. Pasek wykrywania u góry ekranu wskaże, jaka część procesu została zakończona.
5. Po wyświetleniu monitu wybierz pozycję Dalej. W początkowym progowaniu wybierz ponownie pozycję Dalej, nie zaznaczając niczego. Wybierz opcję Hyperstack Displayer podczas wybierania widoku. Wybierz pozycję Dalej.
6. Ustaw filtr na miejscach i wybierz Dalej, nie zaznaczając niczego. Wybierz tracker; Aby to zrobić, wybierz LAP Tracker (zamiast Simple LAP Tracker). Wybierz pozycję Dalej.
7. W przypadku łączenia klatka-klatka ustaw maksymalną odległość na 40 μm. Na torze zaznacz opcję Zamykanie odstępów między segmentami toru. Ustaw w tym celu maksymalną odległość na 100 μm, a maksymalny odstęp między ramkami na 4. Nie wybieraj niczego dla opcji Dzielenie segmentów ścieżki lub Scalanie segmentów ścieżek.
8. Wybierz pozycję Dalej. Śledzenie może zająć dużo czasu. Po zakończeniu w oknie powinien pojawić się komunikat: Śledzenie wykonane w x s na dole. Wybierz pozycję Dalej.
9. Po zakończeniu śledzenia ponownie wybierz pozycję Dalej. Ustawianie filtrów na ścieżkach: Wybierz znak + w lewym dolnym rogu, aby dodać filtr określający liczbę miejsc na ścieżkach. Ustaw filtr na Powyżej dla co najmniej 93% klatek (np. 150 klatek wymaga co najmniej 140 miejsc).
   UWAGA: Niektóre wersje tego oprogramowania będą wymagały wybrania przeciwnego odpowiednika, takiego jak Poniżej co najmniej 7%, co można zrobić, przeciągając linię w lewo lub w prawo, aby osiągnąć żądaną liczbę.
10. Wybierz pozycję Dalej. Pojawią się opcje wyświetlania. Upewnij się, że ścieżki w każdej klatce nie są zdeformowane ani nieparzyste w sposobie, w jaki porusza się ameba, przed zapisaniem pliku XML Trackmate lub pliku CSV Tracks.
11. Jeśli utwór musi zostać usunięty, kliknij TrackScheme. TrackScheme pokaże wszystkie ścieżki i punkty styku ameby we wszystkich ramkach.
    UWAGA: Możliwymi powodami usunięcia śladu są to, że ameba weszła na pole widzenia lub poza nim podczas nagrywania, ślad jest niewłaściwie ukształtowany w porównaniu z rzeczywistą ścieżką ameby lub z jakiegoś powodu ślad lub ameba są odstające w danych zgodnie z parametrami eksperymentalnymi itp.
12. Kliknij na amebę, aby podświetlić miejsce na zielono na ekranie, a w Trackscheme miejsce to będzie otoczone zielonym kwadratem. Spowoduje to, że wskaże, który ślad lub miejsce należy usunąć.
13. Kliknij prawym przyciskiem myszy ścieżkę, która ma zostać usunięta, i wybierz opcję Cała ścieżka. Naciśnij przycisk Usuń.
14. Po przejrzeniu wszystkich ścieżek zapisz plik śledzenia, klikając Zapisz w lewym dolnym rogu wyskakującego okienka oprogramowania śledzącego. Zapisz plik XML pod nazwą filmu. Kliknij przycisk Wznów, aby wrócić do wyskakującego okienka oprogramowania śledzącego.
15. Kliknij Ścieżki i wybierz Ścieżki po lewej stronie. Kliknij Eksportuj do pliku CSV i zapisz plik CSV.
16. Jeśli arkusz kalkulacyjny nie rozpoznaje wynikowego pliku CSV, wykonaj następujące czynności.
    1. Otwórz zapisany plik CSV w Notatniku. Kliknij Control + A i Control + C, aby skopiować całą zawartość.
    2. Otwórz arkusz kalkulacyjny i kliknij Control + V, aby wkleić go do arkusza kalkulacyjnego. Wszystkie dane będą znajdować się w jednej komórce.
    3. Gdy komórki z danymi są nadal zaznaczone, przejdź do pozycji Dane > tekst na kolumny. Wybierz opcję Rozdzielany > Dalej. Wybierz Przecinek > Następny > Zakończ. Zapisz ten plik jako nowy plik CSV.
17. Plik CSV śledzenia będzie zawierał wiele parametrów dostępnych do analizy (Rysunek 3). Skopiuj i wklej żądane parametry do nowego pliku CSV (Rysunek 4) w celu analizy. Użyte tutaj parametry są opisane poniżej.
    1. Całkowita przebyta odległość: całkowita odległość przebyta przez amebę w μm.
    2. Maksymalna przebyta odległość: maksymalna odległość na ścieżce ameby od jej punktu początkowego - niekoniecznie musi to być punkt końcowy
       
       Gdzie dij jest odległością do dowolnego miejsca I do dowolnego punktu j na torze.
    3. Współczynnik zamknięcia: Współczynnik uwięzienia wskazuje, jak skutecznie ameba uciekała od punktu początkowego: czy poruszała się w linii prostej od punktu początkowego (wartość bliska 1), czy też pozostawała stosunkowo blisko punktu początkowego (wartość bliska 0).
       
    4. Średnia prędkość toru: Średnia prędkość ameby na całkowitej odległości przebytej w mikronach na sekundę.
       
    5. Przemieszczenie toru: Odległość między punktem początkowym ameby a punktem końcowym w mikronach.
       UWAGA: Wszystkie parametry analityczne oprogramowania do obrazowania i ich definicje można znaleźć tutaj: https://imagej.net/plugins/trackmate/analyzers/. Pamiętaj, że każdy zapisany plik jest podsumowaniem analizowanych w tym czasie ścieżek. Aby uzyskać solidną analizę danych, należy odpowiednio połączyć wyniki z wielu powtórzeń, godzin itp., zgodnie z danymi (Rysunek 5 i Rysunek 6).

Wyniki

Aby osiągnąć sukces przy użyciu tej metody, należy wziąć pod uwagę kilka kluczowych elementów. Pierwszym z nich jest fizyczna konfiguracja ameby i mikroskopu, drugim jest właściwe wykorzystanie oprogramowania do obrazowania, a trzecim jest eksport i analiza danych obrazowania w znaczący sposób.

Zanim rozpocznie się zapis mikroskopowy, ważne jest, aby upewnić się, że ameba jest prawidłowo skupiona na stoliku mikroskopu (Rysunek 1). Zamiast skupiać się na amebie w najbardziej optymalnej płaszczyźnie Z dla poszczególnych szczegółów, idealnie jest oglądać je bardzo nieznacznie nieostre, tak aby stały się stałymi czarnymi kropkami, w przeciwieństwie do ich półprzezroczystego stanu, gdy ogląda się je szczegółowo. Przeglądanie ich w ten sposób pozwoli oprogramowaniu do obrazowania i oprogramowaniu śledzącemu znacznie łatwiej znaleźć każdą pojedynczą amebę, gdy plik zostanie przekonwertowany na binarny ( Rysunek 2). Wiedza o tym, jaki jest cel w oprogramowaniu do obrazowania - to znaczy, aby każda ameba wyglądała jak dobrze zdefiniowane białe kółko, może pomóc czytelnikowi znaleźć właściwą ostrość podczas robienia oryginalnych zdjęć w jasnym polu. Następnie, z jasno zdefiniowanym każdym okręgiem, oprogramowanie śledzące będzie w stanie prawidłowo śledzić ruchliwość i zbierać indywidualne wskaźniki ruchliwości dla każdej ameby.

Po wykonaniu krok po kroku wskazówek zawartych w powyższym protokole dla oprogramowania do obrazowania i oprogramowania śledzącego oraz odesłaniu do powiązanego wideo, aby pomóc w kluczowych pierwszych krokach korzystania z oprogramowania do obrazowania, nadszedł czas na eksport danych oprogramowania do obrazowania w celu kwantyfikacji i analizy danych. Nieprzetworzone dane wyjściowe z oprogramowania śledzącego będą podobne do tego, co widać na Rysunek 3. W tym miejscu ważne jest, aby sprawdzić, czy liczba miejsc w wyeksportowanych ścieżkach jest poprawna dla tego, czego się oczekuje (np. jeśli ktoś poprosił, aby 93% klatek było obecnych na każdej ścieżce i miał łącznie 100 klatek w filmie, każda wyeksportowana ścieżka powinna mieć więcej lub równą 93 plamom). Jeśli plamki nie spełniają wymagań, może być konieczne cofnięcie się do kroków oprogramowania śledzącego, aby upewnić się, że wymagane parametry zostały ustawione poprawnie.

Z surowego eksportu rozpocznij tworzenie arkusza analizy danych (Rysunek 4). Ważne jest, aby pamiętać, że każdy utwór reprezentuje pojedynczą amebę w pojedynczej repliki. Dlatego, jak widać na Rysunek 4, Rysunek 5 i Rysunek 6, wszystkie ścieżki dla zestawu klatek lub punktu czasowego muszą być uśrednione (Rysunek 4), a proces ten musi być wykonany dla każdego zestawu klatek lub punktu czasowego w całej serii (tj. jeśli w sumie nagrano 3 godziny wideo, a punkty danych są podzielone przez godzinę, następnie będą trzy zestawy klatek/godziny do przeanalizowania na replikę, Rysunek 5). Wreszcie, z tej kombinacji średnich w każdym zestawie ramek w każdej powtórzeniu, uśrednione dane z każdej repliki muszą zostać połączone w jedną przestrzeń, aby można było przeanalizować dane z wielu powtórzeń w celu określenia rzeczywistej średniej i odchylenia standardowego na punkt czasowy (Rysunek 6).

Średnie z każdej repliki zostaną użyte do analizy danych, a łączna średnia i odchylenie standardowe lub błąd standardowy ze wszystkich powtórzeń zostaną użyte do graficznej reprezentacji (jak widać na przykładzie w Rysunek 7). Jeśli analizujemy dane tak, jak to zrobiliśmy tutaj, czyli wiele próbek jest śledzonych w wielu punktach czasowych, najbardziej odpowiednią jest ich analiza przy użyciu dwukierunkowej ANOVA z testem Tukeya post hoc. Dzięki temu możemy określić różnice między próbkami w każdym punkcie czasowym, a także określić różnice w każdej próbce w czasie.

Rysunek 1: Ameba pojawia się jako nieprzezroczyste, ciemne formy w mikroskopii jasnego pola. Powiększony reprezentatywny obraz ameby w 4-krotnym powiększeniu, lekko nieostry, aby wyglądać jak solidne cienie pod oczami. Podziałka = 500 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Ameba zobrazowana w mikroskopie jasnego pola przekształcona w binarną i śledzona. Ameba w 4-krotnym powiększeniu, w jasnym polu (po lewej), została przekonwertowana na binarną z usuniętymi artefaktami (w środku) i, po śledzeniu, z wyświetlonymi wybranymi ścieżkami (po prawej). Górny rząd: całość dobrze zobrazowana przez zszycie 4 obrazów, podziałka = 1000 μm. Dolny rząd: rozmiar pojedynczego obrazu przed zszyciem, podziałka = 500 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Natychmiastowa analiza danych wynikowych z oprogramowania do obrazowania i śledzenia zawiera szeroką gamę typów danych. Reprezentatywne dane wyjściowe ze śledzenia są pokazane w Rysunek 2, który jest pojedynczym filmem. Zwróć uwagę na numery ścieżek (czerwona strzałka) numery pominięć, wskazujące, że oprogramowanie śledzące poprawnie usunęło ścieżki, które nie były zgodne z parametrami. W tym przykładzie tylko 71 z 5385 zidentyfikowanych ścieżek było wyrównanych z parametrami. Ten stosunek jest normalny, biorąc pod uwagę tak surowe wytyczne. Ta liczba ścieżek jest również zgodna z liczbą ameb użytych w tym protokole (na przykład, jeśli na 96-dołkowej płytce zasiano 200 μl 7,5 x 10³ CFU/ml na studzienkę, należy spodziewać się około 1500 ameb w studzience i mniej więcej tyle samo widocznych w 4-ściegowym polu widzenia. Prawdopodobnie będzie o wiele więcej śladów niż jest ameby, ponieważ ameba chodzi po polu widzenia i poza nim, generując nowe ślady). Ten numer ścieżki jest ponownie widoczny w Rysunek 2, gdzie widocznych jest tylko kilka ścieżek w porównaniu z dużą liczbą miejsc. Zawsze sprawdzaj liczbę miejsc na ścieżce (czerwone pole), aby upewnić się, że uwzględnione są tylko prawidłowe długości ścieżek. Na przykład tutaj uwzględniamy ponad 93% klatek, a w tej sekcji było 127 klatek, więc wszystkie liczby plam powinny być powyżej 118. Na żółto zaznaczone są pomiary, które zostały wymienione w protokole. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Dane zreorganizowane zgodnie z potrzebami po początkowym wyprowadzeniu danych. Organizacja poszukiwanych danych po eksporcie. (A) Odpowiednie pomiary wybrane do kwantyfikacji zostały skopiowane z eksportu oprogramowania śledzącego (Rysunek 3) i wklejone do nowego arkusza kalkulacyjnego. (B) Po uporządkowaniu żądanych pomiarów w nowym arkuszu kalkulacyjnym należy obliczyć średnią z każdej ścieżki. Tak więc, w tym reprezentatywnym przykładzie, całkowita odległość, maksymalna odległość, uwięzienie, średnia prędkość i przemieszczenie każdej użytecznej ścieżki w tym pojedynczym filmie zostały uśrednione do pojedynczej liczby dla każdego pomiaru. Zauważ ponownie, że w sumie 71 ścieżek spełniało parametry dla klatek 1-127. Prawdopodobnie będzie inna liczba odpowiednich ścieżek z każdego analizowanego filmu lub zestawu klatek, co widać na Rysunek 5. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Sekwencyjne klatki ustawione do analizy całej serii obrazów lub filmów. Jest to reprezentatywny obraz dodawania sekwencyjnych filmów do analizy danych. Zakładając, że klatki od 1 do 127 stanowią godzinę 1 filmu (tutaj 1 godzina składa się z robienia zdjęcia raz na 28 s). Klatki 128-254 będą godziną 2 wideo, a klatki 255-381 godziną 3 wideo. Połącz wyeksportowane dane (tak jak zostały wyeksportowane w Rysunek 3) ze wszystkich godzin w jeden arkusz, aby pracować ze wszystkimi naraz. Tak jak to zostało zrobione w Rysunek 4, dane ze wszystkich użytecznych ścieżek dla każdego zestawu klatek/h zostaną uśrednione. Wszystko w Rysunek 5 to dane z jednej repliki lub jednej próbki. Jeśli istnieją 3 repliki, to będą 3 identycznie ułożone oddzielne zakładki arkusza kalkulacyjnego, a dane z nich zostaną wprowadzone do nowej karty, jak pokazano w Rysunek 6. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Złożone dane ze wszystkich ameb w każdym zestawie ramek używane do reprezentowania pojedynczej repliki. (A) Wszystkie średnie z każdej klatki ustawionej w Rysunek 5 muszą być zebrane w centralnym miejscu, aby można było zakończyć końcową analizę danych. Na tym reprezentatywnym obrazie pokazane są średnie całkowite odległości z pierwszych trzech zestawów klatek (lub godzin). Czynność tę należy powtórzyć dla każdej uruchamianej próbki/warunku/kontrpróby. Następnie należy uśrednić średnie z każdej próbki z każdego zestawu ramek (żółta ramka). Jest to końcowy punkt danych, na podstawie którego można obliczyć odchylenie standardowe i błąd standardowy. Indywidualne średnie z każdej próbki (tutaj liczby w B3, B4 i B5 dla próbki całkowitej odległości 1; C3, C4 i C5 dla próbki całkowitej odległości 2 itd.) zostaną wykorzystane do przeprowadzenia analizy statystycznej. Proces ten zostanie powtórzony dla wszystkich wymaganych pomiarów (maksymalna odległość, uwięzienie, średnia prędkość, przemieszczenie itp.) (B) Aby stworzyć graficzną reprezentację kwantyfikacji, użyj liczb w żółtym polu jako punktów danych, które zostaną wykorzystane na końcowym wykresie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Surowe dane dotyczące ruchliwości dla ATCC 30461 i ATCC 50370. Surowe dane (reprezentowane tutaj jako średnia ± SE dla każdej godziny) zostały wcześniej zebrane i nie zostały opublikowane dla wcześniejszych badań^18,19. Ta kwantyfikacja ruchliwości pokazuje, że te dwie ameby są podobne w swoich pierwszych 6 godzinach ruchliwości (mierzonej całkowitą odległością w mikronach przebytą w tej godzinie) w 1/4 roztworu Ringera na szklanej powierzchni. Każdy punkt czasowy reprezentuje trzy oddzielne powtórzenia, z których każda składa się z 20-200 śladów ameby. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Możliwość śledzenia i ilościowego określenia ruchliwości ameb, takich jak Acanthamoeba, które są przylegającymi mikroskopijnymi organizmami niewrażliwymi na ruchy Browna o niskiej prędkości ^9,10, ujawnia znaczną ilość informacji na temat zachowania ameb i może znacznie zwiększyć wiedzę na temat metod zapobiegania AK. Protokół ten został szczegółowo opisany w ostatnich publikacjach, a dane zostały potwierdzone lub połączone z innymi podobnymi analizami danych^18,19. Zauważamy tutaj, że szybkość ameba opisana za pomocą tej metody jest podobna do tego, co zostało opublikowane przez inne grupy. Protokół ten jest godny uwagi ze względu na jego zdolność do stosowania w zasadzie na każdej powierzchni lub leczeniu amebą, która jest przezroczysta dla światła, ale ważne jest, aby pamiętać, że chociaż protokół ten może być potencjalnie zmodyfikowany do pracy z innymi organizmami, został do tej pory zoptymalizowany tylko dla Acanthamoeba. Powyższy protokół konsekwentnie działał dobrze w laboratorium, ale przewidziano następujące zmiany dotyczące zmiany metody w celu dostosowania jej do innych potrzeb lub rozwiązywania trudnych sytuacji.

Określanie parametrów śledzenia: W powyższym protokole wymieniono łączenie klatka-klatka, zamykanie odstępów, maksymalny odstęp między ramkami oraz liczbę miejsc na ścieżce, które były najbardziej odpowiednie dla ostatnich publikacji. Niewykluczone jednak, że inne parametry będą lepiej dopasowane do innych potrzeb. Ponadto mogą istnieć parametry, które inni chcieliby użyć, ale nie zostały tutaj użyte (takie jak maksymalna odległość ścieżki w filtrach ścieżek). Więcej informacji na temat każdego parametru i tego, co opisują, można znaleźć tutaj na stronie internetowej (patrz odnośnik²¹). Decydując, które parametry i filtry są najbardziej odpowiednie dla innych eksperymentów i jak należy je ustawić, zastanów się, co jest statystycznie racjonalne dla konkretnego projektu; Na przykład, czy ktoś chciałby mieć dane z ameby, która odchodzi od pola widzenia, a następnie wraca do niego? A może ktoś chciałby zachować dane z ameby, która w ogóle się nie poruszała, ale mimo to została oznaczona jako ślad? i co ma sens w przypadku liczby klatek i długości czasu między klatkami, w których obrazy zostały zarejestrowane.

Zmiana rozmiaru plamy: Odkryliśmy, że przy użyciu jakiegokolwiek oprogramowania lub dowolnej konfiguracji mikroskopu - w oparciu o obecne technologie i oprogramowanie dostępne w standardowych laboratoriach - niezwykle trudno jest dokładnie śledzić liczbę ameb w zagregowanym ciele, ponieważ zmienia się ona w czasie. Jeśli śledzisz rozmiar plamy i próbujesz skorelować ten rozmiar z liczbą znajdujących się w nim organizmów, użyj standardowej krzywej wygenerowanej po wielokrotnych eksperymentach, aby matematycznie przewidzieć rozmiar agregatu. Na przykład agregaty zostały stworzone przez wysiew studni z różnymi liczbami ameby, takimi jak 8, 16, 32, 125, 250, 500, 1000 i 2000 komórek na studzienkę. Przez 24 godziny generowano zdjęcia poklatkowe w różnych punktach czasowych każdego odwiertu. Każda sferoida (która należała do znanej liczby ameb) została przeanalizowana pod kątem dwuwymiarowego obszaru, a standardowa krzywa została wygenerowana jako funkcja liczby ameb w stosunku do wielkości sferoidów w czasie. Eksperyment ten powtórzono co najmniej trzykrotnie, aby uzyskać odpowiednie odchylenie standardowe dowolnej wygenerowanej krzywej.

Określanie kierunkowości ameby: Chociaż może to nie być konieczne w przypadku niektórych badań, może być pomocne w zrozumieniu kierunkowości ameby. Dostarczyłoby to danych na temat chemotaktycznych efektów leczenia lub eksperymentu. Dane te mogą być również wykorzystywane do tworzenia danych zarówno wizualnych (graficznych), jak i ilościowych. Jest to dostępne za pośrednictwem narzędzia Chemotaxis and Migration Tool, które jest bezpłatną wtyczką do oprogramowania do obrazowania. Jest on dostępny na stronie internetowej wraz z instrukcją aplikacji oraz przykładowymi zdjęciami i filmami (patrz Spis materiałów).

Szczegółowa dynamika ruchu: inne grupy badały dynamikę rozprzestrzeniania się i trajektorie dyfuzyjne za pomocą wysoce zaawansowanych i rozwiniętych analiz statystycznych wykraczających poza to, co omówiono tutaj ^9,10,22. Można je rozważyć w oparciu o potrzeby użytkownika.

Podobnie jak w przypadku każdej skutecznej metody, protokół szczegółowo opisany w tym manuskrypcie przeszedł wiele rund rozwiązywania problemów w celu osiągnięcia spójności. Podczas gdy doskonałe, wysokiej jakości filmy z możliwością śledzenia można tworzyć, robiąc zdjęcie co sekundę (lub tak szybko, jak jest w stanie mikroskop, może to być mniej niż sekunda), tworzy to bardzo duże pliki, z którymi praca może być trudna. Jest to realistycznie odpowiednie tylko w przypadku bardzo krótkich filmów nagrywanych maksymalnie przez kilka minut. I odwrotnie, robiąc zdjęcie co kilka sekund, odkryliśmy, że zachowanie ameby jest nadal bardzo łatwe do śledzenia w oparciu o szybkość tego gatunku i możliwe jest tworzenie funkcjonalnych filmów przez godziny lub dni. Odkryliśmy, że maksymalny czas między obrazami wynosi 30 s, czyli czas potrzebny do dokładnego śledzenia ameby przez oprogramowanie do obrazowania. Przedział czasu wybrany przez użytkownika powinien być rozważany przy użyciu znanych ograniczeń dotyczących tego, jak szybko mikroskop może rejestrować obrazy, ile obrazów na studzienkę jest potrzebnych i ile studzienek jest rejestrowanych w każdym interwale. Podobnie, parametry wymienione w tym protokole dotyczące maksymalnego przemieszczenia, dozwolonych przerw między klatkami, minimalnych wymaganych klatek i tak dalej, zostały określone metodą prób i błędów przez to laboratorium w celu stworzenia informacji o ścieżce, które obejmują najbardziej kompletne ścieżki ameby i ignorują szum tworzony przez niekompletne ścieżki, amebę, która dołącza lub opuszcza scenę w trakcie wideo, lub błędy spowodowane zamieszaniem w oprogramowaniu do obrazowania, na przykład gdy dwie ameby spotykają się w połowie ścieżki, a następnie rozdzielają się. Tego rodzaju błędy i niekompletne ścieżki są, co zrozumiałe, wysokie przy tworzeniu bardzo długich (od godzin do dni) filmów mikroskopijnych organizmów biologicznych, które nieustannie wchodzą ze sobą w interakcje i są powodem, dla którego bardzo duża część błędnych ścieżek musi zostać odrzucona. Należy zauważyć, że etap wypełniania otworów w protokole jest, z doświadczenia tego laboratorium, ważny dla zmniejszenia błędów w sposobie, w jaki oprogramowanie do obrazowania śledzi amebę. Upewniając się, że każda ameba jest solidnym okręgiem, a nie czasami pączkiem lub kształtem litery C, oprogramowanie ma znacznie większe szanse na pomyślne śledzenie każdej ameby.

Ponadto, jak wspomniano, użytkownik ma do dyspozycji wiele parametrów do analizy obrazu lub filmu. Opierając się na potrzebach eksperymentalnych, konsekwentnie odnosiliśmy największe korzyści z analizy dystansu całkowitego, dystansu maksymalnego, prędkości i przemieszczenia. Zostały one dogłębnie omówione (w tym z wykorzystaniem różnych szczepów i powierzchni) wraz z interpretacjami graficznymi we wcześniejszych publikacjach^18,19. Te cztery parametry pozwalają użytkownikowi na ekstrapolację zdolności ameby do pokonywania odległości liniowych i czasu potrzebnego na to, co pomaga w zrozumieniu ich zachowania w odniesieniu do zanieczyszczenia soczewek kontaktowych. Pobieranie i analizowanie tych parametrów to duże zadanie, jak szczegółowo opisano na naszych rysunkach. Podczas pracy z dużymi i licznymi arkuszami kalkulacyjnymi z danych wyjściowych oprogramowania do obrazowania ograniczyliśmy niezamierzone błędy, tworząc zablokowane szablony arkuszy kalkulacyjnych, które automatycznie obliczały wszystkie wymagane analizy. Jednak możliwym ulepszeniem tej metody byłoby napisanie skryptu, który może obsłużyć te dane oraz sortować je i analizować.

Podsumowując, opisano tutaj dostępną i dokładną metodę pomiaru wielkości i ruchliwości Acanthamoeba w wielu różnych warunkach. Wykazaliśmy, że metoda ta może być stosowana do wielu różnych szczepów ameb i podkreśliliśmy, że chociaż mogą istnieć proste parametry do uzyskiwania informacji o ruchliwości, ten eksperymentalny zestaw może być wysoce dostosowany do dowolnych konkretnych potrzeb.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
¼ Dzwonek' s roztwór	ThermoFisher Scientific	BR0052G	Oxoid Ringers Solution Tabletki. Postępuj zgodnie ze wskazówkami, aby uzyskać jedną czwartą siły zamiast dzwonków o pełnej sile.
10 &mikro; Pipeta L	Eppendorf Research	3123000039	2 & mikro; L-20 i mikro; L pojedynczy kanał
10 i mikro; L końcówki do pipet	Neptune Scientific, San Diego, CA, USA	BT10.N	10 µ L Uniwersalna końcówka barierowa
48-dołkowa płytka	Millipore Sigma,	CLS3548	Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plate: płytka polistyrenowa, studzienki z płaskim dnem, sterylna, z
pokrywką Probówki stożkowe 50 ml (1 na każdą próbkę, 1 na każde przejście 2 próbki)	Fisher Scientific	Falcon 352098	Falcon 50 mL stożkowe probówki wirówkowe o wysokiej przejrzystości, polipropylenowa
płytka 96-dołkowa	Millipore Sigma, Burlington, MA, USA	CLS3596	Płyta wielodołkowa Corning Costar TC-Treated: płyta polistyrenowa, studzienki z płaskim dnem, sterylna, z pokrywką
Acanthamoeba	American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	ATCC 30461	Ten protokół został zweryfikowany pod kątem ATCC 50655, 30872, 50702, 30010, 30461, 50370, 50703, 30137, PRA-115 i PRA-411
Pożywki do hodowli aksenicznej (AC6)	Wyprodukowano w domu	n/a	Zawiera 20 g peptonu biosatu, 5 g glukozy, 0,3 g KH2PO4, 10 i mikro; g witaminy B12 i 1 szklanka5 mg  L-metionina na litr destylowanej wody dejonizowanej. Dostosować pH do 6,6-6,95 za pomocą 1 M NaOH i autoklawować w temperaturze 121 & stopni; C przez 20 min, przechowywać w temperaturze pokojowej do 3 miesięcy.
Wirówka i odpowiedni wirnik	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	Sorvall ST 40R	Dopuszczalne są dowolne równoważne wirówki i wirniki, o ile mogą obracać stożkowe probówki o pojemności 50 ml przy 500 x g przez 5 minut
Chemotaksja i narzędzie do migracji Darmowe			oprogramowanie oparte na ImageJ, dostępne pod adresem https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html
Jednorazowy hemocytometr	Bulldog Bio, Portsmouth, NH, USA	DHC-N01	Neubauer Ulepszony 2-chipowy jednorazowy hemocytometr, indywidualnie pakowany, niepirogenne
oprogramowanie ImageJ z wtyczką Trackmate (ten protokół napisany za pomocą Trackmate w wersji 6.0.2.)			Darmowe oprogramowanie opracowane przez National Institutes of Health, dostępne pod adresem imagej.net. Wtyczka Trackmate dostępna pod adresem https://imagej.net/plugins/trackmate/
Microscope, najlepiej z automatycznym ruchomym stolikiem	Nikon, Tokio, Japonia		W tym badaniu użyto mikroskopu Nikon Eclipse Ti-U, a zautomatyzowany ruchomy stolik został wykorzystany, aby móc rejestrować obrazy w wielu studzienkach jednocześnie.
Oprogramowanie NIS-Elements	firmy Nikon
	Fisher Scientific, Hampton, NH, Stany Zjednoczone	BrandTech 26331	BrandTech accu-jet pro Kontroler pipet
Serologiczne końcówki do pipet	VWR	5 ml: 76201-710 10 mL: 170356 25 mL: 89130-900 50 mL: 75816-088	Pipeta serologiczna VWR, niepirogenna
Sterylna aluminiowa komórka przepływowa	Biosurface Technologies Corporation, Bozeman, MT, USA	FC 81-AL	Jednokanałowa kolektoria przepływowa z anodyzowanego aluminium z 96-dołkową płytką do użytku z mikroskopem odwróconym
Kolby T75	VWR, Radnor, PA, USA	734-2316	Kolba do hodowli tkankowych VWR, 182,5 cm, Obrabiana powierzchnia, Zatyczka uszczelniająca, Sterylne