Artykuł metodologiczny

Oszacowanie wrażliwości strukturalnej regionów wewnętrznie nieuporządkowanych w odpowiedzi na stres hiperosmotyczny w żywych komórkach za pomocą FRET

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66275

⸱

12 stycznia 2024

 ,  , 
1Departamento de Bioquímica, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Intherentnie nieuporządkowane regiony (IDR) to elastyczne domeny białkowe, które modyfikują swoją konformację w odpowiedzi na zmiany środowiskowe. Zespołowy transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET) może oszacować wymiary białka w różnych warunkach. Przedstawiamy podejście FRET do oceny wrażliwości strukturalnej IDR w żywych komórkach Saccharomyces cerevisiae w warunkach stresu hiperosmotycznego.

Streszczenie

Intrinsically disordered regions (IDR) to domeny białkowe, które uczestniczą w kluczowych procesach komórkowych. W warunkach stresowych zmieniają się właściwości fizykochemiczne środowiska komórkowego, co ma bezpośredni wpływ na konformacyjny zespół IDR. Szczegółowe oceny sytuacji są z natury wrażliwe na zakłócenia środowiskowe. Badanie, w jaki sposób właściwości fizykochemiczne komórki regulują konformacyjny zespół IDR, jest niezbędne do zrozumienia środowiskowej kontroli ich funkcji. W tym miejscu opisujemy krok po kroku metodę pomiaru wrażliwości strukturalnej IDR w żywych komórkach Saccharomyces cerevisiae w odpowiedzi na warunki stresu hiperosmotycznego. Przedstawiamy zastosowanie zespołowego transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) do oszacowania, jak zmieniają się globalne wymiary IDR podczas postępującego wzrostu stresu hiperosmotycznego wywieranego na komórki za pomocą dowolnego osmolitu. Dodatkowo udostępniamy skrypt do przetwarzania pomiarów fluorescencji i porównywania czułości strukturalnej dla różnych IDR-ów. Postępując zgodnie z tą metodą, naukowcy mogą uzyskać cenne informacje na temat zmian konformacyjnych, jakie zachodzą w złożonym środowisku wewnątrzkomórkowym w zmieniającym się środowisku.

Wprowadzenie

Nieuporządkowane regiony (IDR) są krytycznymi składnikami procesów komórkowych1. W połączeniu z domenami strukturalnymi, IDR-y są niezbędne dla funkcji białek. Skład aminokwasowy IDR jest tendencyjny, reprezentowany głównie przez naładowane, hydrofilowe i małe resztki. Ze względu na tę właściwość identyfikatory IDR są uznawane za domeny o niskiej złożoności2,3. Liczne IDR-y przyciągnęły uwagę, przede wszystkim dlatego, że regiony te odgrywają kluczową rolę w stanach patologicznych, zwłaszcza w chorobach neurodegeneracyjnych. Takie choroby charakteryzują się samoorganizacją, a następnie zewnątrzkomórkowym lub wewnątrzkomórkowym odkładaniem się IDR w neuronach4. Przykładami takich IDR są amyloid-β (Aβ) w chorobie Alzheimera, huntingtyna (HTT) w chorobie Huntingtona i białko wiążące DNA TAR-43 (TDP-43) oraz fuzja w mięsaku (FUS) w stwardnieniu zanikowym bocznym i otępieniu czołowo-skroniowym4. Badania nad strukturalnymi rearanżacjami IDR w kontekście choroby zostały znacznie wzbogacone o metody spektroskopowe, w tym transfer energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET).

Hydrofilowa i rozszerzona natura IDR-ów sprawia, że są one niezwykle wrażliwe na zmiany właściwości fizykochemicznych środowiska roztworu5. Stopień, w jakim konformacyjny zespół IDR jest modyfikowany przez środowisko, nazywa się wrażliwością strukturalną5,6,7. Do badania konformacji i dynamiki IDR można wykorzystać różne techniki, w tym dichroizm kołowy (CD) i rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS)8,9. Niestety, CD i SAXS wymagają dużych ilości oczyszczonych białek, więc nie nadają się do badań na komórkach. W przeciwieństwie do tego, FRET jest techniką, która mierzy intensywność fluorescencji dwóch cząsteczek fluorescencyjnych, które specyficznie znakują jeden IDR, co oznacza, że można je monitorować w złożonych mieszaninach, takich jak żywe komórki10. Dynamiczny pomiar wrażliwości strukturalnej IDR w żywych komórkach jest niezbędny do zrozumienia, w jaki sposób środowisko reguluje konformację i funkcję zaburzonego proteomu.

FRET to potężna metoda ilościowego określania strukturalnej wrażliwości IDR, a także białek globularnych i wielodomenowych w żywych komórkach. Metoda wymaga konstruktu składającego się z interesującego IDR umieszczonego pomiędzy dwoma białkami fluorescencyjnymi (FP), znanymi jako para FRET. W przypadku tego protokołu sugerujemy użycie mCerulean3 jako dawcy FP i Citrine jako akceptora FP, ze względu na ich duży zakres dynamiki, w porównaniu z innymi FP zgłoszonymi w poprzednim badaniu dotyczącym czułości IDR6. FRET był wcześniej wykorzystywany do pomiaru wrażliwości strukturalnej IDR rośliny w różnych kontekstach komórkowych6. Ponadto technika ta została wykorzystana do scharakteryzowania ogólnych wymiarów białkowych IDR przez różne grupy badawcze, zarówno in vitro, jak i in vivo5,11.

Tutaj opisujemy metodę zespołową FRET do badania strukturalnej wrażliwości IDR w komórkach żywych drożdży (Saccharomyces cerevisiae). Pokazujemy reprezentatywne wyniki, które są oparte na IDR zakładu o nazwie AtLEA4-5. AtLEA4-5 jest nieuporządkowany w roztworze, ale zwija się w α-helisę, gdy stłoczenie makromolekularne jest indukowane in vitro12. AtLEA4-5 jest dobrym modelem referencyjnym dla tej metody, ponieważ jest stosunkowo mały (158 reszt), nieuporządkowany i wrażliwy na perturbacje środowiskowe, jak podano in silico i in vitro6,12. Przedstawiona tutaj metoda może być skalowana w celu uzyskania wysokiej przepustowości, ponieważ komórki drożdży są łatwe w hodowli, a obróbka jest stosowana w małych ilościach. Ponadto, niewielkie modyfikacje protokołu mogą być stosowane do innych systemów komórkowych, takich jak bakterie i komórki roślinne6. Protokół może być wykonany w dowolnym laboratorium biologii molekularnej z dostępem do czytnika mikropłytek z trybem fluorescencji, sprzętu dostępnego w większości instytucji badawczych.

Protokół

1. Konstrukcja plazmidu

  1. Namnoż otwarta ramka odczytu (ORF) kodująca pożądany IDR za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Nie uwzględniaj kodonu stop, ponieważ ORF będzie flankowany przez geny kodujące białka fluorescencyjne. Do amplifikacji zaprojektuj primery z miejscami restrykcyjnymi SacI (5') i BglII (3').
    UWAGA: W sekcji wyników reprezentatywnych jako wybrany IDR wykorzystano AtLEA4-5. ORF AtLEA4-5 namnożono z plazmidu pTrc99A-AtLEA4-512.
  2. Przetraw produkt PCR ORF poprzez następczą restrykcję enzymami SacI i BglII13.
  3. Pozyskaj komercyjny plazmid pDRFLIP38-AtLEA4-5 (#178189) z Addgene (https://www.addgene.org/178189/).
  4. Przeprowadź następczą restrykcję enzymami SacI i BglII, aby usunąć ORF AtLEA4-5 z plazmidu pDRFLIP38-AtLEA4-5, pozostawiając otwarty plazmid zawierający parę FRET13.
  5. Oczyść przetrawione fragmenty DNA, stosując odzysk z żelu po elektroforezie w żelu agarozowym14. Połącz ograniczone fragmenty za pomocą ligazy DNA15.
  6. Wprowadź produkt reakcji klonowania do kompetentnych komórek Escherichia coli (szczepy DH5α lub pokrewne) i wyselekcjonuj na płytkach Luria-Bertani (LB) zawierających 50 µg/mL ampicyliny16. Inkubuj przez noc (ON) w temperaturze 37 °C.
  7. Wyizoluj i hoduj co najmniej pięć przetransformowanych kolonii na nowej płytce i przeprowadź genotypowanie za pomocą PCR17. Oczyść plazmidowe DNA z pozytywnej przetransformowanej kolonii, stosując standardowe metody miniprep18.
  8. Zweryfikuj ekstrakcję i integralność plazmidowego DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym19. Potwierdź prawidłowe sklonowanie konstruktu za pomocą sekwencjonowania metodą Sangera20.

2. Ekspresja plazmidowa w komórkach drożdży

UWAGA: W celu wykonania poniższych kroków należy stosować standardowe techniki aseptyczne. Należy użyć komory z laminarnym przepływem powietrza do hodowli lub palnika.

  1. Zaszczep kreską szczep S. cerevisiae BJ5465 (ATCC: 208289) do 3 mL pożywki Yeast Peptone Dextrose (YPD) i inkubuj przez noc (ON) w temperaturze 30 °C przy 200 rpm.
    UWAGA: BJ5465 to szczep z deficytem proteaz (CH1), zalecany do pracy z regionami nieustrukturyzowanymi (IDR). Można testować i stosować inne szczepy S. cerevisiae.
  2. Odwiruj 1 mL nasyconej kultury drożdży z nocnej inkubacji (OD600 ~ 3-4) przy 14 000 x g przez 1 min. Ostrożnie usuń supernatant za pomocą pipety.
  3. Resuspenduj osad w 1 mL buforu Tris-EDTA (TE) (pH 7.5), delikatnie potrząsając probówką. Odwiruj przy 14 000 x g przez 1 min i ostrożnie usuń supernatant.
  4. Resuspenduj osad w 500 µL buforu Lazy Bones (40% w/v PEG 3,350; 100 mM octanu litu; 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA; pH 7.5) za pomocą pipety. Dodaj 25 µL przegotowanego (100 °C przez 5 min, a następnie chłodzenia na lodzie przez 5 min) DNA z plemników łososia (2 mg/mL) do resuspendowanych komórek drożdży.
  5. Dodaj 100 ng plazmidowego DNA do mieszaniny i mieszaj na wortexie przez 1 min, aby zapewnić dokładne wymieszanie. Odstaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na 1-2 h.
  6. Poddaj mieszaninę drożdży szokowi termicznemu w temperaturze 42 °C przez 12 min, a następnie chłodź na lodzie przez kolejne 12 min. Odwiruj probówkę przy 14 000 x g przez 1 min i ostrożnie usuń supernatant.
  7. Resuspenduj osad w 1 mL buforu TE (pH 7.5). Wysiej 100 µL transformowanych komórek na płytki z syntetyczną pożywką drożdżową bez uracylu (SD-ura) uzupełnionej o 15 g/L agaru.
  8. Inkubuj płytki w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni (Rycina 1). Zaszczep kreską co najmniej pięć transformantów drożdżowych na nowej płytce i inkubuj przez noc.

3. Walidacja transformantów drożdżowych

  1. Pobrać niewielką porcję każdego kandydata na transformanta, delikatnie go zeskrobując i resuspendując w 5 µL 20 mM NaOH w osobnych probówkach do PCR.
  2. Podgrzać próbkę w temperaturze 99 °C przez 10 min w termocyklerze, aby zlizować komórki i uwolnić DNA do roztworu. Ten krok jest kluczowy dla przygotowania matrycy DNA do reakcji PCR.
  3. Przenieść 1 µL podgrzanej próbki do oddzielnej mieszaniny reakcyjnej PCR zawierającej odpowiednie primery i odczynniki PCR do genotypowania. Użyto następujących primerów: primer Forward: 5´-AAATATACCCCAGCCTCGATCTAGA-3´, primer Reverse: 5´-GTAATACGACTCACTATAGGGCG-3´.
  4. Przeprowadzić reakcję PCR i potwierdzić obecność prawidłowego plazmidu za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Wybrać jednego transformanta do dalszych eksperymentów.

4. Przygotowanie hodowli komórek drożdży do analizy FRET

  1. Zaszczep smugą wybranego transformanta drożdży 3 mL płynnego podłoża 1x SD-Ura.
    UWAGA: Procedurę tę należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza, używając sterylnych materiałów.
  2. Inkubować w temperaturze 30 °C przy 200 rpm przez co najmniej 12 h do osiągnięcia nasycenia. Zmierzyć OD600. Wartość wzrostu powinna mieścić się w przedziale OD600 = 1,0-2,0.
    ​UWAGA: Jeśli OD600 jest niższa niż 1,0, należy wydłużyć czas inkubacji komórek. Jeśli OD600 przekracza 2,0, nie należy kontynuować procedury i należy rozpocząć ponownie od kroku 4.1.

5. Przygotowanie komórek drożdży do analizy FRET

  1. Pobrać 2 mL nocnej hodowli drożdży i odwirować przy 14 000 x g w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć nadsącz za pomocą pipety.
  2. Resuspendować osad w 1 mL buforu MES (kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy) o stężeniu 50 mM (pH 6).
  3. Odwirować przy 14 000 x g w temperaturze pokojowej. Usunąć nadsącz.
  4. Powtórzyć kroki 5.2 i 5.3. Resuspendować komórki drożdży w 2 mL buforu MES o pH 6 i przelać tę objętość do zbiornika na odczynniki.

6. Konfiguracja pomiarów fluorescencji

UWAGA: Obecne skanowanie uznaje się za przeprowadzone w czytniku mikropłytek w trybie fluorescencji.

  1. W ustawieniach podstawowych skonfiguruj instrument w następujący sposób: Typ pomiaru: widmo intensywności fluorescencji (FI); Nazwa mikropłytki: Greiner 96 F-bottom.
  2. W ustawieniach optycznych skonfiguruj instrument w następujący sposób: Liczba punktów skanowania długości fali: 91; Długość fali wzbudzenia: 433 nm; Szerokość pasma wzbudzenia: 10 nm; Długość fali emisji: 460 - 550; Szerokość kroku: 1 nm; Szerokość pasma emisji: 10 nm; Wysokość ogniskowej ustalona przez autofocus; Wysokość ogniskowej: 5 mm; Długość fali użyta do wzmocnienia: 490 nm.
  3. W ustawieniach ogólnych skonfiguruj instrument w następujący sposób: Czas stabilizacji: 0.1 s; Kierunek odczytu: jednokierunkowy, poziomy od lewej do prawej, od góry do dołu.
    UWAGA: Ręcznie wprowadzone wzmocnienie musi być dostosowywane dla każdego pomiaru, korzystając z dołka, w którym spodziewany jest najwyższy poziom intensywności fluorescencji w całym zakresie skanowania długości fali.

7. Przygotowanie roztworów hipertonicznych i pomiary fluorescencji

  1. Przygotować roztwory NaCl o stężeniach 0 M, 0,2 M, 0,4 M, 0,6 M, 0,8 M, 1 M, 1,5 M i 2 M w czarnej płytce 96-dołkowej z przezroczystym dnem. Objętość końcowa w każdym dołku wyniesie 200 µL (150 µL roztworu osmolitu + 50 µL zawiesiny komórek drożdży).
    UWAGA: Do indukowania stresu hiperosmotycznego można użyć innych osmolitów. Wszystkie roztwory muszą być przygotowane w buforze MES 50 mM o pH 6.
  2. Nanieść 150 µL buforu MES 50 mM, pH 6 do trzech pierwszych dołków rzędu A (A1, A2, A3), a w kolejnych dołkach dodać 150 µL odpowiedniego roztworu w kolejności rosnącej od lewej do prawej (Rysunek 2). Aby przetestować wszystkie sugerowane stężenia, kontynuować nanoszenie w rzędzie B.
    UWAGA: Taki układ uwzględnia pomiary 3 powtórzeń technicznych dla każdego stężenia.
  3. Użyć mikropipety 12-kanałowej do przeniesienia 50 µL wypłukanych komórek drożdży do każdego dołka. Komórki drożdży mają tendencję do sedymentacji na dno zbiornika. Przed przeniesieniem komórek należy dokładnie resuspendować zawiesinę drożdży poprzez pipetowanie w górę i w dół.
  4. Nanieść komórki do płytki 96-dołkowej zawierającej różne roztwory i dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej 4 razy.
  5. Niezwłocznie zmierzyć widma emisji natężenia fluorescencji dla wybranych dołków w czytniku mikropłytek zgodnie z ustawieniami specyfikacji z kroku 6. Powtórzyć procedurę dla każdego IDR testowanego w analizie FRET.
  6. Krok opcjonalny. Jeśli jest dostępny, zmierzyć konstrukt zawierający tylko donor (pDRFLIP38-mCerulean3), postępując zgodnie z opisanymi tutaj krokami.
    UWAGA: Zalecamy wykonanie tego kroku w celu obliczenia wydajności FRET dla każdego warunku. Jeśli czytnik nie może wykonać tego kroku, FRET można obliczyć metodą stosunku FRET. Obie metody obliczeń FRET są wyjaśnione w krokach 8 i 9.
  7. Wykonać co najmniej trzy powtórzenia w trzech niezależnych dniach dla każdego konstruktu.

8. Przetwarzanie danych z wykorzystaniem metody wydajności FRET

UWAGA: Dla czytelników znających język programowania R udostępniamy zestaw skryptów R do przetwarzania danych opisanych w tej sekcji. Skrypty znajdują się pod adresem https://github.com/Kaz-bits/cuevaslab-procotols/tree/main/FRET. Należy postępować zgodnie z instrukcjami zawartymi w pliku README.

  1. Wyeksportuj dane z czytnika mikropłytek do plików w formacie .xlsx.
  2. Znormalizuj wartości intensywności fluorescencji dla każdej długości fali skanowania do punktu izobestycznego użytej pary FRET.
    UWAGA: Krok ten jest niezbędny do porównania widm we wszystkich badanych warunkach. Punkt izobestyczny dla pary FRET mCerulean3 i Citrine wynosi 515 nm. Na przykład oblicz stosunek wartości intensywności fluorescencji dla 460 nm/515 nm, 461 nm/515 nm, 462 nm/515 nm i tak dalej.
  3. Po znormalizowaniu wartości fluorescencji oblicz średnią dla każdego powtórzenia technicznego. Łącznie powinna powstać kolumna dla każdego stanu stresu hiperosmotycznego.
  4. Przedstaw wszystkie widma intensywności fluorescencji na jednym wykresie (Rysunek 3). Każde widmo powinno przedstawiać kombinację widm emisji fluorescencji poszczególnych białek mCerulean3 i Citrine. W rzadkich przypadkach, gdy wydajność FRET wynosi 0, zaobserwowane zostanie tylko widmo emisji fluorescencji donora, a gdy wydajność FRET wynosi 1, tylko fluorescencja akceptora. Szczyt emisji fluorescencji dla mCerulean3 (donor) przypada na 475 nm, a szczyt emisji fluorescencji dla Citrine (akceptor) na 525 nm.
  5. Ustal, czy pomiar fluorescencji wykazuje typową zmianę FRET w odpowiedzi na stres hiperosmotyczny. Jeśli konformacja IDR jest wrażliwa na zastosowanąy zabieg, odbije się to zmianą wydajności FRET. Typowa zmiana wydajności FRET wiąże się ze spadkiem intensywności fluorescencji donora przy jednoczesnym wzroście intensywności fluorescencji akceptora lub odwrotnie.
  6. Ilościowo określ wydajność FRET (EFRET). Wyznacz znormalizowane wartości szczytowe donora (mCerulean3) (475 nm/515 nm) dla konstruktu IDR oraz konstruktu zawierającego tylko donora dla każdego stanu stresu hiperosmotycznego. Użyj średnich znormalizowanych wartości szczytowych z powtórzeń technicznych. Wykonaj tę operację dla każdego z trzech niezależnych powtórzeń. Oblicz EFRET za pomocą następującego wzoru:
    Równanie wydajności FRET; wzór; kwantyfikacja transferu energii w rezonansie fluorescencyjnym; równanie.
    Gdzie IDA to stosunek 475 nm/515 nm z konstruktu IDR (konstruktu pary FRET), a ID to stosunek 475 nm/515 nm z konstruktu zawierającego tylko donora.
  7. Porównaj wydajności FRET. Znormalizuj wartości EFRET dla każdego stanu stresu hiperosmotycznego do wartości EFRET w warunkach bez stresu (na przykład 0 M NaCl). Wykonaj porównania przy użyciu wykresu pudełkowego lub wykresu krzywej wygładzonej. Przeprowadź jednoczynnikową analizę wariancji (One-way ANOVA), a następnie statystyczny test post hoc Tukeya (wartości p: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001).

9. Przetwarzanie danych z wykorzystaniem metody stosunku FRET

UWAGA: Jeśli nie można uzyskać pomiarów dotyczących wyłącznie donora, należy zastosować metodę stosunku FRET. Metoda ta pozwala na porównanie stosunku FRET w różnych warunkach stresu hiperosmotycznego. Przed wykonaniem kroków opisanych w tej sekcji należy zrealizować kroki od 7.1 do 7.5, aby potwierdzić typowe zachowanie FRET. Dla czytelników znających język programowania R udostępniamy zestaw skryptów R do przetwarzania danych opisanych w tej sekcji. Skrypty znajdują się pod adresem https://github.com/Kaz-bits/cuevaslab-procotols/tree/main/FRET. Należy postępować zgodnie z instrukcjami zawartymi w pliku README.

  1. Wyodrębnij dane przy 475 nm i 525 nm z pliku xlsx wcześniej wyeksportowanego z czytnika mikropłytek. Wartości te odpowiadają szczytowi emisji fluorescencji dla mCerulean3 (donor, DxDm) oraz szczytowi emisji fluorescencji dla Citrine (akceptor, DxAm) podczas wzbudzenia fluoroforu donora (433 nm).
  2. Znormalizuj wartości intensywności fluorescencji przy 475 nm i 525 nm do punktu izosbestycznego zastosowanej pary FRET. Punkt izosbestyczny dla pary FRET mCerulean3 i Citrine wynosi 515 nm. Oblicz stosunek FRET (DxAm/DxDm).
  3. Porównaj stosunki FRET. Znormalizuj wartości DxAm/DxDm dla każdego stanu stresu hiperosmotycznego do średniej wartości DxAm/DxDm dla stanu bezstresowego (na przykład 0 M NaCl). Przeprowadź porównania za pomocą wykresu pudełkowego lub wykresu z wygładzoną krzywą (Rysunek 4 i Rysunek 5). Wykonaj jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA), a następnie statystyczny test post hoc Tukeya (wartości p: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001).

Wyniki

Po transformacji komórek drożdży plazmidem pDRFLIP38-AtLEA4-5, fluorescencję pozytywnych transformantów obserwowano za pomocą transiluminatora światła niebieskiego i filtra (Rycina 1). Przygotowywanie różnych roztworów do indukowania stresu hiperosmotycznego jest czasochłonne, dlatego sugerujemy postępowanie zgodnie z szablonem płytki 96-dołkowej przedstawionym na Rycynie 2. Bezzwłocznie po potraktowaniu stressem hiperosmotycznym z zastosowaniem różnych stężeń chlorku sodu, zarejestrowano widma emisji fluorescencji (Rycina 3). Widma emisji fluorescencji dla każdego stanu uzyskano w celu potwierdzenia typowej zmiany zachowania FRET. W celu skorygowania błędów eksperymentalnych wymagana jest normalizacja wartości natężenia fluorescencji do punktu izosbestycznego. W tych reprezentatywnych wynikach przetestowano wcześniej opisaną białko AtLEA4-5, która jest wysoce czułą roślinną domeną nieustrukturyzowaną (IDR)6. Jako referencję przetestowano również lekko niewrażliwe globularne białko ABP (Rycina 3). Można zauważyć, że oba konstrukty wykazują kombinację widm emisji mCerulean3 i Citrine (piki dla donora i akceptora FP), co wskazuje na pewien stopień podstawowej wydajności FRET w warunkach standardowych (0 M NaCl). W przypadku AtLEA4-5 stres hiperosmotyczny spowodował wzrost natężenia fluorescencji akceptora połączony ze spadkiem natężenia fluorescencji donora, co wskazuje na indukowane stresem hiperosmotycznym zagęszczenie IDR (Rycina 3A). Tendencja ta nie została zaobserwowana w ABP (Rycina 3B). Aby ilościowo określić różnice w wrażliwości strukturalnej przy różnych potraktowaniach stresem hiperosmotycznym, wykreślono stosunek FRET (DxAm/DxDm) dla każdego stanu i przeprowadzono statystyczny test jednoczynnikowej analizy wariancji (One-way ANOVA) (Rycina 4). Na koniec porównano wrażliwość strukturalną AtLE4-5 i ABP. Zaobserwowano, że AtLEA4-5 wykazała znacznie wyższą wrażliwość niż ABP (Rycina 5).

Wzrost kolonii bakteryjnych na płytce agarowej; mikrobiologia, wyniki eksperymentalne, analiza pożywki odżywczej.
Rycina 1: Emisja fluorescencji transformantów S. cerevisiae. Szalka Petri z pożywką SD-ura z posianymi drożdżami S. cerevisiae przekształconymi za pomocą plazmidu pDRFLIP38-AtLEA4-5. Fluorescencję obserwowano przy użyciu transiluminatora światła niebieskiego i pomarańczowego filtra. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Płytka z gradientem osmolitów, reakcje IDR, wzrost stężenia, dane eksperymentalne, analiza naukowa.
Rysunek 2: Szablon płytki 96-dołkowej dla systemu FRET. Trzy powtórzenia techniczne dla każdego warunku stresu hiperosmotycznego są umieszczane w kolejnych dołkach. Pierwsze dwa rzędy (A i B) mieszczą osiem warunków dla jednego konstruktu (IDR1). Kolejne rzędy mogą pomieścić nowe konstrukty (IDR2, IDR3 itd.). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Fluorescencja a stężenie NaCl; wykresy przedstawiają znormalizowane widma emisji; analiza porównawcza.
Rysunek 3: Znormalizowane widma emisji fluorescencji w różnych warunkach stresu hiperosmotycznego. Widma potwierdziły typowe zachowanie FRET w odpowiedzi na traktowanie stresem hiperosmotycznym (NaCl). (A) AtLEA4-5, wysoce wrażliwy region nieustrukturyzowany (IDR). Wzrost intensywności fluorescencji akceptora wiąże się ze spadkiem intensywności fluorescencji donora. (B) ABP, białko globularne o niewielkiej wrażliwości. Piki obserwuje się przy 475 nm i 525 nm zgodnie z parą FRET mCerulean3 i Citrine. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres pudełkowy znormalizowanego DENV D/XM-D/XDm w funkcji NaCl (mM); istotność statystyczna przy różnych stężeniach.
Rysunek 4: Ilościowe określenie wrażliwości strukturalnej w różnych warunkach stresu hiperosmotycznego. Znormalizowany stosunek FRET (DxAm/DxDm) żywych komórek drożdży poddanych działaniu różnych stężeń NaCl. (A) AtLEA4-5. (B) Białko wiążące arabinozę (ABP). n = 9 niezależnych pomiarów. Jednoczynnikowa ANOVA. ns: nieistotne. wartości p: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p< 0,0001. Pudełka reprezentują 25. i 75. percentyl (linia oznacza medianę). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza oddziaływań białek; ΔFRET w funkcji stężenia NaCl; wykres wyników IDR dla ABP, AtLEA4-5.
Rysunek 5: Porównanie wrażliwości strukturalnej AtLEA4-5 i ABP. (A) Znormalizowany stosunek FRET (DxAm/DxDm) w różnych warunkach stresu hiperosmotycznego dla AtLEA4-5 i ABP. n = 3 niezależne pomiary. (B) Wartość Delta FRET (1,5 M - 0 M NaCl) dla AtLEA4-5 i ABP. Zmiana jest raportowana jako wrażliwość strukturalna konstruktów mierzona w systemie FRET przy 1,5 M NaCl. n = 3 niezależne pomiary. Średnia ± SD. Dwuczynnikowa analiza ANOVA z następującymi wartościami p: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p< 0,0001. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Przedstawiona tu metoda umożliwia uzyskanie wglądu w to, w jaki sposób globalny wymiar zespołu IDR-ów wyczuwa i reaguje na perturbacje środowiskowe. Metoda ta opiera się na genetycznie kodowanym konstrukcie i nie wymaga żadnych dodatkowych składników poza stabilną ekspresją plazmidu w komórkach drożdży, dzięki czemu można ją dostosować do potencjalnych zastosowań w innych typach komórek. Co więcej, jest wszechstronny w badaniu innych zaburzeń fizykochemicznych, których doświadczają komórki eukariotyczne podczas swojego cyklu życiowego21. Rozdzielczość FRET jest godna uwagi, przy czym transfer energii zachodzi tylko w odległości mniejszej niż 10 nm między FP donorowym a akceptorowym. Jednak głównym ograniczeniem jest brak precyzyjnych informacji strukturalnych, których nie można uzyskać za pomocą metody zespołowej FRET.

Nieodłączna heterogeniczność i elastyczność IDR stanowi wyzwanie podczas badania ich zespołu w kontekście komórkowym, co sprawia, że techniki takie jak krystalografia rentgenowska są niepraktyczne. NMR był brany pod uwagę do badania nieuporządkowanych białek w komórkach, ale zmieniające się warunki mogą stanowić problem z powodu zakłóceń sygnału22. Implementacja techniki FRET do badania zespołów konformacyjnych IDR oferuje unikalne możliwości, pozwalające na mapowanie rozmieszczenia populacji w żywych komórkach. Ponadto można go uzupełnić metodami in vitro, takimi jak jednocząsteczkowy FRET (smFRET), co świadczy o jego zdolności adaptacyjnych do różnych podejść i warunków eksperymentalnych23. Protokół ten wykorzystuje mCerulean3 jako dawcę FP i Citrine jako akceptor FP, zapewniając prosty i łatwy do śledzenia system. Wybór par FRET musi dokładnie rozważyć nakładanie się widma, aby złagodzić przesłuchy między sygnałami24,25. Podczas raportowania zmian czułości strukturalnej za pomocą tej metody, wybór odpowiedniej metryki FRET, takiej jak wydajność FRET (EFRET), ma kluczowe znaczenie dla wiarygodnej interpretacji sygnału. Alternatywnie, czułość strukturalna może być analizowana i porównywana przy użyciu współczynnika FRET (DxAm/DxDm), ale wymaga to starannej korekcji przesłuchu fluorescencji donor-akceptor25. Na interpretację danych fluorescencyjnych uzyskanych z czytników mikropłytek mogą mieć wpływ różne czynniki, w tym właściwości fluoroforów, orientacja dipolów, systemy międzycząsteczkowe FRET i wewnątrzcząsteczkowe FRET, przygotowanie próbki i analiza danych25.

Intermolekularny FRET jest głównym ograniczeniem zespołowej metody FRET, ponieważ nie można jej pominąć we wstępnej analizie danych. Stanowi to ważną kwestię dla czytelnika, ponieważ niektóre IDR-y są znane z rekrutacji do kondensatów biomolekularnych26,27. Lokalne stężenie makrocząsteczek w kondensatach biomolekularnych jest wysokie, co może indukować interakcje międzycząsteczkowe, a tym samym wpływać na odczyt FRET. W przypadku AtLEA4-5 wykazano, że samoorganizuje się w dyskretne struktury punktowe pod wpływem stresu hiperosmotycznego w komórkach drożdży6. Aby wykluczyć wpływ międzycząsteczkowego FRET, autorzy inkubowali komórki z 1,6-heksanodiolem (1,6-HD), cząsteczką, która rozbija kondensaty biomolekularne. Leczenie 1,6-HD rozpuściło kondensaty AtLEA4-5, ale poziomy FRET nie uległy zmniejszeniu, co wskazuje, że kondensacja białek nie powoduje niepożądanego międzycząsteczkowego FRET. Ponieważ efekt ten będzie zależał od każdego IDR, czytelnicy powinni zastosować dodatkowe podejścia, takie jak fotowybielanie akceptorowe lub koekspresja konstruktów tylko dawców i tylko akceptorów6. Jednak informacje uzyskane z zespołu FRET w żywych komórkach mają istotne znaczenie dla scharakteryzowania wrażliwości strukturalnej IDR.

Skomplikowanym aspektem przedstawionego tutaj protokołu jest to, że wykorzystuje on organizm, który wykazuje zachowanie reagujące na stres hiperosmotyczny. W obecności wysokich stężeń zewnętrznych chlorku sodu woda opuszcza komórkę, zwiększając całkowite stężenie białka i tworząc zatłoczone środowisko28. IDR-y są wrażliwe na zmiany stłoczenia makromolekularnego 5,6,11,12. W szczególności AtLEA4-5, białko użyte jako model w tym protokole, było wrażliwe na tłumy o różnej masie cząsteczkowej, ale nie na wysokie stężenia soli lub glicerolu in vitro6. Ponieważ akumulacja glicerolu jest ważna dla odpowiedzi i aklimatyzacji komórek drożdży do stresu hiperosmotycznego29, należy podkreślić, że głównym czynnikiem przyczyniającym się do zagęszczenia AtLEA4-5 jest stłoczenie makromolekularne podczas wczesnych zdarzeń wykrywania osmo. To, w jaki sposób zmienia się struktura AtLEA4-5 podczas kolejnych etapów aklimatyzacji, kiedy gromadzi się glicerol, wymaga dalszych badań.

Badanie dynamiki konformacyjnej w nieuporządkowanych białkach obejmuje różne techniki. W tym kontekście FRET jest metodą kluczową. W zależności od konkretnych zapytań badawczych i rozważanych cech, badacze mogą zastosować spektroskopię NMR in vivo w celu scharakteryzowania IDR30. Ponadto smFRET jest cennym narzędziem do badań in vivo 23. Spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) jest kolejną techniką wykorzystywaną do ilościowego badania IDR w kontekście komórkowym31. Metody oparte na spektrometrii mas są również potężnymi podejściami, ponieważ mogą dostarczyć informacji strukturalnych na temat konformacji komórkowej białek32. Metody te obejmują natywną spektrometrię mas (native-MS) i spektrometrię mas ruchliwości jonów (IM-MS)32,33. Wszystkie te metody umożliwiają naukowcom zagłębienie się w wielorakie konformacje IDR i jego dynamikę, rzucając światło na ich wkład w biologię komórki. Protokół opisany w tej pracy może być wykorzystany do przeprowadzenia wstępnego badania przesiewowego wrażliwości strukturalnej w sposób wysokoprzepustowy. Badania uzupełniające mogą koncentrować się na testowaniu wrażliwości strukturalnej w pożądanym typie komórki lub z potencjałem uzyskania wglądu mechanistycznego za pomocą metod in vitro, takich jak smFRET, CD lub SAXS. Połączenie metod jest niezbędne do uzyskania jasnego obrazu wrażliwości strukturalnej IDR w zmieniającym się otoczeniu komórek.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy członkom laboratorium Cuevas-Velazquez za krytyczną recenzję manuskryptu. Prace te były wspierane przez Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica, Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM-PAPIIT) numer projektu IA203422; Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnología (CONAHCYT), numer projektu 252952; oraz Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Grant 5000-9182. CET (CVU 1083636) i CAPD (CVU 1269643) przyznają CONAHCYT stypendium M.Sc.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytka 96-dołkowaGreiner Bio-One655096
AgarSigma-Aldrich5040
BglIINew England BioLabsR0144S
BJ5465 CellsAmerican Type Culture Collection208289
Buffer MES 50 mMSigma-AldrichM8250
Buffer Tris-HCl 10 mMInvitrogen
EDTA 1 mMMerck108452
FalconCorning352057
LB mediaSigma-AldrichL2897
Octan litu 0,1 MSigma-AldrichL6883
Agaroza niskotopliwaGOLDBIOA-204-25
Mikrowirówkaeppendorf5452000010
Zestaw do miniprzygotowaniaZymoPureD4210
NaOH 0,02 MMerck106462
PEG 3,350 40%Sigma-Aldrich1546547
plazmid pDRFLIP38-AtLEA4-5addgene178189
Czytnik płytekBMG LABTECHCLARIOstar Plus
SacINew England BioLabsR3156S
DNA nasienia łososia 2 mg/mlThermo Fisher Scientific15632011
SD-UraSigma-AldrichY1501
Klocyd soduSigma-AldrichS9888
Taq polymesarePromegaM5123
TransiluminatorInstrumenty AccurisE4000
Spektrofotometr UV-VisibleThermo Fisher ScientificBiomate3
YPDSigma-AldrichY1500
15506017 Probówki

Bibliografia

  1. Wright, P. E., Dyson, H. J. Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (1), 18-29 (2015).
  2. Covarrubias, A. A., Romero-Pérez, P. S., Cuevas-Velazquez, C. L., Rendón-Luna, D. F. The functional diversity of structural disorder in plant proteins. Arch Biochem Biophys. 680, 108229(2019).
  3. Ahmed, S. S., et al. Characterization of intrinsically disordered regions in proteins informed by human genetic diversity. PLoS Comput Biol. 18 (3), e1009911(2022).
  4. Birol, M., Melo, A. M. Untangling the conformational polymorphism of disordered proteins associated with neurodegeneration at the single-molecule level. Front Mol Neurosci. 12, 309(2019).
  5. Moses, D., et al. Revealing the hidden sensitivity of intrinsically disordered proteins to their chemical environment. J Phys Chem Lett. 11 (23), 10131-10136 (2020).
  6. Cuevas-Velazquez, C. L., et al. Intrinsically disordered protein biosensor tracks the physical-chemical effects of osmotic stress on cells. Nat Commun. 12 (1), 5438(2021).
  7. Holehouse, A. S., Sukenik, S. Controlling structural bias in intrinsically disordered proteins using solution space scanning. J Chem Theory Comput. 16 (3), 1794-1805 (2020).
  8. Martin, E. W., Hopkins, J. B., Mittag, T. Small-angle X-ray scattering experiments of monodisperse intrinsically disordered protein samples close to the solubility limit. Methods Enzymol. 646, 185-222 (2021).
  9. Miles, A. J., Drew, E. D., Wallace, B. A. DichroIDP: a method for analyses of intrinsically disordered proteins using circular dichroism spectroscopy. Commun Biol. 6 (1), 823(2023).
  10. Kaminski, C. F., Rees, E. J., Schierle, G. S. K. A quantitative protocol for intensity-based live cell FRET imaging. Method Mol Biol. 1076, 445-454 (2014).
  11. Moses, D., et al. Structural biases in disordered proteins are prevalent in the cell. bioRxiv. , (2022).
  12. Cuevas-Velazquez, C. L., Saab-Rincón, G., Reyes, J. L., Covarrubias, A. A. The Unstructured N-terminal Region of Arabidopsis Group 4 Late Embryogenesis Abundant (LEA) Proteins Is Required for Folding and for Chaperone-like Activity under Water Deficit. J Biol Chem. 291 (20), 10893-10903 (2016).
  13. JoVE Science Education Database. Restriction enzyme digests. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  14. JoVE Science Education Database. Gel purification. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  15. JoVE Science Education Database. DNA ligation reactions. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  16. JoVE Science Education Database. Bacterial transformation using heat Ssock and competent cells. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  17. JoVE Science Education Database. PCR: Principle, instrumentation, and applications. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  18. JoVE Science Education Database. Plasmid purification. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  19. JoVE Science Education Database. DNA gel electrophoresis. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  20. JoVE Core Molecular Biology. Sanger/chain termination sequencing using dideoxynucleotides - Concept. , Available from: https://app.jove.com/science-education/v/12020/sanger-sequencing (2023).
  21. Theillet, F. X., et al. Physicochemical properties of cells and their effects on intrinsically disordered proteins (IDPs). Chem Rev. 114 (13), 6661-6714 (2014).
  22. Brutscher, B., et al. NMR methods for the study of instrinsically disordered proteins structure, dynamics, and interactions: General overview and practical guidelines. Adv Exp Med Biol. 870, 49-122 (2015).
  23. Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annu Rev Phys Chem. 71, 391-414 (2020).
  24. Roebroek, T., et al. Simultaneous readout of multiple FRET pairs using photochromism. Nat Commun. 12 (1), 2005(2021).
  25. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nat Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  26. Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).
  27. Belott, C., Janis, B., Menze, M. A. Liquid-liquid phase separation promotes animal desiccation tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (44), 27676-27684 (2020).
  28. Miermont, A., et al. Severe osmotic compression triggers a slowdown of intracellular signaling, which can be explained by molecular crowding. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5725-5730 (2013).
  29. Saito, H., Posas, F. Response to hyperosmotic stress. Genetics. 192 (2), 289-318 (2012).
  30. Selenko, P., Wagner, G. Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy. J Struct Biol. 158 (2), 244-253 (2007).
  31. Cattani, J., Subramaniam, V., Drescher, M. Room-temperature in-cell EPR spectroscopy: alpha-Synuclein disease variants remain intrinsically disordered in the cell. Phys Chem Chem Phys. 19 (28), 18147-18151 (2017).
  32. Beveridge, R., Chappuis, Q., Macphee, C., Barran, P. Mass spectrometry methods for intrinsically disordered proteins. Analyst. 138 (1), 32-42 (2013).
  33. Beveridge, R., et al. Ion mobility mass spectrometry uncovers the impact of the patterning of oppositely charged residues on the conformational distributions of intrinsically disordered proteins. J Am Chem Soc. 141 (12), 4908-4918 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Pomiar FRETSaccharomyces cerevisiaeintensywność fluorescencjikonformacja białkaczytnik mikropłytekodpowiedź na osmolitystres komórek drożdży
Oszacowanie wrażliwości strukturalnej regionów wewnętrznie nieuporządkowanych w odpowiedzi na stres hiperosmotyczny w żywych komórkach za pomocą FRET
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.