Opisujemy metodę badania, jak pH reaguje na sygnały środowiskowe w glikosomy krwiobiegowej formy afrykańskich trypanosomów. Podejście to obejmuje czujnik białka dziedzicznego wrażliwego na pH w połączeniu z cytometrią przepływową w celu pomiaru dynamiki pH, zarówno jako test przebiegu w czasie, jak i w formacie wysokoprzepustowego badania przesiewowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiar dynamicznych zmian pH glikosomalnego u żywego Trypanosoma brucei
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Metabolizm glukozy jest krytyczny dla afrykańskiego trypanosomu, Trypanosoma brucei, jako niezbędny proces metaboliczny i regulator rozwoju pasożyta. Niewiele wiadomo na temat reakcji komórkowych generowanych, gdy zmienia się poziom glukozy w środowisku. Zarówno w krwiobiegu, jak i w postaci procyklicznej (w stadium owada) glikosomy zawierają większość glikolizy. Te organelle są szybko zakwaszane w odpowiedzi na niedobór glukozy, co prawdopodobnie powoduje allosteryczną regulację enzymów glikolitycznych, takich jak heksokinaza. W poprzednich pracach lokalizacja sondy chemicznej używanej do pomiarów pH była wyzwaniem, co ograniczało jej użyteczność w innych zastosowaniach.
Ten artykuł opisuje rozwój i wykorzystanie pasożytów, które wyrażają glikozomalnie zlokalizowany pHluorin2, dziedziczny białkowy bioczujnik pH. pHluorin2 to ratiometryczny wariant pHluorin, który wykazuje zależny od pH (kwasu) spadek wzbudzenia przy 395 nm, jednocześnie powodując wzrost wzbudzenia przy 475 nm. Transgeniczne pasożyty zostały wygenerowane przez sklonowanie otwartej ramki odczytu pHluorin2 do wektora ekspresji trypanosomów pLEW100v5, umożliwiając indukowalną ekspresję białka na dowolnym etapie cyklu życia. Immunofluorescencję zastosowano w celu potwierdzenia lokalizacji glikosomalnej biosensora pHluorin2, porównując lokalizację biosensora z aldolazą białkową rezydującą w glikosomalach. Czułość czujnika została skalibrowana przy różnych poziomach pH poprzez inkubację komórek w serii o pH od 4 do 8, podejście, które wcześniej zastosowaliśmy do kalibracji czujnika pH na bazie fluoresceiny. Następnie zmierzyliśmy fluorescencję pHluorin2 przy 405 nm i 488 nm za pomocą cytometrii przepływowej w celu określenia pH glikozomalnego. Zweryfikowaliśmy działanie żywych transgenicznych pasożytów wykazujących ekspresję pHluoryny2, monitorując pH w czasie w odpowiedzi na deprywację glukozy, znany czynnik wyzwalający zakwaszenie glikosomalne u pasożytów PF. Narzędzie to ma szereg potencjalnych zastosowań, w tym potencjalnie może być wykorzystywane w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych leków. Poza glikozomalnym pH czujnik może być dostosowany do innych organelli lub stosowany w innych trypanosomatydach w celu zrozumienia dynamiki pH w warunkach żywych komórek.
Wprowadzenie
Pasożytnicze kinetoplastydy, podobnie jak większość żywych organizmów, polegają na glukozie jako podstawowym składniku centralnego metabolizmu węgla. Do tej grupy należą organizmy ważne z medycznego punktu widzenia, takie jak trypanosom afrykański, Trypanosoma brucei; amerykański trypanosom T. cruzi; i pasożyty z rodzaju Leishmania. Metabolizm glukozy ma kluczowe znaczenie dla wzrostu pasożytów na etapach cyklu życia patogenu. Na przykład, gdy jest pozbawiony glukozy, forma krwi (BSF) afrykańskiego trypanosomu szybko umiera. Warto zauważyć, że glikoliza służy jako jedyne źródło ATP na tym etapie infekcji1. Pasożyty Le....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Użycie trypanosomów T. brucei brucei 90-13 BSF, monomorficznej linii pasożytniczej, wymaga zachowania środków ostrożności, ponieważ są one uznawane za organizmy z grupy ryzyka 2, które powinny być obsługiwane w laboratoriach drugiego poziomu bezpieczeństwa biologicznego.
1. Hodowla i transfekcja trypanosomów
- Hodować trypanosomy T. brucei brucei 90-13 BSF w medium HMI-9 uzupełnionym o 10% inaktywowanego ciepłem FBS oraz 10% Nu-Serum w temperaturze 37 °C w 5% CO210.
UWAGA: Aby utrzymać kulturę w dobrym stanie, należy zachować gęstość komórek w zakresie od 2....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Lokalizacja pHluorin2-PTS1 w glikosomach T. brucei w formie BSF
Aby ocenić lokalizację subkomórkową pHluorin2-PTS1, pasożyty poddano analizom immunofluorescencyjnym. Sygnał z transgenu kolokalizował z antyserami przeciwko białku glikosomalnemu, aldolazie (TbAldolase) (Rycina 2A). Średni współczynnik korelacji Pearsona dla kolokalizacji przeciwciał anty-TbAldolase i pHluorin2-PTS1 wyniósł 0,895, co wskazuje, że pHluorin2-PTS1 lokalizowało się głównie w glikosomac.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Percepcja środowiskowa i mechanizmy odpowiedzi w afrykańskim trypanosomie są słabo poznane. Wiadomo, że zmiany w dostępności składników odżywczych wywołują różne reakcje pasożyta, w tym zakwaszenie glikosomów. Tutaj opisaliśmy metodę badania odpowiedzi pH glikosomalnego na zaburzenia środowiskowe w żywych komórkach za pomocą czujnika dziedzicznego białka, pHluorin2 i cytometrii przepływowej.
Istnieje kilka krytycznych etapów korzystania z czujnika. Po pierwsze, ważna jest charakterystyka trans.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
pHluorin2-PTS1 został sklonowany do pLEW100v5 przez Twist Bioscience, który dostarczył konstrukt w wektorze klonowania o wysokiej kopii; pLEW100v5 był prezentem od Dr. George'a Crossa. Surowica odpornościowa przeciwko aldolazie T. brucei jest dostępna na życzenie u dr Meredith T. Morris z Clemson University. Prace laboratoriów JCM i KAC zostały częściowo wsparte nagrodą przyznaną przez National Institutes of Health (R01AI156382). TPK był wspierany przez NIH 3R01AI156382.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kolby do hodowli tkankowych 50 ml (niepoddane obróbce, sterylne) | VWR | 10861-572 | |
| 75 cm2 Kolba do hodowli tkankowych (niepoddawana obróbce, sterylna) | Corning | 431464U | |
| 80 µ L płaskodenna płytka 384-dołkowa | BrandTech | 781620 | |
| Amaxa Ludzki nukleofektor z komórek T Zestaw | Lonza | VPA-1002 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | invitrogen firmy Thermo Fisher Scientific | A24858 | Oprogramowanie FlowJo |
| BRANDplates 96-Well, płaska płyta | dolna Millipore Sigma | BR781662 | |
| wtyczka Coloc 2 firmy ImageJ | https://imagej.net/plugins/coloc-2 | ||
| CytKick Max Auto Sampler | firmy Thermo Fisher Scientific | A42973 | |
| Cytometr przepływowy CytoFLEX | Beckman-Coulter | ||
| Nauki 16% wodny roztwór paraformaldehydu, klasa EM, 10 ml Ampułka | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| Oprogramowanie statystyczne | GraphPad Prism | ||
| Nigericin (sól sodowa) | Cayman Chemical | 11437 | |
| Nucleofector 2b | Lonza | Produkt wycofany | |
| OP2 Liquid Handler | opentrons | OP2 | |
| poli-L-lizyna, 0,1% (w/v) w H2O | Sigma Life Science | CAS: 25988-63-0 | Robot pipetujący do testu HTS |
| Czerwień tiazolowa (TO-PRO-3) | biot# | 40087 | Obrabowaliśmy niestandardowy stojak na płyty akrylowe, aby ta marka płyty mogła być wykrywana i używana w naszym CytKick Max Auto Próbnik |
| valinomycin | Cayman Chemical | 10009152 | Robot do pipetowania do testu HTS |
| Do kalibracji pH | |||
| Do kalibracji pH |
Bibliografia
- Coley, A. F., Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. Glycolysis in the African trypanosome: Targeting enzymes and their subcellular compartments for therapeutic development. Molecular Biology International. 2011, 123702(2011).
- Mcconville, M. J., Saunders, E. C., Kloehn, J., Dagley, M. J.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
