Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badanie porównawcze matryc podstawno-błonowych do utrzymania ludzkich komórek macierzystych i generowania organoidów jelitowych

3.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66277

⸱

15 marca 2024

 ,  ,  , 
1Center for Pharmacometrics & Systems Pharmacology, Department of Pharmaceutics, University of Florida, 2TheWell Bioscience, Inc

W tym artykule

Podsumowanie

Organoidy stały się cennymi narzędziami do modelowania chorób. Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) kieruje losem komórki podczas generowania organoidów, a użycie systemu, który przypomina tkankę natywną, może poprawić dokładność modelu. W badaniu tym porównano wytwarzanie indukowanych organoidów jelitowych ludzkich komórek macierzystych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w hydrożelach ECM pochodzenia zwierzęcego i bezksenowęglowych.

Streszczenie

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) odgrywa kluczową rolę w zachowaniu i rozwoju komórek. Organoidy wytwarzane z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) znajdują się w centrum uwagi wielu obszarów badawczych. Jednak brak wskazówek fizjologicznych w klasycznych materiałach do hodowli komórkowych utrudnia skuteczne różnicowanie iPSC. Włączenie dostępnego na rynku ECM do hodowli komórek macierzystych dostarcza fizycznych i chemicznych wskazówek korzystnych dla utrzymania komórek. Dostępne na rynku produkty błony podstawnej pochodzenia zwierzęcego składają się z białek ECM i czynników wzrostu, które wspomagają utrzymanie komórek. Ponieważ ECM posiada właściwości specyficzne dla tkanki, które mogą modulować los komórki, matryce wolne od ksenotypów są wykorzystywane do przesyłania translacji do badań klinicznych. Chociaż dostępne na rynku matryce są szeroko stosowane w badaniach nad hiPSC i organoidami, równoważność tych matryc nie została jeszcze oceniona. W tym miejscu przeprowadzono badanie porównawcze utrzymania hiPSC i wytwarzania organoidów jelitowych człowieka (hIO) w czterech różnych matrycach: Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB) i VitroGel (Matrix 4-XF). Chociaż kolonie nie miały idealnie okrągłego kształtu, spontaniczne różnicowanie było minimalne, a ponad 85% komórek wykazywało ekspresję markera komórek macierzystych SSEA-4. Matrix 4-XF doprowadził do powstania okrągłych grudek 3D. Ponadto zwiększenie stężenia suplementu i czynników wzrostu w pożywkach używanych do wytwarzania roztworu hydrożelu Matrix 4-XF poprawiło ekspresję hiPSC SSEA-4 1,3-krotnie. Różnicowanie hiPSC utrzymywanych przez Matrix 2-AB doprowadziło do mniejszego uwalniania sferoidów w stadium środkowego / tylnego jelita w porównaniu z innymi błonami podstawnymi pochodzenia zwierzęcego. W porównaniu z innymi, matryca organoidowa wolna od ksenotypów (Matrix 4-O3) prowadzi do większych i bardziej dojrzałych hiIO, co sugeruje, że właściwości fizyczne hydrożeli wolnych od ksenotypów można wykorzystać do optymalizacji wytwarzania organoidów. Podsumowując, wyniki sugerują, że różnice w składzie różnych matryc wpływają na etapy różnicowania IO. Badanie to podnosi świadomość na temat różnic w dostępnych na rynku matrycach i stanowi przewodnik po optymalizacji matryc podczas pracy z iPSC i IO.

Wprowadzenie

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) jest dynamicznym i wielofunkcyjnym składnikiem tkanek, który odgrywa kluczową rolę w regulacji zachowania i rozwoju komórek. Jako złożona sieć zapewnia wsparcie strukturalne, ligandy adhezyjne komórek1 oraz magazynowanie czynników wzrostu i cytokin, które regulują sygnalizację komórkową. Na przykład podczas gojenia się ran ECM służy jako rusztowanie dla migrujących komórek i jako rezerwuar czynników wzrostu zaangażowanych w naprawę tkanek2. Podobnie, rozregulowanie ECM może prowadzić do zwiększenia nasilenia różnych chorób, takich jak zwłóknienie i rak3,4. Podczas rozwoju embrionalnego ECM kieruje morfogenezą tkanek. Na przykład w rozwoju serca komponenty ECM odgrywają rolę w tworzeniu prawidłowej architektury i funkcji tkanki serca5. Ponad dekada badań wykazała, że sama sztywność mikrośrodowiska6,7 może kontrolować specyfikację linii komórek macierzystych. Nic więc dziwnego, że podczas różnicowania komórek in vitro ECM wpływa na los komórek macierzystych, dostarczając sygnałów do różnicowania.

Organoidy mogą być generowane z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Rozpoczęcie od odpowiednio scharakteryzowanej linii iPSC jest niezbędne do pomyślnego wytworzenia organoidów. Jednak brak wskazówek fizjologicznych w klasycznych materiałach do hodowli komórkowych utrudnia skuteczne różnicowanie iPSC i wytwarzanie organoidów. Co więcej, ostatnie badania podkreśliły znaczenie składu macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), interakcji między komórkami a ECM8, a także wskazówek mechanicznych i geometrycznych9,10,11 w kontekście ekspansji i różnicowania organoidów12. Rozwój technologii organoidów poprzez poprawę odtwarzalności będzie wymagał uwzględnienia wskazówek fizycznych i chemicznych specyficznych dla tkanki.

Organoidy mają na celu odtworzenie rodzimej tkanki w fizjologicznie podobnym mikrośrodowisku. Wybór systemu ECM, który ściśle naśladuje natywny tkankowy ECM, ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia fizjologicznego znaczenia dotyczącego zachowania, funkcji i odpowiedzi komórki na bodźce13. Wybór składników ECM może wpływać na różnicowanie komórek macierzystych w określone typy komórek w organoidzie. Różne białka ECM i ich kombinacje mogą dostarczać wskazówek, które kierują losem komórki14. Na przykład badania wykazały, że stosowanie określonych komponentów ECM może sprzyjać różnicowaniu jelitowych komórek macierzystych w dojrzałe typy komórek jelitowych, co skutkuje fizjologicznie istotnymi organoidami jelitowymi15. Chociaż organoidy są cennym narzędziem podczas modelowania chorób i testowania leków, wybór odpowiedniego systemu ECM ma kluczowe znaczenie dla tego zastosowania. Odpowiedni system ECM może zwiększyć dokładność modelowania choroby poprzez stworzenie mikrośrodowiska, które przypomina dotkniętą chorobą tkankę16. Co więcej, specyficzny tkankowo ECM może pomóc w generowaniu organoidów, które lepiej podsumowują fenotypy związane z chorobą i reakcje na leki17. Optymalizacja systemu ECM stosowanego w różnicowaniu organoidów ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia pożądanych wyników różnicowania.

Komercyjnie dostępne systemy membran bazowych pochodzące ze zwierzęcych źródeł ECM (np. Matrigel, Cultrex) i hydrożel wolny od kseno-merów (np. VitroGel) są szeroko stosowane w badaniach nad iPSC i organoidami. Firmy, które je komercjalizują, oraz badacze, którzy z nich korzystają, na przestrzeni lat opracowali wiele instrukcji dotyczących ich konkretnych produktów i zastosowań. Wiele z tych instrukcji posłużyło jako przewodnik przy generowaniu tego protokołu. Co więcej, korzyści i niepowodzenia związane z ich wewnętrznymi właściwościami zostały indywidualnie odnotowane przez wielu18,19,20,21. Nie istnieje jednak systematyczny przepływ pracy, który kierowałby wyborem optymalnych systemów do pracy z iPSC i organoidami. W tym miejscu zapewniony jest przepływ pracy umożliwiający systematyczną ocenę równoważności systemów ECM z różnych źródeł dla iPSC i pracy organoidowej. Jest to badanie porównawcze utrzymania dwóch różnych ludzkich linii iPSC (hiPSC) i generacji organoidów jelitowych człowieka (hIO) w czterech różnych matrycach: Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB) i VitroGel (Matrix 4-XF). Do hodowli organoidów wykorzystano cztery wersje matrycy wolnej od ksenotypu VitroGel, które wcześniej zostały zoptymalizowane pod kątem hodowli organoidów: ORGANOID 1 (Matrix 4-O1), ORGANOID 2 (Matrix 4-O2), ORGANOID 3 (Matrix 4-O3), ORGANOID 4 (Matrix 4-O4). Wykorzystano również matryce pochodzenia zwierzęcego zoptymalizowane pod kątem organoidów: Matrigel High Concentration (Matrix 1-ABO) i Cultrex Type 2 (Matrix 3-ABO). Użyto dostępnych na rynku pożywek do hodowli komórek macierzystych (mTeSR Plus) oraz zestawu do różnicowania organoidów (STEMdiff intestinal organoid kit). Protokół ten łączy indywidualne instrukcje od producentów produktów z doświadczeniami laboratoryjnymi, aby poprowadzić czytelnika w kierunku skutecznej optymalizacji ECM pod kątem ich specyficznej pracy z iPSC i organoidami. Podsumowując, ten protokół i reprezentatywne wyniki podkreślają znaczenie wyboru optymalnego mikrośrodowiska dla pracy komórek macierzystych i różnicowania organoidów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla hiPSC

OSTRZEŻENIE: Wszystkie prace są wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza (BSC) zgodnie ze standardowymi technikami aseptycznymi. Należy przestrzegać norm bezpieczeństwa OSHA dla laboratoriów, w tym właściwego stosowania środków ochrony osobistej, takich jak fartuchy laboratoryjne, rękawiczki i gogle.

  1. Przygotowanie aliquotów macierzy i pożywek do hodowli komórkowej
    1. W przypadku komercyjnie dostępnych błon podstawnych pochodzenia zwierzęcego (BMs; Matrix 1-AB, Matrix 2-AB, Matrix 3-AB), przygotować aliquoty w objętościach roboczych zgodnie z zaleceniami producenta zestawionymi w Tabeli 1 i przechowywać je w temperaturze -20 °C lub -80 °C do długotrwałego przechowywania. Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza. Jeśli powstaną pęcherzyki, przed przechowywaniem odwirować próbki w temperaturze 4 °C, przy <200 x g, przez ok. 1-2 min, aby wypchnąć pęcherzyki na powierzchnię.
      UWAGA: Tworzenie aliquotów jednorazowych pomaga uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania, które niszczą strukturę ECM. Ponieważ stężenie BM różni się w zależności od numeru partii, należy ściśle przestrzegać zaleceń producenta podczas przygotowywania aliquotów jednorazowych i roztworów do powlekania. BMs o wysokim stężeniu są lepkie i trudne do pipetowania; należy używać zimnych końcówek wcześniej przechowywanych w -20 °C.
    2. Przygotować pożywkę do hodowli komórek macierzystych zgodnie z zaleceniami producenta. Aby przygotować specyficzne, komercyjnie dostępne pełne pożywki użyte w tym protokole, dodać 100 mL 5-krotnego koktajlu suplementów do 400 mL pożywki bazowej. Następnie dokładnie wymieszać pożywkę i rozdzielić na aliquoty po 40 mL, przechowywane w 20 °C. Przed użyciem rozmrozić każdy aliquot pełnej pożywki i zużyć go niezwłocznie lub przechowywać w temperaturze 2 - 8 °C do 2 tygodni. Nie zamrażać ponownie.
    3. Przygotować aliquoty pełnej pożywki dla komórek macierzystych zawierające 3-krotne stężenie koktajlu suplementów w celu przygotowania hydrożelu Matrix 4-XE, t.j. rozcieńczyć suplement 5x do 3x.
  2. Powlekanie plastiku do hodowli tkanek błonami podstawnymi pochodzenia zwierzęcego (Matrix 1-3AB)
    1. Przed rozpoczęciem przygotować następujące elementy: macierze podczas rozmrażania i manipulowania zawsze trzymać na lodzie, aby zapobiec ich żelowaniu. Do przygotowania rozcieńczonych macierzy używać zimnych pożywek. Przed rozpoczęciem oraz na każdym etapie procesu różnicowania hiPSC i generowania organoidów hIO przygotować odpowiednią liczbę powtórzeń w dołkach dla każdego warunku, aby móc analizować komórki.
      UWAGA: W niniejszym badaniu zastosowano płytki 24-dołkowe. Zalecane objętości powlekania dla innych rozmiarów płytek znajdują się w Tabeli 2.
    2. Dla każdego rodzaju macierzy przygotować 25 mL zimnej pożywki advance DMEM/F-12 zawierającej 15 mM HEPES w probówce stożkowej 50 mL. Przechowywać na lodzie.
    3. Dodać rozmrożone macierze do odpowiednich zimnych pożywek advance DMEM/F-12 i dobrze wymieszać. Podczas mieszania utrzymać niską temperaturę pożywek. Wizualnie sprawdzić jednorodność mieszaniny, upewniając się, że nie ma grudek.
    4. Niezwłocznie użyć rozcieńczonych roztworów macierzy do powlekania każdego dołka wybranego do użycia (250 µL/dołek w przypadku płytek 24-dołkowych).
    5. Delikatnie przechylić naczynie hodowlane, aby równomiernie rozprowadzić roztwór powlekający po całej powierzchni. Inkubować w temperaturze pokojowej (15 - 25 °C) przez co najmniej 1 h przed użyciem.
      UWAGA: Jeśli płytka nie zostanie użyta niezwłocznie, można ją przechowywać w temperaturze 2 - 8 °C do 1 tygodnia po powleczeniu, jednak musi być ona uszczelniona przezroczystą folią, aby zapobiec odparowywaniu. W przypadku użycia przechowywanych płytek, należy pozwolić im osiągnąć temperaturę pokojową (15 - 25 °C) przez 30 min przed przejściem do następnego kroku.
    6. Delikatnie usunąć nadmiar roztworu za pomocą pipety serologicznej lub poprzez aspirację. Należy upewnić się, że powleczona powierzchnia nie została zarysowana.
    7. Niezwłocznie dodać ciepłą pełną pożywkę dla komórek macierzystych (50% całkowitej objętości wymaganej dla konkretnego dołka, np. 250 µL/dołek w przypadku płytki 24-dołkowej).
  3. Powlekanie plastiku do hodowli tkanek hydrożelem Matrix 4-XE
    1. Przed rozpoczęciem przygotować następujące elementy: wyjąć hydrożel Matrix 4-XE z lodówki i pozwolić mu ogrzać się do temperatury pokojowej (25 °C). Przed rozpoczęciem oraz na każdym etapie procesu różnicowania hiPSC i generowania organoidów hIO przygotować odpowiednią liczbę powtórzeń w dołkach dla każdego warunku, aby móc analizować komórki.
      UWAGA: W niniejszym badaniu zastosowano płytki 24-dołkowe. Zalecane objętości powlekania dla innych rozmiarów płytek znajdują się w Tabeli 3.
    2. Przygotować pełną pożywkę do hodowli komórek macierzystych zawierającą 3-krotne stężenie czynników wzrostu w porównaniu ze standardową recepturą dla hodowli komórek macierzystych (pożywka 3x dla komórek macierzystych).
    3. Wymieszać hydrożel Matrix 4-XE i pożywkę 3x dla komórek macierzystych w stosunku objętościowym 2:1 v/v i delikatnie pipetować w górę i w dół 5-10 razy, aby dokładnie wymieszać.
    4. Przenieść mieszaninę hydrożelu do płytki wielodołkowej i ostrożnie przechylić naczynie hodowlane, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę po całej powierzchni. Użyć 250 µL/dołek w przypadku płytki 24-dołkowej. Zalecane objętości znajdują się w Tabeli 3.
    5. Odczekać 10-15 min w temperaturze pokojowej do uformowania się miękkiego żelu. Podczas procesu formowania hydrożelu nie wolno zakłócać struktury żelu poprzez przechylanie lub potrząsanie płytką.
  4. Bezenzymatyczne pasażowanie i wysiew agregatów hiPSC
    1. Przed rozpoczęciem przygotować następujące elementy: co najmniej 1 h przed pasażowaniem powlecć odpowiednie naczynia plastikowe macierzami. Odmierzyć odpowiednią ilość pełnej pożywki dla komórek macierzystych i ogrzać do temperatury pokojowej (15 - 25 °C). Unikać wielokrotnych cykli podgrzewania pełnej pożywki.
      UWAGA: Poniższe kroki opisują pasażowanie już ustabilizowanej i >90% konfluencyjnej hodowli iPSC na płytce 6-dołkowej oraz ich wysiew na płytki 24-dołkowe w celu różnicowania organoidów jelitowych.
    2. Przepłukać komórki 1 mL D-PBS (bez Ca++ i Mg++) i aspirować. Dodać 1 mL bezenzymatycznego odczynnika do selekcji ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, ostrożnie zamieszać ruchem okrężnym, aby równomiernie rozprowadzić, i aspirować w ciągu 1 min. Kolonie powinny być wystawione jedynie na cienką warstwę cieczy.
    3. Inkubować w 37 °C, aż kolonie zaczną wyglądać na mniej zwarte, co zajmie ok. 3-8 min.
      UWAGA: Optymalny czas inkubacji może się różnić w zależności od użytej linii komórkowej. Optymalny czas inkubacji należy ustalić podczas pierwszego pasażowania danej linii komórkowej z użyciem bezenzymatycznego odczynnika do selekcji ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.
    4. Dodać 1 mL pełnej pożywki dla komórek macierzystych. Odczepić kolonie, ostrożnie i mocno opukując bok płytki. Płytkę należy trzymać drugą ręką.
    5. Za pomocą pipety o objętości 1 mL lub większej przenieść zawiesinę agregatów komórkowych do probówki stożkowej 15 mL. Ocenić wielkość agregatów za pomocą mikroskopu w świetle przechodzącym i upewnić się, że wielkość agregatów mieści się w przedziale 50-200 µm; jeśli są większe, delikatnie potrząsnąć probówką stożkową, aby je rozbić.
    6. Narysować siatkę x-y na dnie każdego dołka płaskodennej płytki 96-dołkowej, która będzie służyć do liczenia agregatów, i dodać 50 µL D-PBS do każdego z dołków. Zaleca się wyciągnięcie średniej z agregatów policzonych w 3 dołkach.
    7. Upewnić się, że agregaty komórkowe są równomiernie rozłożone, delikatnie potrząsając probówką, a następnie przenieść 5 µL zawiesiny agregatów do każdego z dołków płaskodennej płytki 96-dołkowej.
      UWAGA: Nie zaleca się stosowania automatycznego licznika komórek do liczenia agregatów. Zalecane jest liczenie ręczne.
    8. Policzyć całkowitą liczbę agregatów w każdym dołku, których średnica wynosi 50 - 200 µm. Jeśli większość agregatów komórkowych ma średnicę > 200 µm (patrz Rysunek 1), powtórzyć kroki 1.4.5 - 1.4.7.
    9. Obliczyć objętość (w µL) zawiesiny agregatów wymaganą do wysiewu 6 000 agregatów według następującego wzoru:
      Wzór na obliczenie objętości zawiesiny agregatów; równanie matematyczne; badania naukowe.
      UWAGA: Optymalna gęstość wysiewu musi zostać zoptymalizowana dla każdej linii komórkowej. Aby określić optymalną gęstość wysiewu, zaleca się przeprowadzenie wstępnego wysiewu w zakresie różnych gęstości agregatów (np. 4 000, 5 000 i 6 000 agregatów na dołek) i sprawdzenie po 24-48 h od wysiewu, czy osiągnięto konfluencję 85%-90%.
    10. W ramach kontroli jakości oddzielić próbkę komórek do badania markerów komórek macierzystych metodą cytometrii przepływowej. Listę powszechnie stosowanych markerów znajduje się w Tabeli 4.
    11. Rozdzielić wymaganą objętość zawiesiny agregatów iPSC do osobnych probówek 15 mL w celu wysiewu do dołków powleczonych różnymi ECM.
    12. Odwirować probówkę zawierającą roztwór agregatów iPSC przy 200 x g przez 5 min, aby usunąć pożywkę zawierającą bezenzymatyczny odczynnik do selekcji ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Oczekując na zakończenie wirowania, dodać 50% pożądanej objętości na dołek do każdego dołka, jeśli nie zostało to jeszcze zrobione.
  5. Hodowla iPSC na płytkach zawierających macierze pochodzenia zwierzęcego
    1. Delikatnie resuspendować agregaty iPSC w obliczonej 50% objętości pełnej pożywki dla komórek macierzystych, aby uzyskać pożądane zagęszczenie, a następnie nanieść mieszaninę agregatów komórkowych do powleczonych dołków zawierających 50% obliczonej objętości pełnej pożywki dla komórek macierzystych.
      UWAGA: W przypadku niektórych linii komórkowych lub gdy agregaty mają wielkość 50 µm lub mniejszą, konieczne może być dodanie inhibitora ROCK-1. Zaleca się dodanie <10 µm, aby uniknąć przedwczesnej gastrulacji.
    2. Ostrożnie dodać pożywkę z komórkami na wierzch macierzy, 250 µL/dołek w przypadku płytki 24-dołkowej. Zalecane objętości pożywki komórkowej dla płytek o innych rozmiarach dołków znajdują się w Tabeli 2.
    3. Przechylać płytkę kilkukrotnie w krótkich ruchach w przód i w tył oraz na boki, aby równomiernie rozprowadzić agregaty komórkowe.
      OSTROŻNIE: Nierównomierny rozkład agregatów prowadzi do zwiększenia spontanicznego różnicowania ludzkich iPSC. Kołowe rozprowadzanie zawiesiny agregatów powoduje ich aglomerację na krawędziach dołków i niższą gęstość w centrum.
    4. Inkubować płytkę w 37 °C i codziennie lub co drugi dzień wymieniać pożywkę na pełną pożywkę dla komórek macierzystych. Podczas wymiany pożywki wizualnie oceniać hodowle, aby monitorować wzrost i ustalić, czy komórki wymagają pasażowania, czy są gotowe do różnicowania. Aby pominąć dwa kolejne dni karmienia, dodać 2-krotną objętość pożywki potrzebną na jeden dzień.
  6. Hodowla iPSC na płytkach zawierających Matrix 4-XE
    1. Delikatnie resuspendować agregaty iPSC w całkowitej obliczonej objętości 3-krotnej pełnej pożywki dla komórek macierzystych, aby uzyskać pożądane zagęszczenie.
    2. Ostrożnie dodać pożywkę z komórkami na wierzch hydrożelu, 250 µL/dołek w przypadku płytki 24-dołkowej. Zalecane objętości pożywki komórkowej dla płytek o innych rozmiarach dołków znajdują się w Tabeli 3.
      OSTROŻNIE: Hydrożel spuchnie i zajmie większą objętość niż bezpośrednio po przygotowaniu. Kolonie iPSC będą częściowo zatopione w hydrożelu na dnie płytki, dlatego zaleca się wymianę 50%-80% górnej warstwy pożywki bez naruszania hydrożelu.
    3. Przesuwać płytkę kilkukrotnie w szybkich, krótkich ruchach w przód i w tył oraz na boki, aby równomiernie rozprowadzić agregaty komórkowe.
    4. Umieścić płytkę w inkubatorze w 37 °C z 5% CO2 i 95% wilgotności. Wymieniać pożywkę komórkową na pełną pożywkę dla komórek macierzystych. Wymiany pożywki przeprowadzać codziennie lub co drugi dzień; w tym drugim przypadku dodać 2-krotną objętość pożywki.
    5. Wizualnie kontrolować hodowle, aby śledzić ich wzrost do momentu osiągnięcia stadium odpowiedniego do różnicowania.

Porównanie wielkości iPSC na obrazie mikroskopowym; pasek skali 200μm; analiza hodowli komórkowych.
Rycina 1: Optymalna wielkość agregatu. Obrazy agregatów linii komórkowej iPSC SCTi003A przedstawiające przykład optymalnej wielkości agregatu. Pasek skali = 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

2. Dyferencjacje hiPSC i generowanie organoidów jelitowych

UWAGA: Wszystkie prace są wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza (BSC) zgodnie ze standardowymi technikami aseptycznymi. Należy przestrzegać norm bezpieczeństwa OSHA dla laboratoriów, w tym prawidłowego stosowania środków ochrony osobistej, takich jak fartuchy laboratoryjne, rękawiczki i gogle ochronne.

  1. Przed rozpoczęciem należy przygotować następujące elementy: przygotować alikwoty medium do różnicowania niezbędne dla każdego etapu. Po rozmrożeniu alikwotów należy ich niezwłocznie użyć. Nie zamrażać ponownie. Postępować zgodnie z Tabela 5 ogólny przewodnik po typach pożywek oraz objętościach potrzebnych na każdym etapie dla płytki 24-dołkowej.
    UWAGA: Optymalny czas na każdym etapie różnicowania może się różnić w zależności od linii komórkowej. W celu poprawy efektywności różnicowania zaleca się sprawdzanie ekspresji markerów komórkowych charakterystycznych dla każdego etapu. W niniejszym badaniu nie zastosowano okresowej oceny ekspresji genów w hodowlach iPSC, ponieważ wykorzystano zweryfikowane przez dostawcę partie o niskim numerze pasażu, jednak jest ona zalecana jako krok kontroli jakości dla nowych lub nieweryfikowanych jeszcze linii iPSC podczas kolejnych etapów różnicowania.
  2. Etap 1: Definitywna endodermą (DE)
    1. Aby ocenić gotowość do rozpoczęcia różnicowania, należy sprawdzić następujące kryteria.
      1. Za pomocą mikroskopu należy ocenić stopień zрастаcia (konfluencję) kolonii komórek macierzystych oraz stopień spontanicznego różnicowania w hodowli. Nie należy polegać wyłącznie na ocenie morfologicznej. Optymalna konfluencja powinna wynosić od 85% do 90% (powyżej ~105 komórki/cm2), a obserwowana minimalna różnicowanie spontaniczne powinno być <5% różnicowania.
      2. Przed przejściem do następnego etapu należy zebrać komórki z studni poświęcalnej w celu charakterystyki markerów hiPSC za pomocą cytometrii przepływowej. W reprezentacyjnej charakterystyce cytometrycznej zastosowano strategię bramkowania w oparciu o rozproszenie światła przednie i boczne. Jeśli komórki spełniają optymalne kryteria, należy rozpocząć różnicowanie. Kryteria przejścia dla komórek to >ekspresja najlepiej 3 markerów na poziomie 85% (Tabela 4), szczególnie w przypadku nowych lub niezakwalifikowanych jeszcze w laboratorium linii iPSC.
        UWAGA: hodowle iPSC hodowane na różnych macierzach przechodzą ten sam ogólny proces, przy czym jedynie w przypadku wzrostu iPSC na Matrix 4-XE wymagane są łagodniejsze zmiany pożywki, aby nie naruszyć częściowo zatopionych komórek. Podczas indukcji ostatecznej endodermy spodziewana jest znaczna śmierć komórek, ponieważ na tym etapie są one szczególnie wrażliwe. Należy zachować ostrożność podczas wymiany pożywki, dążąc do zminimalizowania czasu ekspozycji komórek poza 37 °C środowisko inkubacji w jak największym stopniu.
    2. Rozpocząć różnicowanie kolonii komórek zgodnie z opisem poniżej.
      1. Dzień 0: Podgrzać alikwot pożywki DE do 37 °CAby uniknąć denaturacji pożywek w wyniku cykli ogrzewania i chłodzenia, należy podgrzać tylko objętość wymaganą dla dnia 0 (0,7 ml/dołek).
      2. Odssać pożywkę z hiPSC. Ostrożnie dodać 0,7 ml pożywki DE Medium na studzienkę, aplikując ją po ściance studzienki. Należy unikać gwałtownego pipetowania, które mogłoby doprowadzić do odklejenia lub uszkodzenia kolonii. Inkubować płytkę w 37 °C z 5% CO2 oraz wilgotność 95% przez 24 h.
      3. Dzień 1: Podgrzać alikwot medium DE w objętości niezbędnej na Dzień 1 (0,5 ml/dołek) do 37 °COdessać pożywkę DE z komórek i ostrożnie dodać 0,5 ml pożywki DE na studzienkę, wlewając ją po ściance. Inkubować w 37 °C z 5% CO2 oraz 95% wilgotności przez 24 h.
      4. Dzień 3: Komórki są gotowe do analizy w celu oceny formowania się definitywnej endodermy. Należy odnieść się do Tabela 4 dla rekomendowanych markerów. Przed przejściem do kolejnej fazy należy poświęcić jedną studnią w celu przeprowadzenia charakterystyki cytometrycznej za pomocą przepływowej cytometrii dla specyficznych markerów związanych z DE. Do reprezentatywnej charakterystyki cytometrycznej zastosowano strategię bramkowania rozproszenia przedniego i bocznego (FSC i SSC). Zaleca się sprawdzenie ekspresji więcej niż jednego markera, zwłaszcza w przypadku nowych lub niezakwalifikowanych jeszcze w laboratorium linii iPSC.
  3. Etap 2: Jelito środkowe/jelito tylne (MH)
    1. Dzień 3: Podgrzać tylko taką objętość podłoża MH, która jest potrzebna na 3. dzień (0,5 ml/dołek), do 15- 25 °COdssać pożywkę DE z komórek i zastąpić ją 0,5 ml pożywki MH. Inkubować w 37 °C z dodatkiem 5% CO2 oraz 95% wilgotności przez 24 h.
    2. Dni 4–9: Przed codzienną wymianą pożywki należy użyć mikroskopu z powiększeniem 2x lub 4x, aby ocenić tworzenie się sferoidów, sprawdzając obecność widocznych struktur 3D (może wystąpić od 4. dnia) oraz wolno pływających sferoidów (mogą pojawić się od 5. dnia).
    3. Gdy sferoidy zaczną się odrywać, należy za pomocą pipety o objętości 1 ml delikatnie przenieść medium z komórek do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml, aby ocenić liczbę sferoidów, które oddzieliły się od komórek.
      UWAGA: Należy unikać jakichkolwiek sił ścinających, które mogłyby spowodować oddzielenie struktur 3D od monowarstwy; po osiągnięciu odpowiedniego stopnia dojrzałości sferoidy oddzielą się samoistnie.
    4. Jeśli ododerwało się mniej niż 50 sferoidów, odwiruj z prędkością 200 x g przez 5 min, usunąć stare medium, a następnie resuspender sferoidy w 0,5 ml medium na dołek i przenieść do odpowiednich dołków, aż do momentu dojrzewania odpowiedniej liczby sferoidów.
      UWAGA: Czas ekspozycji na medium jelita środkowego/tylnego odgrywa kluczową rolę w określaniu tożsamości regionalnej rozwijających się organoidów jelita cienkiego, takich jak dwunastnica (krótsza ekspozycja) lub jelito cienkie/ileum (dłuższa ekspozycja). Aby uzyskać bardziej jednorodne kultury o tej samej tożsamości, należy dążyć do jednoczesnego zbierania sferoidów poddanych działaniu medium jelita środkowego/tylnego.
    5. Powtarzać krok 2.3.3 do momentu odseparowania wystarczającej liczby sferoidów do ich osadzenia i zainicjowania hodowli ludzkich organoidów jelita (hIO).
    6. Przed przejściem do kolejnej fazy należy wydzielić próbkę sferoidów i przeprowadzić charakterystykę cytometryczną markerów specyficznych dla jelita środkowego i tylnego (MH). W reprezentatywnej charakterystyce cytometrycznej zastosowano strategię bramkowania w oparciu o rozproszenie światła przednie i boczne. Patrz na Tabela 4 w celu uzyskania listy powszechnie stosowanych markerów. Zaleca się sprawdzenie ekspresji więcej niż jednego markera, szczególnie w przypadku nowych lub niepotwierdzonych jeszcze w laboratorium linii iPSC.
  4. Etap 3: Osadzanie sferoidów w materiale
    1. Przed rozpoczęciem procedury należy przygotować następujące elementy.
      1. Rozmrozić alikwoty Matrix 1-ABO oraz Matrix 3-ABO na lodzie. Uwzględnić liczbę zebranych sferoidów, aby określić całkowitą ilość potrzebnej macierzy, jeśli 30-40 µL na każdą kopułę będzie wymagana określona ilość macierzy. 
      2. Przygotuj 25 ml schłodzonego medium Advance DMEM/F-12 zawierającego 15 mM HEPES. Wysokostężone macierze zewnątrzkomórkowe (ECM) są lepkie i trudne do pipetowania. Umieść pudełko sterylnych 100 µL końcówki do pipet w temperaturze -20 °C do przygotowania schłodzonych końcówek, co może usprawnić ten proces. Przygotować alikwoty pożywki do hodowli organoidów jelitowych (OGM), co wymaga 4 dokarmień (0,5 ml/studzienkę na każde dokarmienie). Patrz Tabela 5 do przygotowania.
      3. Rozmrozić alikwot suplementu OGM na lodzie. Po rozmrożeniu należy bezzwłocznie wykorzystać alikwoty. Nie zamrażać ponownie. Przechowywać kompletne OGM w temperaturze 2-8 °C przez maksymalnie 2 tygodnie.
      4. Przygotuj pożywkę OGM zawierającą trzykrotność suplementów w porównaniu do standardowego składu (3x OGM). Wyjmij Matrix 4-XFO1 przez Matrix 4-XFO4 z lodówki i doprowadź je do temperatury pokojowej (25 °C).
    2. W przypadku systemu pochodzenia zwierzęcego należy wykonać poniższe kroki.
      1. Umieść sterylną 24-dołkową płytkę do hodowli tkanek w inkubatorze, aby ogrzała się do 37 °C podczas przygotowywania sferoidów i macierzy. Pozostawione sferoidy powinny osiąść na dnie probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Ostrożnie odessij i usuń nadsącz.
        UWAGA: Aby przeprowadzić dokładniejsze porównanie wpływu macierzy, należy przechowywać sferoidy uzyskane z hiPSC zróżnicowanych na każdej z macierzy w osobnych probówkach.
      2. Do sferoidów należy dodać 1 ml DMEM/F-12 z 15 mM HEPES. Wirować przy 300 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej (15 - 25 °C).
      3. Ostrożnie usuń jak największą ilość supernatantu. Zaleca się rozpoczęcie usuwania za pomocą pipety o objętości 1 ml, a następnie przejście na 100 µL a nawet 10 µL pipetami, aby usunąć jak największą ilość cieczy, nie naruszając osadu sferoidów.
        UWAGA: Im większa objętość pozostałej pożywki, tym bardziej rozcieńczone będą matryce. Rozcieńczone matryce mogą prowadzić do problemów z żelowaniem lub powstawania miększych kopułek. Miększe kopułki wiążą się z większym ryzykiem zapadnięcia się przy minimalnych zakłóceniach.
      4. Używanie pipety w warunkach chłodniczych 100 µL końcówka do pipety, dodać 40 µL/50 sferoidów w zimnych (2- 8 °C) Matrix 1-ABO lub Matrix 3-ABO do odpowiednich probówek. Delikatnie rozprowadzić sferoidy w matrycy, pipetując roztwór w górę i w dół około 5 razy. Nie opróżniać całkowicie końcówki pipety, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza.
      5. Wyjmij płytkę z inkubatora, a następnie za pomocą zimnej końcówki do pipety ostrożnie przenieś osadzone sferoidy do centrum płytki, postępując zgodnie z krokami opisanymi w Rycina 2Należy unikać zbyt szybkiego dozowania Matrix 1-ABO oraz Matrix 3-ABO do szalki hodowlanej, aby nie doprowadzić do spłaszczenia kopuły..
      6. Ostrożnie przenieś płytkę do 37 °C umieścić w inkubatorze i inkubować przez 30 min, aby zapewnić żelowanie kopułki. Należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć wstrząsania lub gwałtownych ruchów podczas transportu oraz w inkubatorze.
      7. Podczas inkubacji kopuły w celu żelowania, ogrzewać w temperaturze 37 °C odpowiednią objętość OGM z jelit (0,5 ml/dołek) dla liczby dołków przeznaczonych do użycia.
        UWAGA: Podgrzewać tylko potrzebną objętość. Unikać cykli podgrzewania i chłodzenia. Przed dodaniem do kopuły należy upewnić się, że medium jest ciepłe; zimne medium może doprowadzić do zapadnięcia się kopuły.
      8. Po 30 min ostrożnie dodaj 0,5 ml jelitowego pożywki OGM do ściany dołka, aby nie naruszyć kopułki. Inkubuj w 37 °C z 5% CO2 oraz 95% wilgotności. Co 3–4 dni należy przeprowadzić pełną wymianę pożywki poprzez usunięcie starej i dodanie świeżej pożywki.
    3. W przypadku systemów organoidowych Matrix 4-XF należy postępować zgodnie z opisanymi krokami.
      UWAGA: System organoidowy Matrix 4-XF obejmuje cztery różne opcje (O1-O4); skład każdego typu różni się pod względem ligandów biofunkcjonalnych, sztywności oraz podatności na degradację. W związku z tym zaleca się przeprowadzenie wstępnych eksperymentów w celu ustalenia optymalnego typu dla konkretnego zastosowania. Niniejszy protokół opisuje wykorzystanie czterech opcji w celu znalezienia optymalnej formulacji dla organoidów jelitowych pochodzących z hiPSC. Dodatkowo, mimo istnienia wielu możliwych do zastosowania protokołów hodowli (np. enkapsulacja 3D, enkapsulacja kopułkowa), w niniejszym protokole zastosowano metodę kopułkową, aby umożliwić bezpośrednie porównanie z powszechnymi metodami stosowanymi przy pracy z systemami błony podstawnej pochodzenia zwierzęcego.
      1. Do sferoidów wytworzonych w systemie Matrix 4-XFO4 dodać 1 ml na dołek schłodzonego medium DMEM/F-12 advance zawierającego 16 mM HEPES. Odwirować przy 300 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej (15 - 25 °C).
        UWAGA: Aby znaleźć optymalną formulację dla danej aplikacji, należy upewnić się, że sferoidy zostały rozdzielone do 4 oddzielnych probówek przed wirowaniem. Sferoidy wytworzone na macierzach pochodzenia zwierzęcego mogą również być dojrzewane do postaci organoidów jelitowych przy użyciu tego systemu.
      2. Za pomocą pipety o objętości 1 ml należy usunąć supernatant, uważając, aby nie naruszyć sferoidów. Następnie dodać 50 µL do osadu sferoidów (~100 sferoidów) 3x OGM. Dodać 100 µL wybranego Matrix 4-XFO do 50 µL zawiesinę sferoidów i delikatnie wymieszać 5–10 razy. Zachować stosunek mieszania Matrix 4-XFO do 3x OGM w proporcji 2:1 v/v, aby uzyskać końcowe stężenie 1x.
      3. Dodać 40 µL mieszaniny hydrożelu i sferoidów do środka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowych. Ostrożnie przenieść płytki do 37 °C umieścić w inkubatorze i inkubować przez 30 min.
        UWAGA: Matrix 4-XFO nie wymaga 37 °C inkubacja w celu żelowania; zaleca się jednak utrzymywanie organoidów w warunkach zbliżonych do tych stosowanych w systemach Matrix 1-ABO i Matrix 3-ABO, które wymagają 37 °C dla lepszej żelowania kopułek.
      4. Po 30 min ostrożnie dodaj 0,5 ml jelitowego medium OGM do krawędzi dołka, tak aby nie naruszyć kopuły. Inkubuj w 37 °C z 5% CO2 oraz 95% wilgotności. Co 3–4 dni należy przeprowadzić całkowitą wymianę pożywki poprzez usunięcie starej pożywki i dodanie świeżej.
  5. pasażowanie i dojrzewanie hIO
    1. Przygotuj te same odczynniki chemiczne, roztwory i reagenty, co w kroku 2.4.1.
    2. Do probówki stożkowej o pojemności 15 ml (jedna na każdą warunek) dodać 1-2 ml roztworu płuczącego przeciwadhezyjnego i zamieszać ruchem obrotowym, aby pokryć ścianki probówki.
    3. Usuń roztwór przeciwprywierający i wypłucz probówki 5 ml D-PBS (bez Ca++ i Mg++). Zakręć wszystkie powlekane probówki i przechowuj je w temperaturze pokojowej (15 - 25 °C) do momentu użycia.
    4. Odssać pożywkę z kopułek. Za pomocą pipety o objętości 1 ml dodać 1 ml schłodzonego medium DMEM/F-12 bezpośrednio do kopułki. Celem jest oddzielenie kopułek od płytki.
    5. Do studzienki należy dodać dodatkowe 1 ml schłodzonego medium DMEM/F-12 i pipetować w górę i w dół, aby zebrać pozostałe organoidy. Następnie przenieść je do powlekanych probówek stożkowych o pojemności 15 ml.
      UWAGA: Prawidłowość zbioru organoidów należy zweryfikować poprzez wizualną ocenę dołka pod mikroskopem. W przypadku stwierdzenia obecności pozostałych organoidów należy powtórzyć krok 2.5.5.
    6. Za pomocą pipety o objętości 1 ml przeprowadź wielokrotne zasysanie i wydmuchiwanie zawiesiny w celu rozbicia organoidów, aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny fragmentów o pożądanej wielkości organoidów (np. 100 – 500 µm).
      UWAGA: Należy wykorzystać a 200 µL pipetę w celu zweryfikowania, czy organoidy mają zalecany rozmiar. Wykorzystując 200 µL pipetka wspomaga dodatkową fragmentację w razie potrzeby, zapewniając, że fragmenty mogą swobodnie przejść przez 200 µL końcówka do pipety
      OSTROŻNIE: Należy unikać rozbijania fragmentów na pojedyncze komórki poprzez zbyt intensywne lub przedłużone pipetowanie.
    7. Ustal pożądaną gęstość organoidów, licząc fragmenty lub stosując stosunek podziału. Wydziel alikwot i przeprowadź liczenie zgodnie z procedurą opisaną w krokach 1.4.6–1.4.9 dla liczenia aglomeratów.
      UWAGA: Optymalną gęstość organoidów należy dostosować do każdej linii; zazwyczaj zaleca się gęstość od 40 do 80 organoidów jelitowych na kopułkę.
    8. Należy upewnić się, że podczas procesu liczenia organoidów probówka znajduje się w lodzie. Po około 5 minutach fragmenty organoidów opadną na dno probówki pod wpływem grawitacji.
      UWAGA: Im większa objętość roztworu z organoidami, tym dłuższy będzie czas ich osiadania na dnie.
    9. Ostrożnie usuń jak najwięcej supernatantu oraz mętnej warstwy utworzonej na powierzchni organoidów. W przypadku wczesnych pasażów, gdy organoidy dojrzewają, mętna faza ta obejmuje macierz oraz poszczególne komórki.
    10. Dodaj 2 ml schłodzonego medium DMEM/F-12, pipetując bezpośrednio na pellet. Odwiruj przy 200 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej (15 - 25 °C).
    11. W przypadku systemu pochodzenia zwierzęcego należy ostrożnie usunąć i odrzucić nadsącz, postępując zgodnie z krokami opisanymi w punktach 2.4.2.4-2.4.2.9.
    12. W przypadku systemu Matrix 4-XFO należy ostrożnie usunąć i zutylizować nadsącz, postępując zgodnie z czynnościami opisanymi w krokach 2.4.3.2-2.4.3.4.
      UWAGA: Podczas pracy z systemem Matrix 4-XFO zaleca się stosowanie wolnego od składników pochodzenia zwierzęcego (xeno-free) roztworu do odzyskiwania organoidów z hydrożelu w celu optymalnego usunięcia pozostałości hydrożelu. Stosowanie tego roztworu jest szczególnie zalecane przy przejściu z systemów hydrożelowych opartych na materiale zwierzęcym na systemy wolne od składników pochodzenia zwierzęcego, aby zapewnić całkowite wyeliminowanie wszelkich materiałów ksenogenicznych.

Schemat techniki pipetowania dla dozowania cieczy do płytki do hodowli; instrukcja obsługi pipety krok po kroku.
Rysunek 2. Schemat techniki zalecanej do tworzenia kopułek. Schemat przedstawia proces krok po kroku, zalecany w celu prawidłowego utworzenia kopułek dla wszystkich układów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

3. Charakterystyka wielkości IO

UWAGA: Wielkość organoidów określono na podstawie obrazów w polu jasnym wykonanych przy powiększeniu 4x oraz 10x. Analiza przetwarzania obrazów została zautomatyzowana przy użyciu programu MATLAB. Ogólne etapy procesu opisano poniżej, a fragment kodu zawarto w Pliku uzupełniającym 1.

  1. Zdefiniuj katalog zawierający obrazy i wyświetl listę wszystkich plików obrazów w tym katalogu. Zainicjuj tabelę do przechowywania wyników. Odczytaj obrazy w jasnym polu z pliku.
  2. Zdefiniuj przelicznik pikseli na µm i ustaw skalę. Jeśli obraz nie zawiera paska skali, poproś użytkownika o podanie współczynnika konwersji pikseli na µm.
  3. Konwertuj obraz do skali szarości. Zastosuj filtr Gaussa, aby zredukować szum w obrazie. Przeprowadź progowanie przefiltrowanego obrazu, aby oddzielić organoidy od tła.
  4. Wypełnij małe otwory i usuń małe obiekty, aby oczyścić obraz binarny. Wykonaj analizę składowych spójnych, aby zidentyfikować poszczególne organoidy i obliczyć ich właściwości, takie jak powierzchnia, centroid, długość osi głównej oraz długość osi pomocniczej.
  5. Oblicz rozmiar organoidów na podstawie długości osi głównej i pomocniczej. Wyświetl segmentowane organoidy na oryginalnym obrazie i opisz je ich rozmiarem. Wydrukuj rozmiary organoidów i zapisz wyniki w pliku .cvs.
    UWAGA: Pierwsze kilka obrazów przeanalizowano ręcznie w celu ustalenia optymalnych parametrów odchylenia standardowego filtra Gaussa oraz powierzchni do progowania. Kod w Supplementary File 1 stanowi przykład podstawowej struktury analizy rozmiaru organoidów z obrazów w jasnym polu; jednak konieczne jest dalsze doprecyzowanie, aby dostosować go do specyficznych wymagań każdego typu i jakości obrazu. Ten sam proces można przeprowadzić przy użyciu otwartoźródłowego oprogramowania, takiego jak FIJI z Image J.
  6. Postępuj zgodnie z poniższymi krokami, aby skorzystać z oprogramowania FIJI.
    1. Zdefiniuj przelicznik pikseli na µm i ustaw skalę. Jeśli obraz nie zawiera paska skali, poproś użytkownika o podanie współczynnika konwersji pikseli na µm, klikając Analyze > Set Scale.
    2. Konwertuj obraz do skali szarości, klikając Image > Type > 8bit. Zastosuj filtr Gaussa, aby zredukować szum w obrazie, klikając Process > Filter > Gaussian blurb > Sigma (radius) used: 2.
    3. Przeprowadź progowanie przefiltrowanego obrazu, aby oddzielić organoidy od tła, klikając Image > Threshold > MaxEntropy > Apply.
    4. Wypełnij małe otwory i usuń małe obiekty, aby oczyścić obraz binarny, klikając Process > Noise > Remove Outliers > 20 pixels.
    5. Wykonaj analizę składowych spójnych, aby zidentyfikować poszczególne organoidy i obliczyć ich właściwości, takie jak powierzchnia, centroid, długość osi głównej oraz długość osi pomocniczej, klikając Analyze > Set measurement > Make sure Area, Perimeter, and Diameter are included > Analyze > Analyze Particles > Show Outlines.
  7. Analiza statystyczna
    1. Oceń rozkład danych pod kątem normalności za pomocą testu Shapiro-Wilka w oprogramowaniu JMP (SAS). Aby zbadać różnice statystyczne między grupami, przeprowadź dwuczynnikową analizę wariancji (ANOVA), a następnie wykonaj testy post-hoc przy użyciu nieparametrycznej metody Wilcoxona w oprogramowaniu JMP (SAS). Istotność ustalono na poziomie alfa p ≤ 0,05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zgodnie z niniejszym protokołem, komercyjnie dostępne błony podstawne oraz system hydrożelowy wolny od komponentów zwierzęcych zostały z powodzeniem wykorzystane do hodowli komórek hiPSC i ich różnicowania w hIO. Głównym celem tych eksperymentów była systematyczna ocena równoważności macierzy pochodzących z różnych źródeł w pracy z hiPSC i hIO. Pierwsza część protokołu koncentrowała się na utrzymaniu i charakterystyce zdrowej kultury iPSC, która pozwala na efektywne generowanie organoidów jelitowych. Opisano i porównano ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wybór optymalnego mikrośrodowiska do pracy z komórkami macierzystymi i organoidami jest kluczowym wczesnym krokiem w przypadku korzystania z tych platform w szerokim zakresie zastosowań. Nasze reprezentatywne wyniki pokazują, że Matrix 4-XFO3 w połączeniu z wyższym stężeniem czynników wzrostu prowadzi do większych organoidów, co sugeruje, że właściwości fizyczne hydrożeli wolnych od ksenotypów można wykorzystać do optymalizacji wytwarzania organoidów przy użyciu tych systemów. Wcześniej wykazano, że unikalne cechy macier...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Dr John Huang jest założycielem i dyrektorem generalnym TheWell Bioscience.

Podziękowania

Autorzy potwierdzają wcześniejsze szkolenia i ogólne zalecenia dotyczące rozpoczęcia pracy z hiPSC i organoidami od dr Christiny Pacak, Silveli Susuki-Hatano i Russella D'Souzy. Dziękują dr Chelsey Simmons za jej wskazówki dotyczące stosowania systemów hydrożelowych do hodowli komórkowych in vitro. Autorzy chcieliby również podziękować dr Christine Rodriguez i Thomasowi Allisonowi z STEMCELL Technologies za ich wskazówki dotyczące hodowli hiPSC. Autorzy dziękują również TheWell Bioscience za pokrycie kosztów publikacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytka 24-dołkowa (poddana hodowli, sterylna)Falcon353504
37 ° C Łaźnia wodnaVWR
96-dołkowa płytka Fisher ScientificFB012931
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634
Antyadhezyjne płukanie SolutioSTEMCELL Technologies7010
Szafa bezpieczeństwa biologicznego (BSC)Labconco Logic
Brightfield MicroscopeEcho RebelREB-01-E2
BXS0116ATCCACS-1030
Wirówka z regulacją temperatury (4 ° ThermoScientific75002441
Probówki stożkowe, 15 ml, sterylneThermo Fisher Scientific339650
Probówki stożkowe, 50 mL, sterylneThermo Fisher Scientific339652
Cultrex RGF BME, Typ 2Bio-techne3533-005-02
Cultrex Stem Cell Kwalifikowany RGF BME Bio-techne3434-010-02
D-PBS (bez Ca++ i Mg++)Thermo Fisher Scientific14190144
GeltrexLDEV-Free, hESC Reduce Growth FactorGibco A14133-02
Suplement GlutaMAXThermo Fischer Scientific35050-061
Analizator komórek Guava Muse lub inny sprzęt do cytometrii przepływowej (opcjonalnie)Luminex0500-3115
Roztwór buforowy HEPESThermo Fischer Scientific15630-056
Heralcell Vios Inkubator do hodowli komórkowych (37 ° C, 5% CO2)Thermo Scientific 
JMP SoftwareSAS InstituteJMP 16
MATLABMathWorks, IncR2022b
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Matryca membrany podstawnej bez LDEV 
Matrigel Matrix o wysokim stężeniu (HC), obniżony czynnik wzrostu (GFR) bez LDEVCorning 
mTeSR Plus MediumSTEMCELL Technologies100-0276
Nunclon Delta 24-dołkowa płytka poddana obróbce powierzchniowejThermo Scientific144530
PE Mouse Anti-human CD326 (EpCAM)BD Pharmingen566841
PE Mouse Anti-human CDX2 BD Pharmingen563428
PE Mouse Anti-human FOXA2BD Pharmingen561589
PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human SSEA4 BD Pharmingen561565
ReLeSRSTEMCELL5872
SCTi003-ASTEMCELL Technologies200-0510
Pipety serologiczne (10 ml) Pipety13-678-11E
(5 ml) Fisher Scientific13-678-11D
Pożywka do wzrostu organoidów jelitowych STEMdiffSTEMCELL Technologies5145
STEMdiff Zestaw organoidów jelitowychSTEMCELL Technologies5140
Vitrogel Hydrogel MatrixTheWell BioscienceVHM01
VitroGel ORGANOID Discovery KitTheWell BioscienceVHM04-K
51033775356231354263 serologiczne Fisher Scientific

Bibliografia

  1. Hynes, R. O. Integrins: Bidirectional, allosteric signaling machines. Cell. 110 (6), 673-687 (2002).
  2. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123, Pt 24 4195-4200 (2010).
  3. Hinz, B., Gabbiani, G. Fibrosis: Recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives. F1000 Biol Rep. 2, 78(2010).
  4. Pickup, M. W., Mouw, J. K., Weaver, V. M. The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer. EMBO Rep. 15 (12), 1243-1253 (2014).
  5. Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: A dynamic view. Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).
  6. Even-Ram, S., Artym, V., Yamada, K. M. Matrix control of stem cell fate. Cell. 126 (4), 645-647 (2006).
  7. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  8. Tran, O. N., et al. Organ-specific extracellular matrix directs trans-differentiation of mesenchymal stem cells and formation of salivary gland-like organoids in vivo. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 306(2022).
  9. Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
  10. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  11. Gjorevski, N., et al. Tissue geometry drives deterministic organoid patterning. Science. 375 (6576), (2022).
  12. Heo, J. H., Kang, D., Seo, S. J., Jin, Y. Engineering the extracellular matrix for organoid culture. Int J Stem Cells. 15 (1), 60-69 (2022).
  13. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
  14. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  15. Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).
  16. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  17. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
  18. Greenlee, A. R., Kronenwetter-Koepel, T. A., Kaiser, S. J., Liu, K. Comparison of Matrigel and gelatin substrata for feeder-free culture of undifferentiated mouse embryonic stem cells for toxicity testing. Toxicol In Vitro. 19 (3), 389-397 (2005).
  19. Geltrex LDEV-Free, HESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix User Guide (Pub.No. MAN0007336 3.0. Fisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FGeltrex_LDEV_Free_hESC_qualified_PI.pdf (2024).
  20. biotechne R&D Systems. Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor. biotechne R&D Systems. , (2024).
  21. VitroGel Organoid Protocol. TheWell Bioscience. , Available from: https://www.thewellbio.com/video-protocols (2024).
  22. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).
  23. Henderson, J. K., et al. Preimplantation human embryos and embryonic stem cells show comparable expression of stage-specific embryonic antigens. Stem Cells. 20 (4), 329-337 (2002).
  24. Haruna, N. F., Huang, J. Investigating the dynamic biophysical properties of a tunable hydrogel for 3D cell culture. J Cytol Tissue Biol. 7, 30(2020).
  25. Cherne, M. D., et al. A synthetic hydrogel, VitroGel ORGANOID-3, improves immune cell-epithelial interactions in a tissue chip co-culture model of human gastric organoids and dendritic cells. Front Pharmacol. 12, 707891(2021).
  26. Stewart, D. C., et al. Quantitative assessment of intestinal stiffness and associations with fibrosis in human inflammatory bowel disease. PLoS One. 13, e0200377(2018).
  27. Hernandez-Gordillo, V., et al. Fully synthetic matrices for in vitro culture of primary human intestinal enteroids and endometrial organoids. Biomaterials. 254, 120125(2020).
  28. Broguiere, N., et al. Growth of epithelial organoids in a defined hydrogel. Adv Mater. 30, 1801621(2018).
  29. Barthes, J., et al. Cell microenvironment engineering and monitoring for tissue engineering and regenerative medicine: The recent advances. BioMed Res Int. 2014, 921905(2014).
  30. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  31. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nat Rev Mater. 5 (7), 539-551 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

ludzkie komórki macierzysteorganoidy jelitowehydrożel wolny od składników pochodzenia zwierzęcegomacierz pozakomórkowahodowla organoidówindukowane pluripotencjalne komórki macierzysteróżnicowanie organoidów
Badanie porównawcze matryc podstawno-błonowych do utrzymania ludzkich komórek macierzystych i generowania organoidów jelitowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.