Method Article

Badanie porównawcze matryc podstawno-błonowych do utrzymania ludzkich komórek macierzystych i generowania organoidów jelitowych

DOI:

10.3791/66277

⸱

March 15th, 2024

 ,  ,  , 
1Center for Pharmacometrics & Systems Pharmacology, Department of Pharmaceutics, University of Florida, 2TheWell Bioscience, Inc

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoidy stały się cennymi narzędziami do modelowania chorób. Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) kieruje losem komórki podczas generowania organoidów, a użycie systemu, który przypomina tkankę natywną, może poprawić dokładność modelu. W badaniu tym porównano wytwarzanie indukowanych organoidów jelitowych ludzkich komórek macierzystych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w hydrożelach ECM pochodzenia zwierzęcego i bezksenowęglowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) odgrywa kluczową rolę w zachowaniu i rozwoju komórek. Organoidy wytwarzane z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) znajdują się w centrum uwagi wielu obszarów badawczych. Jednak brak wskazówek fizjologicznych w klasycznych materiałach do hodowli komórkowych utrudnia skuteczne różnicowanie iPSC. Włączenie dostępnego na rynku ECM do hodowli komórek macierzystych dostarcza fizycznych i chemicznych wskazówek korzystnych dla utrzymania komórek. Dostępne na rynku produkty błony podstawnej pochodzenia zwierzęcego składają się z białek ECM i czynników wzrostu, które wspomagają utrzymanie komórek. Ponieważ ECM posiada właściwości specyficzne dla tkanki, które mogą modulować los komórki, matryce wolne od ksenotypów są wykorzystywane do przesyłania translacji do badań klinicznych. Chociaż dostępne na rynku matryce są szeroko stosowane w badaniach nad hiPSC i organoidami, równoważność tych matryc nie została jeszcze oceniona. W tym miejscu przeprowadzono badanie porównawcze utrzymania hiPSC i wytwarzania organoidów jelitowych człowieka (hIO) w czterech różnych matrycach: Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB) i VitroGel (Matrix 4-XF). Chociaż kolonie nie miały idealnie okrągłego kształtu, spontaniczne różnicowanie było minimalne, a ponad 85% komórek wykazywało ekspresję markera komórek macierzystych SSEA-4. Matrix 4-XF doprowadził do powstania okrągłych grudek 3D. Ponadto zwiększenie stężenia suplementu i czynników wzrostu w pożywkach używanych do wytwarzania roztworu hydrożelu Matrix 4-XF poprawiło ekspresję hiPSC SSEA-4 1,3-krotnie. Różnicowanie hiPSC utrzymywanych przez Matrix 2-AB doprowadziło do mniejszego uwalniania sferoidów w stadium środkowego / tylnego jelita w porównaniu z innymi błonami podstawnymi pochodzenia zwierzęcego. W porównaniu z innymi, matryca organoidowa wolna od ksenotypów (Matrix 4-O3) prowadzi do większych i bardziej dojrzałych hiIO, co sugeruje, że właściwości fizyczne hydrożeli wolnych od ksenotypów można wykorzystać do optymalizacji wytwarzania organoidów. Podsumowując, wyniki sugerują, że różnice w składzie różnych matryc wpływają na etapy różnicowania IO. Badanie to podnosi świadomość na temat różnic w dostępnych na rynku matrycach i stanowi przewodnik po optymalizacji matryc podczas pracy z iPSC i IO.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) jest dynamicznym i wielofunkcyjnym składnikiem tkanek, który odgrywa kluczową rolę w regulacji zachowania i rozwoju komórek. Jako złożona sieć zapewnia wsparcie strukturalne, ligandy adhezyjne komórek1 oraz magazynowanie czynników wzrostu i cytokin, które regulują sygnalizację komórkową. Na przykład podczas gojenia się ran ECM służy jako rusztowanie dla migrujących komórek i jako rezerwuar czynników wzrostu zaangażowanych w naprawę tkanek2. Podobnie, rozregulowanie ECM może prowadzić do zwiększenia nasilenia różnych chorób, takich jak zwłóknienie i rak3,4. Podczas rozwoju embrionalnego ECM kieruje morfogenezą tkanek. Na przykład w rozwoju serca komponenty ECM odgrywają rolę w tworzeniu prawidłowej architektury i funkcji tkanki serca5. Ponad dekada badań wykazała, że sama sztywność mikrośrodowiska6,7 może kontrolować specyfikację linii komórek macierzystych. Nic więc dziwnego, że podczas różnicowania komórek in vitro ECM wpływa na los komórek macierzystych, dostarczając sygnałów do różnicowania.

Organoidy mogą być generowane z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Rozpoczęcie od odpowiednio scharakteryzowanej linii iPSC jest niezbędne do pomyślnego wytworzenia organoidów. Jednak brak wskazówek fizjologicznych w klasycznych materiałach do hodowli komórkowych utrudnia skuteczne różnicowanie iPSC i wytwarzanie organoidów. Co więcej, ostatnie badania podkreśliły znaczenie składu macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), interakcji między komórkami a ECM8, a także wskazówek mechanicznych i geometrycznych9,10,11 w kontekście ekspansji i różnicowania organoidów12. Rozwój technologii organoidów poprzez poprawę odtwarzalności będzie wymagał uwzględnienia wskazówek fizycznych i chemicznych specyficznych dla tkanki.

Organoidy mają na celu odtworzenie rodzimej tkanki w fizjologicznie podobnym mikrośrodowisku. Wybór systemu ECM, który ściśle naśladuje natywny tkankowy ECM, ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia fizjologicznego znaczenia dotyczącego zachowania, funkcji i odpowiedzi komórki na bodźce13. Wybór składników ECM może wpływać na różnicowanie komórek macierzystych w określone typy komórek w organoidzie. Różne białka ECM i ich kombinacje mogą dostarczać wskazówek, które kierują losem komórki14. Na przykład badania wykazały, że stosowanie określonych komponentów ECM może sprzyjać różnicowaniu jelitowych komórek macierzystych w dojrzałe typy komórek jelitowych, co skutkuje fizjologicznie istotnymi organoidami jelitowymi15. Chociaż organoidy są cennym narzędziem podczas modelowania chorób i testowania leków, wybór odpowiedniego systemu ECM ma kluczowe znaczenie dla tego zastosowania. Odpowiedni system ECM może zwiększyć dokładność modelowania choroby poprzez stworzenie mikrośrodowiska, które przypomina dotkniętą chorobą tkankę16. Co więcej, specyficzny tkankowo ECM może pomóc w generowaniu organoidów, które lepiej podsumowują fenotypy związane z chorobą i reakcje na leki17. Optymalizacja systemu ECM stosowanego w różnicowaniu organoidów ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia pożądanych wyników różnicowania.

Komercyjnie dostępne systemy membran bazowych pochodzące ze zwierzęcych źródeł ECM (np. Matrigel, Cultrex) i hydrożel wolny od kseno-merów (np. VitroGel) są szeroko stosowane w badaniach nad iPSC i organoidami. Firmy, które je komercjalizują, oraz badacze, którzy z nich korzystają, na przestrzeni lat opracowali wiele instrukcji dotyczących ich konkretnych produktów i zastosowań. Wiele z tych instrukcji posłużyło jako przewodnik przy generowaniu tego protokołu. Co więcej, korzyści i niepowodzenia związane z ich wewnętrznymi właściwościami zostały indywidualnie odnotowane przez wielu18,19,20,21. Nie istnieje jednak systematyczny przepływ pracy, który kierowałby wyborem optymalnych systemów do pracy z iPSC i organoidami. W tym miejscu zapewniony jest przepływ pracy umożliwiający systematyczną ocenę równoważności systemów ECM z różnych źródeł dla iPSC i pracy organoidowej. Jest to badanie porównawcze utrzymania dwóch różnych ludzkich linii iPSC (hiPSC) i generacji organoidów jelitowych człowieka (hIO) w czterech różnych matrycach: Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB) i VitroGel (Matrix 4-XF). Do hodowli organoidów wykorzystano cztery wersje matrycy wolnej od ksenotypu VitroGel, które wcześniej zostały zoptymalizowane pod kątem hodowli organoidów: ORGANOID 1 (Matrix 4-O1), ORGANOID 2 (Matrix 4-O2), ORGANOID 3 (Matrix 4-O3), ORGANOID 4 (Matrix 4-O4). Wykorzystano również matryce pochodzenia zwierzęcego zoptymalizowane pod kątem organoidów: Matrigel High Concentration (Matrix 1-ABO) i Cultrex Type 2 (Matrix 3-ABO). Użyto dostępnych na rynku pożywek do hodowli komórek macierzystych (mTeSR Plus) oraz zestawu do różnicowania organoidów (STEMdiff intestinal organoid kit). Protokół ten łączy indywidualne instrukcje od producentów produktów z doświadczeniami laboratoryjnymi, aby poprowadzić czytelnika w kierunku skutecznej optymalizacji ECM pod kątem ich specyficznej pracy z iPSC i organoidami. Podsumowując, ten protokół i reprezentatywne wyniki podkreślają znaczenie wyboru optymalnego mikrośrodowiska dla pracy komórek macierzystych i różnicowania organoidów.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. konserwacja hiPSC

UWAGA: Wszystkie prace wykonywane są w Gabinecie Bezpieczeństwa Biologicznego (BSC) zgodnie ze standardowymi technikami aseptycznymi. Musi przestrzegać norm bezpieczeństwa OSHA dla laboratoriów, w tym właściwego stosowania środków ochrony osobistej, takich jak fartuchy laboratoryjne, rękawice i gogle.

  1. Przygotowanie matryc, podwielokrotności i pożywek do hodowli komórkowych
    1. Dla dostępnych na rynku membran podstawnych pochodzenia zwierzęcego (BM; Matrix 1-AB, Matrix 2-AB, Matrix 3-AB), przygotować porcje objętości roboczych zgodnie z zaleceniem producenta podsumowanym w tabeli 1 i przechowywać je w temperaturze -20 °C lub -80 °C do długotrwałego przechowywania. Unikaj tworzenia się pęcherzyków. Jeśli utworzą się pęcherzyki, przed przechowywaniem odwirować próbki w temperaturze 4 °C, przy <200 x g, przez ~1-2 minuty, aby zmusić pęcherzyk do wydostania się na powierzchnię.
      UWAGA: Tworzenie jednorazowych porcji pomaga uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania, które zakłócają architekturę ECM. Ponieważ stężenie BM różni się w zależności od numeru partii, należy postępować zgodnie z zaleceniami producenta, aby przygotować jednorazowe podwielokrotności i przygotować roztwory do powlekania. Wysokoskoncentrowane BM są lepkie i trudne do pipetowania; używać zimnych końcówek przechowywanych wcześniej w temperaturze -20 °C.
    2. Przygotować pożywkę do hodowli komórek macierzystych zgodnie z zaleceniami producenta. Aby przygotować specyficzne dostępne na rynku kompletne podłoża używane w tym protokole, dodaj 100 ml 5x koktajlu suplementu do 400 ml podłoża podstawowego. Następnie dokładnie wymieszać tę pożywkę i podzielić na 40 ml objętości, przechowywaną w temperaturze 20 °C. Przed użyciem rozmrozić każdą porcję kompletnej pożywki, natychmiast zużyć porcjowaną kompletną pożywkę lub przechowywać w temperaturze 2 - 8 °C przez okres do 2 tygodni. Nie zamrażaj go ponownie.
    3. Przygotować porcje kompletnej pożywki z komórkami macierzystymi zawierającej 3x stężenie koktajlu suplementu, aby przygotować hydrożel Matrix 4-XE, tj. rozcieńczyć 5x suplement do 3x.
  2. Powlekanie tworzywa sztucznego z kultur tkankowych BM pochodzenia zwierzęcego (Matrix 1-3AB)
    1. Przed rozpoczęciem przygotuj następujące elementy: podczas rozmrażania i obchodzenia się z matrycami zawsze trzymaj je w lodzie, aby zapobiec ich zżelowaniu. Użyj zimnych pożywek do przygotowania rozcieńczonych matryc. Przygotuj wystarczającą liczbę dołków replikowanych na warunek, aby oznaczyć komórki przed rozpoczęciem i na każdym etapie procesu różnicowania hiPSC i generowania organoidów hIO.
      UWAGA: W tym badaniu użyto płytek 24-dołkowych. Patrz Tabela 2, aby zapoznać się z zalecanymi objętościami powłoki dla innych rozmiarów płyt.
    2. Dla każdego rodzaju matrycy należy przygotować 25 ml zimnego zalewu DMEM/F-12 zawierającego 15 mM HEPES w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Trzymaj je na lodzie.
    3. Dodaj rozmrożone matryce do odpowiedniego DMEM/F-12 na zimno i dobrze wymieszaj. Utrzymuj media w chłodzie podczas procesu mieszania. Sprawdź wzrokowo, czy mieszanie jest jednorodne, upewniając się, że nie ma grudek.
    4. Natychmiast użyj rozcieńczonych roztworów matryc, aby pokryć każdą studzienkę wybraną do użycia (250 μl / studzienkę w przypadku stosowania płytek 24-dołkowych).
    5. Delikatnie przechyl kulturę, aby równomiernie rozprowadzić roztwór powlekający na powierzchni. Inkubować w temperaturze pokojowej (15 - 25 °C) przez co najmniej 1 godzinę przed użyciem.
      UWAGA: Jeśli płytka nie zostanie natychmiast użyta, może być przechowywana w temperaturze 2 - 8 °C do 1 tygodnia po nałożeniu powłoki, ale musi być uszczelniona przezroczystą folią, aby zapobiec parowaniu. W przypadku korzystania z przechowywanych płytek pozwól im osiągnąć temperaturę pokojową (15 - 25 °C) przez 30 minut przed przejściem do następnego kroku.
    6. Delikatnie usunąć nadmiar roztworu za pomocą pipety serologicznej lub przez aspirację. Upewnij się, że powlekana powierzchnia nie jest porysowana.
    7. Natychmiast dodać ciepłe kompletne podłoże z komórkami macierzystymi (50% całkowitej objętości potrzebnej do określonego dołka, np. 250 μl/dołek w przypadku stosowania płytki 24-dołkowej).
  3. Powlekanie tworzywa sztucznego kultur tkankowych hydrożelem Matrix 4-XE
    1. Przed rozpoczęciem przygotuj następujące elementy: wyjmij hydrożel Matrix 4-XE z lodówki i pozwól mu ogrzać się do temperatury pokojowej (25 °C). Przygotuj wystarczającą liczbę dołków replikowanych na warunek, aby oznaczyć komórki przed rozpoczęciem i na każdym etapie procesu różnicowania hiPSC i generowania organoidów hIO.
      UWAGA: W tym badaniu użyto płytek 24-dołkowych. Patrz Tabela 3, aby zapoznać się z zalecanymi objętościami powłoki dla innych rozmiarów płyt.
    2. Przygotuj kompletną pożywkę do hodowli komórek macierzystych zawierającą 3x stężenie czynnika wzrostu w porównaniu ze standardową formułą do hodowli komórek macierzystych (3x pożywka dla komórek macierzystych).
    3. Wymieszaj hydrożel Matrix 4-XE i 3x pożywkę z komórkami macierzystymi w proporcji mieszania 2:1 v/v i delikatnie pipetuj w górę i w dół 5x-10x, aby dokładnie wymieszać.
    4. Przenieś mieszaninę hydrożelu na płytkę dołka i ostrożnie przechyl naczynie do hodowli, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę na powierzchni. Użyj 250 μl/basenik, jeśli używasz płytki 24-dołkowej. Patrz Tabela 3, aby zapoznać się z zalecanymi objętościami.
    5. Odczekaj 10-15 minut w temperaturze pokojowej, aby powstał miękki żel. Podczas procesu tworzenia hydrożelu nie należy przerywać hydrożelu poprzez przechylanie lub potrząsanie płytką.
  4. Bezenzymatyczne pasażowanie i wysiew brył hiPSC
    1. Przed rozpoczęciem przygotuj następujące elementy: co najmniej 1 godzinę przed pasażem pokryj żądane wyroby z tworzywa sztucznego matrycami. Podwielokrotność wystarczającej ilości kompletnych pożywek z komórek macierzystych i ogrzanie do temperatury pokojowej (15–25 °C). Unikaj wielu cykli nagrzewania dla całego medium.
      UWAGA: Poniższe kroki opisują przejście już ustalonej i w >90% zlewającej się hodowli iPSC na 6-dołkowej płytce i wysiewanie ich na 24-dołkowych płytkach w celu różnicowania organoidów jelitowych.
    2. Przepłukać komórki 1 ml D-PBS (bez Ca++ i Mg++) i aspiratem. Dodaj 1 ml bezenzymatycznego odczynnika do selekcji ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, ostrożnie zamieszaj, aby równomiernie się rozprowadził, i odessaj w ciągu 1 minuty. Kolonie muszą być tylko wystawione na działanie cienkiej warstwy cieczy.
    3. Inkubować w temperaturze 37 °C, aż kolonie zaczną wyglądać na mniej zagęszczone, co zajmie ~ 3-8 min.
      UWAGA: Optymalny czas inkubacji może się różnić w zależności od użytej linii komórkowej. Optymalny czas inkubacji musi zostać określony podczas przechodzenia każdej linii komórkowej po raz pierwszy za pomocą bezenzymatycznego odczynnika do selekcji ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.
    4. Dodać 1 ml kompletnej pożywki z komórkami macierzystymi. Odłącz kolonie, ostrożnie mocno stukając w bok płytki. Upewnij się, że trzymasz talerz drugą ręką.
    5. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml lub większej przenieś zawiesinę grudek komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Oceń wielkość grudek za pomocą mikroskopu jasnego pola i upewnij się, że rozmiar grudki komórek mieści się w przedziale 50-200 μm; Jeśli są większe, delikatnie potrząśnij stożkową rurką, aby je rozbić.
    6. Narysuj siatkę x-y na dnie każdej studzienki 96-dołkowej płytki o płaskim dnie, która będzie używana do liczenia brył i dodaj 50 μl D-PBS do każdej z studzienek. Zaleca się uśrednienie kęp liczonych z 3 dołków.
    7. Upewnij się, że grudki komórek są równomiernie rozłożone, delikatnie potrząsając probówką, a następnie przenieś 5 μl zawiesiny grudek do każdego z dołków płaskodennej płytki 96-dołkowej.
      UWAGA: Nie zaleca się używania automatycznego licznika komórek do liczenia grudek. Zalecane jest liczenie ręczne.
    8. Policz całkowitą liczbę grudek w każdym dołku o średnicy 50 - 200 μm. Jeśli większość skupisk komórek ma > średnicy 200 μm (patrz Rysunek 1), powtórz kroki 1.4.5 - 1.4.7.
    9. Obliczyć objętość (w μl) zawiesiny grudek wymaganą do wysiewu 6 000 kęp w następujący sposób:
      figure-protocol-1
      UWAGA: Optymalna gęstość wysiewu musi być zoptymalizowana dla każdej linii komórkowej. Aby określić optymalną gęstość wysiewu, zaleca się przeprowadzenie wstępnego siewu w zakresie gęstości kęp (np. 4 000, 5 000 i 6 000 kęp na studzienkę) i sprawdzenie 24-48 godzin po wysiewie, czy osiągnięto zbieżność 85%-90%.
    10. W ramach kontroli jakości należy oddzielić próbkę komórek do badania markerów komórek macierzystych za pomocą cytometrii przepływowej. Patrz Tabela 4, aby zapoznać się z listą typowych markerów.
    11. Oddzielić wymaganą objętość zawiesiny grudek iPSC do wysiewu na dołkach pokrytych różnymi ECM do oddzielnych probówek o pojemności 15 ml.
    12. Odwirować probówkę zawierającą roztwór grudek iPSC o stężeniu 200 x g przez 5 minut w celu usunięcia pożywki zawierającej wolny od enzymów odczynnik do selekcji ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Czekając na odwirowanie, dodaj 50% żądanej objętości na studzienkę do każdej studzienki, jeśli nie zostało to jeszcze zrobione.
  5. Hodowla iPSC na płytkach zawierających matryce pochodzenia zwierzęcego
    1. Delikatnie zawiesić zbrylenia iPSC w obliczonej 50% objętości kompletnego podłoża z komórkami macierzystymi, aby uzyskać pożądaną gęstość, a następnie umieścić mieszaninę agregatów komórkowych w powlekanych studzienkach zawierających 50% obliczonej kompletnej pożywki dla komórek macierzystych.
      UWAGA: Dodanie inhibitora ROCK-1 może być konieczne w przypadku niektórych linii komórkowych lub gdy grudki mają 50 μm lub mniej. Zaleca się dodanie <10 μm, aby uniknąć wczesnej gastrulacji.
    2. Ostrożnie dodać pożywkę z komórkami na wierzchu matryc, 250 μl/basenik, jeśli używasz płytki 24-dołkowej. Zalecana objętość pożywki komórkowej dla płytek studzienkowych o innych rozmiarach znajduje się w tabeli 2.
    3. Przechyl płytkę kilkoma krótkimi ruchami w przód iw tył oraz na boki, aby równomiernie rozprowadzić grudki komórek.
      UWAGA: Nierównomierny rozkład agregatów powoduje zwiększone spontaniczne różnicowanie ludzkich iPSC. Okrężne rozsiewanie zawiesiny grudek powoduje gromadzenie się grudek na granicy studni i mniejsze zagęszczenie w środku.
    4. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i wykonywać zmiany pożywki przy użyciu kompletnych pożywek z komórek macierzystych codziennie lub co drugi dzień. Wykonując zmiany pożywki, należy wizualnie ocenić hodowle, aby monitorować wzrost i określić, czy komórki wymagają czasu pasażowania, czy są gotowe do różnicowania. Aby pominąć dwa kolejne dni karmienia, dodaj 2x objętość pożywki potrzebną na jeden dzień.
  6. Posiew iPSC na płytkach zawierających Matrix 4-XE
    1. Delikatnie ponownie zawiesić zbrylenia iPSC w całkowitej obliczonej objętości 3 razy bardziej kompletnej pożywki z komórek macierzystych, aby uzyskać pożądaną gęstość.
    2. Ostrożnie dodać pożywkę z komórkami na wierzchu hydrożelu 250 μl/basenik, jeśli używasz płytki 24-dołkowej. Zalecana objętość pożywki komórkowej dla płytek studzienkowych o innych rozmiarach znajduje się w tabeli 3.
      UWAGA: Hydrożel pęcznieje i zajmuje większą objętość niż świeżo przygotowany. Kolonie iPSC będą częściowo osadzone w hydrożelu na dnie płytki, dlatego zaleca się wymianę 50%-80% górnego podłoża bez naruszania hydrożelu.
    3. Przesuń płytkę kilkoma szybkimi, krótkimi ruchami w przód iw tył oraz na boki, aby równomiernie rozprowadzić grudki komórek.
    4. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C o wilgotności 5%CO2 i wilgotności 95%. Zmień pożywkę komórkową za pomocą kompletnej pożywki z komórek macierzystych. Wykonuj zmiany podłoża codziennie lub co drugi dzień; W przypadku tego ostatniego dodaj 2x objętość podłoża.
    5. Sprawdź wzrokowo kultury, aby śledzić ich wzrost, gdy osiągną etap odpowiedni do różnicowania.

figure-protocol-2
Rysunek 1: Optymalna wielkość kępy. Obrazy grudek linii komórkowej iPSC SCTi003A przedstawiające przykład optymalnej wielkości skupiska. Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. różnicowanie hiPSC i generowanie organoidów jelitowych

UWAGA: Wszystkie prace wykonywane są w Gabinecie Bezpieczeństwa Biologicznego (BSC) zgodnie ze standardowymi technikami aseptycznymi. Musi przestrzegać norm bezpieczeństwa OSHA dla laboratoriów, w tym właściwego stosowania środków ochrony osobistej, takich jak fartuchy laboratoryjne, rękawice i gogle.

  1. Przed rozpoczęciem należy przygotować następujące elementy: przygotować porcje pożywki różnicującej wymagane dla każdego etapu. Po rozmrożeniu porcji należy je natychmiast zużyć. Nie zamrażać ponownie. Postępuj zgodnie z tabelą 5, aby uzyskać ogólny przewodnik po każdym stage rodzaj nośnika i objętości potrzebne do płytki 24-dołkowej.
    UWAGA: Optymalny czas na każdym etapie różnicowania może się różnić w zależności od linii komórkowej. Zaleca się sprawdzanie ekspresji markera komórkowego każdego etapu w celu poprawy skuteczności różnicowania. Okresowa ocena ekspresji genów w hodowlach iPSCS nie została uwzględniona w tym badaniu, ponieważ wykorzystaliśmy partie kwalifikowane przez dostawcę przy niskich pasażach, ale jest zalecana jako etap kontroli jakości dla nowych/jeszcze niezakwalifikowanych linii iPSC podczas kolejnych etapów różnicowania.
  2. Etap 1: Ostateczna endoderma (DE)
    1. Aby ocenić gotowość do rozpoczęcia różnicowania, należy sprawdzić następujące kryteria.
      1. Za pomocą mikroskopu oceń zbieg kolonii komórek macierzystych i stopień spontanicznego różnicowania w hodowli. Nie polegaj tylko na ocenie morfologicznej. Optymalna konfluencja powinna wynosić od 85% do 90% (powyżej ~105 komórek/cm2), a minimalne spontaniczne różnicowanie powinno wynosić <5% różnicowania.
      2. Zbierz komórki ze studni protektorowej w celu scharakteryzowania markerów hiPSC za pomocą cytometrii przepływowej przed przystąpieniem do następnego kroku. Do charakterystyki reprezentatywnej cytometrii przepływowej wykorzystano strategię bramkowania rozproszenia do przodu i bocznego. Jeśli komórki spełniają optymalne kryteria, rozpocznij różnicowanie. Kryterium przenikania komórek wynosi >85% ekspresji idealnie 3 markerów (Tabela 4), szczególnie w przypadku nowych/jeszcze niezakwalifikowanych linii iPSC w laboratorium.
        UWAGA: Kultury iPSC hodowane na różnych matrycach przechodzą ten sam ogólny proces, przy wzroście tylko iPSC na Matrix 4-XE, co wymaga delikatniejszych zmian pożywki, aby nie zakłócać częściowo osadzonych komórek. Podczas indukcji ostatecznej endodermy spodziewana jest znaczna śmierć komórek, ponieważ na tym etapie komórki są szczególnie wrażliwe. Należy zachować ostrożność podczas zmian pożywki, dążąc do jak największego zminimalizowania czasu ekspozycji komórek poza środowiskiem inkubacji w temperaturze 37 °C.
    2. Rozpocznij różnicowanie kolonii komórkowych zgodnie z poniższym opisem.
      1. Dzień 0: Podgrzać podwielokrotność pożywki DE do temperatury 37 °C. Aby uniknąć denaturacji pożywki z cykli ogrzewania i chłodzenia, upewnij się, że ogrzewasz tylko objętość wymaganą na Dzień 0 (0,7 ml / studzienkę).
      2. Odessać pożywkę z hiPSC. Ostrożnie dodaj 0,7 ml DE Medium na studzienkę po bokach studzienki. Należy unikać ostrego pipetowania, które mogłoby oderwać lub uszkodzić kolonie. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wilgotnością 95% przez 24 godziny.
      3. Dzień 1: Ogrzać podwielokrotność pożywki DE zawierającej tylko objętość potrzebną do dnia 1 (0,5 ml/studzienkę) do 37 °C. Odessać pożywkę DE z komórek i ostrożnie dodać 0,5 ml pożywki DE na studzienkę z boku studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wilgotnością 95% przez 24 godziny.
      4. Dzień 3: Komórki są gotowe do oznaczenia w celu ostatecznego utworzenia endodermy. Patrz Tabela 4, aby zapoznać się z zalecanymi znacznikami. Przed przystąpieniem do następnej fazy należy poświęcić studzienkę, aby wykonać charakterystykę cytometrii przepływowej określonych markerów związanych z DE. Do charakterystyki reprezentatywnej cytometrii przepływowej wykorzystano strategię bramkowania rozproszenia do przodu i bocznego. Zaleca się sprawdzenie ekspresji więcej niż 1 markera, szczególnie w przypadku nowych/jeszcze niezakwalifikowanych linii iPSC w laboratorium.
  3. Etap 2: Jelito środkowe/jelito tylne (MH)
    1. Dzień 3: Podgrzej tylko objętość pożywki MH potrzebną do dnia 3 (0,5 ml / dołek) do 15 - 25 °C. Odessać pożywkę DE z komórek i zastąpić 0,5 ml pożywki MH. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wilgotnością 95% przez 24 godziny.
    2. Dzień 4 - 9: Przed dziennymi zmianami podłoża użyj mikroskopu przy 2-krotnym lub 4-krotnym powiększeniu, aby ocenić powstawanie sferoid, sprawdzając, czy nie ma widocznych struktur 3D (może to nastąpić od 4 dnia); sferoid swobodnie unoszących się (może wystąpić od 5 dnia).
    3. Gdy sferoidy zaczną się odłączać, użyj pipetora o pojemności 1 ml, aby delikatnie przenieść pożywkę z komórek do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml, aby ocenić liczbę sferoid odłączonych od komórek.
      UWAGA: Unikaj wszelkich sił tnących, które mogą oderwać struktury 3D od monowarstwy; Gdy będą gotowe, sferoidy same się odczepią.
    4. Jeśli odłączonych jest mniej niż 50 sferoid, odwirować przy 200 x g przez 5 minut, usunąć starą pożywkę i ponownie zawiesić sferoidy na 0,5 ml / studzienkę pożywki i przenieść do odpowiedniej studzienki, aż dojrzeje wystarczająca ilość sferoidów.
      UWAGA: Czas ekspozycji na podłoże w jelicie środkowym/tylnym odgrywa kluczową rolę w określaniu regionalnej tożsamości rozwijających się organoidów jelita cienkiego, takich jak dwunastnica (krótsza ekspozycja) lub jelito kręte (dłuższa ekspozycja). Aby uzyskać bardziej jednolite kultury o tej samej tożsamości, staraj się jednocześnie zbierać sferoidy wystawione na działanie pożywki w jelicie środkowym/tylnym.
    5. Powtarzaj krok 2.3.3, aż do odłączenia wystarczającej liczby sferoidów, aby zagnieździć się i zainicjować hodowlę ludzkich organoidów jelitowych (hIO).
    6. Przed przystąpieniem do następnej fazy należy oddzielić próbkę sferoid i przeprowadzić charakterystykę cytometrii przepływowej określonych markerów związanych z jelitem środkowym/tylnym (MH). Do charakterystyki reprezentatywnej cytometrii przepływowej wykorzystano strategię bramkowania rozproszenia do przodu i bocznego. Patrz Tabela 4, aby zapoznać się z listą powszechnie używanych znaczników. Zaleca się sprawdzenie ekspresji więcej niż 1 markera, szczególnie w przypadku nowych/jeszcze niezakwalifikowanych linii iPSC w laboratorium.
  4. Etap 3: Osadzenie sferoidy
    1. Przed rozpoczęciem procedury przygotuj następujące elementy.
      1. Rozmrozić podwielokrotności Matrix 1-ABO i Matrix 3-ABO na lodzie. Weź pod uwagę liczbę pobranych sferoid, aby określić całkowitą ilość matrycy potrzebnej, jeśli wymagane będzie 30-40 μl matrycy na kopułę.
      2. Przygotować 25 ml zimnego Advance DMEM/F-12 zawierającego 15 mM HEPES. Wysokostężone ECM są lepkie i trudne do pipetowania. Umieść pudełko ze sterylnymi końcówkami do pipet o pojemności 100 μl w temperaturze -20 °C, aby przygotować zimne końcówki, które mogą wspomóc ten proces. Przygotuj porcje pożywki do wzrostu organoidów jelitowych (OGM), która wymaga 4 karmień (0,5 ml / studzienkę na paszę). Patrz Tabela 5 w celu przygotowania.
      3. Rozmrozić podwielokrotność suplementu OGM na lodzie. Po rozmrożeniu porcji należy je natychmiast zużyć. Nie zamrażać ponownie. Przechowywać cały OGM w temperaturze 2-8 °C przez okres do 2 tygodni.
      4. Przygotować OGM zawierający 3x suplementu w porównaniu ze standardową formułą dla (3x OGM). Wyjmij Matrix 4-XFO1 thought Matrix 4-XFO4 z lodówki i pozwól im ogrzać się do temperatury pokojowej (25 °C).
    2. W przypadku systemu pochodzenia zwierzęcego wykonaj czynności opisane poniżej.
      1. Umieścić sterylną 24-dołkową płytkę do hodowli tkankowej w inkubatorze, aby ogrzała się do temperatury 37 °C, przygotowując sferoidy i matryce. Niech zebrane sferoidy osiądą na dnie stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Ostrożnie odessać i wyrzucić supernatant.
        UWAGA: Aby dokonać dokładniejszego porównania wpływu matryc, upewnij się, że sferoidy zebrane z hiPSC są zróżnicowane na każdej matrycy w oddzielnych probówkach.
      2. Dodać 1 ml DMEM/F-12 z 15 mM HEPES do sferoid. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (15 - 25 °C).
      3. Ostrożnie usunąć jak najwięcej supernatantu. Zaleca się rozpoczęcie usuwania od pipety o pojemności 1 ml i przejście na pipety o pojemności 100 μl, a nawet 10 μl, aby usunąć jak najwięcej bez naruszania osadu sferoidów.
        UWAGA: Im większa pozostała objętość nośnika, tym bardziej rozcieńczone będą matryce. Rozcieńczone matryce mogą prowadzić do problemów z żelowaniem lub bardziej miękkich kopuł. Bardziej miękkie kopuły prowadzą do większych szans na zawalenie się przy minimalnych zakłóceniach.
      4. Za pomocą pipetora z zimną końcówką do pipety o pojemności 100 μl dodać 40 μl/50 sferoid zimnej (2 - 8 °C) Matrix 1-ABO lub Matrix 3-ABO do odpowiedniej probówki. Delikatnie rozprowadź sferoidy w matrycy, pipetując w górę iw dół ~5x. Nie należy całkowicie opróżniać końcówki pipety, ponieważ mogą powodować powstawanie pęcherzyków powietrza.
      5. Wyjmij płytkę z inkubatora i za pomocą zimnej końcówki pipety delikatnie przenieś osadzone sferoidy na środek płytki, wykonując czynności opisane w Rysunek 2. Unikaj zbyt szybkiego dozowania Matrix 1-ABO i Matrix 3-ABO do naczynia hodowlanego, ponieważ spowoduje to spłaszczenie kopuły.
      6. Ostrożnie przenieść płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C i inkubować przez 30 minut, aby zapewnić żelowanie kopuły. Należy szczególnie uważać na wszelkie wstrząsy lub gwałtowne ruchy podczas transportu i w inkubatorze.
      7. Podczas inkubacji kopuły do żelowania, ogrzać w temperaturze 37 °C wystarczającą objętość jelitowego OGM (0,5 ml/studzienkę) dla liczby studzienek, które mają być użyte.
        UWAGA: Ogrzej tylko potrzebną objętość. Unikaj cykli ocieplania i chłodzenia. Upewnij się, że nośnik jest ciepły przed dodaniem go do kopuły; Zimne media mogą doprowadzić do zawalenia się kopuły.
      8. Po 30 minutach ostrożnie dodaj 0,5 ml jelitowego OGM z boku studzienki, aby nie naruszyć kopuły. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wilgotnością 95%. Wykonuj pełną wymianę podłoża co 3 - 4 dni, usuwając pożywkę, a następnie dodaj świeżą pożywkę.
    3. W przypadku systemów organoidowych Matrix 4-XF postępuj zgodnie z opisanymi krokami.
      UWAGA: System organoidów Matrix 4-XF obejmuje cztery różne opcje (O1-O4); Formuła każdego typu różni się biofunkcjonalnymi ligandami, sztywnością i degradowalnością. W związku z tym zaleca się przeprowadzenie wstępnych eksperymentów w celu określenia optymalnego typu dla konkretnego zastosowania. W protokole tym opisano wykorzystanie czterech opcji w celu znalezienia optymalnej formuły organoidów jelitowych pochodzących z hiPSC. Ponadto, chociaż istnieje wiele protokołów hodowli, które można zastosować (np. enkapsulacja 3D, enkapsulacja kopuły), protokół ten obejmuje użycie metody kopułowej, dzięki czemu możliwe jest bezpośrednie porównanie z powszechnymi metodami stosowanymi podczas pracy z systemami membran podstawnych pochodzenia zwierzęcego.
      1. Dodać 1 ml/studzienkę zimnego DMEM/F-12 zawierającego 16 mM HEPES do sferoid generowanych w systemie Matrix 4-XFO4. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (15 - 25 °C).
        UWAGA: Aby znaleźć optymalną formułę dla danego zastosowania, przed odwirowaniem należy rozprowadzić sferoidy w 4 oddzielnych probówkach. Sferoidy generowane na matrycach pochodzenia zwierzęcego mogą być również dojrzewane do organoidów jelitowych za pomocą tego systemu.
      2. Za pomocą pipetora o pojemności 1 ml usunąć supernatant bez naruszania sferoid. Dodaj 50 μL 3x OGM do granulki sferoid (~100 sferoid). Dodaj 100 μl wybranego Matrix 4-XFO do 50 μl zawiesiny sferoidalnej i delikatnie wymieszaj 5x-10x razy. Utrzymuj Matrix 4-XFO do 3x OGM w proporcji mieszania 2:1 v/v, aby uzyskać końcowe stężenie 1x.
      3. Dodać 40 μl mieszaniny hydrożelu i sferoidy do środka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Ostrożnie przenieść płytki do inkubatora o temperaturze 37 °C i inkubować przez 30 min.
        UWAGA: Matrix 4-XFO nie wymaga inkubacji w temperaturze 37 °C do żelowania; Zaleca się jednak, aby organoidy były narażone na podobne warunki w porównaniu z systemami Matrix 1-ABO i Matrix 3-ABO, które wymagają 37 °C dla lepszego żelowania kopuł.
      4. Po 30 minutach ostrożnie dodaj 0,5 ml jelitowego OGM na bok studzienki, aby nie naruszyć kopuły. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wilgotnością 95%. Wykonuj pełną wymianę podłoża co 3 - 4 dni, usuwając pożywkę, a następnie dodając świeżą pożywkę.
  5. Przejście i dojrzewanie hIO
    1. Przygotuj te same chemikalia, roztwory i odczynniki, jak w kroku 2.4.1.
    2. Dodaj 1-2 ml roztworu do płukania zapobiegającego przywieraniu do stożkowej probówki o pojemności 15 ml (1 na warunek) i zamieszaj, aby pokryć probówkę.
    3. Usunąć roztwór zapobiegający przywieraniu i przepłukać probówki 5 ml D-PBS (bez Ca++ i Mg++). Zakryj wszystkie powlekane probówki i przechowuj je w temperaturze pokojowej (15 - 25 °C) do momentu, gdy będą potrzebne.
    4. Odessać pożywkę z kopuł. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml dodaj 1 ml zimnego DMEM/F-12 bezpośrednio do kopuły. Celem jest odłączenie kopuł od płyty.
    5. Dodaj dodatkowy 1 ml zimnego DMEM/F-12 do studzienki i pipetuj w górę iw dół, aby zebrać pozostałe organoidy. Przenieść do powlekanych probówek stożkowych o pojemności 15 ml.
      UWAGA: Sprawdź pomyślne zebranie organoidów, badając wzrokowo studnię pod mikroskopem. W przypadku zaobserwowania jakichkolwiek pozostałości organoidów należy powtórzyć krok 2.5.5.
    6. Za pomocą pipetora o pojemności 1 ml należy wykonać pipetowanie zawiesiny w górę i w dół w celu rozdrobnienia organoidów, aż do uzyskania jednolitej zawiesiny fragmentów o pożądanym rozmiarze organoidu (np. 100 - 500 μm).
      UWAGA: Użyj pipetora o pojemności 200 μl, aby sprawdzić, czy organoidy są zgodne z zalecanym rozmiarem. Zastosowanie pipetora o pojemności 200 μl ułatwia dodatkowe rozdrobnienie w razie potrzeby, dzięki czemu fragmenty mogą płynnie przejść przez końcówkę pipety o pojemności 200 μl.
      UWAGA: Należy unikać rozbijania fragmentów na pojedyncze komórki przez ostre lub długotrwałe pipetowanie.
    7. Ustal pożądaną gęstość organoidów, licząc fragmenty lub stosując współczynnik podziału. Oddzielić podwielokrotność i przeprowadzić liczenie, stosując tę samą procedurę, co w krokach 1.4.6-1.4.9 dla liczenia brył.
      UWAGA: Optymalna gęstość organoidów powinna być zoptymalizowana dla każdej linii; Ogólnie rzecz biorąc, zalecana jest gęstość 40 - 80 organoidów jelitowych na kopułę.
    8. Upewnij się, że probówka jest umieszczona na lodzie podczas procesu liczenia organoidów. Po około 5 minutach fragmenty organoidów osiądą na dnie probówki pod wpływem grawitacji.
      UWAGA: Im większa objętość roztworu organoidu, tym dłużej potrwa opadanie na dno.
    9. Delikatnie wyeliminuj jak najwięcej supernatantu i mętną warstwę utworzoną na wierzchu organoidów. We wczesnych pasażach, gdy organoidy dojrzewają, ta mętna faza obejmuje macierz i pojedyncze komórki.
    10. Dodać 2 ml zimnego DMEM/F-12 bezpośrednio pipetując na granulkę. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (15 - 25 °C).
    11. W przypadku systemu pochodzenia zwierzęcego ostrożnie usunąć i odrzucić supernatant, postępując zgodnie z tymi samymi krokami, które opisano w krokach 2.4.2.4-2.4.2.9.
    12. W przypadku systemu Matrix 4-XFO ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant, wykonując te same czynności, które opisano w krokach 2.4.3.2-2.4.3.4.
      UWAGA: Podczas pracy z systemem Matrix 4-XFO zaleca się stosowanie roztworu do odzyskiwania hydrożelowych organoidów bez kseno-grafów w celu optymalnego usunięcia pozostałości hydrożelu. To rozwiązanie odzysku jest szczególnie zalecane przy przechodzeniu z systemów hydrożelowych pochodzenia zwierzęcego na systemy hydrożelowe wolne od ksenoizolacji, aby zapewnić eliminację wszelkich materiałów ksenogenicznych.

figure-protocol-3
Rysunek 2. Schemat techniki zalecanej do formowania kopuły. Schemat opisuje krok po kroku proces zalecany do pomyślnego formowania kopuły dla wszystkich systemów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Charakterystyka wielkości IO

UWAGA: Rozmiar organoidów charakteryzowały obrazy w jasnym polu wykonane przy powiększeniu 4x i 10x. Analiza przetwarzania obrazu została zautomatyzowana za pomocą MATLAB. Ogólne kroki procesu są opisane poniżej, a próbka kodu znajduje się w pliku uzupełniającym 1.

  1. Zdefiniuj katalog zawierający obrazy i wyświetl listę wszystkich plików obrazów w katalogu. Zainicjuj tabelę, aby zapisać wyniki. Odczytywanie obrazów w jasnym polu w pliku.
  2. Zdefiniuj konwersję pikseli na μm i ustaw skalę. Jeśli obraz nie zawiera podziałki liniowej, poproś użytkownika o podanie współczynnika konwersji z pikseli na μm.
  3. Przekonwertuj obraz na skalę szarości. Zastosuj filtr gaussowski, aby zredukować szumy na obrazie. Proguj przefiltrowany obraz, aby oddzielić organoidy od tła.
  4. Wypełnij małe otwory i usuń małe przedmioty, aby oczyścić obraz binarny. Wykonaj analizę połączonych komponentów, aby zidentyfikować poszczególne organoidy i obliczyć ich właściwości, takie jak powierzchnia, środek ciężkości, długość osi głównej i długość osi mniejszej.
  5. Oblicz rozmiar organoidu na podstawie długości osi głównej i pomocniczej. Wyświetl podzielone na segmenty organoidy na oryginalnym obrazie i oznacz je ich rozmiarem. Wydrukuj rozmiary organoidów i zapisz wyniki w pliku .cvs.
    UWAGA: Pierwsze kilka obrazów zostało przeanalizowanych ręcznie w celu określenia optymalnych parametrów odchylenia standardowego filtra Gaussa i obszaru do progu. Kod w pliku uzupełniającym 1 zawiera przykład podstawowej struktury analizy wielkości organoidów na podstawie obrazów w jasnym polu; Konieczne jest jednak dalsze udoskonalenie, aby dostosować je do specyficznych wymagań dla każdego typu i jakości obrazu. Ten sam proces można wykonać za pomocą oprogramowania typu open source, takiego jak FIJI z Image J.
  6. Wykonaj poniższe czynności, aby korzystać z oprogramowania FIJI.
    1. Zdefiniuj konwersję pikseli na μm i ustaw skalę. Jeśli obraz nie zawiera paska podziałki, poproś użytkownika o podanie współczynnika konwersji z pikseli na μm, klikając przycisk Analizuj > Ustaw skalę.
    2. Przekonwertuj obraz na skalę szarości, klikając Obraz > Wpisz > 8bit. Zastosuj filtr Gaussa, aby zredukować szum na obrazie, klikając Przetwarzaj > Filtr > Notatka gaussowska > Sigma (promień) używany: 2.
    3. Proguj przefiltrowany obraz, aby oddzielić organoidy od tła, klikając Obraz > Próg > MaxEntropia > Zastosuj.
    4. Wypełnij małe otwory i usuń małe obiekty, aby oczyścić obraz binarny, klikając Przetwarzaj > Szum > Usuń wartości odstające > 20 pikseli.
    5. Wykonaj analizę połączonych komponentów, aby zidentyfikować poszczególne organoidy i obliczyć ich właściwości, takie jak powierzchnia, środek ciężkości, długość osi głównej i długość osi pomocniczej, klikając Analizuj > Ustaw pomiar > Upewnij się, że obszar, obwód i średnica są uwzględnione > Analizuj > Analizuj cząstki > Pokaż kontury.
  7. analiza statystyczna
    1. Oceń rozkład danych pod kątem normalności za pomocą testu Saphiro-Wilk przy użyciu oprogramowania JMP (SAS). Aby zbadać różnice statystyczne między grupami, należy przeprowadzić dwukierunkową analizę danych i testy post-hoc przy użyciu nieparametrycznej metody Wilcoxona w oprogramowaniu JMP (SAS). Istotność ustalono na poziomie alfa p ≤ 0,05.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z tym protokołem, dostępne na rynku błony podstawne i system hydrożelowy bez kseno-free zostały z powodzeniem wykorzystane do hodowli komórek hiPSC i różnicowania ich w hIO. Głównym celem tych eksperymentów była systematyczna ocena równoważności matryc z różnych źródeł dla pracy hiPSC i hIO. Pierwsza sekcja tego protokołu koncentrowała się na utrzymaniu i scharakteryzowaniu zdrowej kultury iPSC, która zapewnia wydajne wytwarzanie organoidów jelitowych. Opisano proces powlekania pożytku hodowlanego matrycami pochodzenia zwierzęcego Matrix 1-AB, Matrix 2-AB i Matrix 3-AB i porównano go z systemem hydrożelowym Matrix 4-XF bez ksenoizolacji.

Jak pokazano w Rysunek 3A, hiPSC BXS 0116 (pochodna CD34+) wykazują porównywalną morfologię, gdy są hodowane na trzech matrycach pochodzenia zwierzęcego. Niemniej jednak porównanie linii komórkowej BXS 0116 z SCTi003-A (pochodzącym z PBMC) hodowanym na dołkach pokrytych Matrix 1-AB podkreśla, że wewnętrzne różnice między liniami komórkowymi (pokazane w Tabeli 6) mogą prowadzić do różnic dotyczących proliferacji, różnicowania i morfologii komórek. Na przykład, podczas gdy wygenerowanie DE dla linii komórkowych SCTi003-A zajęło 3 dni, dla linii BXS0116 zajęło to 5 dni. Ponadto, jak pokazano w Rysunek 3B-C, hodowla hiPSC w systemach hydrożelowych Matrix 4-XF prowadzi do tworzenia kolonii w częściowo osadzonej kolonii 3D, która drastycznie różni się od płaskiej morfologii hodowli hiPSC na płytkach pokrytych Matrix 1-AB lub równoważnymi systemami. Ponadto jednym z kluczowych aspektów, na które należy zwrócić uwagę w tych eksperymentach, jest to, że stworzenie systemu hydrożelowego wolnego od ksenotypów przy użyciu 3-krotnych czynników wzrostu może znacznie poprawić żywotność komórek i ekspresję markerów komórek macierzystych. Podsumowując, hodowle hiPSC na matrycach pochodzenia zwierzęcego i wolne od ksenotypów Matrix 4-XF wykonane z 3-krotnym stężeniem czynników wzrostu doprowadziły do równoważnej ekspresji SSEA-4 (marker komórek macierzystych)22; jednak system hydrożelowy sprzyja tworzeniu się częściowo osadzonych kolonii 3D.

Druga sekcja tego protokołu skupia się na różnicowaniu hiPSC do generowania hIO. W tym przypadku dostępny na rynku zestaw opracowany na podstawie Spence et al.23 został użyty do różnicowania w określoną endodermę (DE), następnie jelito środkowe / tylne jelito (MH), a na końcu zebranie sferoidy, aby dojrzeć do IO (Rysunek 4C). Dla efektywnego generowania IO kluczowe znaczenie ma sprawdzenie, czy posiew hiPSC ma minimalne spontaniczne różnicowanie przed rozpoczęciem protokołu różnicowania. Jak pokazano w Rysunek 4A, im niższa ekspresja markerów komórek macierzystych, takich jak SSEA-4, podczas rozpoczynania różnicowania DE, tym mniej wydajny będzie proces na każdym etapie (tj. niższa ekspresja markerów MH) i późniejsza słaba generacja hIO. Wykorzystanie kompaktowego stacjonarnego urządzenia do cytometrii przepływowej ułatwiło szybki dostęp do wyników cytometrii przepływowej i podjęcie decyzji o jakości różnicowania przed przejściem do następnego etapu. Osobliwą obserwacją było to, że hiPSC utrzymywany przez Matrix 2-AB powodował mniej uwalniania sferoidów w fazie jelita środkowego/tylnego w porównaniu z innymi systemami pochodzącymi od zwierząt. Innym kluczowym aspektem, na który należy zwrócić uwagę, jest to, że ponieważ kolonie hiPSC utrzymywane w Matrix 4-XF miały już strukturę 3D na początku różnicowania, systemy te doprowadziły do powstania większych sferoid.

Sferoidy zostały wbudowane w Matrix 1-ABO, Matrix 3-ABO i Matrix 4-XFO1- Matrix 4-XFO4 i zostały dojrzałe do hIO za pomocą zestawu. Po 7 dniach dojrzewania sferoidy zostały one przepasane i osadzone w odpowiednich systemach matrycowych. Wzrost organoidu w każdym systemie był śledzony przez 7 dni na podstawie zdjęć w jasnym polu. Podczas gdy hodowla rozpoczęła się od organoidów o stosunkowo podobnej wielkości, po 5 dniach rozmiar hIO różnił się w zależności od matrycy, w której były osadzone (Ryc. 5). Spośród czterech Matrix 4-XFO preparatem, który doprowadził do powstania większych organoidów, był Matrix 4-XFO3. Systemy Matrix 4-XFO zostały opracowane z różnymi ligandami i właściwościami mechanicznymi, aby pasowały do różnych zastosowań24. W szczególności sztywność Matrix 4-XFO325 jest bliższa sztywności ludzkiego jelita26 niż inne formuły Matrix 4-XFO, co potwierdza najnowsze odkrycia dotyczące roli właściwości mechanicznych ECM w ekspansji organoidów12,27,28. Nasze reprezentatywne wyniki wskazują, że Matrix 1-ABO i Matrix 3-ABO w równym stopniu ułatwiają wzrost i ekspansję organoidów jelitowych.

figure-results-1
Rysunek 3: Wybór systemu matrycowego do konserwacji iPSC. (A) Reprezentatywne obrazy dwóch linii komórkowych hodowanych na kulturze powlekanej trzema różnymi systemami macierzy pochodzenia zwierzęcego. (B) Reprezentatywne obrazy porównujące stosowanie Matrix 4-XF z 1x vs. 3x suplementacją czynnika wzrostu pokazują, że zwiększenie suplementacji czynnika wzrostu poprawia żywotność hiPSC na hydrożelu Matrix 4-XF. (C) Porównanie cytometrii przepływowej ekspresji SSEA-4 Matrix 1-AB, Matrix 3-AB, Matrix 4-XF (3X) wykazuje równoważną ekspresję, podczas gdy Matrix 4-XF (1X) doprowadziło do niższej ekspresji SSEA-4. Słupki reprezentują średnią ± SD n = 5; Do badania istotności wykorzystano dwukierunkową ANOVA oraz testy post-hoc z nieparametryczną metodą Wilcoxona. Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 4: Różnicowanie iPSC na określoną endodermę (DE) i jelito środkowe/tylne (MH). (A) Reprezentatywne obrazy różnicowania iPSC do DE rozpoczynające się od różnych poziomów markera SSEA4 podkreślają znaczenie rozpoczęcia różnicowania od populacji hiPSC z wysoką ekspresją markerów komórek macierzystych. Czerwone strzałki wskazują obszary spontanicznego różnicowania przed rozpoczęciem DE. (B) Przykład analizy metodą cytometrii przepływowej ekspresji markera komórek macierzystych SSEA4 przed rozpoczęciem różnicowania i markera DE FOXA2 po 3 dniach różnicowania DE dla słabego różnicowania DE (po lewej) i dobrego różnicowania (po prawej). Każdy wykres przedstawia analizę komórek wyodrębnionych z 1; Do analizy statystycznej zaleca się uśrednienie wyników z co najmniej 3 przebiegów cytometrii przepływowej. (C) Reprezentatywne obrazy różnicowania iPSC do hIO na wszystkich badanych matrycach. Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 5: Wybór systemu matrycowego do osadzania sferoidów i dojrzewania hIO. (A) Przykładowe obrazy dojrzewania hIO osadzone w Matrix 4-XFO 1-4. Moduł sprężystości układów Matrix 4-XFO wynosi około 50-300 Pa, przy czym najwyższy jest dla Matrix 4-XFO3 > Matrix 4-XFO4 > Matrix 4-XFO2 > Matrix 4-XFO1. Sztywność matrycy 1-ABO i matrycy 3-ABO waha się od 440-800 Pa w zależności od partii. (B) Przykładowe obrazy dojrzewania hIO osadzono w Matrix 1-ABO, Matrix 3-ABO i Matrix 4-XFO3 w dniu osadzenia (Dzień 0) i po 1 tygodniu hodowli (Dzień 7). (C) Dane przedstawiające porównanie wielkości hiIO dojrzałych w różnych systemach matrycowych. Słupki reprezentują średnią ± SD wynoszącą n = 7; Do badania istotności wykorzystano dwukierunkową ANOVA oraz testy post-hoc z nieparametryczną metodą Wilcoxona. Podziałka liniowa = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 6: Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne organoidów jelitowych hodowanych w różnych matrycach potwierdzają populację komórek nabłonkowych. Całe organoidy jelitowe wyhodowane w różnych matrycach utrwalono i wybarwiono cząsteczką adhezyjną komórek nabłonka (EpCAM) (kolor zielony) i podbarwiono przeciwwagowo dla jąder komórkowych DAPI (kolor niebieski). Wszystkie organoidy wykazują komórki EpCAM-dodatnie, co potwierdza populację komórek nabłonkowych zlokalizowanych na zewnętrznej powierzchni organoidów. Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Podsumowanie przygotowania, przechowywania i rozcieńczania podwielokrotności matryc używanych do powlekania preparatów hodowlanych używanych do iPSC. * Aby uzyskać dokładny współczynnik rozcieńczenia, sprawdź zalecany współczynnik rozcieńczenia i/lub stężenia białka w Certyfikacie Analizy każdej partii. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Tabela referencyjna objętości roztworów powlekających na powierzchnię kultur i mTeSR Plus Medium. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Tabela referencyjna objętości roztworów prekursorowych Matrix 4-XF na powierzchnię materiału hodowlanego i kompletnej pożywki dla komórek macierzystych. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 4: Lista popularnych markerów zalecanych do scharakteryzowania hiPSC i hIO podczas procesu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 5: Podsumowanie pożywek potrzebnych do różnicowania hiPSC w organoidy jelitowe. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 6: Szczegółowe informacje na temat dwóch linii hiPSC użytych w tym badaniu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający 1: Ogólny kod MATLAB do modyfikacji zgodnie z określonym typem obrazu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wybór optymalnego mikrośrodowiska do pracy z komórkami macierzystymi i organoidami jest kluczowym wczesnym krokiem w przypadku korzystania z tych platform w szerokim zakresie zastosowań. Nasze reprezentatywne wyniki pokazują, że Matrix 4-XFO3 w połączeniu z wyższym stężeniem czynników wzrostu prowadzi do większych organoidów, co sugeruje, że właściwości fizyczne hydrożeli wolnych od ksenotypów można wykorzystać do optymalizacji wytwarzania organoidów przy użyciu tych systemów. Wcześniej wykazano, że unikalne cechy macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) są ściśle powiązane z tożsamością komórek w narządzie12. Ponieważ komórki wyczuwają siły zewnętrzne za pośrednictwem integryn i innych receptorów, charakterystyka mechaniczna ECM ma głęboki wpływ na komórki macierzyste, a w odpowiedzi komórki macierzyste mogą generować siły wewnętrzne12. Interakcje między komórkami macierzystymi a ich mikrośrodowiskiem mają kluczowe znaczenie w inicjowaniu różnorodnych szlaków sygnałowych12. Dodatkowo wykazano, że ECM może służyć jako rezerwuar do przechowywania i uwalniania czynników wzrostu i innych cząsteczek sygnałowych, które wpływają na zachowanie komórek. W związku z tym nasze reprezentatywne wyniki i dziesięciolecia badań podkreślają znaczenie uwzględnienia biochemicznych i fizycznych aspektów natywnego mikrośrodowiska komórkowego i właściwości tkanek przy wyborze systemów matrycowych do badań in vitro 29,30.

W protokole wyjaśniono kilka krytycznych kroków i zaleceń, aby poinformować użytkowników o potencjalnych problemach i sposobach ich uniknięcia. Niemniej jednak w tych metodach przedstawiono dwa krytyczne kroki, które są kluczowe dla pomyślnego wdrożenia tego protokołu. Po pierwsze, sprawdzenie specyficznych markerów związanych z populacją komórek macierzystych ma kluczowe znaczenie dla określenia optymalnego systemu powlekania, który utrzyma populację komórek macierzystych w gotowości do skutecznego, kontrolowanego różnicowania. Podobnie, potwierdzenie ekspresji markerów związanych z każdym krokiem różnicowania jest niezbędne do podjęcia decyzji, kiedy przejść do następnego etapu. Protokół ten zawiera ogólne wytyczne dotyczące minimalnego czasu wymaganego na każdym etapie. Niemniej jednak optymalny czas na każdym etapie będzie różny dla różnych linii komórkowych i warunków eksperymentalnych (np. genotyp, sztywność). Dlatego scharakteryzowanie wielu markerów specyficznych dla etapu jest najlepszym podejściem do poprawy wydajności generowania hIO.

Drugim krytycznym krokiem było włączenie wyższego stężenia czynników wzrostu podczas korzystania z systemu Matrix 4-XF bez ksenomechanizmu, co ma ogromne znaczenie. Jednym z często podkreślanych ograniczeń systemów biomateriałowych wolnych od ksenotypów jest brak czynników wzrostu31. Jednak ta słabość może stać się mocną stroną: pełna kontrola czynników wzrostu w systemach w celu poprawy odtwarzalności. Chociaż protokół ten opisuje użycie dostępnych na rynku pożywek i zestawu do suplementacji czynnika wzrostu, to samo uzasadnienie można zastosować w przypadku wytwarzania kompletnych pożywek we własnym zakresie z pojedynczymi komponentami. Konkretny stosunek hydrożelu do podłoża wskazuje, o ile wyższe musi być stężenie czynników wzrostu; Na przykład stosunek 2:1 może wymagać 3-krotnego stężenia czynników wzrostu, aby uzyskać stężenie reprezentatywne dla standardowego zastosowanego kompletnego podłoża. Pełna kontrola czynników wzrostu obecnych w systemie jest korzystna dla odpowiedzi na pytania mechanistyczne i uniknięcia problemów regulacyjnych w wielu zastosowaniach.

Etapy przetwarzania obrazu opisane w kroku 3 są ograniczone jakością obrazów i typem wykonanych obrazów. Może wymagać dopracowania, aby dopasować go do specyficznych wymagań każdego typu i jakości obrazu. Jednak ogólne etapy procesu i próbka kodu MATLAB podstawowej ramy do analizy wielkości organoidów na podstawie obrazów w jasnym polu pomagają zdefiniować przepływ pracy, który można jeszcze bardziej zoptymalizować i rozszerzyć. Co więcej, dostęp do mikroskopu jasnego pola jest bardziej powszechny niż w przypadku innych typów mikroskopów. Chociaż brak dostępu i znajomości MATLAB może ograniczać korzystanie z tego kodu, ogólne kroki procesu są kompatybilne z oprogramowaniem typu open source, takim jak Fiji by Image J. Sam rozmiar organoidu nie jest zalecaną metryką do oceny dojrzałości; Zachęca się do przeprowadzenia oceny określonych markerów reprezentatywnych dla narządu docelowego; niektóre z tych markerów dla tkanki jelitowej przedstawiono w Tabeli 4. Rycina 6 przedstawia przykład barwienia immunofluorescencyjnego całych organoidów cząsteczką adhezyjną komórek nabłonka (EpCAM), która jest zlokalizowana na zewnętrznej powierzchni (podstawno-bocznej) organoidów. Podczas gdy EpCAM został uwidoczniony w organoidach hodowanych we wszystkich systemach ECM, wystąpiły różnice w wielkości tych organoidów. W ten sposób informacje o wielkości organoidów pomagają zoptymalizować warunki hodowli. Ponadto w badaniach odpowiedzi na lek wielkość organoidu służy jako wskaźnik odpowiedzi na badany związek; Zmiany wielkości mogą odzwierciedlać skuteczność lub toksyczność badanych związków. Co ważne, generowanie wielu partii organoidów o ustandaryzowanej wielkości jest obecnie wyzwaniem w tej dziedzinie, ale jest to ważny wskaźnik odtwarzalności eksperymentalnej, dzięki czemu wyniki można porównywać w różnych eksperymentach lub laboratoriach. Ogólnie rzecz biorąc, zautomatyzowany przepływ pracy, który umożliwia ekstrakcję ważnych informacji o organoidach z obrazów w jasnym polu, jest korzystnym narzędziem dla wielu badaczy.

Oba systemy, matryce pochodzenia zwierzęcego i hydrożele wolne od ksenoizolacji, mają swoje wady i zalety. Matryca 2-AB prowadząca do mniejszej liczby uwolnień sferoidów w stadium MH niż w przypadku innych matryc pochodzenia zwierzęcego może wynikać z różnic między partiami, co jest powszechnie znaną cechą dostępnych na rynku matryc pochodzenia zwierzęcego. Należy zauważyć, że stężenie dostępnych na rynku systemów ECM jest różne; Na przykład do przygotowania roztworów powlekających wykorzystano współczynniki rozcieńczenia zawarte w arkuszach specyfikacji produktu, które mogą prowadzić do nieznacznie innych stężeń w przypadku matryc pochodzenia zwierzęcego. Te różnice w stężeniu białka mogą znacząco wpływać na różnicowanie, prowadząc do różnic w skuteczności różnicowania w przypadku stosowania tego samego produktu z różnych partii. Aby dokonać wyboru między tymi systemami, należy wziąć pod uwagę takie czynniki, jak konkretne cele eksperymentalne, względy etyczne i wymagania prawne. Na przykład w przypadku porównywania wyników eksperymentów in vitro z mysim modelem zwierzęcym w celu udzielenia odpowiedzi na pytania dotyczące biologii nowotworów i nowotworów, użycie matryc pochodzących z myszy Engelbreth-Holm Swarm EHS może być doskonałym wyborem. Ponadto, ponieważ produkty takie jak Matrigel są używane od dziesięcioleci, istnieje wiele protokołów, danych i odniesień. Jednak użycie dobrze zdefiniowanych matryc wolnych od kseno, które pozwalają na dostosowanie właściwości fizycznych i chemicznych, może być bardziej odpowiednią opcją, gdy pytanie badawcze jest związane z chorobami lub terapiami u ludzi. Ponadto większość systemów hydrożelowych wolnych od kseno-kabli jest zaprojektowana tak, aby spełniała normy regulacyjne, co czyni je odpowiednim wyborem do badań, które wymagają zgodności z dobrymi praktykami produkcyjnymi (GMP) lub innymi wytycznymi regulacyjnymi.

Podsumowując, podczas gdy matryce pochodzenia zwierzęcego są szeroko stosowane do utrzymywania iPSC i generowania organoidów ze względu na ich biokompatybilność, systemy hydrożelowe wolne od ksenoizolacji oferują korzyści pod względem odtwarzalności, opłacalności, zgodności z przepisami i względów etycznych. Wybór między nimi zależy od konkretnych potrzeb badania lub zastosowania klinicznego. Systemy hydrożelowe wolne od kseno-żelu zyskują na popularności jako bardziej wszechstronna i zrównoważona alternatywa, która może wspierać wykorzystanie organoidów i systemów mikrofizjologicznych na potrzeby przedklinicznej krótkiej listy kandydatów terapeutycznych. To zastosowanie może znacznie usprawnić wczesne opracowywanie leków i pomóc w sprostaniu obecnym wyzwaniom związanym z tłumaczeniami klinicznymi w przemyśle farmaceutycznym.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr John Huang jest założycielem i dyrektorem generalnym TheWell Bioscience.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy potwierdzają wcześniejsze szkolenia i ogólne zalecenia dotyczące rozpoczęcia pracy z hiPSC i organoidami od dr Christiny Pacak, Silveli Susuki-Hatano i Russella D'Souzy. Dziękują dr Chelsey Simmons za jej wskazówki dotyczące stosowania systemów hydrożelowych do hodowli komórkowych in vitro. Autorzy chcieliby również podziękować dr Christine Rodriguez i Thomasowi Allisonowi z STEMCELL Technologies za ich wskazówki dotyczące hodowli hiPSC. Autorzy dziękują również TheWell Bioscience za pokrycie kosztów publikacji.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Płytka 24-dołkowa (poddana hodowli, sterylna)Falcon353504
37 ° C Łaźnia wodnaVWR
96-dołkowa płytka Fisher ScientificFB012931
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634
Antyadhezyjne płukanie SolutioSTEMCELL Technologies7010
Szafa bezpieczeństwa biologicznego (BSC)Labconco Logic
Brightfield MicroscopeEcho RebelREB-01-E2
BXS0116ATCCACS-1030
Wirówka z regulacją temperatury (4 ° ThermoScientific75002441
Probówki stożkowe, 15 ml, sterylneThermo Fisher Scientific339650
Probówki stożkowe, 50 mL, sterylneThermo Fisher Scientific339652
Cultrex RGF BME, Typ 2Bio-techne3533-005-02
Cultrex Stem Cell Kwalifikowany RGF BME Bio-techne3434-010-02
D-PBS (bez Ca++ i Mg++)Thermo Fisher Scientific14190144
GeltrexLDEV-Free, hESC Reduce Growth FactorGibco A14133-02
Suplement GlutaMAXThermo Fischer Scientific35050-061
Analizator komórek Guava Muse lub inny sprzęt do cytometrii przepływowej (opcjonalnie)Luminex0500-3115
Roztwór buforowy HEPESThermo Fischer Scientific15630-056
Heralcell Vios Inkubator do hodowli komórkowych (37 ° C, 5% CO2)Thermo Scientific 
JMP SoftwareSAS InstituteJMP 16
MATLABMathWorks, IncR2022b
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Matryca membrany podstawnej bez LDEV 
Matrigel Matrix o wysokim stężeniu (HC), obniżony czynnik wzrostu (GFR) bez LDEVCorning 
mTeSR Plus MediumSTEMCELL Technologies100-0276
Nunclon Delta 24-dołkowa płytka poddana obróbce powierzchniowejThermo Scientific144530
PE Mouse Anti-human CD326 (EpCAM)BD Pharmingen566841
PE Mouse Anti-human CDX2 BD Pharmingen563428
PE Mouse Anti-human FOXA2BD Pharmingen561589
PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human SSEA4 BD Pharmingen561565
ReLeSRSTEMCELL5872
SCTi003-ASTEMCELL Technologies200-0510
Pipety serologiczne (10 ml) Pipety13-678-11E
(5 ml) Fisher Scientific13-678-11D
Pożywka do wzrostu organoidów jelitowych STEMdiffSTEMCELL Technologies5145
STEMdiff Zestaw organoidów jelitowychSTEMCELL Technologies5140
Vitrogel Hydrogel MatrixTheWell BioscienceVHM01
VitroGel ORGANOID Discovery KitTheWell BioscienceVHM04-K
51033775356231354263 serologiczne Fisher Scientific

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hynes, R. O. Integrins: Bidirectional, allosteric signaling machines. Cell. 110 (6), 673-687 (2002).
  2. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123, Pt 24 4195-4200 (2010).
  3. Hinz, B., Gabbiani, G. Fibrosis: Recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives. F1000 Biol Rep. 2, 78(2010).
  4. Pickup, M. W., Mouw, J. K., Weaver, V. M. The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer. EMBO Rep. 15 (12), 1243-1253 (2014).
  5. Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: A dynamic view. Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).
  6. Even-Ram, S., Artym, V., Yamada, K. M. Matrix control of stem cell fate. Cell. 126 (4), 645-647 (2006).
  7. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  8. Tran, O. N., et al. Organ-specific extracellular matrix directs trans-differentiation of mesenchymal stem cells and formation of salivary gland-like organoids in vivo. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 306(2022).
  9. Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
  10. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  11. Gjorevski, N., et al. Tissue geometry drives deterministic organoid patterning. Science. 375 (6576), (2022).
  12. Heo, J. H., Kang, D., Seo, S. J., Jin, Y. Engineering the extracellular matrix for organoid culture. Int J Stem Cells. 15 (1), 60-69 (2022).
  13. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
  14. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  15. Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).
  16. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  17. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
  18. Greenlee, A. R., Kronenwetter-Koepel, T. A., Kaiser, S. J., Liu, K. Comparison of Matrigel and gelatin substrata for feeder-free culture of undifferentiated mouse embryonic stem cells for toxicity testing. Toxicol In Vitro. 19 (3), 389-397 (2005).
  19. Geltrex LDEV-Free, HESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix User Guide (Pub.No. MAN0007336 3.0. Fisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FGeltrex_LDEV_Free_hESC_qualified_PI.pdf (2024).
  20. biotechne R&D Systems. Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor. biotechne R&D Systems. , (2024).
  21. VitroGel Organoid Protocol. TheWell Bioscience. , Available from: https://www.thewellbio.com/video-protocols (2024).
  22. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).
  23. Henderson, J. K., et al. Preimplantation human embryos and embryonic stem cells show comparable expression of stage-specific embryonic antigens. Stem Cells. 20 (4), 329-337 (2002).
  24. Haruna, N. F., Huang, J. Investigating the dynamic biophysical properties of a tunable hydrogel for 3D cell culture. J Cytol Tissue Biol. 7, 30(2020).
  25. Cherne, M. D., et al. A synthetic hydrogel, VitroGel ORGANOID-3, improves immune cell-epithelial interactions in a tissue chip co-culture model of human gastric organoids and dendritic cells. Front Pharmacol. 12, 707891(2021).
  26. Stewart, D. C., et al. Quantitative assessment of intestinal stiffness and associations with fibrosis in human inflammatory bowel disease. PLoS One. 13, e0200377(2018).
  27. Hernandez-Gordillo, V., et al. Fully synthetic matrices for in vitro culture of primary human intestinal enteroids and endometrial organoids. Biomaterials. 254, 120125(2020).
  28. Broguiere, N., et al. Growth of epithelial organoids in a defined hydrogel. Adv Mater. 30, 1801621(2018).
  29. Barthes, J., et al. Cell microenvironment engineering and monitoring for tissue engineering and regenerative medicine: The recent advances. BioMed Res Int. 2014, 921905(2014).
  30. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  31. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nat Rev Mater. 5 (7), 539-551 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Basement Membrane MatricesHuman Stem CellsIntestinal OrganoidsXeno Free HydrogelOrganoid GenerationStem Cell MaintenanceExtracellular MatrixOrganoid CultureInduced Pluripotent Stem CellsOrganoid Differentiation

Related Articles