Artykuł metodologiczny

Oznaczanie ilościowe Acanthamoeba spp. Ruchliwość

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66268

⸱

20 września 2024

 ,  , 
1Alcon Research, LLC

W tym artykule

Podsumowanie

Ta procedura opisuje, jak wizualizować, śledzić i określać ilościowo Acanthamoeba spp. Ruchliwość.

Streszczenie

Zapalenie rogówki Acanthamoeba to poważna infekcja oka, która stanowi wyzwanie w leczeniu i może prowadzić do ślepoty. Pomimo swojej wszechobecności i potencjalnego zanieczyszczenia soczewek kontaktowych po ekspozycji na wodę, naturalne zachowanie tego patogenu pozostaje nieuchwytne. Zrozumienie wzorców ruchowych Acanthamoeba może dostarczyć nam informacji o tym, w jaki sposób kolonizuje soczewki kontaktowe i zanieczyszcza rogówkę pacjenta. Na szczęście Acanthamoeba spp. są widoczne w mikroskopii jasnego pola przy 4-krotnym powiększeniu. Poprzednie techniki zostały opracowane w celu ilościowego określenia ruchliwości Acanthamoeba w odniesieniu do efektów cytopatycznych lub niedostatecznej ekspozycji na pole elektryczne. W tym miejscu opisujemy metodę śledzenia i ilościowego oznaczania Acanthamoeba spp. Ruchliwość długoterminowa (od godzin do dni), która jest protokołem mającym zastosowanie do wielu szczepów ameby, powierzchni i stanu odżywienia ameby. Procedura ta służy do określenia wielu kwantyfikacji ruchliwości rdzenia, takich jak odległość, prędkość, uwięzienie i kierunkowość, które są niezbędne do monitorowania różnych etapów infekcji, proliferacji lub zmiany zachowania.

Wprowadzenie

Badania nad Acanthamoeba znacznie wzrosły w ostatnich latach ze względu na zwiększoną częstość występowania zapalenia rogówki Acanthamoeba (AK), które jest infekcją pasożytniczą po przyczepieniu Acanthamoeba do rogówki1. Podczas gdy ogniska AK można przypisać niewłaściwej pielęgnacji soczewek kontaktowych lub nieskutecznym rozwiązaniom do pielęgnacji soczewek kontaktowych2,3,4,5, obecnie nie ma wymagań dotyczących wykazania skuteczności dezynfekcji Acanthamoeba dla jakiegokolwiek produktu na rynku. Jednak w środowisku naukowym i organizacjach normalizacyjnych trwają wysiłki mające na celu zbadanie protokołów niezbędnych do ilościowego określenia skuteczności dezynfekcji produktów do pielęgnacji soczewek kontaktowych6,7. Ponadto, ze względu na podobieństwo w aspektach komórkowych i funkcjonalnych do ludzkich makrofagów, zauważono, że Acanthamoeba odgrywa znaczącą rolę w żywieniu i rozprzestrzenianiu innych ludzkich patogenów8, oprócz chorobotwórczości, jaką niesie ze sobą sama ameba.

Ostatnio opisano techniki, które były w stanie określić ilościowo ruchliwość Acanthamoeba - która generalnie nie podlega w dużym stopniu ruchom Browna9,10 - w odniesieniu do efektów cytopatycznych lub niedostatecznej ekspozycji na pole elektryczne9,11, a także postępy w analizie ruchliwości w badaniach nad gigantycznymi wirusami z użyciem Acanthamoeba jako możliwy do śledzenia wektor wirusowy12,13. W ciągu ostatnich 20 lat nastąpiła również stała i znacząca poprawa w śledzeniu komórek i cząstek przy użyciu nowych programów, takich jak oprogramowanie do obrazowania użyte tutaj, oraz nowych algorytmów i technologii głębokiego uczenia14. Jest to jednak stosunkowo nowa i rozwijająca się dziedzina nauki dotycząca badań laboratoryjnych, zastosowań klinicznych i standardów przemysłowych, a także brakuje opublikowanych danych dotyczących metod wizualizacji i śledzenia tej ameby, szczególnie w celu ilościowego określenia zmian w zachowaniu po przestrzeganiu soczewek kontaktowych lub w trakcie lub po dezynfekcji soczewek kontaktowych. Inne dziedziny, które rozszerzyły się o długoterminowy monitoring wizualny, wspierały te wysiłki15,16,17. Ze względu na z natury trudną naturę Acanthamoeba - w tym ogólną odporność na plazmidy (które mogą nadawać fluorescencję), zdolność ameba do konsumowania i niszczenia standardowych barwników komórkowych oraz unikalny zewnętrzny skład białka - co utrudnia znakowanie przeciwciał - metody dostępne dla innych komórek, które uwidaczniają je w warunkach innych niż obrazowanie w jasnym polu, były bezużyteczne w tym organizmie. Tak więc ilościowe określenie ruchliwości tej ameby wykazało znaczący dodatek do tej dziedziny. Korzystając z opisanej tutaj metody, udało nam się ustalić, że ameba pozostaje ruchliwa przez co najmniej 12 godzin bez składników odżywczych18 i że ameba, która została poddana procesowi dezynfekcji i przestaje się poruszać podczas dezynfekcji, może odzyskać swoją ruchliwość po dezynfekcji, jeśli nie zostanie w pełni zlizowana19.

Ten protokół szczegółowo opisuje, jak wizualnie śledzić i określać ilościowo ruchliwość ameb pod mikroskopem. Podstawowe kroki to zarejestrowanie ameby w jasnym polu przy użyciu odpowiedniej ostrości i czasu między obrazami, przekształcenie obrazów w binarne za pomocą oprogramowania do obrazowania, a następnie użycie wtyczki śledzącej oprogramowania do obrazowania, aby ustawić parametry eksperymentalne i śledzić każdą amebę w celu określenia wymaganych pomiarów, takich jak prędkość, odległość i uwięzienie. Następnie możliwe jest ilościowe określenie chemotaksji ameby lub populacji ameb w celu określenia kierunkowości. Kluczowym wkładem tej metody jest wizualizacja i ilościowe określenie zachowania ameb podczas różnych stanów wsparcia żywieniowego, przylegania do powierzchni, wyzwania dezynfekcji lub innych zmian środowiskowych, takich jak współżycie z hodowlą komórek ssaków.

Protokół

1. Przygotowanie Acanthamoeba

UWAGA: Niniejszy protokół został zweryfikowany dla szczepów ATCC 5065, 30872, 50702, 3010, 30461, 50370, 50703, 30137, PRA-15 oraz PRA-41. Jest to patogen poziomu BSL2 i prace z nim powinny być prowadzone w komorze z laminarnym przepływem powietrza oraz laboratorium poziomu BSL2.

  1. Utworzenie kultury macierzystej z fiolki z próbką lub przygotowanego czopa20 należy napełnić kolbę T75 30 ml pożywki AC6, a następnie aseptycznie dodać do niej jedną zatyczkę lub zawartość fiolki z próbką. Kolbę należy inkubować przez 3–5 dni w temperaturze 26-30 °C aż do uzyskania konfluencji na poziomie od 50% do 80% w kolbie.
  2. Przeprowadź pasaż komórek w dniu poprzedzającym ich wykorzystanie, aby uzyskać jednorodną populację trofozoitów.
    1. W zależności od potrzeb szczepu należy potrząsnąć i/lub energicznie uderzyć dwa razy w kulturę macierzystą, aby odłączyć przylgniełe trofozoity.
    2. Napełnić kolbę T75 30 ml pożywki AC6. Do pasażu dodać 2 ml kultury matki. Inkubować kolbę przez 18–24 h w temperaturze 26-30 °C.
  3. Przed zebraniem materiału należy poddać populację trofozoitów inspekcji wizualnej pod mikroskopem przy powiększeniu 4x. Należy upewnić się, że trofozoity są przylegające i jednorodne.
  4. Energicznie uderzyć dwa razy w kolbę, aby oderwać przytwierdzone trofozoity. Przelew zawartość do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  5. Wiruj probówkę przy 50 x g g przez 5 min w zbalansowanej wirówce, aby otrzymać osad z ameb. Odlać lub odpipetować i usunąć nadsącz z pożywki. Rozcieńczyć osad w 2–10 ml ¼ Roztwór Ringera.
  6. Wymieszaj próbkę za pomocą wstrząsarki wirpowej. Dodaj 10 µL próbki do jednorazowej komory licznikowej i policzyć CFU/ml w Acanthamoeba.
  7. Na podstawie obliczeń wykonanych przy użyciu komory odliczającej erytrocyty (hemocytometru), rozcieńcz osad z ameb do stężenia 7,5 x 103 komórek/ml w ¼ Roztwór Ringera.
  8. Zasiać ameby na powierzchni, która może być szklana, plastikowa lub składać się z agaru beznutrientowego, a także w różnych kształtach studzienek, zależnie od potrzeb eksperymentalnych opisanych poniżej.
    1. płytka 96-dołkowa: do każdego dołka wysiać 200 µL z Acanthamoeba zawiesinę i zamknąć płytkę pokrywką.
    2. płyta 48-dołkowa: do każdego dołka nanieść 1 ml Acanthamoeba zawiesinę i przykryć płytkę pokrywką.
    3. Komora przepływowa: Powoli dodać 4 ml Acanthamoeba zawiesinę przez sterylne porty sterylnej aluminiowej celi przepływowej, unikając powstawania pęcherzyków powietrza w komorze. Po dodaniu zawiesiny należy zamknąć porty za pomocą zacisków.
  9. Przed obrazowaniem należy odczekać co najmniej 30 minut, aby ameby przywarły do powierzchni, przed rozpoczęciem rejestracji mikroskopowej.

2. Wizualizacja i rejestracja Acanthamoeba

  1. Obserwuj amebę przy 4-krotnym powiększeniu w jasnym polu. Tło powinno mieć jasnoszary kolor, a ameba powinna być czarna. Dostosuj oświetlenie i ostrość tak, aby ameby były widoczne jako pełne ciemne koła, a nie jako obiekty półprzezroczyste (czyli by były lekko poza ogniskiem, Rycina 1).
    UWAGA: Optymalnym powiększeniem do śledzenia jest 4x z kilku powodów: ameby, które opuszczą pole widzenia lub wejdą do niego podczas śledzenia, nie powinny być uwzględniane w analizie danych, zatem mniejsze powiększenie najlepiej pozwala na uwzględnienie maksymalnej liczby ameb w analizie w danym okresie czasu. Ameby powinny pojawiać się jako pełne czarne koła w jasnym polu, aby można było przekształcić je w obraz binarny na potrzeby analizy śledzenia. Najłatwiej osiągnąć to przy mniejszym powiększeniu, ponieważ większe powiększenia łatwiej ujawniają półprzezroczystą naturę i struktury wewnętrzne ameb. Zasadniczo przy mniejszym powiększeniu w jednym polu widzenia można uchwycić więcej ameb, co sprzyja bardziej wiarygodnej analizie danych.
  2. Skonfiguruj programy rejestrujące w oprogramowaniu do obrazowania tak, aby rejestrowały obraz w regularnych odstępach czasu w celu śledzenia ameb. Najdłuższy odstęp czasu między obrazami pozwalający na dokładne śledzenie wynosi 30 s; optymalny czas pod kątem rozmiaru plików i szczegółowości śledzenia to 12 s lub 24 s.
  3. Ameby mogą być śledzone przez wiele dni z rzędu, jednak należy pamiętać o rozmiarze plików, jakie generuje tego typu rejestracja, oraz o trudnościach związanych z manipulowaniem ekstremalnie dużymi plikami. Aby tego uniknąć, rejestruj ameby w określonych przedziałach czasowych w wybranych odstępach. Na przykład: rejestruj przez 1 h co 12 h przez 5 dni.
  4. Jeśli mikroskop i program na to pozwalają, rejestruj wiele studzienek podczas jednej sesji, korzystając z współrzędnych XY studzienek płytki lub wielu lokalizacji w komorze przepływowej. W razie potrzeby połącz kilka sekcji jednej studzienki lub komory przepływowej, aby stworzyć większe pole widzenia przy 4-krotnym powiększeniu.
    UWAGA: Jedynym ograniczeniem w kwestii liczby rejestrowanych lokalizacji jest prędkość, z jaką stolik mikroskopu może przemieszczać się między lokalizacjami w czasie określonego interwału obrazowania (np. przy robieniu zdjęcia co 12 s, 24 s itd.). Nie jest to jednak wymagane; filmy ze śledzenia wykonane z jednej lokalizacji mogą nadal dostarczyć wystarczającej liczby trajektorii dla wiarygodnej analizy statystycznej. W badaniu tym użyto mikroskopu Nikon Eclipse Ti-U i wykorzystano zautomatyzowany ruchomy stolik do rejestrowania obrazów w wielu studzienkach jednocześnie. Jednakże sprawdzi się każdy mikroskop z programowalną funkcją rejestracji. Mikroskop musi być podłączony do komputera i umożliwiać zapisywanie obrazów w programie lub na dysku twardym.

3. Analiza wielkości ameby

  1. Otwórz plik z mikroskopu w oprogramowaniu do obrazowania. Pojawią się opcje importu Bio-formats. W oknie dialogowym upewnij się, że ustawienia są następujące: Stack viewing; View with: Selection-Hyperstack; Memory Management: zaznacz Use virtual stack; Color mode: Default.
  2. Upewnij się, że żadne inne menu rozwijane ani pola wyboru nie są aktywne. Kliknij Ok.
  3. Otwórz opcje serii bio-formats. Wybierz wymaganą serię. Jeśli w jednym czasie rejestrowano tylko jedną lokalizację, prawdopodobnie dostępna będzie tylko jedna opcja. Kliknij Ok.
  4. Wybierz Image > Duplicate , aby zduplikować pojedynczą studzienkę, nad którą aktualnie się pracuje, wybierając tylko jeden kanał C i tylko jeden kanał Z.
  5. Od tego momentu, w celu manipulacji i analizy, pracuj wyłącznie na zduplikowanym obrazie, a nie na oryginale. Wybierz Image > Type > 8-bit. Wybierz Process > Subtract Background.
  6. Ustaw parametr rolling ball na 10.0. Zaznacz Light Background. Zaznacz Sliding Paraboloid.
  7. Wybierz Process > Enhance Contrast. Ustaw wartość saturated pixels na 0,1% dla trofozoitów lub 0,3% dla grupy komórek i agregatów.
  8. Wybierz Image > Adjust > Threshold (Default > B&W). Otworzy się okno Make Binary. Wybierz Default i zaznacz Black background (of Binary Masks).
  9. Ustaw próg (threshold) agresywnie, tak aby większość plam w tle nie była widoczna, ale widoczna była część każdej ameby.
  10. Jeśli oprogramowanie odwróciło obraz i tło jest białe, a ameba czarna, przejdź do Edit > Invert, aby przywrócić czarne tło i białe ameby.
  11. Wybierz Process> Binary > Close, na wypadek gdyby komórki miały niewielkie przerwy w błonie zewnętrznej z powodu braku ostrości lub ruchliwości komórki.
  12. Wybierz Process > Binary > Fill Holes. Usuń artefakty niebędące amebami, korzystając z narzędzi do rysowania kształtów oraz opcji Edit > Fill. Jeśli na tym etapie tło jest białe, a amebą czarna, wybierz Edit > Invert. Obraz powinien teraz odpowiadać obrazom binarnym na Rysunku 2.
  13. Aby zapisać wielkość każdej ameby, wybierz Analyze > Analyze Particles. Ustaw Size: 10-Infinity, Circularity: 0-1, Show: Nothing. Zaznacz Only Display Results and Summarize.
  14. Zapisz wygenerowane pliki CSV. Wybierz File > Save As > Tiff i zmień nazwę zgodnie z wymaganą specyfikacją.

4. Przygotowanie plików z mikroskopu do śledzenia (analiza motywności)

  1. Otwórz plik z mikroskopu w oprogramowaniu do obrazowania. Pojawi się okno Opcji importowania Bio-Formats.
  2. W oknie dialogowym upewnij się, że zaznaczone są następujące opcje: Stack viewing; View with: Selection-Hyperstack. W sekcji zarządzania pamięcią (memory management) zaznacz Użycie wirtualnego stosu (Virtual Stack)Kliknij Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia..
  3. Otworzą się opcje serii Bio-Formats. Wybierz wymaganą serię. Jeśli w danym czasie rejestrowana jest tylko jedna lokalizacja, prawdopodobnie pojawi się tutaj tylko jedna opcja. Kliknij Proszę o przesłanie tekstu źródłowego do tłumaczenia..
  4. Wybierz Obraz > DuplikatOd tego momentu należy pracować wyłącznie na zduplikowanym fragmencie filmu, zamiast na pliku oryginalnym.
    UWAGA: Powielić fragment filmu, który jest w danej chwili śledzony. Aby to zrobić, należy znać klatki odpowiadające minutom wymaganym do przeprowadzenia eksperymentu. Na przykład, jeśli chce się śledzić 1Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. godzinę i wykonuje zdjęcia co 24 s, w 1 godzinie powinno znaleźć się 150 klatekst godzinę. Zatem 1Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. godzina będzie obejmować klatki 1-150, drugand godzina wyniesie 151–30 i tak dalej.
  5. Wybierz Obraz > Typ > 8-bitowyWybierz Proces > Odjęcie tłaUstaw parametr rolling ball na 10,0.
  6. Sprawdź Jasne tłoSprawdź Przesuwna paraboloidaWybierz Proces > Poprawa kontrastu i ustawić go na poziomie 0,1%.
  7. Sprawdź Wszystkie x# przekroje (na przykład wszystkie 150 przekrojów). Odznacz NormalizacjaWybierz Obraz > Dostosuj > Próg (domyślny) > B&W).
  8. Proces Make Binary zostanie uruchomiony. Wybierz DomyślnySprawdzić Czarne tło (masek binarnych).
  9. Zastosuj agresywny próg tak, aby większość plam tła nie była widoczna, ale niektóre fragmenty ameby pozostały widoczne. Na tym etapie, jeśli tło jest białe, a ameba czarna, wybierz Edytuj > OdwrócićTło powinno być czarne, a ameba biała.
  10. Wybierz Proces > Binarny > ZamknijWybierz Proces > Binarny > Wypełnianie otworówWybierz Plik > Zapisz jako > Tiff orędy nazwę zgodnie z żądaną specyfikacją. Plik jest teraz gotowy do śledzenia.

5. Analiza motylości poprzez śledzenie

  1. W oprogramowaniu do obrazowania, w pliku tiff wymaganym do śledzenia, przejdź do Wtyczki > Śledzenie > TrackMateOtworzy się wersja programu Trackmate.
  2. Wybierz DalejWybierz detektor LoG z rozwijanego menu detektora. Ustaw szacowaną średnicę plamki (blob diameter): 35,0 mikrometrów, próg 1,0. Odznacz Zastosuj filtr medianowy i Do lokalizacji podpikselowej.
  3. Kliknij Podgląd na pierwszych, środkowych i końcowych przekrojach. Należy upewnić się, że wszystkie ameby zostały objęte fioletowym okręgiem i że w zaznaczeniu nie znajdują się defekty tła ani artefakty.
  4. Wybierz NastępnyRozpocznie się przetwarzanie; ten etap może potrwać kilka minut. Pasek detekcji u góry ekranu będzie wskazywać postęp procesu.
  5. Wybierz Następny po wyświetleniu odpowiedniego komunikatu. Podczas wstępnego progowania należy wybrać Dalej ponownie bez wybierania czegokolwiek. Wybierz Wyświetlacz hiperstosu podczas wyboru widoku. Wybierz Dalej.
  6. Ustaw filtr dla plamek i wybierz Następnie bez zaznaczania żadnego elementu. Wybierz tracker; aby to zrobić, zaznacz Kalkulator LAP (zamiast prostego trackera LAP). Wybierz Następny.
  7. W przypadku łączenia klatek (frame-to-frame linking) ustaw maksymalną odległość na 40 µmKontrola zamykania przerwy między segmentami toru Zezwalaj na zamykanie przerwUstaw maksymalną odległość dla tego parametru na 100 µm oraz maksymalną przerwę między klatkami na 4. Nie zaznaczaj żadnej opcji w sekcjach Track segment splitting (podział segmentów ścieżki) ani Track segment merging (łączenie segmentów ścieżki).
  8. Wybierz DalejŚledzenie może wymagać znacznej ilości czasu do wykonania. Po jego zakończeniu w dolnej części okna powinna pojawić się informacja: Tracking done in x s. Wybierz Następny.
  9. Wybierz Dalej ponownie po zakończeniu śledzenia. Ustaw filtry na ścieżkach: wybierz + kliknij w lewym dolnym rogu, aby dodać filtr dla liczby punktów w ścieżkach. Ustaw filtr na Above dla co najmniej 93% klatek (np. 150 klatek wymagałoby minimum 140 punktów).
    UWAGA: Niektóre wersje tego oprogramowania będą wymagały wybrania przeciwstawnej wartości ekwiwalentnej, np. Poniżej co najmniej 7%, co można osiągnąć poprzez przeciągnięcie linii w lewo lub w prawo do uzyskania pożądanej liczby.
  10. Wybierz DalejPojawi się okno Opcje wyświetlania (Display Options). Przed zapisaniem pliku Trackmate XML lub pliku śledzenia CSV należy upewnić się, że ścieżki w każdej klatce nie są zdeformowane ani nienaturalne w odniesieniu do sposobu poruszania się ameby.
  11. Jeśli ścieżka wymaga usunięcia, kliknij w Schemat ŚcieżekTrackScheme wyświetli wszystkie ścieżki i punkty kontaktu ameby we wszystkich klatkach.
    UWAGA: Możliwymi powodami usunięcia ścieżki są: przejście ameby przez pole widzenia lub wyjście z niego podczas nagrywania, nieprawidłowy kształt ścieżki w stosunku do rzeczywistej trasy ameby lub fakt, że ścieżka bądź ameba stanowi wartość odstającą w danych zgodnie z parametrami eksperymentalnymi itp.
  12. Kliknij amebę, aby zaznaczyć punkt na zielono na ekranie; w Trackscheme punkt ten zostanie obramowany zielonym kwadratem. Wskaże to, który ślad lub punkt należy usunąć.
  13. Kliknij prawym przyciskiem myszy na ścieżce, którą należy usunąć, i wybierz Cały przebiegNaciśnij przycisk Usuń przycisk
  14. Po przeanalizowaniu wszystkich śladów należy zapisać plik śledzenia, klikając Zapisz w lewym dolnym rogu okna programu do śledzenia. Zapisz plik XML, używając nazwy filmu. Kliknij Podsumowanie aby powrócić do okna wyskakującego oprogramowania do śledzenia.
  15. Kliknij Ścieżki i wybierz Ścieżki po lewej stronie. Kliknij Eksportuj do pliku CSV i zapisz plik CSV.
  16. Jeśli arkusz kalkulacyjny nie rozpoznaje otrzymanego pliku CSV, należy wykonać następujące kroki.
    1. Otwórz zapisany plik CSV w Notatniku. Kliknij Zaznacz wszystko i Ctrl + C aby skopiować całą zawartość.
    2. Otwórz arkusz kalkulacyjny i kliknij Ctrl + V aby wkleić je do arkusza kalkulacyjnego. Wszystkie dane znajdą się w jednej komórce.
    3. Mając wciąż zaznaczone komórki z danymi, przejdź do Dane > Tekst do kolumnWybierz Oddzielony > DalejWybierz Przecinek > Dalej > ZakończZapisz ten plik jako nowy plik CSV.
  17. Plik CSV z danymi śledzenia będzie zawierał wiele parametrów dostępnych do analizy (Rysunek 3). Skopiuj i wklej żądane parametry do nowego pliku CSV (Rysunek 4) do analizy. Parametry zastosowane w tej procedurze opisano poniżej.
    1. Całkowity dystans przebyty: całkowity dystans przebyty przez amebę w µm.
    2. Maksymalny przebyty dystans: maksymalna odległość na ścieżce ameby od punktu startowego – nie musi być ona koniecznie punktem końcowym
      figure-protocol-1
      Gdzie dij to odległość od dowolnego punktu i do dowolnego punktu j na torze.
    3. Współczynnik ograniczenia: Współczynnik ograniczenia wskazuje, jak efektywnie ameba oddaliła się od punktu początkowego: czy poruszała się w linii prostej od punktu startowego (wartość bliska 1), czy pozostała stosunkowo blisko punktu początkowego (wartość bliska 0).
      figure-protocol-2
    4. Średnia prędkość na ścieżce: Średnia prędkość ameby na całkowitym przebytym dystansie w mikrometrach na sekundę.
      figure-protocol-3
    5. Przemieszczenie po ścieżce: odległość między punktem początkowym a końcowym ameby wyrażona w mikronach.
      UWAGA: Wszystkie parametry analizy oprogramowania do obrazowania oraz ich definicje można znaleźć tutaj: https://imagej.net/plugins/trackmate/analyzers/. Należy pamiętać, że każdy zapisany plik jest podsumowaniem ścieżek przeanalizowanych w danym czasie. Aby uzyskać wiarygodną analizę danych, należy odpowiednio połączyć wyniki z wielu powtórzeń, godzin itp., w zależności od charakteru danych (Rycina 5 i Rycina 6).

Wyniki

Aby osiągnąć sukces przy zastosowaniu tej metody, należy wziąć pod uwagę kilka kluczowych aspektów. Pierwszym z nich jest fizyczne przygotowanie ameby oraz mikroskopu, drugim właściwe wykorzystanie oprogramowania do obrazowania, a trzecim eksport i analiza uzyskanych danych obrazowych w sposób znaczący.

Przed rozpoczęciem rejestracji mikroskopowej kluczowe jest upewnienie się, że ameby są odpowiednio ustawione w płaszczyźnie ostrości na stoliku mikroskopu (Ryc. 1). Zamiast ustawiać ostrość na amebie w najbardziej optymalnej płaszczyźnie Z dla poszczególnych detali, w tym przypadku idealne jest ustawienie ich w lekkim rozmyciu, tak aby stały się one jednolitymi czarnymi kropkami, w przeciwieństwie do ich półprzezroczystego stanu podczas szczegółowej obserwacji. Taki sposób obrazowania pozwoli oprogramowaniu do analizy obrazu oraz oprogramowaniu do śledzenia znacznie łatwiej zidentyfikować każdą poszczególną amebę podczas konwersji pliku do formatu binarnego (Ryc. 2). Zrozumienie celu w oprogramowaniu do obrazowania – czyli tego, aby każda ameba pojawiła się jako wyraźne białe koło – może pomóc użytkownikowi w uzyskaniu właściwej ostrości podczas wykonywania oryginalnych zdjęć w jasnym polu. Następnie, przy wyraźnie zdefiniowanych kołach, oprogramowanie do śledzenia będzie w stanie prawidłowo monitorować motywność i zebrać indywidualne parametry motywności dla każdej ameby.

Po wykonaniu instrukcji krok po kroku zawartych w protokole dla oprogramowania do obrazowania oraz oprogramowania do śledzenia i po zapoznaniu się z powiązanym filmem w celu pomocy w kluczowych pierwszych etapach korzystania z oprogramowania do obrazowania, nadszedł czas na eksport danych z oprogramowania do obrazowania w celu kwantyfikacji i analizy danych. Surowy wynik z oprogramowania do śledzenia będzie podobny do tego, co widać na Rysunku 3. W tym miejscu ważne jest sprawdzenie, czy liczba punktów w wyeksportowanych ścieżkach jest zgodna z oczekiwaniami (np. jeśli wymagano, aby w każdej ścieżce obecnych było 93% klatek, a wideo miało łącznie 10 klatek, każda wyeksportowana ścieżka powinna zawierać co najmniej 93 punkty). Jeśli punkty nie spełniają wymagań, może być konieczny powrót do etapów w oprogramowaniu do śledzenia, aby upewnić się, że wymagane parametry zostały ustawione prawidłowo.

Na podstawie surowego eksportu należy rozpocząć tworzenie arkusza analizy danych (Rycina 4). Należy pamiętać, że każda ścieżka reprezentuje pojedynczą amebę w obrębie pojedynczego powtórzenia. Dlatego, jak pokazano na Rycynie 4, Rycynie 5 i Rycynie 6, wszystkie ścieżki dla danego zestawu klatek lub punktu czasowego muszą zostać uśrednione (Rycina 4); proces ten należy powtórzyć dla każdego zestawu klatek lub punktu czasowego w całej serii (np. jeśli nagrano łącznie 3 h filmu, a punkty danych zostały podzielone według godzin, to w każdym powtórzeniu do analizy będą trzy zestawy klatek/godziny, Rycina 5). Na koniec, z tak uzyskanych średnich dla każdego zestawu klatek w każdym powtórzeniu, należy połączyć dane ze wszystkich powtórzeń w jednej przestrzeni, aby umożliwić analizę danych z wielu powtórzeń i wyznaczenie rzeczywistej średniej oraz odchylenia standardowego dla każdego punktu czasowego (Rycina 6).

Do analizy danych wykorzystane zostaną średnie z każdego powtórzenia, natomiast do reprezentacji graficznej (jak pokazano w przykładzie na Rysunku 7) użyte zostaną połączona średnia oraz odchylenie standardowe lub błąd standardowy ze wszystkich powtórzeń. W przypadku analizy danych przeprowadzonej w ten sposób, gdzie wiele próbek jest śledzonych w wielu punktach czasowych, najodpowiedniejszą metodą jest zastosowanie dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z pomiarem powtarzanym oraz testu post hoc Tukeya. Pozwala to na określenie różnic między próbkami w każdym punkcie czasowym, a także różnic w obrębie każdej próbki w czasie.

figure-results-1
Rysunek 1Ameba pojawia się jako nieprzezroczyste ciemne formy w mikroskopii w polu jasnym. Powiększony reprezentatywny obraz ameby przy 4-krotnym powiększeniu, lekko nieostry, aby prezentować się jako pełne ciemne okręgi. Pasek skali = 500 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2Obraz ameby wykonany za pomocą mikroskopii w polu jasnym, przekształcony na obraz binarny i poddany śledzeniu. Ameba przy 4-krotnym powiększeniu w jasnym polu (lewo), przekształcona na obraz binarny z usuniętymi artefaktami (środek) oraz, po śledzeniu, z wyświetlonymi wybranymi ścieżkami (prawo). Górny rząd: cały dołek obrazowany poprzez zestawienie 4 obrazów, pasek skali = 1000 µmDolny rząd: rozmiar pojedynczego obrazu przed złożeniem, pasek skali = 500 µm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3Bezpośredni wynik analizy danych z oprogramowania do obrazowania i śledzenia zawiera szeroką gamę typów danych. Reprezentatywny wynik śledzenia przedstawiono na Rysunek 2, co stanowi pojedynczy film. Należy zauważyć, że numery ścieżek (czerwona strzałka) nie są ciągłe, co wskazuje, że oprogramowanie do śledzenia poprawnie usunęło ścieżki, które nie były zgodne z parametrami. W tym przykładzie tylko 71 z 5385 zidentyfikowanych ścieżek było zgodnych z parametrami. Taki stosunek jest normalny, biorąc pod uwagę tak rygorystyczne wytyczne. Liczba ta jest również zgodna z liczbą ameb wykorzystanych w tym protokole (na przykład, jeśli na płytce 96-dołkowej wysiano 200 µL o wymiarach 7,5 x 103 CFU/mL na dołek, należy spodziewać się około 150 ameb w dołku i podobnej liczby widocznych w polu widzenia o rozmiarze 4 szwów. Prawdopodobnie pojawi się znacznie więcej śladów niż samych ameb, ponieważ ameby przemieszczają się w obrębie pola widzenia i poza nie, pozostawiając nowe ślady). Liczba śladów jest ponownie widoczna w Rysunek 2, gdzie widocznych jest tylko kilka śladów w porównaniu do dużej liczby plamek. Zawsze należy sprawdzić liczbę plamek w śladzie (czerwona ramka), aby upewnić się, że uwzględniono tylko prawidłowe długości śladów. Przykładowo, w tym przypadku uwzględniamy ponad 93% klatek, a w tej sekcji było 127 klatek, zatem wszystkie liczby plamek powinny być wyższe niż 18. Na żółto zaznaczono pomiary wspomniane w protokole. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

figure-results-4
Rysunek 4Dane zreorganizowane w razie potrzeby po wstępnym wyjściu danych. Organizacja wybranych danych po eksporcie.A) Wybrane odpowiednie pomiary do kwantyfikacji zostały skopiowane z eksportu z oprogramowania do śledzenia (Rycina 3) i wklejone do nowego arkusza kalkulacyjnego.(B) Po zorganizowaniu wybranych pomiarów w nowym arkuszu kalkulacyjnym należy obliczyć średnią dla każdego śladu. W tym reprezentatywnym przykładzie całkowita droga (Total Distance), maksymalna odległość (Max Distance), stopień ograniczenia (Confinement), średnia prędkość (Mean Speed) oraz przemieszczenie (Displacement) każdego użytecznego śladu w tym pojedynczym filmie zostały uśrednione do jednej wartości dla każdego pomiaru. Należy ponownie zauważyć, że łącznie 71 śladów spełniło parametry dla klatek 1–127. W przypadku każdego analizowanego filmu lub zestawu klatek liczba odpowiednich śladów prawdopodobnie będzie inna, co widać w Rycina 5. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-5
Rycina 5Zestaw kolejnych klatek do analizy całego szeregu obrazów lub filmu. Jest to reprezentacyjny obraz dodawania sekwencyjnych filmów do analizy danych. Przyjmijmy, że klatki 1–127 stanowią pierwszą godzinę filmu (tutaj 1 h składa się z obrazów pobieranych co 28 s). Klatki 128–254 będą drugą godziną filmu, a klatki 25–381 trzecią godziną filmu. Połącz wyeksportowane dane (w taki sposób, w jaki zostały wyeksportowane w Rysunek 3) ze wszystkich godzin do jednego arkusza, aby móc pracować z nimi wszystkimi jednocześnie. Zgodnie z tym, co zrobiono w Rycina 4dane ze wszystkich użytecznych ścieżek dla każdego zestawu klatek/h zostaną uśrednione. Wszystko w Rysunek 5 czy dane pochodzą z jednego powtórzenia, czy z jednej próbki. W przypadku trzech powtórzeń utworzone zostaną trzy oddzielne karty arkusza o identycznym układzie, a dane z tych kart zostaną wprowadzone do nowej karty, zgodnie z pokazanym w Rysunek 6. Aby wyświetlić tę figurę w powiększeniu, należy kliknąć tutaj.

figure-results-6
Rysunek 6Zagregowane dane ze wszystkich ameb w każdym zestawie klatek, służące do reprezentowania pojedynczej powtórki. (A) Wszystkie średnie z każdego zestawu klatek w Rycina 5 należy zebrać w jednym miejscu, aby możliwe było przeprowadzenie końcowej analizy danych. Na tym reprezentatywnym obrazie przedstawiono średnie wartości całkowitego dystansu (Total Distance) z pierwszych trzech zestawów klatek (lub godzin). Procedurę tę należy powtórzyć dla każdej analizowanej próbki/warunku/powtórzenia. Następnie należy obliczyć średnią z wartości średnich dla każdej próbki z każdego zestawu klatek (żółta ramka). Jest to końcowy punkt danych, na podstawie którego można obliczyć odchylenie standardowe oraz błąd standardowy. Pojedyncze średnie dla każdej próbki (tutaj liczby w komórkach B3, B4 i B5 dla całkowitego dystansu próbki 1; C3, C4 i C5 dla całkowitego dystansu próbki 2 itd.) zostaną wykorzystane do przeprowadzenia analizy statystycznej. Proces ten należy powtórzyć dla wszystkich wymaganych pomiarów (maksymalny dystans, zamknięcie, średnia prędkość, przemieszczenie itd.) (BAby przygotować reprezentację graficzną ilościowego oznaczenia, należy wykorzystać wartości z żółtego pola jako punkty danych do końcowego wykresu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rycina 7Surowe dane dotyczące ruchliwości dla szczepów ATCC 30461 i ATCC 50370. Surowe dane (przedstawione tutaj jako średnia ± (SE dla każdej godziny) został wcześniej zebrany i nie został opublikowany w poprzednich badaniach18,19Ta kwantyfikacja motywności wykazuje, że dwie te ameby są podobne w ciągu pierwszych 6 h motywności (mierzonej jako całkowity dystans przebyty w mikronach w ciągu tej godziny) w ¼ roztwór Ringera na powierzchni szklanej. Każdy punkt czasowy reprezentuje trzy oddzielne powtórzenia, z których każde składa się z 20–20 śladów ameb. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Możliwość śledzenia i ilościowego określenia ruchliwości ameb, takich jak Acanthamoeba, które są przylegającymi mikroskopijnymi organizmami niewrażliwymi na ruchy Browna o niskiej prędkości 9,10, ujawnia znaczną ilość informacji na temat zachowania ameb i może znacznie zwiększyć wiedzę na temat metod zapobiegania AK. Protokół ten został szczegółowo opisany w ostatnich publikacjach, a dane zostały potwierdzone lub połączone z innymi podobnymi analizami danych18,19. Zauważamy tutaj, że szybkość ameba opisana za pomocą tej metody jest podobna do tego, co zostało opublikowane przez inne grupy. Protokół ten jest godny uwagi ze względu na jego zdolność do stosowania w zasadzie na każdej powierzchni lub leczeniu amebą, która jest przezroczysta dla światła, ale ważne jest, aby pamiętać, że chociaż protokół ten może być potencjalnie zmodyfikowany do pracy z innymi organizmami, został do tej pory zoptymalizowany tylko dla Acanthamoeba. Powyższy protokół konsekwentnie działał dobrze w laboratorium, ale przewidziano następujące zmiany dotyczące zmiany metody w celu dostosowania jej do innych potrzeb lub rozwiązywania trudnych sytuacji.

Określanie parametrów śledzenia: W powyższym protokole wymieniono łączenie klatka-klatka, zamykanie odstępów, maksymalny odstęp między ramkami oraz liczbę miejsc na ścieżce, które były najbardziej odpowiednie dla ostatnich publikacji. Niewykluczone jednak, że inne parametry będą lepiej dopasowane do innych potrzeb. Ponadto mogą istnieć parametry, które inni chcieliby użyć, ale nie zostały tutaj użyte (takie jak maksymalna odległość ścieżki w filtrach ścieżek). Więcej informacji na temat każdego parametru i tego, co opisują, można znaleźć tutaj na stronie internetowej (patrz odnośnik21). Decydując, które parametry i filtry są najbardziej odpowiednie dla innych eksperymentów i jak należy je ustawić, zastanów się, co jest statystycznie racjonalne dla konkretnego projektu; Na przykład, czy ktoś chciałby mieć dane z ameby, która odchodzi od pola widzenia, a następnie wraca do niego? A może ktoś chciałby zachować dane z ameby, która w ogóle się nie poruszała, ale mimo to została oznaczona jako ślad? i co ma sens w przypadku liczby klatek i długości czasu między klatkami, w których obrazy zostały zarejestrowane.

Zmiana rozmiaru plamy: Odkryliśmy, że przy użyciu jakiegokolwiek oprogramowania lub dowolnej konfiguracji mikroskopu - w oparciu o obecne technologie i oprogramowanie dostępne w standardowych laboratoriach - niezwykle trudno jest dokładnie śledzić liczbę ameb w zagregowanym ciele, ponieważ zmienia się ona w czasie. Jeśli śledzisz rozmiar plamy i próbujesz skorelować ten rozmiar z liczbą znajdujących się w nim organizmów, użyj standardowej krzywej wygenerowanej po wielokrotnych eksperymentach, aby matematycznie przewidzieć rozmiar agregatu. Na przykład agregaty zostały stworzone przez wysiew studni z różnymi liczbami ameby, takimi jak 8, 16, 32, 125, 250, 500, 1000 i 2000 komórek na studzienkę. Przez 24 godziny generowano zdjęcia poklatkowe w różnych punktach czasowych każdego odwiertu. Każda sferoida (która należała do znanej liczby ameb) została przeanalizowana pod kątem dwuwymiarowego obszaru, a standardowa krzywa została wygenerowana jako funkcja liczby ameb w stosunku do wielkości sferoidów w czasie. Eksperyment ten powtórzono co najmniej trzykrotnie, aby uzyskać odpowiednie odchylenie standardowe dowolnej wygenerowanej krzywej.

Określanie kierunkowości ameby: Chociaż może to nie być konieczne w przypadku niektórych badań, może być pomocne w zrozumieniu kierunkowości ameby. Dostarczyłoby to danych na temat chemotaktycznych efektów leczenia lub eksperymentu. Dane te mogą być również wykorzystywane do tworzenia danych zarówno wizualnych (graficznych), jak i ilościowych. Jest to dostępne za pośrednictwem narzędzia Chemotaxis and Migration Tool, które jest bezpłatną wtyczką do oprogramowania do obrazowania. Jest on dostępny na stronie internetowej wraz z instrukcją aplikacji oraz przykładowymi zdjęciami i filmami (patrz Spis materiałów).

Szczegółowa dynamika ruchu: inne grupy badały dynamikę rozprzestrzeniania się i trajektorie dyfuzyjne za pomocą wysoce zaawansowanych i rozwiniętych analiz statystycznych wykraczających poza to, co omówiono tutaj 9,10,22. Można je rozważyć w oparciu o potrzeby użytkownika.

Podobnie jak w przypadku każdej skutecznej metody, protokół szczegółowo opisany w tym manuskrypcie przeszedł wiele rund rozwiązywania problemów w celu osiągnięcia spójności. Podczas gdy doskonałe, wysokiej jakości filmy z możliwością śledzenia można tworzyć, robiąc zdjęcie co sekundę (lub tak szybko, jak jest w stanie mikroskop, może to być mniej niż sekunda), tworzy to bardzo duże pliki, z którymi praca może być trudna. Jest to realistycznie odpowiednie tylko w przypadku bardzo krótkich filmów nagrywanych maksymalnie przez kilka minut. I odwrotnie, robiąc zdjęcie co kilka sekund, odkryliśmy, że zachowanie ameby jest nadal bardzo łatwe do śledzenia w oparciu o szybkość tego gatunku i możliwe jest tworzenie funkcjonalnych filmów przez godziny lub dni. Odkryliśmy, że maksymalny czas między obrazami wynosi 30 s, czyli czas potrzebny do dokładnego śledzenia ameby przez oprogramowanie do obrazowania. Przedział czasu wybrany przez użytkownika powinien być rozważany przy użyciu znanych ograniczeń dotyczących tego, jak szybko mikroskop może rejestrować obrazy, ile obrazów na studzienkę jest potrzebnych i ile studzienek jest rejestrowanych w każdym interwale. Podobnie, parametry wymienione w tym protokole dotyczące maksymalnego przemieszczenia, dozwolonych przerw między klatkami, minimalnych wymaganych klatek i tak dalej, zostały określone metodą prób i błędów przez to laboratorium w celu stworzenia informacji o ścieżce, które obejmują najbardziej kompletne ścieżki ameby i ignorują szum tworzony przez niekompletne ścieżki, amebę, która dołącza lub opuszcza scenę w trakcie wideo, lub błędy spowodowane zamieszaniem w oprogramowaniu do obrazowania, na przykład gdy dwie ameby spotykają się w połowie ścieżki, a następnie rozdzielają się. Tego rodzaju błędy i niekompletne ścieżki są, co zrozumiałe, wysokie przy tworzeniu bardzo długich (od godzin do dni) filmów mikroskopijnych organizmów biologicznych, które nieustannie wchodzą ze sobą w interakcje i są powodem, dla którego bardzo duża część błędnych ścieżek musi zostać odrzucona. Należy zauważyć, że etap wypełniania otworów w protokole jest, z doświadczenia tego laboratorium, ważny dla zmniejszenia błędów w sposobie, w jaki oprogramowanie do obrazowania śledzi amebę. Upewniając się, że każda ameba jest solidnym okręgiem, a nie czasami pączkiem lub kształtem litery C, oprogramowanie ma znacznie większe szanse na pomyślne śledzenie każdej ameby.

Ponadto, jak wspomniano, użytkownik ma do dyspozycji wiele parametrów do analizy obrazu lub filmu. Opierając się na potrzebach eksperymentalnych, konsekwentnie odnosiliśmy największe korzyści z analizy dystansu całkowitego, dystansu maksymalnego, prędkości i przemieszczenia. Zostały one dogłębnie omówione (w tym z wykorzystaniem różnych szczepów i powierzchni) wraz z interpretacjami graficznymi we wcześniejszych publikacjach18,19. Te cztery parametry pozwalają użytkownikowi na ekstrapolację zdolności ameby do pokonywania odległości liniowych i czasu potrzebnego na to, co pomaga w zrozumieniu ich zachowania w odniesieniu do zanieczyszczenia soczewek kontaktowych. Pobieranie i analizowanie tych parametrów to duże zadanie, jak szczegółowo opisano na naszych rysunkach. Podczas pracy z dużymi i licznymi arkuszami kalkulacyjnymi z danych wyjściowych oprogramowania do obrazowania ograniczyliśmy niezamierzone błędy, tworząc zablokowane szablony arkuszy kalkulacyjnych, które automatycznie obliczały wszystkie wymagane analizy. Jednak możliwym ulepszeniem tej metody byłoby napisanie skryptu, który może obsłużyć te dane oraz sortować je i analizować.

Podsumowując, opisano tutaj dostępną i dokładną metodę pomiaru wielkości i ruchliwości Acanthamoeba w wielu różnych warunkach. Wykazaliśmy, że metoda ta może być stosowana do wielu różnych szczepów ameb i podkreśliliśmy, że chociaż mogą istnieć proste parametry do uzyskiwania informacji o ruchliwości, ten eksperymentalny zestaw może być wysoce dostosowany do dowolnych konkretnych potrzeb.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy są pracownikami firmy Alcon Research, LLC.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Alcon Research, LLC.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
¼ Dzwonek' s roztwórThermoFisher ScientificBR0052GOxoid Ringers Solution Tabletki. Postępuj zgodnie ze wskazówkami, aby uzyskać jedną czwartą siły zamiast dzwonków o pełnej sile. 
10 &mikro; Pipeta LEppendorf Research31230000392 & mikro; L-20 i mikro; L pojedynczy kanał
10 i mikro; L końcówki do pipetNeptune Scientific, San Diego, CA, USABT10.N10 µ L Uniwersalna końcówka barierowa
48-dołkowa płytkaMillipore Sigma, CLS3548Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plate: płytka polistyrenowa, studzienki z płaskim dnem, sterylna, z
pokrywką Probówki stożkowe 50 ml (1 na każdą próbkę, 1 na każde przejście 2 próbki)Fisher ScientificFalcon 352098Falcon 50 mL stożkowe probówki wirówkowe o wysokiej przejrzystości, polipropylenowa
płytka 96-dołkowaMillipore Sigma, Burlington, MA, USACLS3596Płyta wielodołkowa Corning Costar TC-Treated: płyta polistyrenowa, studzienki z płaskim dnem, sterylna, z pokrywką
Acanthamoeba  American Type Culture Collection, Manassas, VA, USAATCC 30461Ten protokół został zweryfikowany pod kątem ATCC 50655, 30872, 50702, 30010, 30461, 50370, 50703, 30137, PRA-115 i PRA-411
Pożywki do hodowli aksenicznej (AC6)Wyprodukowano w domun/aZawiera 20 g peptonu biosatu, 5 g glukozy, 0,3 g KH2PO4, 10 i mikro; g witaminy B12 i 1 szklanka5 mg  L-metionina na litr destylowanej wody dejonizowanej. Dostosować pH do 6,6-6,95 za pomocą 1 M NaOH i autoklawować w temperaturze 121 & stopni; C przez 20 min, przechowywać w temperaturze pokojowej do 3 miesięcy.
Wirówka i odpowiedni wirnikThermo Scientific, Waltham, MA, USASorvall ST 40RDopuszczalne są dowolne równoważne wirówki i wirniki, o ile mogą obracać stożkowe probówki o pojemności 50 ml przy 500 x g przez 5 minut
Chemotaksja i narzędzie do migracji Darmoweoprogramowanie oparte na ImageJ, dostępne pod adresem https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html
Jednorazowy hemocytometrBulldog Bio, Portsmouth, NH, USADHC-N01Neubauer Ulepszony 2-chipowy jednorazowy hemocytometr, indywidualnie pakowany, niepirogenne
oprogramowanie ImageJ z wtyczką Trackmate (ten protokół napisany za pomocą Trackmate w wersji 6.0.2.)Darmowe oprogramowanie opracowane przez National Institutes of Health, dostępne pod adresem imagej.net. Wtyczka Trackmate dostępna pod adresem https://imagej.net/plugins/trackmate/
Microscope, najlepiej z automatycznym ruchomym stolikiemNikon, Tokio, JaponiaW tym badaniu użyto mikroskopu Nikon Eclipse Ti-U, a zautomatyzowany ruchomy stolik został wykorzystany, aby móc rejestrować obrazy w wielu studzienkach jednocześnie.
Oprogramowanie NIS-Elementsfirmy Nikon
Fisher Scientific, Hampton, NH, Stany ZjednoczoneBrandTech 26331BrandTech accu-jet pro Kontroler pipet
Serologiczne końcówki do pipetVWR5 ml: 76201-710
10 mL: 170356
25 mL: 89130-900
50 mL: 75816-088		Pipeta serologiczna VWR, niepirogenna
Sterylna aluminiowa komórka przepływowaBiosurface Technologies Corporation, Bozeman, MT, USAFC 81-ALJednokanałowa kolektoria przepływowa z anodyzowanego aluminium z 96-dołkową płytką do użytku z mikroskopem odwróconym
Kolby T75VWR, Radnor, PA, USA734-2316Kolba do hodowli tkankowych VWR, 182,5 cm, Obrabiana powierzchnia, Zatyczka uszczelniająca, Sterylne
Pipeta serologiczna

Bibliografia

  1. Randag, A. C., et al. The rising incidence of Acanthamoeba keratitis: A 7-year nationwide survey and clinical assessment of risk factors and functional outcomes. PLoS One. 14 (9), e0222092(2019).
  2. Szentmary, N., et al. Acanthamoeba keratitis - Clinical signs, differential diagnosis and treatment. J Curr Ophthalmol. 31 (1), 16-23 (2019).
  3. Carnt, N., et al. Acanthamoeba keratitis: confirmation of the UK outbreak and a prospective case-control study identifying contributing risk factors. Br J Ophthalmol. 102 (12), 1621-1628 (2018).
  4. Verani, J. R., et al. National outbreak of Acanthamoeba keratitis associated with use of a contact lens solution, United States. Emerg Infect Dis. 15 (8), 1236-1242 (2009).
  5. Tu, E. Y., Joslin, C. E. Recent outbreaks of atypical contact lens-related keratitis: what have we learned. Am J Ophthalmol. 150 (5), 602-608 (2010).
  6. International Organization for Standardization. ISO 14729:2001/A1. Ophthalmic optics-Contact lens care products-Microbiological requirements and test methods for products and regimens for hygienic management of contact lenses. International Organization for Standardization. , Geneva, Switzerland. (2010).
  7. ASC Z80, Parent Committee Meeting. , Available from: https://www.thevisioncouncil.org/sites/default/files/ASCZ80_ParentCommitteeMinutes_February_27_2018_FINALMar19-2018.pdf (2023).
  8. Rayamajhee, B., et al. Acanthamoeba, an environmental phagocyte enhancing survival and transmission of human pathogens. Trends Parasitol. 38 (11), 975-990 (2022).
  9. Reverey, J. F., et al. Superdiffusion dominates intracellular particle motion in the supercrowded cytoplasm of pathogenic Acanthamoeba castellanii. Sci Rep. 5, 11690(2015).
  10. Thapa, S., Lukat, N., Selhuber-Unkel, C., Cherstvy, A. G., Metzler, R. Transient superdiffusion of polydisperse vacuoles in highly motile amoeboid cells. J Chem Phys. 150 (14), 144901(2019).
  11. Rudell, J. C., et al. Acanthamoeba migration in an electric field. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (6), 4225-4233 (2013).
  12. Fukaya, S., Aoki, K., Kobayashi, M., Takemura, M. Kinetic analysis of the motility of giant virus-infected amoebae using phase-contrast microscopic images. Front Microbiol. 10, 3014(2019).
  13. Fukaya, S., Takemura, M. Kinetic analysis of Acanthamoeba castellanii infected with giant viruses quantitatively revealed process of morphological and behavioral changes in host cells. Microbiol Spectr. 9 (1), 0036821(2021).
  14. Cheng, H. J., Hsu, C. H., Hung, C. L., Lin, C. Y. A review for cell and particle tracking on microscopy images using algorithms and deep learning technologies. Biomed J. 45 (3), 465-471 (2022).
  15. Mathieu, E., et al. Time-lapse lens-free imaging of cell migration in diverse physical microenvironments. Lab Chip. 16 (17), 3304-3316 (2016).
  16. Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry A. 93 (3), 357-370 (2018).
  17. Piltti, K. M., et al. Live-cell time-lapse imaging and single-cell tracking of in vitro cultured neural stem cells - Tools for analyzing dynamics of cell cycle, migration, and lineage selection. Methods. 133, 81-90 (2018).
  18. Campolo, A., et al. Continuous real-time motility analysis of Acanthamoeba reveals sustained movement in absence of nutrients. Pathogens. 10 (8), 995(2021).
  19. Campolo, A., Patterson, B., Lara, E., Shannon, P., Crary, M. Complete recovery of Acanthamoeba motility among surviving organisms after contact lens care disinfection. Microorganisms. 11 (2), 299(2023).
  20. Crary, M. J., Walters, R., Shannon, P., Gabriel, M. M. Variables affecting the recovery of Acanthamoeba trophozoites. Pathogens. 10 (2), 221(2021).
  21. imagej. , Available from: https://imagej.net/plugins/trackmate/tutorials/getting-started (2024).
  22. Cherstvy, A. G., Nagel, O., Beta, C., Metzler, R. Non-Gaussianity, population heterogeneity, and transient superdiffusion in the spreading dynamics of amoeboid cells. Phys Chem Chem Phys. 20 (35), 23034-23054 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ruchliwość Acanthamoebazapalenie rogówki wywołane przez Acanthamoebamikroskopia w polu jasnymkwantyfikacja ruchliwościśledzenie trofozoitówzanieczyszczenie soczewek kontaktowychtrójwymiarowe modele rogówkianaliza obrazujednostki tworzące koloniebinarna analiza obrazu
Oznaczanie ilościowe Acanthamoeba spp. Ruchliwość
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.