Artykuł metodologiczny

Adaptacja w ekstremalnych warunkach życia: eksperymentalna ewolucja z ekstremofilem archeonem Sulfolobus acidocaldarius

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66271

⸱

14 czerwca 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Evolution, Infection and Genomics, School of Biological Sciences, The University of Manchester, 2Division of Pharmacy and Optometry, School of Health Sciences, The University of Manchester, 3Department of Earth and Environmental Sciences, School of Natural Sciences, The University of Manchester

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy eksperymentalny protokół ewolucji do adaptacji u termofilów, wykorzystując tanie, energooszczędne termomiksery stołowe jako inkubatory. Technika ta została zademonstrowana poprzez scharakteryzowanie adaptacji do temperatury u Sulfolobus acidocaldarius, archeonu o optymalnej temperaturze wzrostu 75 °C.

Streszczenie

Archeon Sulfolobus acidocaldarius okazał się obiecującym modelowym systemem ciepłolubnym. Zbadanie, w jaki sposób termofile przystosowują się do zmieniających się temperatur, jest kluczowym wymogiem, nie tylko dla zrozumienia podstawowych procesów ewolucyjnych, ale także dla opracowania S. acidocaldarius jako podstawy dla bioinżynierii. Jedną z głównych przeszkód w przeprowadzaniu eksperymentalnej ewolucji z udziałem termofilów są koszty konserwacji sprzętu i zużycia energii przez tradycyjne inkubatory do wzrostu w wysokich temperaturach. Aby sprostać temu wyzwaniu, przedstawiono kompleksowy protokół eksperymentalny do przeprowadzenia eksperymentalnej ewolucji u S. acidocaldarius, wykorzystujący tanie i energooszczędne termomiksery laboratoryjne. Protokół obejmuje technikę hodowli okresowej o stosunkowo małych objętościach (1,5 ml), co umożliwia śledzenie adaptacji w wielu niezależnych liniach. Metoda ta jest łatwo skalowalna dzięki zastosowaniu dodatkowych termomikserów. Takie podejście zwiększa dostępność S. acidocaldarius jako systemu modelowego, zmniejszając zarówno początkowe inwestycje, jak i bieżące koszty związane z badaniami eksperymentalnymi. Co więcej, technikę tę można przenieść do innych systemów mikrobiologicznych w celu zbadania adaptacji do różnych warunków środowiskowych.

Wprowadzenie

Wczesne życie na Ziemi mogło powstać w ekstremalnych środowiskach, takich jak kominy hydrotermalne, które charakteryzują się ekstremalnie wysokimi temperaturami i kwasowością1. Mikroorganizmy nadal zamieszkują ekstremalne środowiska, w tym gorące źródła i wulkaniczne solfatara. Scharakteryzowanie dynamiki ewolucyjnej, która zachodzi w tych ekstremalnych warunkach, może rzucić światło na wyspecjalizowane procesy fizjologiczne, które umożliwiają przetrwanie w tych warunkach. Może to mieć daleko idące implikacje, począwszy od zrozumienia początków różnorodności biologicznej, a skończywszy na opracowaniu nowych enzymów wysokotemperaturowych o zastosowaniach biotechnologicznych.

Zrozumienie dynamiki ewolucji mikroorganizmów w ekstremalnych środowiskach pozostaje ograniczone, pomimo jej krytycznego znaczenia. W przeciwieństwie do tego, znaczna część wiedzy na temat ewolucji w środowiskach mezofilnych została zdobyta dzięki zastosowaniu techniki znanej jako ewolucja eksperymentalna. Ewolucja eksperymentalna polega na obserwacji zmian ewolucyjnych w warunkach laboratoryjnych2,3,4,5. Często wiąże się to ze zdefiniowanym środowiskiem zmiany (np. temperatura, zasolenie, wprowadzenie toksyny lub organizmu konkurencyjnego)7,8,9. W połączeniu z sekwencjonowaniem całego genomu, ewolucja eksperymentalna umożliwiła nam przetestowanie kluczowych aspektów procesów ewolucyjnych, w tym równoległości, powtarzalności i genomicznych podstaw adaptacji. Jednak do tej pory większość eksperymentalnych ewolucji przeprowadzono na mikroorganizmach mezofilnych (w tym bakteriach, grzybach i wirusach2,3,4,5, ale w dużej mierze z wyłączeniem archeonów). Metoda ewolucji eksperymentalnej zastosowana do mikroorganizmów ciepłolubnych pozwoliłaby nam lepiej zrozumieć, w jaki sposób ewoluują i przyczyniłaby się do pełniejszego zrozumienia ewolucji. Ma to potencjalnie daleko idące implikacje, od rozszyfrowania początków życia ciepłolubnego na Ziemi po zastosowania biotechnologiczne obejmujące 'ekstremozymy' używane w bioprocesach wysokotemperaturowych10 i badania astrobiologiczne11.

Archeon Sulfolobus acidocaldarius jest idealnym kandydatem na organizm modelowy do rozwoju eksperymentalnych technik ewolucji dla termofilów. S. acidocaldarius rozmnaża się tlenowo, z optymalną temperaturą wzrostu na poziomie 75 °C (zakres od 55 °C do 85 °C) i wysoką kwasowością (pH 2-3)4,6,12,13,14. Co ciekawe, pomimo ekstremalnych warunków wzrostu, S. acidocaldarius utrzymuje gęstość populacji i tempo mutacji porównywalne z mezophiles7,15,16,17,18. Ponadto posiada stosunkowo mały, dobrze opisany genom (szczep DSM639: 2,2 Mb, 36,7% GC, 2,347 genów)12; S. acidocaldarius korzysta również z solidnych narzędzi inżynierii genomu, które pozwalają na bezpośrednią ocenę procesu ewolucyjnego za pomocą ukierunkowanych nokautów genów19. Godnym uwagi przykładem tego jest dostępność genetycznie zmodyfikowanych szczepów S. acidocaldarius, takich jak auksotroficzne szczepy uracylu MW00119 i SK-120, które mogą służyć jako markery do wyboru.

Istnieją poważne wyzwania związane z przeprowadzaniem eksperymentalnej ewolucji z termofilami, takimi jak S. acidocaldarius. Przedłużona inkubacja w wysokich temperaturach wymagana do tych badań wymusza znaczne parowanie zarówno w przypadku technik hodowli płynnej, jak i stałej. Przedłużona praca w wysokich temperaturach może również uszkodzić tradycyjne inkubatory z wytrząsaniem, które są powszechnie stosowane w ewolucji eksperymentalnej w płynnych mediach. Badanie wielu temperatur wymaga znacznych inwestycji finansowych w zakup i utrzymanie kilku inkubatorów. Ponadto wysokie zużycie energii budzi poważne obawy dotyczące środowiska i finansów.

Ta praca wprowadza metodę rozwiązywania problemów napotkanych podczas przeprowadzania eksperymentalnej ewolucji z termofilami, takimi jak S. acidocaldarius. Opierając się na technice opracowanej przez Baesa i in. do badania reakcji na szok cieplny14,21, opracowana tutaj metoda wykorzystuje termomiksery laboratoryjne do spójnej i niezawodnej inkubacji w wysokiej temperaturze. Jego skalowalność pozwala na jednoczesną ocenę wielu zabiegów termicznych, przy jednoczesnym obniżeniu kosztów zakupu dodatkowego sprzętu do inkubacji. Zwiększa to wydajność eksperymentów, umożliwiając solidną analizę statystyczną i szeroko zakrojone badanie czynników wpływających na dynamikę ewolucji u termofilów22. Co więcej, takie podejście znacznie zmniejsza początkową inwestycję finansową i zużycie energii w porównaniu z tradycyjnymi inkubatorami, oferując bardziej zrównoważoną i przyjazną dla środowiska alternatywę.

Nasza metoda stanowi podstawę do eksperymentalnego badania dynamiki ewolucyjnej w środowiskach charakteryzujących się ekstremalnymi temperaturami, które mogły odegrać kluczową rolę we wczesnych etapach różnicowania się życia na Ziemi. Organizmy ciepłolubne mają unikalne właściwości, ale ich ekstremalne warunki wzrostu i specjalistyczne wymagania często ograniczały ich dostępność jako systemu modelowego. Pokonanie tych barier nie tylko rozszerza możliwości badawcze w zakresie badania dynamiki ewolucyjnej, ale także zwiększa szerszą użyteczność termofilów jako systemów modelowych w badaniach naukowych.

Protokół

1. Przygotowanie podłoża wzrostu S. acidocaldarius (BBM+)

UWAGA: Do uprawy S. acidocaldarius, ten protokół używa Basal Brock Medium (BBM+)23. Przygotowuje się to poprzez połączenie nieorganicznych roztworów podstawowych opisanych poniżej w celu utworzenia BBM−, który może być przygotowany z wyprzedzeniem. BBM+ jest następnie przygotowywany w razie potrzeby poprzez dodanie organicznych roztworów podstawowych do BBM−. Receptury roztworów podstawowych są również przedstawione w Tabeli 1. Wszystkie podłoża i roztwory podstawowe powinny być przygotowane w podwójnie destylowanymH2O(ddH2O).

  1. Przygotowanie nieorganicznych roztworów podstawowych do pożywki wzrostowej
    1. Przygotować roztwór podstawowy pierwiastków śladowych.
      1. Przygotować roztwór podstawowy pierwiastków śladowych, dodając 9 g/l dekahydratu tetraboranu sodu (Na2B4O7·10H2O) do ddH2O, a następnie dodając kroplami 1:1 H2SO4 aż do rozpuszczenia.
      2. Wprowadzić kolejno 0,44 g/L siedmiowodnego siarczanu (ZnSO4·7H2O), 0,1 g/L dwuwodnego chlorku miedzi(II) (CuCl2·2H2O), 0,06 g/L dwuwodnego molibdenianu sodu (Na2MoO4·2H2O), 0,06 g/L dwuwodnego siarczanu wanadu(IV) (VOSO4,2H 2O), 0,02 g/l siedmiowodnego siarczanu kobaltu(II) (CoSO4·7H2O) i 3,6 g/l czterowodnego chlorku manganu(II) (MnCl2·4H2O). Roztwór należy sterylizować w autoklawie i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotować roztwór podstawowy Fe (1000x) rozpuszczając 20 g/l sześciowodnego chlorku żelaza (FeCl3·6H2O) wddH2O. Wysterylizować roztwór, filtrując przez filtr 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    3. Przygotować roztwór Brocka I (1000x) rozpuszczając 70 g/l chlorku wapnia (CaCl2·2H2O) w wodzie podwójnie destylowanej (ddH2O). Autoklaw i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Rozpuszczanie CaCl2·2H2O w wodzie jest procesem egzotermicznym. Wykonaj ten krok ostrożnie. Nosić rękawice chroniące przed zagrożeniem termicznym zgodnie z normą EN407 w celu ochrony przed obrażeniami. Nie zamykaj szczelnie naczynia, ponieważ może wzrosnąć ciśnienie.
    4. Przygotować roztwór Brocka II/III, łącząc 130 g/l siarczanu amonu ((NH4)2SO4), 25 g/l siedmiowodnego siarczanu magnezu (MgSO4·7H2O), 28 g/l diwodorofosforanu potasu (KH2PO4) i 50 ml uprzednio przygotowanego roztworu podstawowego pierwiastków śladowych. Stosując 1:1 H2SO4 dostosuj pH roztworu podstawowego do 2-3. Roztwór należy sterylizować w autoklawie i przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).
  2. Przygotowanie organicznych roztworów podstawowych do pożywki wzrostowej
    1. Przygotować roztwór podstawowy D-glukozy (100x), rozpuszczając 300 g/l (30% w/v) D-glukozy w ddH2O i sterylizować filtrem (przez filtr 0,22 μm). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Inne źródła węgla mogą być stosowane zamiast D-glukozy zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi (np. D-ksyloza).
    2. Przygotować pepton z roztworu podstawowego kazeiny (100x), rozpuszczając pepton z kazeiny w stężeniu 100 g/l w ddH2O. Autoklaw w celu sterylizacji i przechowywania roztworu podstawowego w temperaturze pokojowej.
    3. Przygotować roztwór podstawowy uracylu (100x) rozpuszczając 2 g/l uracylu w ddH2O i sterylizować filtrem (przez filtr 0,22 μm); przechowywać w temperaturze -20 °C.
  3. Przygotowanie pożywki wzrostowej BBM+ o stężeniu roboczym 1x
    1. Najpierw przygotuj 988 ml sterylnego ddH2O przez autoklawowanie.
    2. Przygotować 1 l BBM−, dodając 1 ml roztworu podstawowego Brocka I, 10 ml roztworu podstawowego Brocka II/III i 1 ml roztworu podstawowego Fe do 988 ml sterylnego ddH2O uprzednio autoklawowanego. Dostosować pH podłoża do zakresu 2-3 za pomocą 1:1 H2SO4,
      UWAGA: BBM− można wykonać z wyprzedzeniem i przechowywać w RT przez okres do 1 miesiąca.
    3. Na koniec, aby wyprodukować 1 l BBM+, połącz po 10 ml roztworu podstawowego D-glukozy, peptonu z roztworu podstawowego kazeiny i roztworu podstawowego uracylu z 985 ml BBM−. Dobrze wymieszaj i dostosuj pH podłoża do 2-3 z 1:1 H2SO4,
      UWAGA: BBM+ powinien być świeżo przygotowany, zgodnie z wymaganiami.
  4. Przygotowanie stałego podłoża BBM+
    1. Przygotować 1 M roztwory podstawowe MgCl2 i CaCl2; pomogą one w krzepnięciu stałego podłoża BBM. Dla 1 M MgCl2 dodać 9,5 g do 100 ml ddH2O. Dla 1 M CaCl2 dodać 11 g do 100 ml ddH2O. Autoklaw do sterylizacji.
      UWAGA: Rozpuszczanie CaCl2·2H2O w wodzie jest procesem egzotermicznym. Wykonaj ten krok ostrożnie. Nosić rękawice chroniące przed zagrożeniem termicznym zgodnie z normą EN407 w celu ochrony przed obrażeniami. Nie zamykaj szczelnie naczynia, ponieważ może wzrosnąć ciśnienie.
    2. Wymieszaj 3% (w/v) gumy gellan (np. 30 g/L) z ddH2O i autoklaw do sterylizacji.
      UWAGA: Guma gellanowa (np. Gelrite) jest tutaj stosowana jako środek żelujący, ponieważ standardowy agar bakteriologiczny nie może krzepnąć w temperaturze 75 °C.
    3. Oddzielnie przygotować BBM+ na stałe podłoże, które należy wymieszać w stosunku 1:1 ze sterylną gumą gellan przygotowaną w kroku 1.4.1.
      1. Najpierw przygotuj 1 l BBM− jak w kroku 1.3.2. Połączyć 887 ml BBM− z 1 ml roztworu podstawowego Fe i po 20 ml roztworu podstawowego D-glukozy, peptonu z roztworu podstawowego kazeiny i roztworu podstawowego uracylu.
      2. Dodać 40 ml 1 M MgCl2 i 12 ml 1 M CaCl2. Dobrze wymieszaj i dostosuj pH podłoża do 2-3 z 1:1 H2SO4,
        UWAGA: Objętości roztworów podstawowych dodanych w tym miejscu są celowo większe niż w przypadku przygotowania płynnego BBM+ w kroku 1.3. Ma to na celu uwzględnienie mieszania w stosunku 1:1 ze stopioną gumą gellan w następnym kroku.
    4. Rozgrzej BBM+ dla stałego podłoża do około 75 °C i wymieszaj w stosunku 1:1 ze stopioną gumą gellan w ddH2O. Dobrze wymieszaj i wlej do stabilnego termicznie tworzywa sztucznego (np. polipropylenu), szklanych szalek Petriego lub sześciodołkowych płytek do wzrostuS. acidocaldarius. Użyj agaru natychmiast po zmiksowaniu, ponieważ szybko stwardnieje.
      UWAGA: Niektóre polistyrenowe szalki Petriego o średnicy 90 mm powszechnie stosowane w mikrobiologii odkształcają się, jeśli są inkubowane w wysokich temperaturach przez dłuższy czas.
      UWAGA: Podejmij odpowiednie środki ostrożności podczas pracy z gorącymi płynami; nosić rękawice chroniące przed zagrożeniem termicznym zgodne z normą EN407 w celu ochrony przed obrażeniami.

2. Przywracanie S. acidocaldarius z hodowli w zamrażarce

  1. Przygotowanie wentylowanych rurek wzrostowych w celu zapewnienia wystarczającego napowietrzenia i dostępności tlenu.
    1. Wcześniej przygotuj przebite probówki mikrowirówkowe o pojemności 2 ml do wzrostu Sulfolobus. Ostrożnie podgrzej drut (>0,7 mm, taki jak wyprostowany spinacz do papieru) za pomocą płomienia palnika Bunsena i przebij pokrywę rurki, tworząc mały otwór o średnicy około 1 mm.
    2. Umieść przekłute probówki w naczyniu nadającym się do sterylizacji w autoklawie (np. pustym pudełku na końcówki do pipet) i autoklawie do sterylizacji.
      UWAGA: Nosić rękawice chroniące przed zagrożeniem termicznym zgodne z normą EN407, aby chronić dłonie przed obrażeniami termicznymi spowodowanymi rozgrzanym metalem. Podgrzewaj drut tylko przez krótki czas (1-2 s), aby zapobiec przegrzaniu. Należy stosować wyłącznie metale o wysokiej temperaturze topnienia (stal).
  2. Zaszczepić kultury starterowe S. acidocaldarius.
    1. Napełnić autoklawowane, przekłute probówki o pojemności 2 ml 1,5 ml wstępnie podgrzanego BBM+ (przygotowanego w sekcji 1, wstępnie inkubowanego w temperaturze 75 °C przez co najmniej 15 minut).
    2. Zaszczepić probówki wypełnione BBM+ skrobakiem (co odpowiada 50 - 60 mg) z glicerolu (25% v/v glicerolu, przechowywanego w temperaturze -80 °C). Tutaj stosowany jest szczep S. acidocaldarius DSM639. Napełnij dodatkową probówkę 1,5 ml BBM+ jako kontrolę ujemną.
  3. Aby zapobiec wydostawaniu się aerozoli z przebitej wieczka probówki o pojemności 2 ml i zanieczyszczeniu środowiska wzrostu (i wszelkich innych próbek) oraz w celu zmniejszenia zmienności parowania kultur w probówkach, należy umieścić membranę przepuszczającą gaz na pokrywie, która wytrzyma podwyższone temperatury (65-85 °C) i zablokuje ucieczkę/infiltrację drobnoustrojów.
    UWAGA: Zastosowanie membran gazoprzepuszczalnych do uszczelniania rur znacznie zmniejsza parowanie. W okresie 48 godzin w temperaturze 75 °C zamknięte probówki wykazują średni ubytek objętości wynoszący 8,63% (zakres: 3,29-16,45%, n = 24 kontrpróby techniczne, powtórzone dwukrotnie), w przeciwieństwie do 25,05% (zakres: 11,92-62,91%, n = 24 kontrpróby techniczne, powtórzone dwukrotnie) dla probówek nieuszczelnionych.
  4. Inkubować zaszczepione probówki w termomikserze w temperaturze 75 °C ze stałym wytrząsaniem przy 400 obrotach na minutę (RPM) przez 48-72 godzin lub do osiągnięcia OD600nm 0,3 - 0,8, jak zmierzono za pomocą spektrofotometru.
    UWAGA: Przebita pokrywka probówek o pojemności 2 ml i potrząsanie umożliwiają odpowiednie napowietrzenie w celu optymalnego wzrostu. Pokrywa termomiksera powinna być na swoim miejscu, aby zapewnić utrzymanie stałej temperatury i zmniejszyć parowanie.
  5. Po okresie inkubacji należy nadać ożywionym kulturom drugą fazę wzrostu (kondycjonowanie wstępne).
    1. Osadzaj kultury, obracając probówki o sile 5000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Następnie wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad komórek w świeżym, ciepłym 1,5 ml BBM+.
      UWAGA: W tym eksperymencie wykorzystano szczep S. acidocaldarius typu dzikiego DSM639, ale te metody wzrostu i ewolucji eksperymentalnej można zastosować do dowolnego szczepu Sulfolobus i potencjalnie innych termofilów.

3. Określanie gęstości populacji, czasu podwojenia i fazy wykładniczego wzrostu S. acidocaldarius

  1. Określ gęstość populacji i czas do fazy wzrostu wykładniczego dla wybranych warunków selekcji. Dla każdego badanego stanu środowiska należy przygotować trzy kultury starterowe, wykonując kroki 2.1-2.5.
  2. Rozcieńczyć trzy kultury w BBM+ do OD600 nm 0,01. Przygotuj co najmniej 20 ml z każdej kultury. Te trzy kultury reprezentują repliki techniczne.
  3. Wykonaj powtórzone krzywe wzrostu OD600 nm w czasie, korzystając z destrukcyjnego próbkowania.
    1. Przygotuj 24 przebite probówki o pojemności 2 ml z kroku 2.1, podziel je na trzy zestawy po osiem i oznacz te kontrpróby techniczne jako 1, 2 i 3 (np. osiem probówek oznaczonych jako powtórzenie 1 itd.).
    2. Z każdej z trzech rozcieńczonych kultur z kroku 3.2 odpipetować pipetą 1,5 ml do siedmiu przygotowanych probówek. Napełnij pozostałą probówkę 1,5 ml BBM+ jako kontrolę ujemną.
  4. Inkubować wszystkie 24 probówki w termomikserze w temperaturze 75 °C i 400 obr./min. Uszczelnić membraną przepuszczającą gaz. W regularnych odstępach czasu (np. 0, 4, 8, 12, 24, 36, 48 godzin) wyjąć po jednej probówce z każdej z trzech kontrprób i zmierzyć OD600 nm za pomocą spektrofotometru, a następnie wyrzucić probówkę. Wymień membranę przepuszczającą gaz po wyjęciu rurki.
  5. Równolegle określ związek między OD600nm a gęstością zaludnienia. Wykonaj seryjne rozcieńczenia (1 x 10-1 do 1 x 10-6) w pożywce BBM+ przez co najmniej trzy punkty czasowe (najlepiej początek, środek i koniec). Zaszczepić 100 μl każdego rozcieńczenia na stałym podłożu BBM+ (przygotowanym jak w kroku 1.4).
    UWAGA: Aby osiągnąć stały wzrost kolonii i dokładne zliczanie, najlepiej jest pipetować rozcieńczoną kulturę na stałe podłoże w miejscu bez wykonywania mechanicznego rozprowadzania, takiego jak rozsiewacz w kształcie litery L lub szklanych kulek. Wydaje się, że mechaniczne rozsiewanie niekorzystnie wpływa na tworzenie kolonii.
  6. Inkubować płytki w inkubatorze statycznym w temperaturze 75 °C aż do pojawienia się kolonii (5-7 dni).
    1. W tym czasie utrzymuj inkubator w wilgoci, aby uniknąć nadmiernego wysuszenia płytek, w przeciwnym razie kolonie nie powstaną.
    2. Osiągnij to, umieszczając talerze w zamkniętym pudełku polipropylenowym wyłożonym wilgotną szmatką. Przebij pokrywę pudełka co najmniej trzy razy, aby umożliwić napowietrzenie.
    3. Umieść wiadra z wodą w inkubatorze, aby zwiększyć wilgotność. Codziennie napełniaj wiadra.
  7. Po zebraniu wszystkich pomiarów OD600nm określ czas podwojenia i czas osiągnięcia fazy wzrostu wykładniczego, dopasowując krzywą logistyczną do relacji między OD600nm a czasem, np. za pomocą SummarizeGrowth z pakietu growthcurver w R.
  8. Gdy widoczne kolonie uformują się na pożywkach stałych, policz jednostki tworzące kolonie (CFU), dążąc do zliczenia od współczynnika rozcieńczenia, tworząc 50-100 kolonii w celu uzyskania najlepszej dokładności.
  9. Obliczyć gęstość komórek w pożywce hodowlanej, korzystając ze wzoru: jtk/ml = liczba kolonii/(objętość posiana × współczynnik rozcieńczenia).
  10. Wykonaj regresję liniową logarytmiczną, aby określić zależność między log10 (CFU) a log10 (OD600 nm). W związku z tym oblicz przewidywaną CFU/ml dla danego OD od nachylenia i punktu przecięcia modelu regresji: przewidywany CFU = 10[nachylenie × log10(OD600nm) + przecięcie].
  11. (Opcjonalnie) Należy również wykonać kroki 3.1-3.10 w inkubatorze z wytrząsaniem, aby określić, czy w termomieszalnikach osiągany jest porównywalny wzrost.

4. Inicjacja niezależnych linii dla eksperymentalnej ewolucji

  1. Dzień 1: Aby wygenerować pojedyncze kolonie, najpierw wykonaj wszystkie kroki opisane w sekcji 2 powyżej, aby wygenerować początkową hodowlę.
  2. Dzień 3: Zmierz OD600 nm hodowli, aby upewnić się, że osiągnęła wystarczającą gęstość w fazie wykładniczej (OD600 nm 0,3-0,8 za pomocą spektrofotometru).
  3. Stworzyć seryjne rozcieńczenia kultury S. acidocaldarius DSM639 z 1 x 10-1-1 x 10-6 i rozprowadzić 100 μl z każdego rozcieńczenia 1 x 10-5 i 1 x 10-6 do studzienek 6-dołkowej płytki zawierającej stałe podłoże BBM+ (sekcja 1 i tabela 1) w kilku powtórzeniach. Inkubować płytki w temperaturze 75 °C w inkubatorze statycznym, jak w kroku 3.5, przez 5-7 dni, aby wyłoniły się pojedyncze kolonie.
  4. Dzień 8-10 (5-7 dni po inkubacji):
    1. Ustal liczbę ewoluujących linii z pojedynczych kolonii. Dla każdej linii wybierz losowo jedną kolonię z płytek za pomocą pętli inokulacyjnej. Ponownie zawiesić kolonię w przekłutej probówce o pojemności 2 ml zawierającej 1,5 ml wstępnie podgrzanej pożywki BBM+. Odpowiednio oznacz rurkę.
    2. Powtórz tę czynność dla żądanej liczby linii; tutaj ustalono siedem linii i oznaczono je jako SA1-7. Napełnij dodatkową probówkę 1,5 ml BBM+ jako kontrolę ujemną.
    3. Uszczelnić górne części probówek oddychającą membraną i inkubować w termomikserze w temperaturze 75 °C, 400 obr./min przez 48-72 godziny, aż kultury staną się mętne (co odpowiada OD600 nm 0,3-0,8 za pomocą spektrofotometru).
  5. Dzień 10-12 (7-9 dni po szczepieniu):
    1. W wirówce stołowej wirować kultury klonalne w temperaturze 5 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad za pomocą 200 μl płynnego BBM+.
    2. Zmieszaj 200 μl zawiesin komórkowych z 200 μl 50% glicerolu (25% v/v glicerolu), aby stworzyć zapasy glicerolu siedmiu niezależnych linii i przechowywać w temperaturze -80 °C. Są to populacje przodków dla eksperymentów ewolucyjnych.

5. Przeprowadzanie eksperymentu z ewolucją temperatury

UWAGA: Diagram koncepcyjny przedstawiający główne aspekty protokołu eksperymentu znajduje się w Rysunek 1.

  1. Użyj siedmiu populacji przodków wygenerowanych w sekcji 4 do eksperymentu ewolucyjnego.
    1. Wszystkie eksperymentalne testy ewolucji przeprowadzić w sterylnych, przebitych probówkach o pojemności 2 ml uszczelnionych przepuszczalną membraną (opisaną powyżej, sekcja 2).
    2. Wraz z tymi populacjami należy utrzymywać oddzielne probówki z przekłutymi 2 ml z 1,5 ml BBM+ jako kontrole ujemne wolne od hodowli w celu monitorowania zanieczyszczenia (krzyżowego) i ustalenia progu OD wskazującego na brak wzrostu kultury.
  2. Ustal obróbkę termiczną: Użycie termomikserów pozwala na ustalenie wielu metod obróbki temperaturowej. W tym przypadku należy zastosować następujące zabiegi temperaturowe: stała 75 °C, stała 65 °C i stopniowe obniżanie z 75-65 °C poprzez obniżanie temperatury o 1 °C co 4 dni ("leczenie spadkiem temperatury").
    UWAGA: Zabiegi te mogą być dostosowane do konkretnych wymagań eksperymentalnych. Do każdej obróbki temperaturowej wymagany jest oddzielny termomikser.
  3. Dzień 1: Ożywić populacje przodków z ich zapasów glicerolu (przygotowanych w kroku 4.5) zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 2.
  4. Dzień 3:
    1. Rozcieńczyć te kultury do OD600 nm 0,01 (mierzonego za pomocą spektrofotometru) do całkowitej objętości co najmniej 6 ml wstępnie podgrzanego BBM+. Podwielokrotność 1,5 ml z każdej z siedmiu rozcieńczonych kultur populacji przodków do trzech oddzielnych probówek z przekłutymi 2 ml, po jednej dla każdej obróbki termicznej ustalonej w kroku 5.2.
      UWAGA: Ten etap porcjowania zapewnia, że wszelka zmienność genetyczna obecna w każdej populacji przodków jest obecna we wszystkich zabiegach termicznych na początku eksperymentu ewolucyjnego. Kultury te będą działać jako transfer 0 (Tx0), aby rozpocząć eksperyment ewolucji temperatury.
    2. Uszczelnij rurki oddychającą membraną i umieść każdy zestaw siedmiu populacji przodków w oddzielnych termomikserach. Ustaw każdy termomikser na wymaganą temperaturę i 400 obr./min, aby rozpocząć eksperyment ewolucji.
  5. Dzień 5:
    1. Po 48 godzinach przeprowadzić transfer 1 (Tx1) poprzez zaszczepienie 1,5 ml podgrzanej pożywki BBM+ w przebitej probówce o pojemności 2 ml z 15 μl kultury z każdej z kultur Tx0 (rozcieńczenie 1:100). Aby uzyskać szybkość, wykonaj ten krok za pomocą pipety wielokanałowej o zmiennej szerokości, aby wykonać wiele transferów z jednego eksperymentu jednocześnie, skracając czas wyjmowania kultur z termomiksera.
    2. Tak jak poprzednio, uszczelnij rurki przed umieszczeniem ich z powrotem w losowych pozycjach w odpowiednich termomikserach. Przeprowadź randomizację ręcznie lub za pomocą randomizatorów iMetaLab 96 well.
  6. Zmierz OD600nm Tx0 w spektrofotometrze płytkowym (200 μl w płytkach 96-dołkowych; ta sama objętość BBM+ jest używana jako ślepa próba), aby śledzić wzrost niezależnych linii.
    UWAGA: OD600nm należy zmierzyć po przeniesieniu do świeżego medium, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Gęstość optyczną można również mierzyć innymi metodami, na przykład za pomocą standardowego spektrofotometru. Zastosowanie spektrofotometru opartego na płytkach umożliwia jednoczesny pomiar wielu kultur, usprawniając proces.
  7. Powtórz kroki 5.5 i 5.6 w dniach 7, 9, 11 itd., odpowiadających Tx2, Tx3, Tx4 itd. Utrzymuj stałą temperaturę dla zabiegów 75 °C i 65 °C. W przypadku obróbki spadku temperatury należy zmniejszać temperaturę o 1 °C co drugi transfer (tj. na Tx2, Tx4, Tx6 itd.).
  8. Przygotuj zapasy glicerolu (krok 3.2.3) populacji po każdym 10. transferze (tj. Tx10, Tx20 itd.), oznaczając probówkę identyfikatorem populacji przodków (np. SA1 dla 1. niezależnej populacji) i numerem transferu (np. Tx10 dla 10. transferu). Użyj tych zapasów glicerolu później, aby ożywić populacje w celu zbadania, jak populacje zmieniały się w czasie lub wznowienia eksperymentu, jeśli jest to wymagane (np. z powodu zanieczyszczenia lub nieoczekiwanych incydentów skutkujących utratą kultur).
  9. Niech eksperyment będzie przebiegał albo przez z góry określoną liczbę transferów, albo do upływu z góry określonej liczby pokoleń. Przy ostatecznym transferze przygotuj zapasy glicerolu wszystkich linii potomnych.
    UWAGA: W tym przypadku eksperyment trwał do momentu, gdy obróbka spadkiem temperatury osiągnęła 65 °C, co miało miejsce na Tx22. Odpowiada to około 150 pokoleniom (obliczonym na podstawie współczynnika rozcieńczenia 100 do 4.6: log2(100) = 6,64 pokolenia na transfer). Długość eksperymentów ewolucyjnych może być dostosowana do wymagań eksperymentalnych.

6. Testy wzrostu w eksperymencie postewolucyjnym: linie przodków kontra ewolucja.

UWAGA: Diagram koncepcyjny przedstawiający protokół testu wzrostu/sprawności jest podany w Rysunek 2.

  1. Przygotuj przekłute probówki o pojemności 2 ml z 1,5 ml BBM+. Przygotuj wystarczającą ilość probówek, aby wyhodować wszystkie linie potomne oraz każdy ze szczepów przodków.
  2. Ożywić populacje przodków i każdą populację potomną przechowywaną w kroku 5.9 po końcowym przeniesieniu doświadczenia ewolucyjnego przy użyciu metody opisanej w krokach 2.2-2.5, ale z inkubacją w temperaturze, której każda populacja doświadczyła podczas dwóch ostatnich transferów w doświadczeniu ewolucji, tj. 75 °C dla stałego traktowania w temperaturze 75 °C, i 65 °C dla doświadczeń przy stałej 65 °C i spadku temperatury. Aby osiągnąć porównywalną gęstość zaludnienia, należy przeprowadzić inkubację w temperaturze 75 °C przez 72 godziny, a inkubację w temperaturze 65 °C przez 120 godzin.
  3. Zmierz OD600 nm wyhodowanych kultur za pomocą spektrofotometru na płytce.
  4. Przeprowadzić testy wzrostu każdej populacji potomnej i każdego szczepu przodków w obu temperaturach (tj. 75 °C i 65 °C) w trzech powtórzeniach. Przygotować przebite probówki wirówkowe o pojemności 2 ml z 1,5 ml BBM+. Przygotuj sześć probówek dla każdej wyewoluowanej linii i każdego szczepu przodków. Oznacz probówki nazwą linii produkcyjnej (SA1-7 lub przodek), temperaturą wzrostu (75 °C lub 65 °C) i identyfikatorem repliki (1, 2 lub 3).
    UWAGA: Jeśli dostępnych jest mniej niż sześć termomikserów, test wzrostu można powielać przez wiele dni w kilku blokach eksperymentalnych. W tym przypadku ważne jest, aby zmierzyć każdą linię i przodka w każdym bloku eksperymentalnym, aby można było oszacować i uwzględnić efekty blokowe statystycznie.
  5. Zaszczepić świeżą pożywkę w sześciu przygotowanych probówkach 15 μl kultury z każdej linii potomnej i szczepu przodków.
  6. Ustawić trzy termomiksery na 75 °C i trzy termomiksery na 65 °C, oznaczając każdy termomikser do identyfikatora repliki. Umieścić probówki w termomikserze odpowiadające temperaturze i powtórzyć ID. W każdym termomikserze upewnij się, że linie i przodkowie są losowo rozmieszczeni w celu kontroli niejednorodności.
  7. Uszczelnij każdy zestaw 24 probówek przepuszczalną membraną. Inkubować przez 48 godzin.
  8. Przenieś 200 μl z każdej kultury do 96-dołkowej płytki. Zmierz OD600nm za pomocą spektrofotometru.
    UWAGA: Pipeta wielokanałowa o zmiennej szerokości może być używana w celu ułatwienia przenoszenia między probówkami mikrowirówkowymi a płytkami 96-dołkowymi.
  9. Kreśl i analizuj dane za pomocą oprogramowania statystycznego (np. R).

7. Sekwencjonowanie całego genomu wyewoluowanych linii genetycznych i identyfikacja mutacji

  1. Reanimować linie potomne przechowywane w kroku 5.9 we wstępnie podgrzanym BBM+ w temperaturze 75 °C przez 48-72 godzin, zaszczepiając odrobinę lodu z każdej zamrożonej populacji do BBM+, jak w sekcji 2, kroki 2.2-2.5. Przygotuj od 1 do 10 ml objętości hodowli, aby uzyskać wystarczającą ilość genomowego DNA. Dokładna wymagana wolumin zależy od opcji wybranej do sekwencjonowania w krokach 7.2 lub 7.3 (poniżej).
    UWAGA: Dobrą praktyką jest również sekwencjonowanie szczepu użytego do zainicjowania populacji przodków. Ma to na celu prawidłowe określenie, czy jakiekolwiek mutacje wykryte w liniach potomnych powstały podczas eksperymentu ewolucyjnego, a nie wcześniej.
  2. (Opcja 1) Ekstrakcja genomowego DNA i przygotowanie bibliotek sekwencjonowania Illumina do sekwencjonowania Illumina.
    1. Ekstrakcja i oczyszczanie genomowego DNA za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji genomowego DNA dla bakterii.
    2. Upewnij się, że wyekstrahowane genomowe DNA spełnia wymagania ilościowe i jakościowe dostawcy sekwencjonowania, używając komercyjnych zestawów zalecanych przez dostawcę.
    3. Wykonaj przygotowanie biblioteki genomowego DNA przy użyciu komercyjnego zestawu zgodnie z protokołem producenta. Zalecany jest protokół sparowanego końca 250 bp. Wyekstrahowane genomowe DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie ono gotowe do przekazania próbek dostawcy sekwencjonowania.
  3. (Opcja 2) Alternatywnie, wyślij próbki do komercyjnego dostawcy, który przeprowadza ekstrakcję DNA, kontrole jakości genomowego DNA, przygotowanie biblioteki Illumina i sekwencjonowanie Illumina jako usługę łączoną.
  4. Analizuj zsekwencjonowane genomy w celu identyfikacji mutacji.
    1. Odbieraj pliki FASTQ i, jeśli nie zostało to jeszcze wykonane przez dostawcę sekwencjonowania, wykonaj przycinanie adaptera za pomocą Trimmomatic z odcięciem jakości okna przesuwnego Q15.
    2. Korzystając z przyciętych plików FASTQ, uruchom potok breseq (wersja 0.38.1) w celu wykrycia mutacji, porównując odczyty genomowego DNA z sekwencją referencyjną dla wybranego szczepu. W przypadku S. acidocaldarius DSM639 jest to RefSeq ID NC_007181.

8. (Opcjonalnie) Ocena zużycia energii przez termomikser w porównaniu z inkubatorem

  1. Aby porównać zużycie energii podczas korzystania z inkubatora i termomiksera do wzrostu, zmierz zużycie energii przez każde urządzenie w ciągu 24 godzin za pomocą wtyczki do monitorowania energii.
  2. Użyj dwóch wtyczek, aby zmierzyć zużycie energii przez oba urządzenia w tym samym czasie. Alternatywnie mierz zużycie energii w kolejnych dniach.
  3. Odłącz inkubator lub termomikser od gniazdka elektrycznego. Podłącz wtyczkę monitorowania energii do gniazdka i zainicjuj ją zgodnie z instrukcjami producenta, łącznie z instalacją oprogramowania do monitorowania i sterowania.
  4. Podłącz inkubator lub termomikser do wtyczki monitorowania energii i pozwól mu pracować przez co najmniej 2 godziny (ale najlepiej przez 24 godziny lub dłużej), aby uzyskać dobre oszacowanie typowego zużycia energii. Rejestruj zużycie energii przez każde urządzenie.

Wyniki

Pomiary krzywej wzrostu
Krzywe wzrostu dla S. acidocaldarius DSM639 przedstawiono na Rysunku 3A. Stwierdzono, że wzrost był podobny przy porównaniu inkubacji z użyciem termomikserów do inkubacji w konwencjonalnych inkubatorach. Średnie parametry szybkości wzrostu oszacowano poprzez dopasowanie krzywej logistycznej do każdej powtórzonej krzywej wzrostu i obliczenie średniej oraz błędu standardowego. Czas do osiągnięcia środkowej fazy wykładniczej w termomikserze i inkubatorze wynosił odpowiednio 27,2 h ± 1,1 h oraz 31,1 h ± 1,9 h. Szacowany początkowy czas podwojenia dla termomiksera i inkubatora w temperaturze 75 °C wynosił odpowiednio 4,29 h ± 0,28 h i 4,19 h ± 0,44 h, co jest zgodne z wcześniej opublikowanymi wartościami24. Zależność między log10(OD600nm) a log10(CFU) została dobrze opisana modelem liniowym (skorygowane R2 = 0,82, F(1,22) = 104, p < 0,00001, nachylenie = 1,73 ± 0,17, punkt przecięcia = 9,73 ± 0,14). Zależność między OD600nm a CFU jest zatem określona wzorem CFU = 10(1,73 × log10(OD600nm) + 9,73). Wartość OD600nm równa 0,3 odpowiada zatem około 6,7 × 108 CFU/mL (Rysunek 3B).

Eksperyment ewolucji temperaturowej
Trzy warunki temperaturowe: stałe 75 °C, stałe 65 °C oraz spadek temperatury (75-65 °C, obniżanie o 1 °C co dwa transfery) zostały zainicjowane z wykorzystaniem siedmiu niezależnych linii pochodzących od S. acidocaldarius DSM639. Pomiary OD600nm były wykonywane po każdym transferze w ciągu 45 dni eksperymentu (około 150 generacji przy 75 °C) i są przedstawione na Rysunku 4. Pomiary OD600nm wykonywane w odstępach dobowych są z natury szumne, ponieważ mogą podlegać subtelnym różnicom np. w okresie wzrostu, temperaturze itp. Niemniej jednak pomiary dobowe mogą być nadal przydatne do oceny żywotności populacji, a także dawać wskazówkę, czy przystosowanie (fitness) poprawia się w czasie. Linie z warunku stałego 75 °C wykazały wzrost OD600nm z początkowego zakresu 0,125-0,3 do zakresu 0,248-0,471 pod koniec eksperymentu. Sugeruje to, że w tym wariancie nastąpiła poprawa przystosowania. W przeciwieństwie do tego, linie z warunku stałego 65 °C wykazały spadek OD600nm z początkowego zakresu 0,018-0,087 do 0,008-0,04 w końcowym punkcie czasowym. Sugeruje to, że populacje nie były w stanie zaadaptować się do stałej temperatury 65 °C, choć fakt, że udało się odzyskać żywe organizmy, wskazuje, że populacje nie zostały całkowicie usunięte w wyniku sukcesywnych rozcieńczeń, co sugeruje pewien stopień adaptacji. Wreszcie, populacje w wariancie spadku temperatury wzrosły z początkowego zakresu OD600nm 0,099-0,279 do 0,3-0,39 w Tx6 (odpowiadającym 288 h i 73 °C w tym wariancie), po czym nastąpił stały spadek do zakresu 0,003-0,024 w końcowym punkcie czasowym.

Analizy wzrostu/przystosowania
Analizy przystosowania przeprowadzono dla każdej populacji potomnej po zakończeniu eksperymentów ewolucyjnych. OD600nm zmierzono po 48 h wzrostu dla wszystkich siedmiu niezależnych linii, a następnie dopasowano modele liniowe w programie R dla każdej temperatury analizy, przyjmując „środowisko selekcyjne” jako efekt główny oraz „powtórzenie/termomikser” jako efekt blokowy. Wzrost szczepu przodka posłużył jako poziom referencyjny dla kontrastów traktowań. Dane przedstawiono na Rysunku 5.

Podczas analizy w 75 °C odnotowano średnio istotne wzrosty przystosowania w stosunku do szczepu przodka dla linii z grup poddanych stałej temperaturze 75 °C (t-test: t210=3.64, p=0.0003) oraz stałej temperaturze 65 °C (t-test: t210=2.8, p=0.005), natomiast nie zaobserwowano ich dla linii z grupy poddanej obniżeniu temperatury (t-test: t210=−0.87, p=0.38). Podczas analizy w 65 °C średnio wszystkie linie z każdej z grup wykazały wzrost przystosowania (linie ze stałej temperatury 75 °C; t-test: t210=4.68, p<0.0001, linie ze stałej temperatury 65 °C; t-test: t210,=4.24, p<0.0001, linie z obniżenia temperatury; t-test: t210=3.15, p=0.002). Jednakże dla obu temperatur analizy wystąpiły znaczne różnice w przystosowaniu poszczególnych linii (Rycina 5). Niektóre linie nie różniły się znacząco od szczepu przodka lub wykazały spadek przystosowania; było to szczególnie widoczne w przypadku linii z grupy poddanej obniżeniu temperatury.

Warto zauważyć, że zależność między OD600nm a CFU/mL mogła ulec zmianie w trakcie eksperymentu ewolucyjnego. Można to ocenić poprzez wyznaczenie parametrów wzrostu dla linii ewoluujących (zgodnie z krokami 3.1-3.10).

Wyniki sekwencjonowania całego genomu
Analizę całego genomu przeprowadzono przy użyciu programu breseq (wersja 0.38.1)25 dla siedmiu linii pochodzących z warunków stałej temperatury 75 °C, wykorzystując genom referencyjny S. acidocaldarius DSM639 (numer dostępu RefSeq NC_007181.1). W genomach wszystkich linii potomnych ujawniono różnorodne mutacje, w tym insercje, delecje oraz polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP) (Tabela 2). Liczne insercje i mutacje niesynonimiczne wystąpiły w genach kodujących białka, a także w regionach międzygenowych, co może wpływać na ekspresję genów ze względu na przesunięcia ramki odczytu w regionach promotorowych genów. Niektóre mutacje były spójne w wielu liniach potomnych w genach zaangażowanych w różne funkcje, takie jak biosynteza ściany komórkowej, transkrypcja, metabolizm, transport komórkowy oraz aktywność katalityczna (Tabela 2). Wśród tych mutacji znajdowała się duża delecja o długości 54 667 par zasad w pięciu z siedmiu linii; potwierdzono to za pomocą wykresu brakującego pokrycia (coverage evidence plot) dla każdej populacji (częstość od 93,2% do 100%). Usunięty region odpowiada utracie 53 genów; rola tych genów w adaptacji zostanie zbadana w przyszłych studiach. Zauważono pewne różnice między użytym izolatem DSM639 a opublikowaną sekwencją referencyjną (przedstawione w Tabeli uzupełniającej 1).

Zużycie energii w inkubatorze wytrząsowym w porównaniu z termomikserem
Zużycie energii przez inkubator z wytrząsaniem porównano z zużyciem energii przez termomikser, wykorzystując dostępną w handlu inteligentną wtyczkę do monitorowania energii w zakresie powszechnie stosowanych temperatur inkubacji oraz 75 °C temperatura zastosowana w tym przypadku. W 75 °Ctermomikser zużył około 1/40th energia tradycyjnego inkubatora z wytrząsarką (Rycina 6), co sugeruje, że termomiksery mogą stanowić potencjalny sposób na zmniejszenie śladu węglowego związanego z ewolucją eksperymentalną.

Schemat eksperymentu ewolucyjnego Sulfolobus acidocaldarius; etapy inkubacji, zmiany temperatury, zapasy glicerynowe.
Rycina 1: Schemat blokowy ilustrujący protokół eksperymentu ewolucyjnego w trzech wariantach temperatury. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat eksperymentu adaptacji temperaturowej; pomiar OD600, konfiguracja termomiksera, wzrost mikroorganizmów.
Rysunek 2: Schemat blokowy ilustrujący kolejne etapy protokołu badania wzrostu/sprawności (fitness assay). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres wzrostu bakterii, OD(600 nm) w funkcji czasu oraz CFU, porównujący metody z użyciem inkubatora i termomiksera.
Rysunek 3: Wyznaczenie kluczowych parametrów wzrostu i porównanie urządzeń inkubacyjnych dla S. acidocaldarius DSM639. Trzy powtórne kultury hodowano w temperaturze 75 °C w 7 oddzielnych probówkach. Do pomiarów zastosowano pobieranie próbek niszczących w celu oznaczenia (A) OD600nm (średnie ± błąd standardowy dla n=3 powtórzeń technicznych; niektóre słupki błędów są mniejsze niż symbole punktów; krzywe reprezentują dopasowane logistyczne modele wzrostu) oraz (B) jednostek tworzących kolonie (CFUs; linie reprezentują dopasowane log-log liniowe modele regresji). Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Wykres analizy wzrostu kultur bakteryjnych; gęstość optyczna w funkcji czasu w różnych temperaturach.
Rycina 4: Reprezentatywne wyniki gęstości optycznych (OD600nm) uzyskane podczas eksperymentów ewolucyjnych. Gęstości optyczne niezależnych linii mierzone podczas eksperymentów ewolucyjnych w trzech wariantach temperatury (stałe 65 °C, stałe 75 °C, spadek 75 °C-65 °C) przeprowadzonych przez około 150 pokoleń. Krzywe przedstawiają wygładzanie Loessa w czasie dla każdej niezależnej linii. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres wyników testów wzrostu przedstawiający OD przy 600 nm dla różnych linii i temperatur.
Rycina 5: Reprezentatywne wyniki testów wzrostu.Testy wzrostu dla niezależnych linii wywodzących się z S. acidocaldarius DSM639 po eksperymentach z ewolucją temperaturową (stałe 65 °C, stałe 75 °C, spadek 75 °C-65 °C) w porównaniu ze szczepem przodkiem. Dla wszystkich linii wzrost badano w 65 °C i 75 °C. Kolorowe punkty przedstawiają średnią ± błąd standardowy powtórzeń technicznych (zaznaczonych na szaro, n = 12 dla przodka i n = 3 dla każdej wyewoluowanej linii). Szary pasek oznacza średnią ± błąd standardowy przystosowania przodka. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres zużycia energii porównujący inkubator i thermomixer w zakresie temperatur, wynik eksperymentu.
Rysunek 6: Zużycie energii w tradycyjnym inkubatorze w porównaniu do urządzeń typu thermomixer. Zużycie energii rejestrowano przez 2 h przy użyciu dostępnej w handlu inteligentnej wtyczki do monitorowania energii. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 1: Składy pożywek i roztwory zapasowe wymagane do hodowli *S. acidocaldarius*. Wszystkie pożywki i roztwory zapasowe powinny być przygotowane w wodzie dwukrotnie destylowanej H2O (ddH2O)2O) a następnie sterylizowano w autoklawie lub poprzez filtrację przez 0.22 µm przefiltrować zgodnie z instrukcją. Szczegółowy opis przygotowania wszystkich pożywek i roztworów stokowych znajduje się w sekcji 1 protokołu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Reprezentatywne wyniki sekwencjonowania całego genomu linii potomnych. Mutacje znalezione w liniach potomnych wywodzących się z S. acidocaldarius DSM639 poddanych stałej temperaturze 75 °C. Mutacje wskazują zmiany w stosunku do bezpośredniego przodka linii, który posiada kilka zmian względem sekwencji referencyjnej dla S. acidocaldarius DSM639 (RefSeq NC_007181; mutacje u przodka przedstawiono w Tabeli uzupełniającej 1). n oznacza liczbę linii, w których znaleziono daną mutację. → gen w „ramce odczytu bezpośredniego”; ← gen w „ramce odczytu odwrotnej”. †Zmiany te są określone względem przesunięcia ramki odczytu (A)10→11 występującego w izolacie S. acidocaldarius DSM639 (Tabela uzupełniająca 1). Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 1: Mutacje obecne w izolacie S. acidocaldarius DSM639 w stosunku do sekwencji referencyjnej (numer dostępu RefSeq NC_007181.1). → gen w „ramce odczytu bezpośredniego”; ← gen w „ramce odczytu odwrotnego”. ‡SACI_RS04020 jest adnotowany jako pseudogen w NC_007181.1, lecz zaobserwowana tutaj mutacja przesunięcia ramki odczytu Δ1 bp prawdopodobnie przywraca jego funkcję, ponieważ wraz z mutacją koduje on białko o 100% identyczności z genem odwrotnej gyrazy rgy (numer dostępu RefSeq WP_176586667.1). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W ramach tych prac opracowano eksperymentalny protokół ewolucji termofilów, tutaj dostosowany do archeonów S. acidocaldarius, ale zdolny do adaptacji do innych mikroorganizmów o wysokich wymaganiach dotyczących wzrostu. Protokół ten opiera się na technikach pierwotnie zaprojektowanych dla bakterii mezofilnych, ale jest specjalnie zmodyfikowany w celu przezwyciężenia wyzwań technicznych związanych z wysokotemperaturowym wzrostem tlenowym 2,4,5,24. Stworzenie tej metody umożliwi zbadanie wcześniej niescharakteryzowanej dynamiki ewolucyjnej, która zachodzi w ekstremalnych warunkach temperaturowych, przypominających warunki, które potencjalnie istniały na najwcześniejszych etapach ewolucji życia1.

Istnieje kilka krytycznych aspektów protokołu, których należy przestrzegać, aby uzyskać wiarygodne wyniki eksperymentów ewolucyjnych. Pierwszą z nich jest niezależność między liniami, którą osiąga się poprzez rozpędzanie się do pojedynczych kolonii przed rozpoczęciem eksperymentu. Jest to konieczne, aby zapewnić, że wszelkie powszechne mutacje znalezione w oddzielnych liniach mają niezależne pochodzenie. Jeśli zamiast tego w celu zainicjowania linii zostanie poddanych masowej hodowli płynnej, wspólne warianty genetyczne mogą zostać rozdystrybuowane do każdej populacji. Drugą kluczową kwestią jest kontrola zanieczyszczenia, którą osiąga się poprzez utrzymanie kontroli ujemnej wolnej od hodowli i monitorowanie wzrostu. W przeciwieństwie do eksperymentów z mezofilami, jest mało prawdopodobne, aby eksperymenty ewolucji ekstremofilów zostały skażone źródłami zewnętrznymi, ale zanieczyszczenie krzyżowe między liniami może nadal wystąpić. Utrzymanie równowagi między napowietrzaniem a parowaniem jest kolejną kluczową kwestią. S.acidocaldarius jest obowiązkowym tlenowcem i dlatego potrzebuje tlenu do wzrostu10,23. Ręczne przebijanie polipropylenowych probówek do mikrowirówek i uszczelnianie ich membraną przepuszczającą gaz21,25 było kluczem do utrzymania napowietrzania bez nadmiernego parowania. Zmniejszenie to można prawdopodobnie przypisać zachowaniu jednolitego środowiska w zamkniętych probówkach (dane nie pokazane).

Dwa aspekty metody mogą wymagać dostosowania lub rozwiązywania problemów w zależności od szczególnych warunków środowiskowych wykorzystanych w doświadczeniu ewolucyjnym: współczynnik rozcieńczenia i czas między transferami. W tej metodzie rozcieńczanie 1:100 wykonywano przy każdym transferze, co wymagało średniej logarytmu2 (100) = 6,64 podwojenia, aby powrócić do tej samej wielkości populacji. Zapewnia to dobrą równowagę między potencjałem adaptacji (optymalny współczynnik rozcieńczenia jest obliczany przez Wahla i Gerrisha26) a wykonalnością eksperymentalną. Zasadniczo silny współczynnik rozcieńczenia umożliwiłby pojawienie się większej liczby pokoleń dziennie, ponieważ wymaga większej liczby podwojeń, aby powrócić do tej samej gęstości zaludnienia (np. 1:1000 wymaga logarytmu2(1000) = średnio 9,97 podwojeń). Jeśli jednak zostanie osiągnięta mniejsza liczba podwojeń niż jest to wymagane między transferami, populacje będą stopniowo wypłukiwane przez rozcieńczenie, chyba że wystąpi korzystna mutacja, która skraca czas podwojenia. w przypadku populacji przenoszonych co 48 godzin, wymagane jest, aby czasy podwojenia były krótsze niż 8 godzin, co jest zgodne z szacowanym czasem podwojenia i poprzednio opublikowanymi wartościami wzrostu heterotroficznego S. acidocaldarius w temperaturze 75 °C (4–6 godzin)23,27. Jednak stopniowy spadek OD600 nm w czasie dla stałych zabiegów w temperaturze 65 °C i spadku temperatury sugeruje, że może to nie być wystarczająco długi czas, aby osiągnąć wymaganą liczbę podwojeń i że korzystny byłby dłuższy okres transferu.

Zwrócono uwagę na kilka ważnych zalet stosowania termomikserów w porównaniu z tradycyjnymi inkubatorami z wytrząsaniem do ewolucji eksperymentalnej, szczególnie podczas badań nad adaptacją do temperatury. Termomiksery stanowią ekonomiczną alternatywę dla inkubatorów z wytrząsaniem, a dodatkową zaletą jest zmniejszona powierzchnia zajmowana przez hakerów. Cechy te umożliwiają efektywną ocenę wielu równoległych zabiegów termicznych. Termomiksery wykazują również niższe zużycie energii niż inkubatory z wytrząsaniem, więc ich zastosowanie może potencjalnie zmniejszyć wpływ na środowisko, gdy inkubowana jest niewielka liczba probówek (np. mniej niż 100). Ta rozbieżność w zużyciu energii jest szczególnie widoczna w temperaturach istotnych dla termofilów, ale ma również zastosowanie w spektrum bardziej umiarkowanych zakresów temperatur (ryc. 6), co oznacza, że termomiksery mogą być również stosowane w celu zmniejszenia wpływu eksperymentalnej ewolucji mezofilów na środowisko. Łącznie cechy te sugerują, że zastosowanie termomikserów w ewolucji eksperymentalnej może potencjalnie poprawić dostępność tej metodologii badawczej, szczególnie w środowiskach o ograniczonych zasobach, takich jak laboratoria w krajach rozwijających się oraz w szkolnictwie podstawowym i średnim.

Pomimo zapewnienia drogi naprzód dla eksperymentalnej ewolucji termofilnej, obecna metoda ma pewne ograniczenia w stosunku do eksperymentalnej ewolucji mezofilnej. Po pierwsze, liczba replikowanych niezależnych linii, które można ustalić za pomocą termomieszalników, jest niewielka w porównaniu z metodami wysokoprzepustowymi obejmującymi płytki mikromiareczkowe, które są szeroko stosowane w przypadku mezofilów4. Parowanie w wysokich temperaturach wyklucza obecnie stosowanie płytek mikromiareczkowych w oknie czasowym wymaganym do osiągnięcia wykładniczego wzrostu. Po drugie, oszacowanie kluczowych parametrów krzywej wzrostu, takich jak tempo wzrostu, czas podwojenia i czas opóźnienia, jest trudne, ponieważ spektrofotometry płytkowe, które mogą pracować w wysokich temperaturach (>45 °C), nie są obecnie dostępne w sprzedaży. Dzięki opisanej tutaj metodzie charakterystyka krzywej wzrostu wymaga obecnie pracochłonnego pobierania próbek niszczących, a tym samym ogranicza przepustowość. Wreszcie, wysokoprzepustowe techniki oceny konkurencyjności adaptowanych izolatów nie są jeszcze w pełni opracowane dla termofilów. W szczególności opracowanie termostabilnego białka fluorescencyjnego, które można wykorzystać do różnicowania szczepów, umożliwiłoby wysokoprzepustowe testy dopasowania oparte na cytometrii przepływowej28,29; Ostatnie odkrycia termostabilnych białek fluorescencyjnych o różnych widmach wskazują na potencjalny przyszły rozwój 30,31,32. Zwiększenie przepustowości jest logicznym kolejnym krokiem w kierunku dalszego rozwoju eksperymentalnych technik ewolucji termofilów, ponieważ umożliwi pełniejsze opisanie procesów ewolucyjnych.

Oświadczenia

Autorzy nie deklarują konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują prof. SV Albers (Uniwersytet we Freiburgu), prof. Eveline Peeters (Vrije Universiteit Brussel) i dr Rani Baes (Vrije Universiteit Brussel) za rady i szczep S. acidocaldarius DSM639. Praca ta została sfinansowana z Royal Society Research Grant (przyznanego DRG: RGS\R1\231308), grantu badawczego UKRI-NERC "Exploring the Frontiers" (przyznanego DRG i CGK: NE/X012662/1) oraz stypendium doktoranckiego Uniwersytetu Kuwejckiego (przyznanego ZA).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &m; m Filtry membranowe napędzane strzykawkąStarLabE4780-1226Do filtrowania elementów mediów sterylizujących, które nie mogą być sterylizowane w autoklawie.
1 μ Pętle inokulacyjne LGreiner731161, 731165 lub 731101Do zaszczepiania kultur. Można użyć innych pętli.
1000 μ L końcówki do pipetStarLabS1111-6811Można używać innych końcówek do pipet.
Probówki do mikrowirówek 2 mlStarLabS1620-2700Do hodowli S. acidocaldarius w termomikserach.
200 μ L końcówki do pipetStarLabS1111-0816Można używać innych końcówek do pipet.
Probówki polistyrenowe o pojemności 50 ml ze stożkowym dnemCorning430828 lub 430829Można stosować inne probówki. Sprawdź wydajność w temperaturze 75 stopni C. Rurki z zaślepkami uszczelniającymi mogą nie pozwalać na wystarczające napowietrzenie; Sprawdź przed użyciem. 
Strzykawka 50 mlBD plastipak300865Do stosowania z filtrami napędzanymi strzykawką.
96-dołkowe płytki do mikromiareczkowania (niepoddane obróbce, z płaskim dnem)NUNC260860Do pomiaru średnicy zewnętrznej przy 600 nm w spektrofotometrze.
Pipeta wielokanałowa o regulowanej szerokościPipet-LiteLA8-300XLSOpcjonalnie, ale oszczędza czas podczas przenoszenia między mikrowirówką a płytkami 96-dołkowymi.
Siarczan amonu ((NH4)2SO4)Milipore168355Dla podstawowego roztworu Brocka I.
AutoklawPriorclaveB60-SMART lub SV100-BASEMożna również stosować inne autoklawy.
Membrana uszczelniająca przepuszczająca gaz Breathe-EASYSigma-AldrichZ763624-100EAPrzycięta na wymiar do stosowania na przebitych probówkach do mikrowirówek. W przypadku zastępowania innych przepuszczalnych dla gazów memrbanów, upewnij się, że wydajność jest odpowiednia przy 75 & deg; C
Dwuwodny chlorek wapnia (CaCl2· 2H2O)Sigma-AldrichC3306Dla podstawowego roztworu Brocka I.
CELLSTAR Płytki sześciodołkowe (zawiesinowe/niepoddane obróbce)GreinerM9062Prawdopodobnie można zastąpić płytki sześciodołkowe innych producentów. Sprawdź wydajność w wysokich temperaturach.
Siarczan kobaltu(II) siedmiowodny (CoSO4· 7H2O)Supelco1025560100Do roztworu podstawowego pierwiastków śladowych.
Chlorek miedzi(II) dwuwodny (CuCl2· 2H2O)Sigma-Aldrich307483Do roztworu podstawowego pierwiastków śladowych.
D-(+)-glukoza bezwodna (C6H12O6)Thermo Scientific Chemicals11462858Można również stosować inne cukry pentozowe i heksozowe (np. D-ksyloza, D-arabinoza). Glukoza nie jest preferowanym źródłem węgla dla S. acidocaldarius (SV Albers, komunikacja osobista)
Woda podwójnie destylowana (ddH2O)
GelriteDuchefa BiochemieG1101.1000Gelrite (guma gellan) jest stosowany zamiast agaru do wytwarzania pożywek stałych ze względu na wyższą temperaturę topnienia.
Szklane szalki Petriego 100 mmMarkaBR455742Szklane szalki Petriego są używane, ponieważ większość standardowych polistyrenowych szalek Petriego 90 mm odkształca się przy 75 & stopni; C (zależne od marki). Alternatywnie można użyć płytek sześciodołkowych, ponieważ nie odkształcają się one w wysokich temperaturach.
InkubatorNew BrunswickInnnova 42RMożna również korzystać z innych inkubatorów. Sprawdź temperaturę roboczą sprzętu przed zakupem/użyciem, ponieważ wiele inkubatorów nie jest w stanie pracować w temperaturach wyższych niż 65 stopni C.
Chlorek żelaza(III) sześciowodny (FeCl3· 6H2O)Supelco103943Do roztworu podstawowego Fe
Siarczan magnezu siedmiowodny (sól Epsom) (MgSO4· 7H2O)Sigma-Aldrich230391Dla podstawowego roztworu Brocka I.
Tetrahydrat chlorku manganu(II) (MnCl2· 4H2O)Sigma-AldrichSIALM5005-100GDo roztworu podstawowego pierwiastków śladowych.
Mini inteligentne gniazdo Wi-Fi, monitorowanie energiiTapoTapo P110Do monitorowania zużycia energii 
N-Z-Amine A - Hydrolizat enzymatyczny kazeiny Sigma-AldrichC0626-500GN-Z-Amine-A jest stosowany jako źródło aminokwasów.
Spinacz do papieru (lub inny wytrzymały drut)brakDo przekłuwania probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml.
Diwodorofosforan potasu (fosforan monopotasowy) (KH2PO4)Sigma-AldrichP0662Dla podstawowego roztworu Brocka I.
Zestaw do oczyszczania genomowego DNA Promega WizardPromegaA1120Opcjonalnie, do ekstrakcji genomowego DNA w laboratorium
Dwuwodny dihydrat molibdenianu sodu (Na2MoO4· 2H2O)Sigma-AldrichM1651-100GDo roztworu podstawowego pierwiastków śladowych.
Dekahydrat tetraboranu sodu (boraks) (Na2B4O7· 10H2O)Sigma-AldrichS9640Do roztworu podstawowego pierwiastków śladowych.
SpektrofotometrBMGSPECTROstar OMEGADo pomiaru średnicy zewnętrznej przy 600 nm. Można stosować inne spektrofotometry, które mogą odczytywać OD przy 600 nm.
Kwas siarkowy (rozcieńczony wodą w stosunku 1:1) (H2SO4)Thermo Scientific Chemicals11337588Służy do dostosowania pH roztworu podstawowego Brock II/III do końcowego pH 2–3.
ThermomixerDLabHM100-ProMożna również stosować inne termomiksery; kluczową kwestią jest zdolność do utrzymania 65– 75 stopni Celsjusza; Temperatury C i 400 RPM
Uracyl (C4H4N2O2)Sigma-AldrichU0750Delecja pyrE jest powszechnym markerem genetycznym stosowanym w S. acidocaldarius. Szczepy deleczujące muszą być uzupełnione uracylem dla wzrostu. Suplementacja nie jest ściśle wymagana dla szczepu typu dzikiego DSM639, ale jest tutaj uwzględniona, ponieważ przyszłe eksperymenty mogą obejmować szczepy delecji.
Dwuwodny siarczan wanadylu (VOSO4· 2H2O)Sigma-Aldrich204862Do roztworu podstawowego pierwiastków śladowych.
Siarczan siedmiowodny (ZnSO4· 7H2O)Sigma-Aldrich221376Do roztworu podstawowego pierwiastków śladowych.

Bibliografia

  1. Nisbet, E. G., Sleep, N. H. The habitat and nature of early life. Nature. 409 (6823), 1083-1091 (2001).
  2. Buckling, A., Craig Maclean, R., Brockhurst, M. A., Colegrave, N. The Beagle in a bottle. Nature. 457 (7231), 824-829 (2009).
  3. Lenski, R. E. Experimental evolution and the dynamics of adaptation and genome evolution in microbial populations. ISME J. 11 (10), 2181-2194 (2017).
  4. McDonald, M. J. Microbial experimental evolution - a proving ground for evolutionary theory and a tool for discovery. EMBO Rep. 20 (8), e46992(2019).
  5. Van Den Bergh, B., Swings, T., Fauvart, M., Michiels, J. Experimental design, population dynamics, and diversity in microbial experimental evolution. Microbiol Mol Biol Rev. 82 (3), e00008-e00018 (2018).
  6. McCarthy, S., et al. Expanding the limits of thermoacidophily in the archaeon Sulfolobus solfataricus by adaptive evolution. Appl Environ Microbiol. 82 (3), 857-867 (2016).
  7. Grogan, D. W. The question of DNA repair in hyperthermophilic archaea. Trends Microbiol. 8 (4), 180-185 (2000).
  8. Whitaker, R. J. Population dynamics through the lens of extreme environments. Rev Mineral Geochem. 59 (1), 259-277 (2005).
  9. Peeters, E., Thia-Toong, T. -L., Gigot, D., Maes, D., Charlier, D. Ss-LrpB, a novel Lrp-like regulator of Sulfolobus solfataricus P2, binds cooperatively to three conserved targets in its own control region: Ss-LrpB-operator interactions for autoregulation. Mol Microbiol. 54 (2), 321-336 (2004).
  10. Quehenberger, J., Shen, L., Albers, S. -V., Siebers, B., Spadiut, O. Sulfolobus - A potential key organism in future biotechnology. Front Microbiol. 8, 2474(2017).
  11. Schultz, J., Dos Santos, A., Patel, N., Rosado, A. S. Life on the edge: Bioprospecting extremophiles for astrobiology. J Indian Inst Sci. 103 (3), 721-737 (2023).
  12. Chen, L., et al. The genome of Sulfolobus acidocaldarius, a model organism of the Crenarchaeota. J Bacteriol. 187 (14), 4992-4999 (2005).
  13. Rastädter, K., Wurm, D. J., Spadiut, O., Quehenberger, J. Physiological characterization of Sulfolobus acidocaldarius in a controlled bioreactor environment. Int J Environ Res Public Health. 18 (11), 5532(2021).
  14. Baes, R., Lemmens, L., Mignon, K., Carlier, M., Peeters, E. Defining heat shock response for the thermoacidophilic model crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius. Extremophiles. 24 (5), 681-692 (2020).
  15. Grogan, D. W. Hyperthermophiles and the problem of DNA instability. Mol Microbiol. 28 (6), 1043-1049 (1998).
  16. Grogan, D. W. Understanding DNA repair in hyperthermophilic archaea: Persistent gaps and other reasons to focus on the fork. Archaea. 2015, 942605(2015).
  17. Drake, J. W. Avoiding dangerous missense: Thermophiles display especially low mutation rates. PLoS Genet. 5 (6), e1000520(2009).
  18. Grogan, D. W., Carver, G. T., Drake, J. W. Genetic fidelity under harsh conditions: Analysis of spontaneous mutation in the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus acidocaldarius. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (14), 7928-7933 (2001).
  19. Wagner, M., et al. Versatile genetic tool box for the Crenarchaeote Sulfolobus acidocaldarius. Front Microbiol. 3, 214(2012).
  20. Suzuki, S., Kurosawa, N. Disruption of the gene encoding restriction endonuclease SuaI and development of a host-vector system for the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus acidocaldarius. Extremophiles. 20 (2), 139-148 (2016).
  21. Baes, R., et al. Transcriptional and translational dynamics underlying heat shock response in the thermophilic crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius. mBio. 14 (5), e0359322(2023).
  22. González, A. G., Pérez Y Terrón, R. Importance of extremophilic microorganisms in biogeochemical cycles. GSC Adv Res Rev. 9 (1), 082-093 (2021).
  23. Brock, T. D., Brock, K. M., Belly, R. T., Weiss, R. L. Sulfolobus: A new genus of sulfur-oxidizing bacteria living at low pH and high temperature. Arch Mikrobiol. 84 (1), 54-68 (1972).
  24. Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. Long-term experimental evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and divergence during 2,000 generations. Am Nat. 138 (6), 1315-1341 (1991).
  25. Baes, R. Exploring transcriptional and translational regulatory mechanisms of the heat shock response of Sulfolobus acidocaldarius. Master's Thesis. , Available from: https://researchportal.vub.be/en/studentTheses/exploring-transcriptional-and-translational-regulatory-mechanisms (2018).
  26. Wahl, L. M., Gerrish, P. J., Saika-Voivod, I. Evaluating the impact of population bottlenecks in experimental evolution. Genetics. 162 (2), 961-971 (2002).
  27. Bernander, R. The cell cycle of Sulfolobus. Mol Microbiol. 66 (3), 557-562 (2007).
  28. Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).
  29. Lang, G. I., Botstein, D., Desai, M. M. Genetic variation and the fate of beneficial mutations in asexual populations. Genetics. 188 (3), 647-661 (2011).
  30. Frenzel, E., Legebeke, J., Van Stralen, A., Van Kranenburg, R., Kuipers, O. P. In vivo selection of sfGFP variants with improved and reliable functionality in industrially important thermophilic bacteria. Biotechnol Biofuels. 11, 8(2018).
  31. Visone, V., et al. In vivo and in vitro protein imaging in thermophilic archaea by exploiting a novel protein tag. PLoS One. 12 (10), e0185791(2017).
  32. Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy. Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Archeony termofilneadaptacja do termofiliihodowla okresowainkubacja w termomikserzeg sto optycznarozcie czenia seryjnebanki glycerolowezmiana rodowiskowa
Adaptacja w ekstremalnych warunkach życia: eksperymentalna ewolucja z ekstremofilem archeonem Sulfolobus acidocaldarius
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.