Adaptacja w ekstremalnych warunkach życia: eksperymentalna ewolucja z ekstremofilem archeonem Sulfolobus acidocaldarius

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy eksperymentalny protokół ewolucji do adaptacji u termofilów, wykorzystując tanie, energooszczędne termomiksery stołowe jako inkubatory. Technika ta została zademonstrowana poprzez scharakteryzowanie adaptacji do temperatury u Sulfolobus acidocaldarius, archeonu o optymalnej temperaturze wzrostu 75 °C.

Streszczenie

Archeon Sulfolobus acidocaldarius okazał się obiecującym modelowym systemem ciepłolubnym. Zbadanie, w jaki sposób termofile przystosowują się do zmieniających się temperatur, jest kluczowym wymogiem, nie tylko dla zrozumienia podstawowych procesów ewolucyjnych, ale także dla opracowania S. acidocaldarius jako podstawy dla bioinżynierii. Jedną z głównych przeszkód w przeprowadzaniu eksperymentalnej ewolucji z udziałem termofilów są koszty konserwacji sprzętu i zużycia energii przez tradycyjne inkubatory do wzrostu w wysokich temperaturach. Aby sprostać temu wyzwaniu, przedstawiono kompleksowy protokół eksperymentalny do przeprowadzenia eksperymentalnej ewolucji u S. acidocaldarius, wykorzystujący tanie i energooszczędne termomiksery laboratoryjne. Protokół obejmuje technikę hodowli okresowej o stosunkowo małych objętościach (1,5 ml), co umożliwia śledzenie adaptacji w wielu niezależnych liniach. Metoda ta jest łatwo skalowalna dzięki zastosowaniu dodatkowych termomikserów. Takie podejście zwiększa dostępność S. acidocaldarius jako systemu modelowego, zmniejszając zarówno początkowe inwestycje, jak i bieżące koszty związane z badaniami eksperymentalnymi. Co więcej, technikę tę można przenieść do innych systemów mikrobiologicznych w celu zbadania adaptacji do różnych warunków środowiskowych.

Wprowadzenie

Wczesne życie na Ziemi mogło powstać w ekstremalnych środowiskach, takich jak kominy hydrotermalne, które charakteryzują się ekstremalnie wysokimi temperaturami i kwasowością¹. Mikroorganizmy nadal zamieszkują ekstremalne środowiska, w tym gorące źródła i wulkaniczne solfatara. Scharakteryzowanie dynamiki ewolucyjnej, która zachodzi w tych ekstremalnych warunkach, może rzucić światło na wyspecjalizowane procesy fizjologiczne, które umożliwiają przetrwanie w tych warunkach. Może to mieć daleko idące implikacje, począwszy od zrozumienia początków różnorodności biologicznej, a skończywszy na opracowaniu nowych enzymów wysokotemperaturowych o zastosowaniach biotechnologicznych.

Zrozumienie dynamiki ewolucji mikroorganizmów w ekstremalnych środowiskach pozostaje ograniczone, pomimo jej krytycznego znaczenia. W przeciwieństwie do tego, znaczna część wiedzy na temat ewolucji w środowiskach mezofilnych została zdobyta dzięki zastosowaniu techniki znanej jako ewolucja eksperymentalna. Ewolucja eksperymentalna polega na obserwacji zmian ewolucyjnych w warunkach laboratoryjnych^2,3,4,5. Często wiąże się to ze zdefiniowanym środowiskiem zmiany (np. temperatura, zasolenie, wprowadzenie toksyny lub organizmu konkurencyjnego)^7,8,9. W połączeniu z sekwencjonowaniem całego genomu, ewolucja eksperymentalna umożliwiła nam przetestowanie kluczowych aspektów procesów ewolucyjnych, w tym równoległości, powtarzalności i genomicznych podstaw adaptacji. Jednak do tej pory większość eksperymentalnych ewolucji przeprowadzono na mikroorganizmach mezofilnych (w tym bakteriach, grzybach i wirusach^2,3,4,5, ale w dużej mierze z wyłączeniem archeonów). Metoda ewolucji eksperymentalnej zastosowana do mikroorganizmów ciepłolubnych pozwoliłaby nam lepiej zrozumieć, w jaki sposób ewoluują i przyczyniłaby się do pełniejszego zrozumienia ewolucji. Ma to potencjalnie daleko idące implikacje, od rozszyfrowania początków życia ciepłolubnego na Ziemi po zastosowania biotechnologiczne obejmujące 'ekstremozymy' używane w bioprocesach wysokotemperaturowych¹⁰ i badania astrobiologiczne¹¹.

Archeon Sulfolobus acidocaldarius jest idealnym kandydatem na organizm modelowy do rozwoju eksperymentalnych technik ewolucji dla termofilów. S. acidocaldarius rozmnaża się tlenowo, z optymalną temperaturą wzrostu na poziomie 75 °C (zakres od 55 °C do 85 °C) i wysoką kwasowością (pH 2-3)^4,6,12,13,14. Co ciekawe, pomimo ekstremalnych warunków wzrostu, S. acidocaldarius utrzymuje gęstość populacji i tempo mutacji porównywalne z mezophiles^{7,15,16,17,18}. Ponadto posiada stosunkowo mały, dobrze opisany genom (szczep DSM639: 2,2 Mb, 36,7% GC, 2,347 genów)¹²; S. acidocaldarius korzysta również z solidnych narzędzi inżynierii genomu, które pozwalają na bezpośrednią ocenę procesu ewolucyjnego za pomocą ukierunkowanych nokautów genów¹⁹. Godnym uwagi przykładem tego jest dostępność genetycznie zmodyfikowanych szczepów S. acidocaldarius, takich jak auksotroficzne szczepy uracylu MW001¹⁹ i SK-1²⁰, które mogą służyć jako markery do wyboru.

Istnieją poważne wyzwania związane z przeprowadzaniem eksperymentalnej ewolucji z termofilami, takimi jak S. acidocaldarius. Przedłużona inkubacja w wysokich temperaturach wymagana do tych badań wymusza znaczne parowanie zarówno w przypadku technik hodowli płynnej, jak i stałej. Przedłużona praca w wysokich temperaturach może również uszkodzić tradycyjne inkubatory z wytrząsaniem, które są powszechnie stosowane w ewolucji eksperymentalnej w płynnych mediach. Badanie wielu temperatur wymaga znacznych inwestycji finansowych w zakup i utrzymanie kilku inkubatorów. Ponadto wysokie zużycie energii budzi poważne obawy dotyczące środowiska i finansów.

Ta praca wprowadza metodę rozwiązywania problemów napotkanych podczas przeprowadzania eksperymentalnej ewolucji z termofilami, takimi jak S. acidocaldarius. Opierając się na technice opracowanej przez Baesa i in. do badania reakcji na szok cieplny^14,21, opracowana tutaj metoda wykorzystuje termomiksery laboratoryjne do spójnej i niezawodnej inkubacji w wysokiej temperaturze. Jego skalowalność pozwala na jednoczesną ocenę wielu zabiegów termicznych, przy jednoczesnym obniżeniu kosztów zakupu dodatkowego sprzętu do inkubacji. Zwiększa to wydajność eksperymentów, umożliwiając solidną analizę statystyczną i szeroko zakrojone badanie czynników wpływających na dynamikę ewolucji u termofilów²². Co więcej, takie podejście znacznie zmniejsza początkową inwestycję finansową i zużycie energii w porównaniu z tradycyjnymi inkubatorami, oferując bardziej zrównoważoną i przyjazną dla środowiska alternatywę.

Nasza metoda stanowi podstawę do eksperymentalnego badania dynamiki ewolucyjnej w środowiskach charakteryzujących się ekstremalnymi temperaturami, które mogły odegrać kluczową rolę we wczesnych etapach różnicowania się życia na Ziemi. Organizmy ciepłolubne mają unikalne właściwości, ale ich ekstremalne warunki wzrostu i specjalistyczne wymagania często ograniczały ich dostępność jako systemu modelowego. Pokonanie tych barier nie tylko rozszerza możliwości badawcze w zakresie badania dynamiki ewolucyjnej, ale także zwiększa szerszą użyteczność termofilów jako systemów modelowych w badaniach naukowych.

Protokół

1. Przygotowanie podłoża wzrostu S. acidocaldarius (BBM⁺)

UWAGA: Do uprawy S. acidocaldarius, ten protokół używa Basal Brock Medium (BBM⁺)²³. Przygotowuje się to poprzez połączenie nieorganicznych roztworów podstawowych opisanych poniżej w celu utworzenia BBM⁻, który może być przygotowany z wyprzedzeniem. BBM⁺ jest następnie przygotowywany w razie potrzeby poprzez dodanie organicznych roztworów podstawowych do BBM⁻. Receptury roztworów podstawowych są również przedstawione w Tabeli 1. Wszystkie podłoża i roztwory podstawowe powinny być przygotowane w podwójnie destylowanym_H2O(ddH₂O).

1. Przygotowanie nieorganicznych roztworów podstawowych do pożywki wzrostowej
   1. Przygotować roztwór podstawowy pierwiastków śladowych.
      1. Przygotować roztwór podstawowy pierwiastków śladowych, dodając 9 g/l dekahydratu tetraboranu sodu (Na₂B₄O₇·10H₂O) do ddH₂O, a następnie dodając kroplami 1:1 H_2SO4 aż do rozpuszczenia.
      2. Wprowadzić kolejno 0,44 g/L siedmiowodnego siarczanu (ZnSO₄·_7H2O), 0,1 g/L dwuwodnego chlorku miedzi(II) (CuCl₂·_2H2O), 0,06 g/L dwuwodnego molibdenianu sodu (Na₂MoO₄·2H₂O), 0,06 g/L dwuwodnego siarczanu wanadu(IV) (VOSO_{4,2H 2O}), 0,02 g/l siedmiowodnego siarczanu kobaltu(II) (CoSO₄·_7H2O) i 3,6 g/l czterowodnego chlorku manganu(II) (MnCl₂·_4H2O). Roztwór należy sterylizować w autoklawie i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   2. Przygotować roztwór podstawowy Fe (1000x) rozpuszczając 20 g/l sześciowodnego chlorku żelaza (FeCl₃·_6H2O) w_ddH2O. Wysterylizować roztwór, filtrując przez filtr 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   3. Przygotować roztwór Brocka I (1000x) rozpuszczając 70 g/l chlorku wapnia (CaCl₂·2H₂O) w wodzie podwójnie destylowanej (ddH₂O). Autoklaw i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Rozpuszczanie CaCl₂·2H₂O w wodzie jest procesem egzotermicznym. Wykonaj ten krok ostrożnie. Nosić rękawice chroniące przed zagrożeniem termicznym zgodnie z normą EN407 w celu ochrony przed obrażeniami. Nie zamykaj szczelnie naczynia, ponieważ może wzrosnąć ciśnienie.
   4. Przygotować roztwór Brocka II/III, łącząc 130 g/l siarczanu amonu ((NH₄)_2SO4), 25 g/l siedmiowodnego siarczanu magnezu (MgSO₄·_7H2O), 28 g/l diwodorofosforanu potasu (KH₂PO₄) i 50 ml uprzednio przygotowanego roztworu podstawowego pierwiastków śladowych. Stosując 1:1 H₂SO₄ dostosuj pH roztworu podstawowego do 2-3. Roztwór należy sterylizować w autoklawie i przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).
2. Przygotowanie organicznych roztworów podstawowych do pożywki wzrostowej
   1. Przygotować roztwór podstawowy D-glukozy (100x), rozpuszczając 300 g/l (30% w/v) D-glukozy w ddH₂O i sterylizować filtrem (przez filtr 0,22 μm). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Inne źródła węgla mogą być stosowane zamiast D-glukozy zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi (np. D-ksyloza).
   2. Przygotować pepton z roztworu podstawowego kazeiny (100x), rozpuszczając pepton z kazeiny w stężeniu 100 g/l w ddH₂O. Autoklaw w celu sterylizacji i przechowywania roztworu podstawowego w temperaturze pokojowej.
   3. Przygotować roztwór podstawowy uracylu (100x) rozpuszczając 2 g/l uracylu w ddH₂O i sterylizować filtrem (przez filtr 0,22 μm); przechowywać w temperaturze -20 °C.
3. Przygotowanie pożywki wzrostowej BBM⁺ o stężeniu roboczym 1x
   1. Najpierw przygotuj 988 ml sterylnego ddH₂O przez autoklawowanie.
   2. Przygotować 1 l BBM⁻, dodając 1 ml roztworu podstawowego Brocka I, 10 ml roztworu podstawowego Brocka II/III i 1 ml roztworu podstawowego Fe do 988 ml sterylnego ddH₂O uprzednio autoklawowanego. Dostosować pH podłoża do zakresu 2-3 za pomocą 1:1 H₂SO₄,
      UWAGA: BBM⁻ można wykonać z wyprzedzeniem i przechowywać w RT przez okres do 1 miesiąca.
   3. Na koniec, aby wyprodukować 1 l BBM⁺, połącz po 10 ml roztworu podstawowego D-glukozy, peptonu z roztworu podstawowego kazeiny i roztworu podstawowego uracylu z 985 ml BBM⁻. Dobrze wymieszaj i dostosuj pH podłoża do 2-3 z 1:1 H₂SO₄,
      UWAGA: BBM⁺ powinien być świeżo przygotowany, zgodnie z wymaganiami.
4. Przygotowanie stałego podłoża BBM⁺
   1. Przygotować 1 M roztwory podstawowe MgCl₂ i CaCl₂; pomogą one w krzepnięciu stałego podłoża BBM. Dla 1 M MgCl₂ dodać 9,5 g do 100 ml ddH₂O. Dla 1 M CaCl₂ dodać 11 g do 100 ml ddH₂O. Autoklaw do sterylizacji.
      UWAGA: Rozpuszczanie CaCl₂·2H₂O w wodzie jest procesem egzotermicznym. Wykonaj ten krok ostrożnie. Nosić rękawice chroniące przed zagrożeniem termicznym zgodnie z normą EN407 w celu ochrony przed obrażeniami. Nie zamykaj szczelnie naczynia, ponieważ może wzrosnąć ciśnienie.
   2. Wymieszaj 3% (w/v) gumy gellan (np. 30 g/L) z ddH₂O i autoklaw do sterylizacji.
      UWAGA: Guma gellanowa (np. Gelrite) jest tutaj stosowana jako środek żelujący, ponieważ standardowy agar bakteriologiczny nie może krzepnąć w temperaturze 75 °C.
   3. Oddzielnie przygotować BBM⁺ na stałe podłoże, które należy wymieszać w stosunku 1:1 ze sterylną gumą gellan przygotowaną w kroku 1.4.1.
      1. Najpierw przygotuj 1 l BBM⁻ jak w kroku 1.3.2. Połączyć 887 ml BBM⁻ z 1 ml roztworu podstawowego Fe i po 20 ml roztworu podstawowego D-glukozy, peptonu z roztworu podstawowego kazeiny i roztworu podstawowego uracylu.
      2. Dodać 40 ml 1 M MgCl₂ i 12 ml 1 M CaCl₂. Dobrze wymieszaj i dostosuj pH podłoża do 2-3 z 1:1 H₂SO₄,
         UWAGA: Objętości roztworów podstawowych dodanych w tym miejscu są celowo większe niż w przypadku przygotowania płynnego BBM⁺ w kroku 1.3. Ma to na celu uwzględnienie mieszania w stosunku 1:1 ze stopioną gumą gellan w następnym kroku.
   4. Rozgrzej BBM⁺ dla stałego podłoża do około 75 °C i wymieszaj w stosunku 1:1 ze stopioną gumą gellan w ddH₂O. Dobrze wymieszaj i wlej do stabilnego termicznie tworzywa sztucznego (np. polipropylenu), szklanych szalek Petriego lub sześciodołkowych płytek do wzrostuS. acidocaldarius. Użyj agaru natychmiast po zmiksowaniu, ponieważ szybko stwardnieje.
      UWAGA: Niektóre polistyrenowe szalki Petriego o średnicy 90 mm powszechnie stosowane w mikrobiologii odkształcają się, jeśli są inkubowane w wysokich temperaturach przez dłuższy czas.
      UWAGA: Podejmij odpowiednie środki ostrożności podczas pracy z gorącymi płynami; nosić rękawice chroniące przed zagrożeniem termicznym zgodne z normą EN407 w celu ochrony przed obrażeniami.

2. Przywracanie S. acidocaldarius z hodowli w zamrażarce

1. Przygotowanie wentylowanych rurek wzrostowych w celu zapewnienia wystarczającego napowietrzenia i dostępności tlenu.
   1. Wcześniej przygotuj przebite probówki mikrowirówkowe o pojemności 2 ml do wzrostu Sulfolobus. Ostrożnie podgrzej drut (>0,7 mm, taki jak wyprostowany spinacz do papieru) za pomocą płomienia palnika Bunsena i przebij pokrywę rurki, tworząc mały otwór o średnicy około 1 mm.
   2. Umieść przekłute probówki w naczyniu nadającym się do sterylizacji w autoklawie (np. pustym pudełku na końcówki do pipet) i autoklawie do sterylizacji.
      UWAGA: Nosić rękawice chroniące przed zagrożeniem termicznym zgodne z normą EN407, aby chronić dłonie przed obrażeniami termicznymi spowodowanymi rozgrzanym metalem. Podgrzewaj drut tylko przez krótki czas (1-2 s), aby zapobiec przegrzaniu. Należy stosować wyłącznie metale o wysokiej temperaturze topnienia (stal).
2. Zaszczepić kultury starterowe S. acidocaldarius.
   1. Napełnić autoklawowane, przekłute probówki o pojemności 2 ml 1,5 ml wstępnie podgrzanego BBM⁺ (przygotowanego w sekcji 1, wstępnie inkubowanego w temperaturze 75 °C przez co najmniej 15 minut).
   2. Zaszczepić probówki wypełnione BBM⁺ skrobakiem (co odpowiada 50 - 60 mg) z glicerolu (25% v/v glicerolu, przechowywanego w temperaturze -80 °C). Tutaj stosowany jest szczep S. acidocaldarius DSM639. Napełnij dodatkową probówkę 1,5 ml BBM+ jako kontrolę ujemną.
3. Aby zapobiec wydostawaniu się aerozoli z przebitej wieczka probówki o pojemności 2 ml i zanieczyszczeniu środowiska wzrostu (i wszelkich innych próbek) oraz w celu zmniejszenia zmienności parowania kultur w probówkach, należy umieścić membranę przepuszczającą gaz na pokrywie, która wytrzyma podwyższone temperatury (65-85 °C) i zablokuje ucieczkę/infiltrację drobnoustrojów.
   UWAGA: Zastosowanie membran gazoprzepuszczalnych do uszczelniania rur znacznie zmniejsza parowanie. W okresie 48 godzin w temperaturze 75 °C zamknięte probówki wykazują średni ubytek objętości wynoszący 8,63% (zakres: 3,29-16,45%, n = 24 kontrpróby techniczne, powtórzone dwukrotnie), w przeciwieństwie do 25,05% (zakres: 11,92-62,91%, n = 24 kontrpróby techniczne, powtórzone dwukrotnie) dla probówek nieuszczelnionych.
4. Inkubować zaszczepione probówki w termomikserze w temperaturze 75 °C ze stałym wytrząsaniem przy 400 obrotach na minutę (RPM) przez 48-72 godzin lub do osiągnięcia OD_600nm 0,3 - 0,8, jak zmierzono za pomocą spektrofotometru.
   UWAGA: Przebita pokrywka probówek o pojemności 2 ml i potrząsanie umożliwiają odpowiednie napowietrzenie w celu optymalnego wzrostu. Pokrywa termomiksera powinna być na swoim miejscu, aby zapewnić utrzymanie stałej temperatury i zmniejszyć parowanie.
5. Po okresie inkubacji należy nadać ożywionym kulturom drugą fazę wzrostu (kondycjonowanie wstępne).
   1. Osadzaj kultury, obracając probówki o sile 5000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Następnie wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad komórek w świeżym, ciepłym 1,5 ml BBM⁺.
      UWAGA: W tym eksperymencie wykorzystano szczep S. acidocaldarius typu dzikiego DSM639, ale te metody wzrostu i ewolucji eksperymentalnej można zastosować do dowolnego szczepu Sulfolobus i potencjalnie innych termofilów.

3. Określanie gęstości populacji, czasu podwojenia i fazy wykładniczego wzrostu S. acidocaldarius

1. Określ gęstość populacji i czas do fazy wzrostu wykładniczego dla wybranych warunków selekcji. Dla każdego badanego stanu środowiska należy przygotować trzy kultury starterowe, wykonując kroki 2.1-2.5.
2. Rozcieńczyć trzy kultury w BBM⁺ do OD_{600 nm} 0,01. Przygotuj co najmniej 20 ml z każdej kultury. Te trzy kultury reprezentują repliki techniczne.
3. Wykonaj powtórzone krzywe wzrostu OD_{600 nm} w czasie, korzystając z destrukcyjnego próbkowania.
   1. Przygotuj 24 przebite probówki o pojemności 2 ml z kroku 2.1, podziel je na trzy zestawy po osiem i oznacz te kontrpróby techniczne jako 1, 2 i 3 (np. osiem probówek oznaczonych jako powtórzenie 1 itd.).
   2. Z każdej z trzech rozcieńczonych kultur z kroku 3.2 odpipetować pipetą 1,5 ml do siedmiu przygotowanych probówek. Napełnij pozostałą probówkę 1,5 ml BBM+ jako kontrolę ujemną.
4. Inkubować wszystkie 24 probówki w termomikserze w temperaturze 75 °C i 400 obr./min. Uszczelnić membraną przepuszczającą gaz. W regularnych odstępach czasu (np. 0, 4, 8, 12, 24, 36, 48 godzin) wyjąć po jednej probówce z każdej z trzech kontrprób i zmierzyć OD_{600 nm} za pomocą spektrofotometru, a następnie wyrzucić probówkę. Wymień membranę przepuszczającą gaz po wyjęciu rurki.
5. Równolegle określ związek między OD_600nm a gęstością zaludnienia. Wykonaj seryjne rozcieńczenia (1 x ^10-1 do 1 x ^10-6) w pożywce BBM⁺ przez co najmniej trzy punkty czasowe (najlepiej początek, środek i koniec). Zaszczepić 100 μl każdego rozcieńczenia na stałym podłożu BBM⁺ (przygotowanym jak w kroku 1.4).
   UWAGA: Aby osiągnąć stały wzrost kolonii i dokładne zliczanie, najlepiej jest pipetować rozcieńczoną kulturę na stałe podłoże w miejscu bez wykonywania mechanicznego rozprowadzania, takiego jak rozsiewacz w kształcie litery L lub szklanych kulek. Wydaje się, że mechaniczne rozsiewanie niekorzystnie wpływa na tworzenie kolonii.
6. Inkubować płytki w inkubatorze statycznym w temperaturze 75 °C aż do pojawienia się kolonii (5-7 dni).
   1. W tym czasie utrzymuj inkubator w wilgoci, aby uniknąć nadmiernego wysuszenia płytek, w przeciwnym razie kolonie nie powstaną.
   2. Osiągnij to, umieszczając talerze w zamkniętym pudełku polipropylenowym wyłożonym wilgotną szmatką. Przebij pokrywę pudełka co najmniej trzy razy, aby umożliwić napowietrzenie.
   3. Umieść wiadra z wodą w inkubatorze, aby zwiększyć wilgotność. Codziennie napełniaj wiadra.
7. Po zebraniu wszystkich pomiarów OD_600nm określ czas podwojenia i czas osiągnięcia fazy wzrostu wykładniczego, dopasowując krzywą logistyczną do relacji między OD_600nm a czasem, np. za pomocą SummarizeGrowth z pakietu growthcurver w R.
8. Gdy widoczne kolonie uformują się na pożywkach stałych, policz jednostki tworzące kolonie (CFU), dążąc do zliczenia od współczynnika rozcieńczenia, tworząc 50-100 kolonii w celu uzyskania najlepszej dokładności.
9. Obliczyć gęstość komórek w pożywce hodowlanej, korzystając ze wzoru: jtk/ml = liczba kolonii/(objętość posiana × współczynnik rozcieńczenia).
10. Wykonaj regresję liniową logarytmiczną, aby określić zależność między log10 (CFU) a log10 (OD_{600 nm}). W związku z tym oblicz przewidywaną CFU/ml dla danego OD od nachylenia i punktu przecięcia modelu regresji: przewidywany CFU = 10^{[nachylenie × log10(OD600nm) + przecięcie]}.
11. (Opcjonalnie) Należy również wykonać kroki 3.1-3.10 w inkubatorze z wytrząsaniem, aby określić, czy w termomieszalnikach osiągany jest porównywalny wzrost.

4. Inicjacja niezależnych linii dla eksperymentalnej ewolucji

1. Dzień 1: Aby wygenerować pojedyncze kolonie, najpierw wykonaj wszystkie kroki opisane w sekcji 2 powyżej, aby wygenerować początkową hodowlę.
2. Dzień 3: Zmierz OD_{600 nm} hodowli, aby upewnić się, że osiągnęła wystarczającą gęstość w fazie wykładniczej (OD_{600 nm} 0,3-0,8 za pomocą spektrofotometru).
3. Stworzyć seryjne rozcieńczenia kultury S. acidocaldarius DSM639 z 1 x ^10-1-1 x ^10-6 i rozprowadzić 100 μl z każdego rozcieńczenia 1 x ^10-5 i 1 x ^10-6 do studzienek 6-dołkowej płytki zawierającej stałe podłoże BBM⁺ (sekcja 1 i tabela 1) w kilku powtórzeniach. Inkubować płytki w temperaturze 75 °C w inkubatorze statycznym, jak w kroku 3.5, przez 5-7 dni, aby wyłoniły się pojedyncze kolonie.
4. Dzień 8-10 (5-7 dni po inkubacji):
   1. Ustal liczbę ewoluujących linii z pojedynczych kolonii. Dla każdej linii wybierz losowo jedną kolonię z płytek za pomocą pętli inokulacyjnej. Ponownie zawiesić kolonię w przekłutej probówce o pojemności 2 ml zawierającej 1,5 ml wstępnie podgrzanej pożywki BBM⁺. Odpowiednio oznacz rurkę.
   2. Powtórz tę czynność dla żądanej liczby linii; tutaj ustalono siedem linii i oznaczono je jako SA1-7. Napełnij dodatkową probówkę 1,5 ml BBM+ jako kontrolę ujemną.
   3. Uszczelnić górne części probówek oddychającą membraną i inkubować w termomikserze w temperaturze 75 °C, 400 obr./min przez 48-72 godziny, aż kultury staną się mętne (co odpowiada OD_{600 nm} 0,3-0,8 za pomocą spektrofotometru).
5. Dzień 10-12 (7-9 dni po szczepieniu):
   1. W wirówce stołowej wirować kultury klonalne w temperaturze 5 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad za pomocą 200 μl płynnego BBM⁺.
   2. Zmieszaj 200 μl zawiesin komórkowych z 200 μl 50% glicerolu (25% v/v glicerolu), aby stworzyć zapasy glicerolu siedmiu niezależnych linii i przechowywać w temperaturze -80 °C. Są to populacje przodków dla eksperymentów ewolucyjnych.

5. Przeprowadzanie eksperymentu z ewolucją temperatury

UWAGA: Diagram koncepcyjny przedstawiający główne aspekty protokołu eksperymentu znajduje się w Rysunek 1.

1. Użyj siedmiu populacji przodków wygenerowanych w sekcji 4 do eksperymentu ewolucyjnego.
   1. Wszystkie eksperymentalne testy ewolucji przeprowadzić w sterylnych, przebitych probówkach o pojemności 2 ml uszczelnionych przepuszczalną membraną (opisaną powyżej, sekcja 2).
   2. Wraz z tymi populacjami należy utrzymywać oddzielne probówki z przekłutymi 2 ml z 1,5 ml BBM⁺ jako kontrole ujemne wolne od hodowli w celu monitorowania zanieczyszczenia (krzyżowego) i ustalenia progu OD wskazującego na brak wzrostu kultury.
2. Ustal obróbkę termiczną: Użycie termomikserów pozwala na ustalenie wielu metod obróbki temperaturowej. W tym przypadku należy zastosować następujące zabiegi temperaturowe: stała 75 °C, stała 65 °C i stopniowe obniżanie z 75-65 °C poprzez obniżanie temperatury o 1 °C co 4 dni ("leczenie spadkiem temperatury").
   UWAGA: Zabiegi te mogą być dostosowane do konkretnych wymagań eksperymentalnych. Do każdej obróbki temperaturowej wymagany jest oddzielny termomikser.
3. Dzień 1: Ożywić populacje przodków z ich zapasów glicerolu (przygotowanych w kroku 4.5) zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 2.
4. Dzień 3:
   1. Rozcieńczyć te kultury do OD_{600 nm} 0,01 (mierzonego za pomocą spektrofotometru) do całkowitej objętości co najmniej 6 ml wstępnie podgrzanego BBM⁺. Podwielokrotność 1,5 ml z każdej z siedmiu rozcieńczonych kultur populacji przodków do trzech oddzielnych probówek z przekłutymi 2 ml, po jednej dla każdej obróbki termicznej ustalonej w kroku 5.2.
      UWAGA: Ten etap porcjowania zapewnia, że wszelka zmienność genetyczna obecna w każdej populacji przodków jest obecna we wszystkich zabiegach termicznych na początku eksperymentu ewolucyjnego. Kultury te będą działać jako transfer 0 (Tx0), aby rozpocząć eksperyment ewolucji temperatury.
   2. Uszczelnij rurki oddychającą membraną i umieść każdy zestaw siedmiu populacji przodków w oddzielnych termomikserach. Ustaw każdy termomikser na wymaganą temperaturę i 400 obr./min, aby rozpocząć eksperyment ewolucji.
5. Dzień 5:
   1. Po 48 godzinach przeprowadzić transfer 1 (Tx1) poprzez zaszczepienie 1,5 ml podgrzanej pożywki BBM⁺ w przebitej probówce o pojemności 2 ml z 15 μl kultury z każdej z kultur Tx0 (rozcieńczenie 1:100). Aby uzyskać szybkość, wykonaj ten krok za pomocą pipety wielokanałowej o zmiennej szerokości, aby wykonać wiele transferów z jednego eksperymentu jednocześnie, skracając czas wyjmowania kultur z termomiksera.
   2. Tak jak poprzednio, uszczelnij rurki przed umieszczeniem ich z powrotem w losowych pozycjach w odpowiednich termomikserach. Przeprowadź randomizację ręcznie lub za pomocą randomizatorów iMetaLab 96 well.
6. Zmierz OD_600nm Tx0 w spektrofotometrze płytkowym (200 μl w płytkach 96-dołkowych; ta sama objętość BBM⁺ jest używana jako ślepa próba), aby śledzić wzrost niezależnych linii.
   UWAGA: OD_600nm należy zmierzyć po przeniesieniu do świeżego medium, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Gęstość optyczną można również mierzyć innymi metodami, na przykład za pomocą standardowego spektrofotometru. Zastosowanie spektrofotometru opartego na płytkach umożliwia jednoczesny pomiar wielu kultur, usprawniając proces.
7. Powtórz kroki 5.5 i 5.6 w dniach 7, 9, 11 itd., odpowiadających Tx2, Tx3, Tx4 itd. Utrzymuj stałą temperaturę dla zabiegów 75 °C i 65 °C. W przypadku obróbki spadku temperatury należy zmniejszać temperaturę o 1 °C co drugi transfer (tj. na Tx2, Tx4, Tx6 itd.).
8. Przygotuj zapasy glicerolu (krok 3.2.3) populacji po każdym 10. transferze (tj. Tx10, Tx20 itd.), oznaczając probówkę identyfikatorem populacji przodków (np. SA1 dla 1. niezależnej populacji) i numerem transferu (np. Tx10 dla 10. transferu). Użyj tych zapasów glicerolu później, aby ożywić populacje w celu zbadania, jak populacje zmieniały się w czasie lub wznowienia eksperymentu, jeśli jest to wymagane (np. z powodu zanieczyszczenia lub nieoczekiwanych incydentów skutkujących utratą kultur).
9. Niech eksperyment będzie przebiegał albo przez z góry określoną liczbę transferów, albo do upływu z góry określonej liczby pokoleń. Przy ostatecznym transferze przygotuj zapasy glicerolu wszystkich linii potomnych.
   UWAGA: W tym przypadku eksperyment trwał do momentu, gdy obróbka spadkiem temperatury osiągnęła 65 °C, co miało miejsce na Tx22. Odpowiada to około 150 pokoleniom (obliczonym na podstawie współczynnika rozcieńczenia 100 do 4.6: log₂(100) = 6,64 pokolenia na transfer). Długość eksperymentów ewolucyjnych może być dostosowana do wymagań eksperymentalnych.

6. Testy wzrostu w eksperymencie postewolucyjnym: linie przodków kontra ewolucja.

UWAGA: Diagram koncepcyjny przedstawiający protokół testu wzrostu/sprawności jest podany w Rysunek 2.

1. Przygotuj przekłute probówki o pojemności 2 ml z 1,5 ml BBM⁺. Przygotuj wystarczającą ilość probówek, aby wyhodować wszystkie linie potomne oraz każdy ze szczepów przodków.
2. Ożywić populacje przodków i każdą populację potomną przechowywaną w kroku 5.9 po końcowym przeniesieniu doświadczenia ewolucyjnego przy użyciu metody opisanej w krokach 2.2-2.5, ale z inkubacją w temperaturze, której każda populacja doświadczyła podczas dwóch ostatnich transferów w doświadczeniu ewolucji, tj. 75 °C dla stałego traktowania w temperaturze 75 °C, i 65 °C dla doświadczeń przy stałej 65 °C i spadku temperatury. Aby osiągnąć porównywalną gęstość zaludnienia, należy przeprowadzić inkubację w temperaturze 75 °C przez 72 godziny, a inkubację w temperaturze 65 °C przez 120 godzin.
3. Zmierz OD_{600 nm} wyhodowanych kultur za pomocą spektrofotometru na płytce.
4. Przeprowadzić testy wzrostu każdej populacji potomnej i każdego szczepu przodków w obu temperaturach (tj. 75 °C i 65 °C) w trzech powtórzeniach. Przygotować przebite probówki wirówkowe o pojemności 2 ml z 1,5 ml BBM⁺. Przygotuj sześć probówek dla każdej wyewoluowanej linii i każdego szczepu przodków. Oznacz probówki nazwą linii produkcyjnej (SA1-7 lub przodek), temperaturą wzrostu (75 °C lub 65 °C) i identyfikatorem repliki (1, 2 lub 3).
   UWAGA: Jeśli dostępnych jest mniej niż sześć termomikserów, test wzrostu można powielać przez wiele dni w kilku blokach eksperymentalnych. W tym przypadku ważne jest, aby zmierzyć każdą linię i przodka w każdym bloku eksperymentalnym, aby można było oszacować i uwzględnić efekty blokowe statystycznie.
5. Zaszczepić świeżą pożywkę w sześciu przygotowanych probówkach 15 μl kultury z każdej linii potomnej i szczepu przodków.
6. Ustawić trzy termomiksery na 75 °C i trzy termomiksery na 65 °C, oznaczając każdy termomikser do identyfikatora repliki. Umieścić probówki w termomikserze odpowiadające temperaturze i powtórzyć ID. W każdym termomikserze upewnij się, że linie i przodkowie są losowo rozmieszczeni w celu kontroli niejednorodności.
7. Uszczelnij każdy zestaw 24 probówek przepuszczalną membraną. Inkubować przez 48 godzin.
8. Przenieś 200 μl z każdej kultury do 96-dołkowej płytki. Zmierz OD_600nm za pomocą spektrofotometru.
   UWAGA: Pipeta wielokanałowa o zmiennej szerokości może być używana w celu ułatwienia przenoszenia między probówkami mikrowirówkowymi a płytkami 96-dołkowymi.
9. Kreśl i analizuj dane za pomocą oprogramowania statystycznego (np. R).

7. Sekwencjonowanie całego genomu wyewoluowanych linii genetycznych i identyfikacja mutacji

1. Reanimować linie potomne przechowywane w kroku 5.9 we wstępnie podgrzanym BBM⁺ w temperaturze 75 °C przez 48-72 godzin, zaszczepiając odrobinę lodu z każdej zamrożonej populacji do BBM⁺, jak w sekcji 2, kroki 2.2-2.5. Przygotuj od 1 do 10 ml objętości hodowli, aby uzyskać wystarczającą ilość genomowego DNA. Dokładna wymagana wolumin zależy od opcji wybranej do sekwencjonowania w krokach 7.2 lub 7.3 (poniżej).
   UWAGA: Dobrą praktyką jest również sekwencjonowanie szczepu użytego do zainicjowania populacji przodków. Ma to na celu prawidłowe określenie, czy jakiekolwiek mutacje wykryte w liniach potomnych powstały podczas eksperymentu ewolucyjnego, a nie wcześniej.
2. (Opcja 1) Ekstrakcja genomowego DNA i przygotowanie bibliotek sekwencjonowania Illumina do sekwencjonowania Illumina.
   1. Ekstrakcja i oczyszczanie genomowego DNA za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji genomowego DNA dla bakterii.
   2. Upewnij się, że wyekstrahowane genomowe DNA spełnia wymagania ilościowe i jakościowe dostawcy sekwencjonowania, używając komercyjnych zestawów zalecanych przez dostawcę.
   3. Wykonaj przygotowanie biblioteki genomowego DNA przy użyciu komercyjnego zestawu zgodnie z protokołem producenta. Zalecany jest protokół sparowanego końca 250 bp. Wyekstrahowane genomowe DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie ono gotowe do przekazania próbek dostawcy sekwencjonowania.
3. (Opcja 2) Alternatywnie, wyślij próbki do komercyjnego dostawcy, który przeprowadza ekstrakcję DNA, kontrole jakości genomowego DNA, przygotowanie biblioteki Illumina i sekwencjonowanie Illumina jako usługę łączoną.
4. Analizuj zsekwencjonowane genomy w celu identyfikacji mutacji.
   1. Odbieraj pliki FASTQ i, jeśli nie zostało to jeszcze wykonane przez dostawcę sekwencjonowania, wykonaj przycinanie adaptera za pomocą Trimmomatic z odcięciem jakości okna przesuwnego Q15.
   2. Korzystając z przyciętych plików FASTQ, uruchom potok breseq (wersja 0.38.1) w celu wykrycia mutacji, porównując odczyty genomowego DNA z sekwencją referencyjną dla wybranego szczepu. W przypadku S. acidocaldarius DSM639 jest to RefSeq ID NC_007181.

8. (Opcjonalnie) Ocena zużycia energii przez termomikser w porównaniu z inkubatorem

1. Aby porównać zużycie energii podczas korzystania z inkubatora i termomiksera do wzrostu, zmierz zużycie energii przez każde urządzenie w ciągu 24 godzin za pomocą wtyczki do monitorowania energii.
2. Użyj dwóch wtyczek, aby zmierzyć zużycie energii przez oba urządzenia w tym samym czasie. Alternatywnie mierz zużycie energii w kolejnych dniach.
3. Odłącz inkubator lub termomikser od gniazdka elektrycznego. Podłącz wtyczkę monitorowania energii do gniazdka i zainicjuj ją zgodnie z instrukcjami producenta, łącznie z instalacją oprogramowania do monitorowania i sterowania.
4. Podłącz inkubator lub termomikser do wtyczki monitorowania energii i pozwól mu pracować przez co najmniej 2 godziny (ale najlepiej przez 24 godziny lub dłużej), aby uzyskać dobre oszacowanie typowego zużycia energii. Rejestruj zużycie energii przez każde urządzenie.

Wyniki

Pomiary krzywej wzrostu
Krzywe wzrostu S. acidocaldarius DSM639 pokazano na Rysunek 3A. Stwierdzono, że wzrost jest podobny, porównując inkubację przy użyciu termomieszalników z inkubatorami konwencjonalnymi. Parametry średniej szybkości wzrostu oszacowano, dopasowując krzywą logistyczną do każdej powtórzonej krzywej wzrostu i obliczając błąd średni i standardowy. Czasy do środkowej fazy wykładniczej na termomikserze i inkubatorze wynosiły odpowiednio 27,2 h ± 1,1 h i 31,1 h ± 1,9 h. Szacowane początkowe czasy podwajania dla termomiksera i inkubatora w temperaturze 75 °C wynosiły odpowiednio 4,29 h ± 0,28 h i 4,19 h ± 0,44 h, co jest zgodne z wcześniej publikowanymi wartościami²⁴. Zależność między logarytmem₁₀ (OD_{600 nm}) a logarytmem₁₀ (CFU) została dobrze scharakteryzowana przez model liniowy (skorygowany R² = 0,82, F(1,22) = 104, p < 0,00001, nachylenie = 1,73 ± 0,17, punkt przecięcia = 9,73 ± 0,14). Zależność między OD_600nm a CFU jest zatem określona wzorem CFU = 10^{(1,73 × log10(OD600nm) + 9,73).} OD_{600 nm} 0,3 odpowiada zatem około 6,7 × 10⁸ CFU/ml (Rysunek 3B).

Eksperyment z ewolucją temperatury
Trzy warunki temperaturowe, stała 75 °C, stała 65 °C i spadek temperatury (75-65 °C, zmniejszający się o 1 °C co dwa transfery), zostały zainicjowane przy użyciu siedmiu niezależnych linii wywodzących się od S. acidocaldarius DSM639. Pomiary OD_{600 nm} zostały wykonane po każdym transferze w ciągu 45 dni eksperymentu (około 150 pokoleń w temperaturze 75 °C) i są pokazane na Rysunek 4. Pomiary OD_{600 nm} wykonywane w ciągu dni są z natury hałaśliwe, ponieważ mogą podlegać subtelnym różnicom, na przykład w okresie wzrostu, temperaturze itp. Jednak pomiary wykonane w ciągu dni mogą być nadal przydatne do oceny żywotności populacji, a także dać wskazówkę, czy sprawność poprawia się z czasem. Linie od stałego warunku 75 °C wzrosły w OD_{600 nm} z początkowego zakresu 0,125-0,3 do zakresu 0,248-0,471 pod koniec eksperymentu. Sugeruje to, że sprawność fizyczna poprawiła się dzięki temu zabiegowi. Natomiast linie ze stałego leczenia w temperaturze 65 °C wykazywały spadek OD_{600 nm}, z początkowego zakresu 0,018-0,087 do 0,008-0,04 w końcowym punkcie czasowym. Sugeruje to, że populacje nie były w stanie przystosować się do stałej temperatury 65 °C, chociaż fakt, że organizmy zdolne do życia mogły zostać odzyskane, pokazuje, że populacje nie zostały wypłukane przez kolejne rozcieńczenia, co sugeruje pewien stopień adaptacji. Wreszcie, populacje w leczeniu spadkiem temperatury wzrosły z początkowego zakresu OD_{600 nm} wynoszącego 0,099-0,279 do 0,3-0,39 w Tx6 (co odpowiada 288 godzinom i 73 °C w tym zabiegu), po czym nastąpił stały spadek do zakresu 0,003-0,024 w końcowym punkcie czasowym.

Testy wzrostu/sprawności
Testy dopasowania przeprowadzono dla każdej populacji potomków po eksperymentach ewolucyjnych. OD_{600 nm} oznaczono po 48 godzinach wzrostu dla wszystkich siedmiu niezależnych linii, a następnie dopasowano modele liniowe w R dla każdej temperatury testu, z "środowiskiem selekcji" jako głównym efektem i "replikat/termomikser" jako efektem blokowym. Wzrost szczepu przodków został wykorzystany jako poziom odniesienia dla kontrastów leczenia. Dane są pokazane w Rysunek 5.

Gdy testowano w temperaturze 75 °C, zaobserwowano średnio znaczący wzrost dopasowania w stosunku do szczepu przodków dla linii ze stałej 75 °C (test t: t₂₁₀=3,64, p=0,0003) i stałej 65 °C (test t: t₂₁₀=2,8, p=0,005), ale nie z leczenia spadkiem temperatury (test t: t₂₁₀=-0,87, p=0,38). Podczas oznaczania w temperaturze 65 °C, średnio, linie ze wszystkich metod leczenia wykazywały wzrost dopasowania (stałe linie o temperaturze 75 °C; test t: t₂₁₀=4,68, p<0,0001, stałe linie 65 °C; Test t: t₂₁₀,=4,24, p<0,0001, linie spadku temperatury; Test t: t₂₁₀ = 3,15, p = 0,002). Jednak w przypadku obu temperatur testu wystąpiły znaczne różnice między liniami pod względem ich dopasowania (Ryc. 5). Niektóre linie nie różniły się znacząco od rodowodu lub miały słabsze przystosowanie; Było to szczególnie widoczne w przypadku linii pochodzących z leczenia spadkiem temperatury.

Warto zauważyć, że związek między OD_600nm a CFU/mL mógł ulec zmianie podczas eksperymentu ewolucyjnego. Można to ocenić, określając parametry wzrostu dla wyewoluowanych linii (następujące kroki 3.1-3.10).

Wyniki sekwencjonowania całego genomu
Analizę całego genomu przeprowadzono przy użyciu breseq (wersja 0.38.1)²⁵ na siedmiu liniach od stałego warunku 75 °C przy użyciu genomu referencyjnego S. acidocaldarius DSM639 (akces RefSeq NC_007181.1). Ujawniono różnorodne mutacje obejmujące insercje, delecje i polimorfizm pojedynczego nukleotydu (SNP) w genomach wszystkich linii potomnych (Tabela 2). Wielokrotne mutacje insercyjne i niesynonimiczne występowały w genach kodujących białka, a także w regionach międzygenowych, które mogą wpływać na ekspresję genów z powodu przesunięć ramki w regionach promotorowych genów. Niektóre z mutacji były spójne w wielu liniach potomnych w genach zaangażowanych w różne funkcje, takie jak biosynteza ściany komórkowej, transkrypcja, metabolizm, transport komórkowy i aktywność katalityczna (Tabela 2). Wśród tych mutacji była duża delecja 54 667 par zasad w pięciu z siedmiu linii; Zostało to potwierdzone przez wykres brakujących dowodów pokrycia dla każdej populacji (częstość waha się od 93,2% do 100%). Usunięty region jest równoznaczny z utratą 53 genów; Rola tych genów w adaptacji zostanie zbadana w przyszłych badaniach. Stwierdzono pewne różnice między zastosowanym izolatem DSM639 a opublikowaną sekwencją referencyjną (przedstawioną w tabeli uzupełniającej 1).

Zużycie energii przez inkubator z wytrząsaniem w porównaniu z termomikserem
Zużycie energii przez inkubator z wytrząsaniem porównano z termomikserem przy użyciu dostępnej na rynku inteligentnej wtyczki do monitorowania energii w zakresie typowych temperatur inkubacji i temperatury 75 °C stosowanej w tym przypadku. W temperaturze 75 °C termomikser zużywał około 1/40 energii tradycyjnego inkubatora z wytrząsaniem (Rysunek 6), co sugeruje termomiksery jako potencjalny sposób na zmniejszenie śladu węglowego związanego z ewolucją eksperymentalną.

Rysunek 1: Schemat blokowy ilustrujący protokół eksperymentu ewolucyjnego w trzech temperaturach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Schemat blokowy ilustrujący etapy protokołu testu wzrostu/sprawności. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Określenie kluczowych parametrów wzrostu i porównanie urządzeń do inkubacji dla S. acidocaldarius DSM639. Trzy powtórzone kultury hodowano w temperaturze 75 °C w 7 oddzielnych probówkach. Do pomiaru (A) OD_600nm (oznacza ± błąd standardowy n=3 kontrprób technicznych; niektóre słupki błędów są mniejsze niż symbole na wykresie); krzywe reprezentują dopasowane logistyczne modele wzrostu i (B) jednostki tworzące kolonie (CFU); reprezentują dopasowane modele regresji liniowej logarytmicznej). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki dla gęstości optycznej (OD_600nm) uzyskane podczas eksperymentów ewolucyjnych. Gęstości optyczne niezależnych linii genetycznych zmierzone podczas eksperymentów ewolucyjnych w trzech temperaturach (stała 65 °C, stała 75 °C, spadek 75 °C-65 °C) prowadzonych przez około 150 pokoleń. Krzywe przedstawiają wygładzenia lessu w czasie dla każdej niezależnej linii. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Reprezentatywne wyniki dla testów wzrostu. Testy wzrostu dla niezależnych linii wywodzących się od S. acidocaldarius DSM639 po eksperymentach z ewolucją temperatury (stała 65 °C, stała 75 °C, spadek 75 °C-65 °C) w porównaniu ze szczepem przodka. Dla wszystkich linii wzrost oznaczano w temperaturze 65 °C i 75 °C. Kolorowe punkty pokazują średni błąd standardowy ± powtórzeń technicznych (pokazanych na szaro, n = 12 dla przodka i n = 3 dla każdej wyewoluowanej linii). Szary pasek oznacza średni ± błąd standardowy dopasowania przodków. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Zużycie energii przez tradycyjne inkubatory w porównaniu z urządzeniami termomiksującymi. Zużycie energii było rejestrowane za pomocą dostępnej na rynku inteligentnej wtyczki do monitorowania energii przez 2 godziny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

Tabela 1: Receptury pożywek i roztwory podstawowe wymagane do uprawy S. acidocaldarius. Wszystkie pożywki i roztwory podstawowe powinny być wykonane z podwójnie destylowanego_H2O(ddH₂O), a następnie wysterylizowane przez autoklawowanie lub sterylizację filtrem przez filtr 0,22 μm, jak wskazano. Proszę zapoznać się z sekcją 1 protokołu w celu uzyskania szczegółowego opisu sposobu przygotowania wszystkich pożywek i roztworów podstawowych. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Reprezentatywne wyniki dla sekwencjonowania całego genomu linii potomnych. Mutacje znalezione w liniach potomnych wywodzących się od S. acidocaldarius DSM639 ze stałej obróbki w temperaturze 75 °C. Mutacje wskazują na zmiany w stosunku do bezpośredniego przodka linii, który posiada kilka zmian w stosunku do sekwencji referencyjnej dla S. acidocaldarius DSM639 (RefSeq NC_007181; mutacje u przodka przedstawiono w Tabeli Uzupełniającej 1). n wskazuje liczbę linii, w których stwierdzono mutację. → gen na "ramce odczytu do przodu"; ← gen w "ramce odczytu wstecznego". †Zmiany te są względne w stosunku do przesunięcia ramki ramki (A)10→11 obecnego w izolacie S. acidocaldarius DSM639 (Tabela uzupełniająca 1). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 1: Mutacje obecne w izolacie S. acidocaldarius DSM639 w stosunku do sekwencji referencyjnej (akces RefSeq NC_007181.1). → gen na "ramce odczytu do przodu"; ← gen w "ramce odczytu wstecznego". ‡SACI_RS04020 jest opisany jako pseudogen w NC_007181.1, ale obserwowana tutaj mutacja przesunięcia ramki Δ1 bp przypuszczalnie przywraca jego funkcję, tak jak w przypadku mutacji, koduje białko o 100% identyczności z genem odwrotnej gyrazy rgy (akcesium RefSeq WP_176586667.1). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W ramach tych prac opracowano eksperymentalny protokół ewolucji termofilów, tutaj dostosowany do archeonów S. acidocaldarius, ale zdolny do adaptacji do innych mikroorganizmów o wysokich wymaganiach dotyczących wzrostu. Protokół ten opiera się na technikach pierwotnie zaprojektowanych dla bakterii mezofilnych, ale jest specjalnie zmodyfikowany w celu przezwyciężenia wyzwań technicznych związanych z wysokotemperaturowym wzrostem tlenowym 2,4,5,24. Stworzenie tej metody umożliwi zbadanie wcześniej niescharakteryzowanej dynamiki ewolucyjnej, która zachodzi w ekstremalnych warunkach temperaturowych, przypominających warunki, które potencjalnie istniały na najwcześniejszych etapach ewolucji życia¹.

Istnieje kilka krytycznych aspektów protokołu, których należy przestrzegać, aby uzyskać wiarygodne wyniki eksperymentów ewolucyjnych. Pierwszą z nich jest niezależność między liniami, którą osiąga się poprzez rozpędzanie się do pojedynczych kolonii przed rozpoczęciem eksperymentu. Jest to konieczne, aby zapewnić, że wszelkie powszechne mutacje znalezione w oddzielnych liniach mają niezależne pochodzenie. Jeśli zamiast tego w celu zainicjowania linii zostanie poddanych masowej hodowli płynnej, wspólne warianty genetyczne mogą zostać rozdystrybuowane do każdej populacji. Drugą kluczową kwestią jest kontrola zanieczyszczenia, którą osiąga się poprzez utrzymanie kontroli ujemnej wolnej od hodowli i monitorowanie wzrostu. W przeciwieństwie do eksperymentów z mezofilami, jest mało prawdopodobne, aby eksperymenty ewolucji ekstremofilów zostały skażone źródłami zewnętrznymi, ale zanieczyszczenie krzyżowe między liniami może nadal wystąpić. Utrzymanie równowagi między napowietrzaniem a parowaniem jest kolejną kluczową kwestią. S.acidocaldarius jest obowiązkowym tlenowcem i dlatego potrzebuje tlenu do wzrostu^10,23. Ręczne przebijanie polipropylenowych probówek do mikrowirówek i uszczelnianie ich membraną przepuszczającą gaz^21,25 było kluczem do utrzymania napowietrzania bez nadmiernego parowania. Zmniejszenie to można prawdopodobnie przypisać zachowaniu jednolitego środowiska w zamkniętych probówkach (dane nie pokazane).

Dwa aspekty metody mogą wymagać dostosowania lub rozwiązywania problemów w zależności od szczególnych warunków środowiskowych wykorzystanych w doświadczeniu ewolucyjnym: współczynnik rozcieńczenia i czas między transferami. W tej metodzie rozcieńczanie 1:100 wykonywano przy każdym transferze, co wymagało średniej logarytmu₂ (100) = 6,64 podwojenia, aby powrócić do tej samej wielkości populacji. Zapewnia to dobrą równowagę między potencjałem adaptacji (optymalny współczynnik rozcieńczenia jest obliczany przez Wahla i Gerrisha²⁶) a wykonalnością eksperymentalną. Zasadniczo silny współczynnik rozcieńczenia umożliwiłby pojawienie się większej liczby pokoleń dziennie, ponieważ wymaga większej liczby podwojeń, aby powrócić do tej samej gęstości zaludnienia (np. 1:1000 wymaga logarytmu₂(1000) = średnio 9,97 podwojeń). Jeśli jednak zostanie osiągnięta mniejsza liczba podwojeń niż jest to wymagane między transferami, populacje będą stopniowo wypłukiwane przez rozcieńczenie, chyba że wystąpi korzystna mutacja, która skraca czas podwojenia. w przypadku populacji przenoszonych co 48 godzin, wymagane jest, aby czasy podwojenia były krótsze niż 8 godzin, co jest zgodne z szacowanym czasem podwojenia i poprzednio opublikowanymi wartościami wzrostu heterotroficznego S. acidocaldarius w temperaturze 75 °C (4–6 godzin)^23,27. Jednak stopniowy spadek OD_{600 nm} w czasie dla stałych zabiegów w temperaturze 65 °C i spadku temperatury sugeruje, że może to nie być wystarczająco długi czas, aby osiągnąć wymaganą liczbę podwojeń i że korzystny byłby dłuższy okres transferu.

Zwrócono uwagę na kilka ważnych zalet stosowania termomikserów w porównaniu z tradycyjnymi inkubatorami z wytrząsaniem do ewolucji eksperymentalnej, szczególnie podczas badań nad adaptacją do temperatury. Termomiksery stanowią ekonomiczną alternatywę dla inkubatorów z wytrząsaniem, a dodatkową zaletą jest zmniejszona powierzchnia zajmowana przez hakerów. Cechy te umożliwiają efektywną ocenę wielu równoległych zabiegów termicznych. Termomiksery wykazują również niższe zużycie energii niż inkubatory z wytrząsaniem, więc ich zastosowanie może potencjalnie zmniejszyć wpływ na środowisko, gdy inkubowana jest niewielka liczba probówek (np. mniej niż 100). Ta rozbieżność w zużyciu energii jest szczególnie widoczna w temperaturach istotnych dla termofilów, ale ma również zastosowanie w spektrum bardziej umiarkowanych zakresów temperatur (ryc. 6), co oznacza, że termomiksery mogą być również stosowane w celu zmniejszenia wpływu eksperymentalnej ewolucji mezofilów na środowisko. Łącznie cechy te sugerują, że zastosowanie termomikserów w ewolucji eksperymentalnej może potencjalnie poprawić dostępność tej metodologii badawczej, szczególnie w środowiskach o ograniczonych zasobach, takich jak laboratoria w krajach rozwijających się oraz w szkolnictwie podstawowym i średnim.

Pomimo zapewnienia drogi naprzód dla eksperymentalnej ewolucji termofilnej, obecna metoda ma pewne ograniczenia w stosunku do eksperymentalnej ewolucji mezofilnej. Po pierwsze, liczba replikowanych niezależnych linii, które można ustalić za pomocą termomieszalników, jest niewielka w porównaniu z metodami wysokoprzepustowymi obejmującymi płytki mikromiareczkowe, które są szeroko stosowane w przypadku mezofilów⁴. Parowanie w wysokich temperaturach wyklucza obecnie stosowanie płytek mikromiareczkowych w oknie czasowym wymaganym do osiągnięcia wykładniczego wzrostu. Po drugie, oszacowanie kluczowych parametrów krzywej wzrostu, takich jak tempo wzrostu, czas podwojenia i czas opóźnienia, jest trudne, ponieważ spektrofotometry płytkowe, które mogą pracować w wysokich temperaturach (>45 °C), nie są obecnie dostępne w sprzedaży. Dzięki opisanej tutaj metodzie charakterystyka krzywej wzrostu wymaga obecnie pracochłonnego pobierania próbek niszczących, a tym samym ogranicza przepustowość. Wreszcie, wysokoprzepustowe techniki oceny konkurencyjności adaptowanych izolatów nie są jeszcze w pełni opracowane dla termofilów. W szczególności opracowanie termostabilnego białka fluorescencyjnego, które można wykorzystać do różnicowania szczepów, umożliwiłoby wysokoprzepustowe testy dopasowania oparte na cytometrii przepływowej^28,29; Ostatnie odkrycia termostabilnych białek fluorescencyjnych o różnych widmach wskazują na potencjalny przyszły rozwój 30,31,32. Zwiększenie przepustowości jest logicznym kolejnym krokiem w kierunku dalszego rozwoju eksperymentalnych technik ewolucji termofilów, ponieważ umożliwi pełniejsze opisanie procesów ewolucyjnych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,22 &m; m Filtry membranowe napędzane strzykawką	StarLab	E4780-1226	Do filtrowania elementów mediów sterylizujących, które nie mogą być sterylizowane w autoklawie.
1 μ Pętle inokulacyjne L	Greiner	731161, 731165 lub 731101	Do zaszczepiania kultur. Można użyć innych pętli.
1000 μ L końcówki do pipet	StarLab	S1111-6811	Można używać innych końcówek do pipet.
Probówki do mikrowirówek 2 ml	StarLab	S1620-2700	Do hodowli S. acidocaldarius w termomikserach.
200 μ L końcówki do pipet	StarLab	S1111-0816	Można używać innych końcówek do pipet.
Probówki polistyrenowe o pojemności 50 ml ze stożkowym dnem	Corning	430828 lub 430829	Można stosować inne probówki. Sprawdź wydajność w temperaturze 75 stopni C. Rurki z zaślepkami uszczelniającymi mogą nie pozwalać na wystarczające napowietrzenie; Sprawdź przed użyciem.
Strzykawka 50 ml	BD plastipak	300865	Do stosowania z filtrami napędzanymi strzykawką.
96-dołkowe płytki do mikromiareczkowania (niepoddane obróbce, z płaskim dnem)	NUNC	260860	Do pomiaru średnicy zewnętrznej przy 600 nm w spektrofotometrze.
Pipeta wielokanałowa o regulowanej szerokości	Pipet-Lite	LA8-300XLS	Opcjonalnie, ale oszczędza czas podczas przenoszenia między mikrowirówką a płytkami 96-dołkowymi.
Siarczan amonu ((NH4)2SO4)	Milipore	168355	Dla podstawowego roztworu Brocka I.
Autoklaw	Priorclave	B60-SMART lub SV100-BASE	Można również stosować inne autoklawy.
Membrana uszczelniająca przepuszczająca gaz Breathe-EASY	Sigma-Aldrich	Z763624-100EA	Przycięta na wymiar do stosowania na przebitych probówkach do mikrowirówek. W przypadku zastępowania innych przepuszczalnych dla gazów memrbanów, upewnij się, że wydajność jest odpowiednia przy 75 & deg; C
Dwuwodny chlorek wapnia (CaCl2· 2H2O)	Sigma-Aldrich	C3306	Dla podstawowego roztworu Brocka I.
CELLSTAR Płytki sześciodołkowe (zawiesinowe/niepoddane obróbce)	Greiner	M9062	Prawdopodobnie można zastąpić płytki sześciodołkowe innych producentów. Sprawdź wydajność w wysokich temperaturach.
Siarczan kobaltu(II) siedmiowodny (CoSO4· 7H2O)	Supelco	1025560100	Do roztworu podstawowego pierwiastków śladowych.
Chlorek miedzi(II) dwuwodny (CuCl2· 2H2O)	Sigma-Aldrich	307483	Do roztworu podstawowego pierwiastków śladowych.
D-(+)-glukoza bezwodna (C6H12O6)	Thermo Scientific Chemicals	11462858	Można również stosować inne cukry pentozowe i heksozowe (np. D-ksyloza, D-arabinoza). Glukoza nie jest preferowanym źródłem węgla dla S. acidocaldarius (SV Albers, komunikacja osobista)
Woda podwójnie destylowana (ddH2O)
Gelrite	Duchefa Biochemie	G1101.1000	Gelrite (guma gellan) jest stosowany zamiast agaru do wytwarzania pożywek stałych ze względu na wyższą temperaturę topnienia.
Szklane szalki Petriego 100 mm	Marka	BR455742	Szklane szalki Petriego są używane, ponieważ większość standardowych polistyrenowych szalek Petriego 90 mm odkształca się przy 75 & stopni; C (zależne od marki). Alternatywnie można użyć płytek sześciodołkowych, ponieważ nie odkształcają się one w wysokich temperaturach.
Inkubator	New Brunswick	Innnova 42R	Można również korzystać z innych inkubatorów. Sprawdź temperaturę roboczą sprzętu przed zakupem/użyciem, ponieważ wiele inkubatorów nie jest w stanie pracować w temperaturach wyższych niż 65 stopni C.
Chlorek żelaza(III) sześciowodny (FeCl3· 6H2O)	Supelco	103943	Do roztworu podstawowego Fe
Siarczan magnezu siedmiowodny (sól Epsom) (MgSO4· 7H2O)	Sigma-Aldrich	230391	Dla podstawowego roztworu Brocka I.
Tetrahydrat chlorku manganu(II) (MnCl2· 4H2O)	Sigma-Aldrich	SIALM5005-100G	Do roztworu podstawowego pierwiastków śladowych.
Mini inteligentne gniazdo Wi-Fi, monitorowanie energii	Tapo	Tapo P110	Do monitorowania zużycia energii
N-Z-Amine A - Hydrolizat enzymatyczny kazeiny	Sigma-Aldrich	C0626-500G	N-Z-Amine-A jest stosowany jako źródło aminokwasów.
Spinacz do papieru (lub inny wytrzymały drut)	brak		Do przekłuwania probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml.
Diwodorofosforan potasu (fosforan monopotasowy) (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P0662	Dla podstawowego roztworu Brocka I.
Zestaw do oczyszczania genomowego DNA Promega Wizard	Promega	A1120	Opcjonalnie, do ekstrakcji genomowego DNA w laboratorium
Dwuwodny dihydrat molibdenianu sodu (Na2MoO4· 2H2O)	Sigma-Aldrich	M1651-100G	Do roztworu podstawowego pierwiastków śladowych.
Dekahydrat tetraboranu sodu (boraks) (Na2B4O7· 10H2O)	Sigma-Aldrich	S9640	Do roztworu podstawowego pierwiastków śladowych.
Spektrofotometr	BMG	SPECTROstar OMEGA	Do pomiaru średnicy zewnętrznej przy 600 nm. Można stosować inne spektrofotometry, które mogą odczytywać OD przy 600 nm.
Kwas siarkowy (rozcieńczony wodą w stosunku 1:1) (H2SO4)	Thermo Scientific Chemicals	11337588	Służy do dostosowania pH roztworu podstawowego Brock II/III do końcowego pH 2–3.
Thermomixer	DLab	HM100-Pro	Można również stosować inne termomiksery; kluczową kwestią jest zdolność do utrzymania 65– 75 stopni Celsjusza; Temperatury C i 400 RPM
Uracyl (C4H4N2O2)	Sigma-Aldrich	U0750	Delecja pyrE jest powszechnym markerem genetycznym stosowanym w S. acidocaldarius. Szczepy deleczujące muszą być uzupełnione uracylem dla wzrostu. Suplementacja nie jest ściśle wymagana dla szczepu typu dzikiego DSM639, ale jest tutaj uwzględniona, ponieważ przyszłe eksperymenty mogą obejmować szczepy delecji.
Dwuwodny siarczan wanadylu (VOSO4· 2H2O)	Sigma-Aldrich	204862	Do roztworu podstawowego pierwiastków śladowych.
Siarczan siedmiowodny (ZnSO4· 7H2O)	Sigma-Aldrich	221376	Do roztworu podstawowego pierwiastków śladowych.