Method Article

Oszacowanie wrażliwości strukturalnej regionów wewnętrznie nieuporządkowanych w odpowiedzi na stres hiperosmotyczny w żywych komórkach za pomocą FRET

DOI:

10.3791/66275

⸱

January 12th, 2024

 ,  , 
1Departamento de Bioquímica, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Intherentnie nieuporządkowane regiony (IDR) to elastyczne domeny białkowe, które modyfikują swoją konformację w odpowiedzi na zmiany środowiskowe. Zespołowy transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET) może oszacować wymiary białka w różnych warunkach. Przedstawiamy podejście FRET do oceny wrażliwości strukturalnej IDR w żywych komórkach Saccharomyces cerevisiae w warunkach stresu hiperosmotycznego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Intrinsically disordered regions (IDR) to domeny białkowe, które uczestniczą w kluczowych procesach komórkowych. W warunkach stresowych zmieniają się właściwości fizykochemiczne środowiska komórkowego, co ma bezpośredni wpływ na konformacyjny zespół IDR. Szczegółowe oceny sytuacji są z natury wrażliwe na zakłócenia środowiskowe. Badanie, w jaki sposób właściwości fizykochemiczne komórki regulują konformacyjny zespół IDR, jest niezbędne do zrozumienia środowiskowej kontroli ich funkcji. W tym miejscu opisujemy krok po kroku metodę pomiaru wrażliwości strukturalnej IDR w żywych komórkach Saccharomyces cerevisiae w odpowiedzi na warunki stresu hiperosmotycznego. Przedstawiamy zastosowanie zespołowego transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) do oszacowania, jak zmieniają się globalne wymiary IDR podczas postępującego wzrostu stresu hiperosmotycznego wywieranego na komórki za pomocą dowolnego osmolitu. Dodatkowo udostępniamy skrypt do przetwarzania pomiarów fluorescencji i porównywania czułości strukturalnej dla różnych IDR-ów. Postępując zgodnie z tą metodą, naukowcy mogą uzyskać cenne informacje na temat zmian konformacyjnych, jakie zachodzą w złożonym środowisku wewnątrzkomórkowym w zmieniającym się środowisku.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nieuporządkowane regiony (IDR) są krytycznymi składnikami procesów komórkowych1. W połączeniu z domenami strukturalnymi, IDR-y są niezbędne dla funkcji białek. Skład aminokwasowy IDR jest tendencyjny, reprezentowany głównie przez naładowane, hydrofilowe i małe resztki. Ze względu na tę właściwość identyfikatory IDR są uznawane za domeny o niskiej złożoności2,3. Liczne IDR-y przyciągnęły uwagę, przede wszystkim dlatego, że regiony te odgrywają kluczową rolę w stanach patologicznych, zwłaszcza w chorobach neurodegeneracyjnych. Takie choroby charakteryzują się samoorganizacją, a następnie zewnątrzkomórkowym lub wewnątrzkomórkowym odkładaniem się IDR w neuronach4. Przykładami takich IDR są amyloid-β (Aβ) w chorobie Alzheimera, huntingtyna (HTT) w chorobie Huntingtona i białko wiążące DNA TAR-43 (TDP-43) oraz fuzja w mięsaku (FUS) w stwardnieniu zanikowym bocznym i otępieniu czołowo-skroniowym4. Badania nad strukturalnymi rearanżacjami IDR w kontekście choroby zostały znacznie wzbogacone o metody spektroskopowe, w tym transfer energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET).

Hydrofilowa i rozszerzona natura IDR-ów sprawia, że są one niezwykle wrażliwe na zmiany właściwości fizykochemicznych środowiska roztworu5. Stopień, w jakim konformacyjny zespół IDR jest modyfikowany przez środowisko, nazywa się wrażliwością strukturalną5,6,7. Do badania konformacji i dynamiki IDR można wykorzystać różne techniki, w tym dichroizm kołowy (CD) i rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS)8,9. Niestety, CD i SAXS wymagają dużych ilości oczyszczonych białek, więc nie nadają się do badań na komórkach. W przeciwieństwie do tego, FRET jest techniką, która mierzy intensywność fluorescencji dwóch cząsteczek fluorescencyjnych, które specyficznie znakują jeden IDR, co oznacza, że można je monitorować w złożonych mieszaninach, takich jak żywe komórki10. Dynamiczny pomiar wrażliwości strukturalnej IDR w żywych komórkach jest niezbędny do zrozumienia, w jaki sposób środowisko reguluje konformację i funkcję zaburzonego proteomu.

FRET to potężna metoda ilościowego określania strukturalnej wrażliwości IDR, a także białek globularnych i wielodomenowych w żywych komórkach. Metoda wymaga konstruktu składającego się z interesującego IDR umieszczonego pomiędzy dwoma białkami fluorescencyjnymi (FP), znanymi jako para FRET. W przypadku tego protokołu sugerujemy użycie mCerulean3 jako dawcy FP i Citrine jako akceptora FP, ze względu na ich duży zakres dynamiki, w porównaniu z innymi FP zgłoszonymi w poprzednim badaniu dotyczącym czułości IDR6. FRET był wcześniej wykorzystywany do pomiaru wrażliwości strukturalnej IDR rośliny w różnych kontekstach komórkowych6. Ponadto technika ta została wykorzystana do scharakteryzowania ogólnych wymiarów białkowych IDR przez różne grupy badawcze, zarówno in vitro, jak i in vivo5,11.

Tutaj opisujemy metodę zespołową FRET do badania strukturalnej wrażliwości IDR w komórkach żywych drożdży (Saccharomyces cerevisiae). Pokazujemy reprezentatywne wyniki, które są oparte na IDR zakładu o nazwie AtLEA4-5. AtLEA4-5 jest nieuporządkowany w roztworze, ale zwija się w α-helisę, gdy stłoczenie makromolekularne jest indukowane in vitro12. AtLEA4-5 jest dobrym modelem referencyjnym dla tej metody, ponieważ jest stosunkowo mały (158 reszt), nieuporządkowany i wrażliwy na perturbacje środowiskowe, jak podano in silico i in vitro6,12. Przedstawiona tutaj metoda może być skalowana w celu uzyskania wysokiej przepustowości, ponieważ komórki drożdży są łatwe w hodowli, a obróbka jest stosowana w małych ilościach. Ponadto, niewielkie modyfikacje protokołu mogą być stosowane do innych systemów komórkowych, takich jak bakterie i komórki roślinne6. Protokół może być wykonany w dowolnym laboratorium biologii molekularnej z dostępem do czytnika mikropłytek z trybem fluorescencji, sprzętu dostępnego w większości instytucji badawczych.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konstrukcja plazmidu

  1. Wzmocnij otwartą ramkę odczytu (ORF), która koduje żądany IDR za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Nie należy dołączać kodonu stop, ponieważ ORF będzie otoczony genami kodującymi białka fluorescencyjne. Do wzmocnienia zaprojektuj podkłady z miejscami ograniczeń SacI (5') i BglII (3').
    UWAGA: W sekcji dotyczącej reprezentatywnych wyników użyliśmy AtLEA4-5 jako wybranego IDR. Wzmocniliśmy ORF AtLEA4-5 z plazmidu plazmidowego12.
  2. Trawić produkt ORF PCR przez kolejne ograniczanie za pomocą enzymów SacI i BglII13.
  3. Uzyskaj komercyjny plazmid pDRFLIP38-AtLEA4-5 (#178189) od Addgene (https://www.addgene.org/178189/).
  4. Przeprowadź kolejne ograniczenie za pomocą enzymów SacI i BglII w celu usunięcia AtLEA4-5 ORF z plazmidu pDRFLIP38-AtLEA4-5, pozostawiając otwarty plazmid zawierający parę FRET13.
  5. Oczyść strawione fragmenty DNA za pomocą odzysku żelu z elektroforezy w żelu agarozowym14. Zwiąż ograniczone fragmenty za pomocą ligazy DNA15.
  6. Przekształć reakcję klonowania w kompetentne komórki Escherichia coli (DH5α lub szczepy pokrewne) i wybierz płytki Luria-Bertani (LB) zawierające 50 μg/ml ampicyliny16. Rosnąć przez noc (ON) w temperaturze 37 °C.
  7. Wyizoluj i wyhoduj co najmniej pięć przekształconych kolonii na nowej płytce i genotypie za pomocą PCR17. Oczyść plazmidowe DNA z pozytywnie przekształconej kolonii przy użyciu standardowych metod miniprep18.
  8. Sprawdź ekstrakcję i integralność plazmidowego DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym19. Sprawdź poprawność klonowania konstrukcji przy użyciu sekwencjonowania Sangera 20.

2. Ekspresja plazmidu w komórkach drożdży

UWAGA: Użyj standardowych technik aseptycznych, aby wykonać następujące kroki. Użyj okapu z przepływem laminarnym lub zapalniczki.

  1. Zaszczepić smugę S. cerevisiae BJ5465 (ATCC: 208289) przecedzić do 3 ml pożywki z dekstrozą drożdżowo-peptonową (YPD) i rosnąć w temperaturze 30 °C i 200 obr.
    UWAGA: BJ5465 to szczep z niedoborem proteazy (CH1) zalecany do pracy z IDR. Inne szczepy S. cerevisiae mogą być testowane i stosowane.
  2. Odwirować 1 ml nasyconej przez noc (OD600 ~ 3-4) kultury drożdży o stężeniu 14 000 x g przez 1 minutę. Ostrożnie usunąć supernatant przez pipetowanie.
  3. Zawiesić osad w 1 ml buforu Tris-EDTA (TE) (pH 7,5), delikatnie przesuwając probówkę. Wirować przy 14 000 x g przez 1 minutę i ostrożnie usunąć supernatant.
  4. Zawiesić osad w 500 μl buforu Lazy Bones (40% w/v PEG 3,350; 100 mM octan litu; 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA; pH 7,5) przez pipetowanie. Dodać 25 μl ugotowanego (100 °C przez 5 minut, a następnie schłodzić na lodzie przez 5 minut) DNA plemników łososia (2 mg/ml) do zawieszonych komórek drożdży.
  5. Dodaj 100 ng plazmidowego DNA do mieszaniny i wiruj mieszaninę przez 1 minutę, aby zapewnić dokładne wymieszanie. Pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na 1-2 godziny.
  6. Szok termiczny mieszaniny drożdży w temperaturze 42 °C przez 12 minut, następnie schładzanie na lodzie przez kolejne 12 minut. Odwirować probówkę o sile 14 000 x g przez 1 minutę i ostrożnie usunąć sklarowany nad osadem.
  7. Zawiesić osad w 1 ml buforu TE (pH 7,5). Umieścić 100 μl przekształconych komórek na pożywce syntetycznej bez uracylu (SD-ura) z drożdżami, uzupełnionymi 15 g/l agaru.
  8. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni (Rysunek 1). Umieść co najmniej pięć transformantów drożdżowych na nowej płytce i rośnij dalej.

3. Walidacja transformantów drożdżowych

  1. Pobrać niewielką porcję każdego kandydata na transformant, delikatnie zeskrobując i ponownie zawieszając w 5 μl 20 mM NaOH w pojedynczych probówkach PCR.
  2. Podgrzewać próbkę w temperaturze 99 °C przez 10 minut w termocyklerze w celu lizy komórek i uwolnienia DNA do roztworu. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla przygotowania matrycy DNA do PCR.
  3. Przenieść 1 μl gotowanej próbki do oddzielnej mieszaniny reakcyjnej PCR zawierającej odpowiednie startery i odczynniki PCR do genotypowania. Użyliśmy następujących starterów: Starter do przodu: 5'-AAATATACCCCAGCCTCGATCTAGA-3'. Podkład odwrotny: 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGGGCG-3'.
  4. Ustaw reakcję PCR i zweryfikuj obecność prawidłowego plazmidu za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Wybierz jeden transformant do dalszych eksperymentów.

4. Przygotowanie hodowli komórek drożdży do testu FRET

  1. Zaszczepić smugę wybranego transformatora drożdżowego w 3 ml płynu 1x SD-Ura medium.
    UWAGA: Wykonaj tę procedurę w okapie z przepływem laminarnym i sterylnym materiale.
  2. Rosnąć w temperaturze 30 °C, 200 obr./min przez co najmniej 12 godzin, aby osiągnąć nasycenie. Zmierz średnicę zewnętrzną600. Wzrost powinien mieścić się w przedziale OD600 = 1,0-2,0,
    UWAGA: Jeśli OD600 jest niższy niż 1,0, daj komórkom więcej czasu na inkubację na wzrost. Jeśli OD600 przekracza 2.0, nie kontynuuj i uruchom ponownie od kroku 4.1.

5. Przygotowanie komórek drożdży do testu FRET

  1. Zebrać 2 ml nocnej kultury drożdży i odwirować przy 14 000 x g w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć supernatant przez pipetowanie.
  2. Zawiesić osad w 1 ml 50 mM buforu kwasu 2-(N-morfolino) etanosulfonowego (MES) (pH 6).
  3. Odwirować przy 14 000 x g w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant.
  4. Powtórz kroki 5.2 i 5.3. Ponownie zawiesić komórki drożdży w 2 ml buforu MES o pH 6 i wlać objętość do zbiornika odczynnika.

6. Ustawianie pomiarów fluorescencji

UWAGA: Uważa się, że obecne skanowanie jest wykonywane w czytniku mikropłytek z trybem fluorescencji.

  1. Aby uzyskać podstawowe ustawienia, ustaw instrument w następujący sposób: Typ pomiaru: widmo intensywności fluorescencji (FI); Nazwa mikropłytki: Greiner 96 F-bottom.
  2. W przypadku ustawień optycznych ustaw instrument w następujący sposób: Liczba punktów skanowania długości fali: 91; Długość fali wzbudzenia: 433 nm; Szerokość pasma wzbudzenia: 10 nm; Długość fali emisji: 460 - 550; Szerokość stopnia: 1 nm; Szerokość pasma emisji: 10 nm; Wysokość ogniskowej uzyskana przez autofokus; Ogniskowa: 5 mm; Długość fali użyta do wzmocnienia: 490 nm.
  3. Dla ustawień ogólnych ustaw instrument w następujący sposób: Czas stabilizacji: 0,1 s; Kierunek czytania: jednokierunkowy, poziomy od lewej do prawej, od góry do dołu.
    UWAGA: Ręcznie wprowadzone wzmocnienie musi być regulowane dla każdego pomiaru przy użyciu studni, która ma wyświetlać najwyższe poziomy intensywności fluorescencji podczas skanowania długości fali.

7. Przygotowanie roztworów hipertonicznych i pomiary fluorescencji

  1. Przygotować roztwory 0 M, 0,2 M, 0,4 M, 0,6 M, 0,8 M, 1 M, 1,5 M i 2 M NaCl na 96-dołkowej czarnej płytce z przezroczystym dnem. Ostateczna objętość w każdym dołku wyniesie 200 μl (150 μl roztworu osmolitu + 50 μl zawiesiny komórek drożdży).
    UWAGA: Inne osmolity mogą być używane do wywoływania stresu hiperosmotycznego. Wszystkie roztwory należy przygotować w 50 mM buforze MES o pH 6.
  2. Załaduj 150 μl 50 mM buforu MES o pH 6 do pierwszych trzech studzienek rzędu A (A1, A2, A3) i do kolejnych studzienek dodaj 150 μl odpowiedniego roztworu w kolejności rosnącej od lewej do prawej (Rysunek 2). W celu zbadania wszystkich sugerowanych stężeń należy kontynuować ładowanie w wierszu B.
    UWAGA: To ustawienie uwzględnia pomiary 3 kontrprób technicznych dla każdego stężenia.
  3. Za pomocą 12-kanałowej mikropipety przenieś 50 μl umytych komórek drożdży do każdej studzienki. Komórki drożdży mają tendencję do osadzania się na dnie zbiornika. Upewnij się, że zawiesina drożdży została dokładnie wymieszana, pipetując w górę iw dół przed przeniesieniem komórek.
  4. Załaduj komórki do 96-dołkowej płytki zawierającej różne roztwory i dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół co najmniej 4 razy.
  5. Natychmiast zmierz widma emisyjne intensywności fluorescencji dla żądanych studzienek w czytniku mikropłytek zgodnie z ustawieniami specyfikacji w kroku 6. Powtórzyć procedurę dla każdego IDR, który ma być badany w teście FRET.
  6. Krok opcjonalny. Jeśli to możliwe, zmierz konstrukt tylko dla dawcy (pDRFLIP38-mCerulean3), wykonując czynności opisane tutaj.
    UWAGA: Zalecamy wykonanie tego kroku w celu obliczenia skuteczności FRET każdego warunku. Jeśli czytnik nie może wykonać tego kroku, FRET można obliczyć przy użyciu metody współczynnika FRET. Obie metody obliczeń FRET są wyjaśnione w krokach 8 i 9.
  7. Wykonaj co najmniej trzy powtórzenia w ciągu trzech niezależnych dni dla każdej konstrukcji.

8. Przetwarzanie danych metodą efektywności FRET

UWAGA: Dla czytelników znających język programowania R udostępniamy zestaw skryptów R do przetwarzania danych opisanych w tej sekcji. Skrypty można znaleźć na stronie https://github.com/Kaz-bits/cuevaslab-procotols/tree/main/FRET. Postępuj zgodnie z instrukcjami w pliku README.

  1. Eksport danych jako plików .xlsx z czytnika mikropłytek.
  2. Normalizuj wartości intensywności fluorescencji przy każdej długości fali skanowania do punktu izobestowego użytej pary FRET.
    UWAGA: Ten krok jest niezbędny do porównania widm wszystkich badanych warunków. Punkt izosbestowy pary mCerulean3 i cytrynu FRET wynosi 515 nm. Na przykład uzyskaj stosunek wartości intensywności fluorescencji 460 nm/515 nm, 461 nm/515 nm, 462 nm/515 nm i tak dalej.
  3. Obliczyć średnią dla każdej kontrpróby technicznej po znormalizowaniu wartości fluorescencji. W sumie powinna istnieć kolumna dla każdego stanu stresu hiperosmotycznego.
  4. Wizualizuj wszystkie widma intensywności fluorescencji na tym samym wykresie (Rysunek 3). Każde widmo powinno wykazywać kombinację widm emisyjnych fluorescencji poszczególnych mCerulean3 i cytrynu. W rzadkich przypadkach, gdy wydajność FRET wynosi 0, obserwowane będzie tylko widmo emisji fluorescencji donorowej lub gdy wydajność FRET wynosi 1, obserwowana będzie tylko fluorescencja akceptorowa. Pik emisji fluorescencji dla mCerulean3 (donor) wynosi 475 nm, a pik emisji fluorescencji dla cytrynu (akceptora) wynosi 525 nm.
  5. Określ, czy pomiar fluorescencji wykazuje typową zmianę FRET w odpowiedzi na stres hiperosmotyczny. Jeśli konformacja IDR jest wrażliwa na obróbkę, odzwierciedli się to jako zmiana wydajności FRET. Typowa zmiana wydajności FRET łączy spadek intensywności fluorescencji dawcy ze wzrostem intensywności fluorescencji akceptora lub odwrotnie.
  6. Określ ilościowo sprawność FRET (EFRET). Uzyskaj znormalizowane wartości szczytowe dawcy (mCerulean3) (475 nm/515 nm) dla konstruktu IDR i konstruktu tylko dla dawcy dla każdego stanu stresu hiperosmotycznego. Należy stosować średnie znormalizowane wartości szczytowe kontrprób technicznych. Wykonaj tę operację dla każdej z trzech niezależnych replikacji. Oblicz EFRET według następującego wzoru:
    figure-protocol-1
    Gdzie IDA jest stosunkiem 475 nm/515 nm z konstrukcji IDR (konstrukcja pary FRET), a ID jest stosunkiem 475 nm/515 nm z konstrukcji opartej wyłącznie na dawcy.
  7. Porównaj wydajność FRET. Znormalizuj wartości EFRET każdego stanu stresu hiperosmotycznego do EFRET stanu niestresowego (na przykład 0 M NaCl). Dokonuj porównań za pomocą wykresu pudełkowego lub wykresu krzywej gładkiej. Wykonaj jednoczynnikową analizę ANOVA, a następnie test statystyczny Tukeya post hoc (wartości p: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001).

9. Przetwarzanie danych metodą współczynnika FRET

UWAGA: Jeśli nie można uzyskać pomiarów tylko od dawcy, wykonaj metodę współczynnika FRET. Metoda ta porównuje stosunek FRET w różnych warunkach stresu hiperosmotycznego. Kroki od 7.1 do 7.5 należy wykonać przed krokami opisanymi w tej sekcji, aby zweryfikować typowe zachowanie FRET. Dla czytelników znających język programowania R udostępniamy zestaw skryptów języka R do wykonywania przetwarzania danych opisanych w tej sekcji. Skrypty można znaleźć na stronie https://github.com/Kaz-bits/cuevaslab-procotols/tree/main/FRET. Postępuj zgodnie z instrukcjami w pliku README.

  1. Wyodrębnij dane przy długości fali 475 nm i 525 nm z pliku xlsx wyeksportowanego wcześniej z czytnika mikropłytek. Wartości te odpowiadają pikowi emisji fluorescencji dla mCerulean3 (donor, DxDm) i pikowi emisji fluorescencji dla cytrynu (akceptor, DxAm), gdy fluorofor donorowy jest wzbudzony (433 nm).
  2. Znormalizować wartości intensywności fluorescencji przy 475 nm i 525 nm do punktu izobestowego użytej pary FRET. Punkt izosbestowy pary mCerulean3 i cytrynu FRET wynosi 515 nm. Uzyskaj współczynnik FRET (DxAm/DxDm).
  3. Porównaj współczynniki FRET. Znormalizuj wartości DxAm/DxDm każdego stanu stresu hiperosmotycznego do średniej DxAm/DxDm stanu niestresowego (na przykład 0 M NaCl). Dokonuj porównań, korzystając z wykresu pudełkowego lub wykresu krzywej gładkiej (Rysunek 4 i Rysunek 5). Wykonaj jednoczynnikową analizę ANOVA, a następnie test statystyczny Tukeya post hoc (wartości p: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po przekształceniu komórek drożdży plazmidem pDRFLIP38-AtLEA4-5, zaobserwowano fluorescencję transformantów dodatnich za pomocą transiluminatora światła niebieskiego i filtra (Rysunek 1). Przygotowanie różnych roztworów do wywołania stresu hiperosmotycznego jest czasochłonne, dlatego sugerujemy skorzystanie z 96-dołkowego szablonu Rysunek 2. Bezpośrednio po leczeniu stresem hiperosmotycznym różnymi stężeniami chlorku sodu uzyskano widma emisji fluorescencji (Rysunek 3). Widma emisji fluorescencji dla każdego stanu uzyskano w celu walidacji typowego zachowania zmiany FRET. Normalizacja wartości intensywności fluorescencji do punktu izobestowego jest wymagana w celu skorygowania błędów doświadczalnych. Aby uzyskać te reprezentatywne wyniki, przetestowaliśmy wcześniej zgłoszony AtLEA4-5, który jest bardzo czułym IDR6. Jako odniesienie przetestowaliśmy również nieco niewrażliwe białko globularne ABP (Rysunek 3). Można zaobserwować, że oba konstrukty wykazują kombinację widm emisyjnych mCerulean3 i cytrynu (piki dla FP donora i akceptora), co wskazuje na pewien stopień podstawowej wydajności FRET w warunkach standardowych (0 M NaCl). W przypadku AtLEA4-5 stres hiperosmotyczny spowodował wzrost intensywności fluorescencji akceptora w połączeniu ze spadkiem intensywności fluorescencji donora, co wskazuje na wywołane stresem hiperosmotycznym zagęszczenie IDR (Figura 3A). Tendencja ta nie została zaobserwowana w ABP (Rysunek 3B). Aby określić ilościowo różnice we wrażliwości strukturalnej w różnych metodach leczenia stresem hiperosmotycznym, wykreśliliśmy współczynnik FRET (DxAm/DxDm) dla każdego stanu i przeprowadziliśmy jednoczynnikowy test statystyczny ANOVA (Rysunek 4). Na koniec porównaliśmy czułość strukturalną AtLE4-5 i ABP. Zaobserwowaliśmy, że AtLEA4-5 wykazywał znacznie wyższą czułość niż ABP (Rysunek 5).

figure-results-1
Rysunek 1: Emisja fluorescencji transformantów S. cerevisiae. Szalka Petriego SD-ura pokryta S. cerevisiae transformowanym plazmidem pDRFLIP38-AtLEA4-5. Fluorescencję obserwowano przy użyciu transiluminatora światła niebieskiego i filtra pomarańczowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Szablon płytki 96-dołkowej dla systemu FRET. Trzy powtórzenia techniczne dla każdego warunku stresu hiperosmotycznego umieszcza się w kolejnych studzienkach. Pierwsze dwa wiersze (A i B) pasują do ośmiu warunków dla jednej konstrukcji (IDR1). Poniższe wiersze mogą pomieścić nowe konstrukcje (IDR2, IDR3 itp.). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Znormalizowane widma emisji fluorescencji w różnych warunkach stresu hiperosmotycznego. W ramach projektu Spectra zweryfikowano typowe zachowanie FRET w odpowiedzi na leczenie stresem hiperosmotycznym (NaCl). (A) AtLEA4-5, wysoce czuły IDR. Wzrost intensywności fluorescencji akceptora jest sprzężony ze spadkiem intensywności fluorescencji dawcy. (B) ABP, lekko niewrażliwe białko globularne. Piki obserwuje się przy 475 nm i 525 nm zgodnie z parą FRET mCerulean3 i Citrine. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Kwantyfikacja wrażliwości strukturalnej w różnych warunkach stresu hiperosmotycznego. Znormalizowany stosunek FRET (DxAm/DxDm) żywych komórek drożdży traktowanych różnymi stężeniami NaCl. (A) ATLEA4-5. (B) Białko wiążące arabinozę (ABP). n = 9 niezależnych pomiarów. Jednokierunkowa ANOVA. NS: Nieistotne. Wartości p: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p< 0,0001. Pola reprezentują percentyl od 25. do 75. (linia na medianie). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Porównanie wrażliwości strukturalnej AtLEA4-5 i ABP. (A) Znormalizowany współczynnik FRET (DxAm/DxDm) w różnych warunkach stresu hiperosmotycznego dla AtLEA4-5 i ABP. n = 3 niezależne pomiary. (B) Wartość Delta FRET (1,5 M - 0 M NaCl) dla AtLEA4-5 i ABP. Zmiana jest podawana jako czułość strukturalna konstrukcji mierzona w systemie FRET przy 1,5 M NaCl. n = 3 niezależne pomiary. Średnia ± SD. Dwukierunkowa ANOVA przy użyciu następujących wartości p: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p< 0,0001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona tu metoda umożliwia uzyskanie wglądu w to, w jaki sposób globalny wymiar zespołu IDR-ów wyczuwa i reaguje na perturbacje środowiskowe. Metoda ta opiera się na genetycznie kodowanym konstrukcie i nie wymaga żadnych dodatkowych składników poza stabilną ekspresją plazmidu w komórkach drożdży, dzięki czemu można ją dostosować do potencjalnych zastosowań w innych typach komórek. Co więcej, jest wszechstronny w badaniu innych zaburzeń fizykochemicznych, których doświadczają komórki eukariotyczne podczas swojego cyklu życiowego21. Rozdzielczość FRET jest godna uwagi, przy czym transfer energii zachodzi tylko w odległości mniejszej niż 10 nm między FP donorowym a akceptorowym. Jednak głównym ograniczeniem jest brak precyzyjnych informacji strukturalnych, których nie można uzyskać za pomocą metody zespołowej FRET.

Nieodłączna heterogeniczność i elastyczność IDR stanowi wyzwanie podczas badania ich zespołu w kontekście komórkowym, co sprawia, że techniki takie jak krystalografia rentgenowska są niepraktyczne. NMR był brany pod uwagę do badania nieuporządkowanych białek w komórkach, ale zmieniające się warunki mogą stanowić problem z powodu zakłóceń sygnału22. Implementacja techniki FRET do badania zespołów konformacyjnych IDR oferuje unikalne możliwości, pozwalające na mapowanie rozmieszczenia populacji w żywych komórkach. Ponadto można go uzupełnić metodami in vitro, takimi jak jednocząsteczkowy FRET (smFRET), co świadczy o jego zdolności adaptacyjnych do różnych podejść i warunków eksperymentalnych23. Protokół ten wykorzystuje mCerulean3 jako dawcę FP i Citrine jako akceptor FP, zapewniając prosty i łatwy do śledzenia system. Wybór par FRET musi dokładnie rozważyć nakładanie się widma, aby złagodzić przesłuchy między sygnałami24,25. Podczas raportowania zmian czułości strukturalnej za pomocą tej metody, wybór odpowiedniej metryki FRET, takiej jak wydajność FRET (EFRET), ma kluczowe znaczenie dla wiarygodnej interpretacji sygnału. Alternatywnie, czułość strukturalna może być analizowana i porównywana przy użyciu współczynnika FRET (DxAm/DxDm), ale wymaga to starannej korekcji przesłuchu fluorescencji donor-akceptor25. Na interpretację danych fluorescencyjnych uzyskanych z czytników mikropłytek mogą mieć wpływ różne czynniki, w tym właściwości fluoroforów, orientacja dipolów, systemy międzycząsteczkowe FRET i wewnątrzcząsteczkowe FRET, przygotowanie próbki i analiza danych25.

Intermolekularny FRET jest głównym ograniczeniem zespołowej metody FRET, ponieważ nie można jej pominąć we wstępnej analizie danych. Stanowi to ważną kwestię dla czytelnika, ponieważ niektóre IDR-y są znane z rekrutacji do kondensatów biomolekularnych26,27. Lokalne stężenie makrocząsteczek w kondensatach biomolekularnych jest wysokie, co może indukować interakcje międzycząsteczkowe, a tym samym wpływać na odczyt FRET. W przypadku AtLEA4-5 wykazano, że samoorganizuje się w dyskretne struktury punktowe pod wpływem stresu hiperosmotycznego w komórkach drożdży6. Aby wykluczyć wpływ międzycząsteczkowego FRET, autorzy inkubowali komórki z 1,6-heksanodiolem (1,6-HD), cząsteczką, która rozbija kondensaty biomolekularne. Leczenie 1,6-HD rozpuściło kondensaty AtLEA4-5, ale poziomy FRET nie uległy zmniejszeniu, co wskazuje, że kondensacja białek nie powoduje niepożądanego międzycząsteczkowego FRET. Ponieważ efekt ten będzie zależał od każdego IDR, czytelnicy powinni zastosować dodatkowe podejścia, takie jak fotowybielanie akceptorowe lub koekspresja konstruktów tylko dawców i tylko akceptorów6. Jednak informacje uzyskane z zespołu FRET w żywych komórkach mają istotne znaczenie dla scharakteryzowania wrażliwości strukturalnej IDR.

Skomplikowanym aspektem przedstawionego tutaj protokołu jest to, że wykorzystuje on organizm, który wykazuje zachowanie reagujące na stres hiperosmotyczny. W obecności wysokich stężeń zewnętrznych chlorku sodu woda opuszcza komórkę, zwiększając całkowite stężenie białka i tworząc zatłoczone środowisko28. IDR-y są wrażliwe na zmiany stłoczenia makromolekularnego 5,6,11,12. W szczególności AtLEA4-5, białko użyte jako model w tym protokole, było wrażliwe na tłumy o różnej masie cząsteczkowej, ale nie na wysokie stężenia soli lub glicerolu in vitro6. Ponieważ akumulacja glicerolu jest ważna dla odpowiedzi i aklimatyzacji komórek drożdży do stresu hiperosmotycznego29, należy podkreślić, że głównym czynnikiem przyczyniającym się do zagęszczenia AtLEA4-5 jest stłoczenie makromolekularne podczas wczesnych zdarzeń wykrywania osmo. To, w jaki sposób zmienia się struktura AtLEA4-5 podczas kolejnych etapów aklimatyzacji, kiedy gromadzi się glicerol, wymaga dalszych badań.

Badanie dynamiki konformacyjnej w nieuporządkowanych białkach obejmuje różne techniki. W tym kontekście FRET jest metodą kluczową. W zależności od konkretnych zapytań badawczych i rozważanych cech, badacze mogą zastosować spektroskopię NMR in vivo w celu scharakteryzowania IDR30. Ponadto smFRET jest cennym narzędziem do badań in vivo 23. Spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) jest kolejną techniką wykorzystywaną do ilościowego badania IDR w kontekście komórkowym31. Metody oparte na spektrometrii mas są również potężnymi podejściami, ponieważ mogą dostarczyć informacji strukturalnych na temat konformacji komórkowej białek32. Metody te obejmują natywną spektrometrię mas (native-MS) i spektrometrię mas ruchliwości jonów (IM-MS)32,33. Wszystkie te metody umożliwiają naukowcom zagłębienie się w wielorakie konformacje IDR i jego dynamikę, rzucając światło na ich wkład w biologię komórki. Protokół opisany w tej pracy może być wykorzystany do przeprowadzenia wstępnego badania przesiewowego wrażliwości strukturalnej w sposób wysokoprzepustowy. Badania uzupełniające mogą koncentrować się na testowaniu wrażliwości strukturalnej w pożądanym typie komórki lub z potencjałem uzyskania wglądu mechanistycznego za pomocą metod in vitro, takich jak smFRET, CD lub SAXS. Połączenie metod jest niezbędne do uzyskania jasnego obrazu wrażliwości strukturalnej IDR w zmieniającym się otoczeniu komórek.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy członkom laboratorium Cuevas-Velazquez za krytyczną recenzję manuskryptu. Prace te były wspierane przez Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica, Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM-PAPIIT) numer projektu IA203422; Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnología (CONAHCYT), numer projektu 252952; oraz Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Grant 5000-9182. CET (CVU 1083636) i CAPD (CVU 1269643) przyznają CONAHCYT stypendium M.Sc.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Płytka 96-dołkowaGreiner Bio-One655096
AgarSigma-Aldrich5040
BglIINew England BioLabsR0144S
BJ5465 CellsAmerican Type Culture Collection208289
Buffer MES 50 mMSigma-AldrichM8250
Buffer Tris-HCl 10 mMInvitrogen
EDTA 1 mMMerck108452
FalconCorning352057
LB mediaSigma-AldrichL2897
Octan litu 0,1 MSigma-AldrichL6883
Agaroza niskotopliwaGOLDBIOA-204-25
Mikrowirówkaeppendorf5452000010
Zestaw do miniprzygotowaniaZymoPureD4210
NaOH 0,02 MMerck106462
PEG 3,350 40%Sigma-Aldrich1546547
plazmid pDRFLIP38-AtLEA4-5addgene178189
Czytnik płytekBMG LABTECHCLARIOstar Plus
SacINew England BioLabsR3156S
DNA nasienia łososia 2 mg/mlThermo Fisher Scientific15632011
SD-UraSigma-AldrichY1501
Klocyd soduSigma-AldrichS9888
Taq polymesarePromegaM5123
TransiluminatorInstrumenty AccurisE4000
Spektrofotometr UV-VisibleThermo Fisher ScientificBiomate3
YPDSigma-AldrichY1500
15506017 Probówki

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wright, P. E., Dyson, H. J. Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (1), 18-29 (2015).
  2. Covarrubias, A. A., Romero-Pérez, P. S., Cuevas-Velazquez, C. L., Rendón-Luna, D. F. The functional diversity of structural disorder in plant proteins. Arch Biochem Biophys. 680, 108229(2019).
  3. Ahmed, S. S., et al. Characterization of intrinsically disordered regions in proteins informed by human genetic diversity. PLoS Comput Biol. 18 (3), e1009911(2022).
  4. Birol, M., Melo, A. M. Untangling the conformational polymorphism of disordered proteins associated with neurodegeneration at the single-molecule level. Front Mol Neurosci. 12, 309(2019).
  5. Moses, D., et al. Revealing the hidden sensitivity of intrinsically disordered proteins to their chemical environment. J Phys Chem Lett. 11 (23), 10131-10136 (2020).
  6. Cuevas-Velazquez, C. L., et al. Intrinsically disordered protein biosensor tracks the physical-chemical effects of osmotic stress on cells. Nat Commun. 12 (1), 5438(2021).
  7. Holehouse, A. S., Sukenik, S. Controlling structural bias in intrinsically disordered proteins using solution space scanning. J Chem Theory Comput. 16 (3), 1794-1805 (2020).
  8. Martin, E. W., Hopkins, J. B., Mittag, T. Small-angle X-ray scattering experiments of monodisperse intrinsically disordered protein samples close to the solubility limit. Methods Enzymol. 646, 185-222 (2021).
  9. Miles, A. J., Drew, E. D., Wallace, B. A. DichroIDP: a method for analyses of intrinsically disordered proteins using circular dichroism spectroscopy. Commun Biol. 6 (1), 823(2023).
  10. Kaminski, C. F., Rees, E. J., Schierle, G. S. K. A quantitative protocol for intensity-based live cell FRET imaging. Method Mol Biol. 1076, 445-454 (2014).
  11. Moses, D., et al. Structural biases in disordered proteins are prevalent in the cell. bioRxiv. , (2022).
  12. Cuevas-Velazquez, C. L., Saab-Rincón, G., Reyes, J. L., Covarrubias, A. A. The Unstructured N-terminal Region of Arabidopsis Group 4 Late Embryogenesis Abundant (LEA) Proteins Is Required for Folding and for Chaperone-like Activity under Water Deficit. J Biol Chem. 291 (20), 10893-10903 (2016).
  13. JoVE Science Education Database. Restriction enzyme digests. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  14. JoVE Science Education Database. Gel purification. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  15. JoVE Science Education Database. DNA ligation reactions. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  16. JoVE Science Education Database. Bacterial transformation using heat Ssock and competent cells. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  17. JoVE Science Education Database. PCR: Principle, instrumentation, and applications. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  18. JoVE Science Education Database. Plasmid purification. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  19. JoVE Science Education Database. DNA gel electrophoresis. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  20. JoVE Core Molecular Biology. Sanger/chain termination sequencing using dideoxynucleotides - Concept. , Available from: https://app.jove.com/science-education/v/12020/sanger-sequencing (2023).
  21. Theillet, F. X., et al. Physicochemical properties of cells and their effects on intrinsically disordered proteins (IDPs). Chem Rev. 114 (13), 6661-6714 (2014).
  22. Brutscher, B., et al. NMR methods for the study of instrinsically disordered proteins structure, dynamics, and interactions: General overview and practical guidelines. Adv Exp Med Biol. 870, 49-122 (2015).
  23. Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annu Rev Phys Chem. 71, 391-414 (2020).
  24. Roebroek, T., et al. Simultaneous readout of multiple FRET pairs using photochromism. Nat Commun. 12 (1), 2005(2021).
  25. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nat Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  26. Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).
  27. Belott, C., Janis, B., Menze, M. A. Liquid-liquid phase separation promotes animal desiccation tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (44), 27676-27684 (2020).
  28. Miermont, A., et al. Severe osmotic compression triggers a slowdown of intracellular signaling, which can be explained by molecular crowding. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5725-5730 (2013).
  29. Saito, H., Posas, F. Response to hyperosmotic stress. Genetics. 192 (2), 289-318 (2012).
  30. Selenko, P., Wagner, G. Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy. J Struct Biol. 158 (2), 244-253 (2007).
  31. Cattani, J., Subramaniam, V., Drescher, M. Room-temperature in-cell EPR spectroscopy: alpha-Synuclein disease variants remain intrinsically disordered in the cell. Phys Chem Chem Phys. 19 (28), 18147-18151 (2017).
  32. Beveridge, R., Chappuis, Q., Macphee, C., Barran, P. Mass spectrometry methods for intrinsically disordered proteins. Analyst. 138 (1), 32-42 (2013).
  33. Beveridge, R., et al. Ion mobility mass spectrometry uncovers the impact of the patterning of oppositely charged residues on the conformational distributions of intrinsically disordered proteins. J Am Chem Soc. 141 (12), 4908-4918 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Intrinsically Disordered RegionsStructural SensitivityHyperosmotic StressFRET MeasurementSaccharomyces CerevisiaeFluorescence IntensityProtein ConformationMicroplate ReaderOsmolyte ResponseYeast Cell Stress

Related Articles