Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Modelowanie ligandów na mapach pochodzących z kriomikroskopii elektronowej

3.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66310

⸱

19 lipca 2024

 ,  , 
1National Centre for Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research, 2Institute for Stem Cell Science and Regenerative Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół wprowadza dostępne narzędzia do modelowania ligandów małocząsteczkowych na mapach krioEM makromolekuł.

Streszczenie

Rozszyfrowanie interakcji białko-ligand w kompleksie makromolekularnym jest kluczowe dla zrozumienia mechanizmu molekularnego, leżących u podstaw procesów biologicznych i rozwoju leków. W ostatnich latach mikroskopia elektronowa próbek kriogenicznych (cryoEM) stała się potężną techniką określania struktur makrocząsteczek i badania sposobu wiązania ligandów w rozdzielczości bliskiej atomowi. Identyfikacja i modelowanie cząsteczek niebiałkowych na mapach krioEM jest często trudne ze względu na anizotropową rozdzielczość w cząsteczce będącej przedmiotem zainteresowania i nieodłączny szum w danych. W tym artykule czytelnicy zapoznają się z różnymi programami i metodami stosowanymi obecnie do identyfikacji ligandów, budowy modeli i doprecyzowywania współrzędnych atomowych przy użyciu wybranych makrocząsteczek. Jednym z najprostszych sposobów identyfikacji obecności liganda, jak pokazano na przykładzie enzymu enolazy, jest odjęcie dwóch map uzyskanych z ligandem i bez niego. Dodatkowa gęstość liganda prawdopodobnie będzie wyróżniać się na mapie różnic nawet przy wyższym progu. Zdarzają się przypadki, jak pokazano w przypadku metabotropowego receptora glutaminianu mGluglu5, kiedy takie proste mapy różnic nie mogą być wygenerowane. Niedawno wprowadzona metoda wyprowadzania mapy pominięć Fo-Fc może służyć jako narzędzie do walidacji i wykazywania obecności liganda. Wreszcie, na przykładzie dobrze przebadanej β-galaktozydazy, przeanalizowano wpływ rozdzielczości na modelowanie ligandów i cząsteczek rozpuszczalnika na mapach krioEM oraz przedstawiono perspektywę wykorzystania krioEM w odkrywaniu leków.

Wprowadzenie

Komórki spełniają swoje funkcje, przeprowadzając niezliczone reakcje chemiczne jednocześnie i niezależnie, a każda z nich jest skrupulatnie regulowana, aby zapewnić im przetrwanie i zdolność adaptacji w odpowiedzi na sygnały środowiskowe. Osiąga się to poprzez rozpoznawanie molekularne, które umożliwia biomolekułom, zwłaszcza białkom, tworzenie przejściowych lub stabilnych kompleksów z innymi makrocząsteczkami, a także małymi cząsteczkami lub ligandami1. Tak więc interakcje białko-ligand mają fundamentalne znaczenie dla wszystkich procesów w biologii, które obejmują regulację ekspresji i aktywności białek, rozpoznawanie substratów i kofaktorów przez enzymy, a także sposób, w jaki komórki postrzegają i przekazują sygnały1,2. Lepsze zrozumienie właściwości kinetycznych, termodynamicznych i strukturalnych kompleksu białko-ligand ujawnia molekularne podstawy interakcji ligandów, a także ułatwia racjonalne projektowanie leków poprzez optymalizację interakcji i swoistości leków. Ekonomicznym i szybszym podejściem do badania interakcji białko-ligand jest zastosowanie dokowania molekularnego, które jest metodą obliczeniową, która wirtualnie przesiewa różnorodny zakres małych cząsteczek i przewiduje tryb wiązania i powinowactwo tych ligandów do białek docelowych3. Jednak dowody eksperymentalne ze struktur o wysokiej rozdzielczości wyznaczonych za pomocą dyfrakcji rentgenowskiej (XRD), magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) lub kriomikroskopii elektronowej (cryoEM) dostarczają niezbędnego dowodu na takie przewidywania i pomagają w opracowaniu nowszych i skuteczniejszych aktywatorów lub inhibitorów dla danego celu. W tym artykule użyto skrótu "cryoEM", jak powszechnie określa się tę technikę. Trwa jednak debata na temat wyboru właściwej nomenklatury, a ostatnio zaproponowano termin cryogenic-sample Electron Microscopy (cryoEM), aby wskazać, że próbka znajduje się w temperaturze kriogenicznej i jest obrazowana za pomocą elektronów4. Podobnie, mapy wyprowadzone z cryoEM zostały nazwane potencjałem elektronowym, potencjałem elektrostatycznym lub potencjałem Coulomba, a dla uproszczenia używamy tutaj map cryoEM 5,6,7,8,9,10.

Chociaż XRD był złotym standardem w wysokorozdzielczym określaniu struktury kompleksów białko-ligand, post resolution-revolution11 cryoEM nabrał rozpędu, na co wskazuje gwałtowny wzrost liczby map potencjału Coulomba lub map krioEM zdeponowanych w Bazie Danych Mikroskopii Elektronowej (EMDB)12,13 w ciągu ostatnich kilku lat14. Dzięki postępom w metodach przygotowywania, obrazowania i przetwarzania próbek, liczba depozycji Protein Data Bank (PDB)14 z wykorzystaniem cryoEM wzrosła z 0,7% do 17% w latach 2010-2020, przy czym około 50% zgłoszonych struktur w 2020 r. określono w rozdzielczości 3,5 A lub lepszej15,16. CryoEM został szybko przyjęty przez społeczność biologów strukturalnych, w tym przemysł farmaceutyczny, ponieważ umożliwia badanie elastycznych i niekrystalicznych makrocząsteczek biologicznych, zwłaszcza białek błonowych i kompleksów wielobiałkowych, w rozdzielczości bliskiej atomowi, pokonując proces krystalizacji i uzyskując dobrze dyfrakcyjne kryształy wymagane do określenia struktury w wysokiej rozdzielczości za pomocą XRD.

Dokładne modelowanie liganda na mapie krioEM jest najważniejsze, ponieważ służy jako plan kompleksu białko-ligand na poziomie molekularnym. W krystalografii rentgenowskiej stosuje się kilka zautomatyzowanych narzędzi do budowania ligandów, które zależą od kształtu i topologii gęstości liganda w celu dopasowania lub wbudowania liganda w gęstość elektronów17,18,19,20. Niemniej jednak, jeśli rozdzielczość jest niższa niż 3 A, podejścia te mają tendencję do uzyskiwania mniej pożądanych wyników, ponieważ cechy topologiczne, od których zależą w celu rozpoznania i budowania, stają się mniej zdefiniowane. W wielu przypadkach metody te okazały się nieskuteczne w dokładnym modelowaniu ligandów na mapach krioEM, ponieważ mapy te zostały określone w zakresie od niskiej do średniej rozdzielczości, zwykle między 3,5 A -5 A17.

Pierwszy krok w określaniu struktury 3D kompleksu białko-ligand za pomocą cryoEM polega na albo współoczyszczaniu liganda z białkiem (gdy ligand ma wysokie powinowactwo do wiązania z białkiem), albo na inkubacji roztworu białka z ligandem przez określony czas przed przygotowaniem siatki. Następnie niewielką objętość próbki umieszcza się na oczyszczonej plazmowo dziurawej siatce TEM, a następnie błyskawicznie zamraża się w ciekłym etanie i ostatecznie obrazuje za pomocą krio-TEM. Obrazy projekcyjne 2D od setek tysięcy do milionów pojedynczych cząstek są uśredniane w celu zrekonstruowania trójwymiarowej (3D) mapy potencjału kulombowskiego makrocząsteczki. Identyfikacja i modelowanie ligandów i cząsteczek rozpuszczalników na tych mapach stanowi w wielu przypadkach poważne wyzwania ze względu na rozdzielczość anizotropową na całej mapie (tj. rozdzielczość nie jest jednolita w całej makrocząsteczce), elastyczność w regionie, w którym związany jest ligand, oraz szum w danych. Wiele narzędzi do modelowania, udoskonalania i wizualizacji, które zostały opracowane dla XRD, jest obecnie dostosowywanych do użytku w cryoEM do tych samych celów18, 19, 20, 21. W tym artykule przedstawiono przegląd różnych metod i oprogramowania stosowanych obecnie do identyfikacji ligandów, budowania modeli i doprecyzowywania współrzędnych wyznaczonych przez cryoEM. Opracowano protokół krok po kroku, aby zilustrować procesy związane z modelowaniem ligandów przy użyciu określonych kompleksów białko-ligand o różnej rozdzielczości i złożoności.

Pierwszy krok w modelowaniu ligandów na mapach cryoEM obejmuje identyfikację gęstości ligandów (niebiałkowych) na mapie. Jeśli wiązanie liganda nie indukuje żadnych zmian konformacyjnych w białku, wówczas obliczenie prostej mapy różnic między kompleksem białko-ligand a białkiem apo zasadniczo podkreśla regiony o dodatkowej gęstości, co sugeruje obecność liganda. Takie różnice można zaobserwować od razu, ponieważ wymagają one tylko dwóch map, a nawet mapy pośrednie podczas procesu udoskonalania 3D mogą być wykorzystane do sprawdzenia, czy ligand jest obecny. Dodatkowo, jeśli rozdzielczość jest wystarczająco wysoka (<3,0 A), mapa różnic może również dostarczyć informacji na temat lokalizacji cząsteczek wody, a także jonów oddziałujących z ligandem i resztą białkowym.

W przypadku braku mapy apo-protein, teraz można korzystać z Servalcat22, który jest dostępny jako samodzielne narzędzie i został również zintegrowany z pakietem oprogramowania CCP-EM23,24 jako część udoskonalenia Refmac i w wydaniu CCP4 8.025,26. Servalcat umożliwia obliczenie mapy różnic ważonych FSC (Fo-Fc) przy użyciu niezaostrzonych półmap i modelu apoprotein jako danych wejściowych. Mapa pominięcia Fo-Fc reprezentuje rozbieżność między mapą eksperymentalną (Fo) a mapą uzyskaną na podstawie modelu (Fc). W przypadku braku liganda w modelu, dodatnia gęstość na mapie Fo-Fc, która pokrywa się z eksperymentalną mapą EM, zazwyczaj sugeruje obecność liganda. Założenie jest takie, że łańcuch białkowy jest dobrze dopasowany do mapy, a pozostała gęstość dodatnia wskazuje na lokalizację liganda. Ważne jest jednak, aby skrupulatnie zbadać, czy dodatnia gęstość nie wynika z niedokładności modelowania, takich jak niewłaściwy rotamer łańcucha bocznego białka.

Drugi krok polega na uzyskaniu lub stworzeniu pliku współrzędnych kartezjańskich liganda z dobrze zdefiniowaną geometrią na podstawie dostępnych informacji chemicznych. Standardowe ligandy (na przykład ATP i NADP+), które są już dostępne w bibliotece monomerów CCP4, można wykorzystać do udoskonalenia poprzez pobranie plików współrzędnych i geometrii za pomocą ich kodu dostępu do monomeru. Jednak w przypadku nieznanych lub niestandardowych ligandów dostępne są różne narzędzia do tworzenia plików geometrii. Niektóre z przykładów obejmują eLBOW27 - (electronic ligand builder and optimization workbench) w Phenix28, Lidia - wbudowane narzędzie w Coot29, JLigand/ACEDRG30,31, CCP-EM23,24, Ligprep32-moduł Glide w ramach pakietu Schrödinger. Plik współrzędnych liganda jest następnie dopasowywany do gęstości, prowadzony zarówno przez eksperymentalną mapę krioEM, jak i mapę różnic w Coot. Po tym następuje udoskonalenie w przestrzeni rzeczywistej w Phenix28 lub wzajemne udoskonalenie w Refmac33. Wymagana jest stacja robocza z systemem Linux lub laptop wyposażony w dobrą kartę graficzną i wyżej wymienione oprogramowanie. Większość z tych programów jest zawarta w różnych pakietach. CCP-EM24 i Phenix28 są swobodnie dostępne dla użytkowników akademickich i zawierają różne narzędzia używane w tym artykule, w tym Coot, Refmac533,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine, itp. Podobnie, Chimera37 i ChimeraX38 udostępniają bezpłatne licencje użytkownikom akademickim.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Modelowanie fosfoenolopirogronianu (PEP) w enolazie z Mycobacterium tuberculosis

  1. Identyfikacja gęstości ligandów na mapie krioEM kompleksu PEP-enolaza
    1. Pobierz nieostrzone półmapy (emd_30988_additional_1.map i emd_30988_additional_2.map) apo-enolazy z dodatkowych danych w EMDB (patrz Spis materiałów).
    2. Otwórz ChimeraX (patrz Tabela Materiałów). Otwórz półmapy apo-enolase, klikając Otwórz na pasku narzędzi i wybierając nazwy plików. Wpisz vop add #1 #2 w wierszu poleceń, aby połączyć obie połówki map w celu uzyskania niezaostrzonej mapy apo-enolase.
      UWAGA: #1 i #2 oznaczają dwie połówki mapy enzymu apo-enolazy, jak wspomniano w kroku 1.1.1.
    3. Zmień nazwę połączonej mapy (ID mapy ChimeraX: #3), wpisując rename #3 Apo-enolase-unsharpened-map. Pokoloruj mapę na szaro z panelu modelu. Mapa wskazuje, że enolaza jest oktameryczna w roztworze o symetrii D4.
    4. Powtórz kroki 1.1.1-1.1.3, używając następujących połówek map emd_30989_additional_1.map (ID mapy: 4) i emd_30989_additional_2.map (ID mapy:5), aby uzyskać PEP-enolase-unsharpened-map (ID mapy: #6).
    5. Aby obliczyć mapę różnic, najpierw dopasuj dwie mapy (PEP-enolaza i niezaostrzone mapy apo-enolazy z kroku 1.1.3 i kroku 1.1.4) względem siebie, klikając Dopasuj (mapa na mapie) w panelu Mapa (pasek narzędzi) w ChimeraX.
      UWAGA: Normalizacja nie jest wykonywana między dwiema mapami. W niektórych przypadkach może być wymagana normalizacja w celu doprowadzenia map do tej samej skali.
    6. Odejmij mapę enolazy PEP od mapy enolazy apo, wpisując vop odejmij #6 #3 w wierszu poleceń.
      UWAGA: #6 = mapa niewyostrzona pep-enolaza, #3 = mapa niezaostrzona apo-enolaza.
    7. Pokoloruj odjętą mapę (ID mapy:7) na zielono, oznaczając gęstość dodatnią (zgodnie z konwencją krystalografii rentgenowskiej)39.
    8. Pobierz współrzędne enolazy oktamerycznej M. tuberculosis (PDB: 7e4x) z Banku Danych o Białkach (PDB), kliknij Otwórz na pasku narzędzi i wybierz nazwę pliku.
    9. Zmień nazwę modelu na 7e4x.pdb, wpisując rename #8 Apo_enolase.pdb w wierszu poleceń. #8 oznacza Apo_enolase.pdb w ChimeraX.
    10. Wybierz model z panelu modelu. Kliknij prawym przyciskiem myszy na pasku narzędzi. Kliknij Przesuń cząsteczkę, aby umieścić model w pobliżu mapy PEP-enolazy (#7) i wyrównać model względem mapy. Dopasuj ten model do mapy PEP-enolase-unsharpened-map, wpisując fit #8 w #6 w wierszu poleceń. Tutaj mapa ma numer 6, a model jest oznaczony numerem 8.
      UWAGA: W niektórych przypadkach lokalne dopasowanie w ChimeraX może nie wystarczyć do wyrównania modelu. W takich przypadkach w Phenix można wykonać dodatkowy krok globalnego dopasowania (DockinMap, patrz Tabela materiałów).
    11. Zapisz dopasowany model, wpisując save Apo-enolase.pdb #8 w wierszu polecenia.
  2. Modelowanie i udoskonalanie PEP w zaostrzonej mapie krioEM kompleksu PEP-enolaza ze współczynnikiem B
    1. Otwórz "coot" (patrz Spis materiałów) z terminala, wpisując ./Coot &.
    2. Wyświetl "Apo-enolase.pdb", klikając Plik, > Otwórz współrzędne Apo-enolase.pdb. Plik współrzędnych jest wyświetlany za pomocą wiązań (kolor według atomu).
    3. Pobierz zaostrzoną mapę Enolase związaną z PEP, tj. emd_30989.map z EMDB. Wyświetl to samo, klikając Plik > Otwórz mapę > emd_30989.map . Ustaw próg na 7,00 σ, przewijając środkowy przycisk myszy.
    4. Znajdź niemodelowane obiekty blob, klikając pozycję Weryfikuj > Niemodelowane obiekty blob > Znajdź obiekty blob.
    5. Zlokalizuj niemodelowaną gęstość liganda w pobliżu reszt miejsca aktywnego, Ser 42, Lys-386 i Arg-364 modelu enolazy.
    6. Pobierz plik modelu monomeru PEP z biblioteki monomerów Coot, klikając File > Get Monomer i wprowadzając PEP jako 3-literowy kod.
    7. Przenieś cząsteczkę PEP do gęstości za pomocą opcji Obróć/Przesuń- Strefa/Łańcuch/Cząsteczka w menu paska bocznego. Użyj udoskonalenia w przestrzeni rzeczywistej w Coot, aby dopasować cząsteczkę PEP do gęstości, klikając Strefa uszlachetniania w przestrzeni rzeczywistej w menu paska bocznego. Połącz dopasowany ligand z Apo-enolase.pdb za pomocą opcji scal cząsteczkę na karcie edycji. Zapisz model jako PEP-Enolase.pdb.
      UWAGA: Można również użyć liganda> opcji Jiggle-Fit Ligand, aby również dopasować ligand.
    8. Aby dodać ligandy do pozostałych monomerów w pliku współrzędnych, kliknij Obliczaj > Narzędzia NCS > Ligandy NCS. Pojawi się osobne okno o nazwie Znajdź ligandy związane z NCS. Dla opcji Białko z NCS wybierz plik współrzędnych Apo-enolase.pdb i Identyfikator łańcucha A jako Łańcuch główny NCS.
      1. Dla cząsteczki zawierającej ligand wybierz Apo-enolase.pdb jako plik współrzędnych i identyfikator łańcucha, J i numer reszty od 1 do 1. Kliknij Znajdź stanowiska kandydatów. Pojawi się okno o nazwie Dopasowane ligandy z listą pozycji kandydujących. Oceń dopasowanie, klikając na poszczególne kandydujące ligandy i przeanalizuj dopasowanie wizualnie.
        UWAGA: W Servalcat/Refmac można podać tylko model monomeru, a symetrię użytą do rekonstrukcji można podać w celu uzyskania modelu rozszerzonego.
    9. Dodatkową gęstość cząsteczek rozpuszczalnika zaobserwowano również w pobliżu liganda. Struktury krystaliczne enolazy o wysokiej rozdzielczości z różnych homologów sugerują obecność dwóch jonów Mg2+ 40,41, co prawdopodobnie stabilizuje ujemny ładunek produktu pośredniego reakcji. Zamodeluj dwa jony Mg2+ w gęstości miejsca aktywnego, klikając umieść atom na wskaźniku i wybierając MG z listy typów atomów wskaźnika.
      UWAGA: Geometria i odległość wiązania mogą służyć jako wskazówka przy wyborze jonu metalu. W przypadku Mg2+ związanych z atomami tlenu w resztach białkowych odległość wiązania waha się w granicach 2,1 A -2,4 A, przy geometrii oktaedrycznej. Jednak w przypadku map o niskiej rozdzielczości sfera koordynacyjna jest często niekompletna, a odległość może się również różnić ze względu na ograniczenia rozdzielczości.
    10. Powtórzyć krok 1.2.8 w celu dodania jonówMg2+ do monomerów związanych z symetrią.
    11. Zapisz model, klikając Plik > Zapisz współrzędne > Wybierz > Nazwa pliku i wpisując Enolase+PEP+Mg.pdb.
    12. Otwórz graficzny interfejs użytkownika Phenix (patrz tabela materiałów). Uruchom zadanie uściślania rzeczywistej przestrzeni z plikami Enolase+PEP+Mg.pdb i emd_30989.map jako modelem wejściowym i mapą, odpowiednio, przy użyciu parametrów domyślnych. Ten krok jest wykonywany iteracyjnie z Coot, aby uzyskać dobre dopasowanie mapy do modelu i geometrię.
      UWAGA: Niewyostrzona mapa różnic służy do wykazania obecności liganda, na przykład na rysunku. Do celów modelowania użyto mapy wyostrzonej współczynnika B, która jest zalecana. Mapa wyostrzona współczynnikiem B może być również używana do obliczania mapy różnic w celach demonstracyjnych, w przeciwieństwie do mapy niewyostrzonej. Jeśli jednak rozdzielczość jest niższa w obszarze, w którym ligand jest związany, wówczas pojedynczy współczynnik B używany do wyostrzania całej mapy może nie ujawniać wyraźnie gęstości liganda.
  3. Wizualizacja i generowanie figur modelowanego liganda
    1. Otwórz udoskonalony model Enolase+PEP+Mg z końcowego zadania uściślania Phenix w PyMOL42 (patrz Spis materiałów), klikając File > Open i wybierając nazwę pliku.
    2. Załaduj emd-30989.map (zaostrzona mapa związana z PEP), klikając File > Open i wybierając nazwę pliku.
    3. Zmień nazwę mapy na wyostrzoną PEP, klikając akcje > zmień nazwę względem obiektu emd_30989 i wpisując PEP-sharpened.
      UWAGA: W większości przypadków, na przykład enolaza, mapy po otwarciu w pymol są znormalizowane, ponieważ opcja normalizowania mapy jest domyślnie zaznaczona w pymol. Ponieważ mapy krioEM są wyśrodkowane na większym pudełku, normalizacja obejmie wszystko, co się w nim znajduje. W ten sposób normalizację można wyłączyć przed otwarciem w pymol.
    4. Wybierz ligandy, klikając wyświetl > sekwencji.
    5. Wpisz isomesh mesh_ligands, PEP-sharpened, 6.0, sele, carve=3.0 w wierszu poleceń i naciśnij enter.
    6. Pokoloruj mesh_ligand na niebiesko, klikając ostatnie pole, C, obok mesh_ligand obiektu.
    7. Wyświetl pozostałości w miejscu aktywnym, Ser-42, Asp-241, Glu-283, Asp-310, Arg-364 i Lys-386 oddziałujące z PEP i Mg2+ odpowiednio w reprezentacji pałeczki i sfery oraz enzym enolazy w reprezentacji kreskówki.
    8. Śledź promienie, wpisując ray 3600, 3600, aby wygenerować obrazy o jakości publikacji i zapisać jako plik png, klikając File > save i wybierając PEP.png jako nazwę pliku.

2. Modelowanie ligandów w metabotropowym receptorze glutaminianu mGluglu5

  1. Identyfikacja i modelowanie gęstości ligandów w krioEM mGlu5 związanego z agonistą i antagonistą
    1. Pobierz dwie półmapy wraz z odpowiadającymi im plikami współrzędnych dla każdego z kompleksów mGlu5 związanych z agonistą (EMD-31536, 7fd8.pdb) i antagonistą (EMD-31537,7fd9.pdb).
    2. Otwórz ChimeraX
      1. Otwórz plik współrzędnych 7fd8.pdb, klikając przycisk Otwórz i wybierając opcję 7fd8.pdb.
      2. Wpisz delete ligand w wierszu poleceń i naciśnij Enter.
      3. Podobnie użyj polecenia delete/B, aby usunąć łańcuch B.
        UWAGA: Ligandy i łańcuchy można usunąć za pomocą menu rozwijanego u góry, korzystając z opcji wyboru i akcji > atomy/wiązania > usunięcia.
      4. Zapisz niezligandowany plik pdb, wpisując następujące polecenie w wierszu polecenia: save 7fd8_noligand_chainA.pdb #1. #1 oznacza identyfikator modelu.
      5. Powtórz kroki 2.1.2.1-2.1.2.4 dla pliku 7fd9.pdb.
    3. Otwórz CCP-EM. Utwórz nowy projekt o nazwie mGlu5 i określ katalog projektu oraz nazwę użytkownika.
      1. Otwórz Relion z opcji na lewym panelu.
        1. Przejdź do zakładki Tworzenie maski.
        2. Podaj jedną z połówek map dla EMD-31536 jako dane wejściowe.
          UWAGA: Relion akceptuje mapy z sufiksem .mrc, a mapy EMD mają sufiks .map. Pliki map można otworzyć w ChimeraX do wglądu i zapisać w formacie .mrc.
        3. Na karcie maski podaj rozmiar piksela jako 0,89 A i początkowy próg binaryzacji jako 0,007.
        4. Uruchom zadanie z aliasem 31536 (lub dowolną inną nazwą, która jest łatwa do naśladowania).
        5. Podobnie utwórz maskę dla połówki mapy EMD - 31537.
      2. Otwórz program Refmac Servalcat z opcji w lewym panelu w CCPEM.
        1. Podaj nazwę jako mGlu5_agonist.
        2. Zaimportuj plik 7fd8_noligand_chainA .pdb zgodnie z opisem w sekcji 2.1.2.4 modelu. Podaj lokalizację dwóch połówek map i odpowiadającej im maski utworzonej w Relion.
        3. Określ rozdzielczość jako 3,8 A.
        4. Przejdź do ustawień zagęszczenia > opcji Ścisła symetria i wspomnij C2 jako symetrię grupy punktów relion.
        5. Uruchom program, naciskając przycisk start u góry.
    4. Po zakończeniu zadania otwórz wynik w Coot (opcja dostępna u góry w sekcji wyników). Spowoduje to domyślne wyświetlenie pliku diffmap.mtz w Coot, gdzie kolory czerwony i zielony oznaczają odpowiednio gęstości ujemne i dodatnie.
      1. Przejdź do Menedżera wyświetlania> właściwości mapy różnic o nazwie DELFWT PHDELWT i zmień poziom konturu na 4.0 (wartość bezwzględna).
        UWAGA: Wybór progu zależy od mapy i rozdzielczości.
      2. Ukryj mapę z etykietą FWT PHWT i cząsteczkę oznaczoną jako refined.pdb.
      3. Przesuwaj mapę za pomocą myszki, aby zwizualizować dodatnią gęstość (kolor zielony) i przesuń większą plamę na środek.
      4. Przejdź do File > Get monomer, wpisz QUS i naciśnij Enter.
      5. Przejdź do Calculate > Modeling > cząsteczki Rigid Body Fit i kliknij dwukrotnie monomer QUS, aby dostosować cząsteczkę do gęstości Fo-Fc.
      6. Użyj opcji scal cząsteczkę na karcie edycji, aby dodać cząsteczkę QUS do pliku współrzędnych refined.pdb.
      7. Powtórz kroki 2.1.4.3-2.1.4.6, aby dopasować ligand z kodem monomeru NAG i CHS odpowiednio w mniejszej plamie w domenie zewnątrzkomórkowej i na górze domeny transbłonowej.
      8. Zapisz współrzędną jako refined_ligands.pdb.
        UWAGA: Rozdzielczość domeny transbłonowej (TM) jest niższa, a zatem nie jest tutaj omawiana.
  2. Udoskonalenie struktury ligandowej mGlu5
    1. Otwórz CCPEM i sklonuj poprzednie zadanie uściślania (krok 2.1.3.2), a następnie uruchom je za pomocą pliku refined_ligands.pdb i zaostrzonej mapy (emd. 31536.mrc) jako dane wejściowe, przy użyciu parametrów domyślnych i symetrii C2.
      UWAGA: Jeśli program nie rozpoznaje liganda, należy dostarczyć pliki CIF. Te pliki CIF można pobrać z pliku PDB lub wygenerować za pomocą różnych programów (szczegółowe informacje można znaleźć w kroku 3.1.1).
  3. Wizualizacja i generowanie figur w PyMOL
    1. Otwórz model refined_expanded.pdb z najnowszego zadania uściślania Refmac w PyMOL.
    2. Przejdź do File > Open i przejdź do katalogu zadań Refmac, aby załadować plik diffmap_normalised_fofc.mrc (mapa różnic w stosunku do zadania Servalcat w kroku 2.1.3.2) file.
      UWAGA: Jeśli pliki z rozszerzeniem .mrc nie są widoczne podczas przeglądania, zmień typ pliku na >wszystkie pliki i przeglądaj.
    3. Wybierz ligandy za pomocą sekwencji wyświetlania >
      4. .
    4. Przejdź do przycisku Akcje i zmień nazwę zaznaczenia na ligandy.
    5. Wpisz następujące polecenie w wierszu poleceń i naciśnij Enter: isomesh mesh_ligands, diffmap_normalised_fofc, 6.0, ligands, carve=2.5.
      UWAGA: Szerokość siatki można regulować. W tym przypadku używana jest szerokość siatki 0,2, którą ustawia się za pomocą następującego polecenia: set mesh_width=0,2.
    6. Kliknij prawym przyciskiem myszy jeden z monomerów i przejdź do koloru łańcucha >, aby określić kolor każdego monomeru. Pokoloruj ligand i siatkę, używając ostatniego pola oznaczonego literą c w ligandzie i mesh_ligands obiektach. Dimer receptora mGlu5 jest pokazany w kreskówce, a monomery są zabarwione na turkusowy i pszenny. Ligandy są pokazane w sztyfcie, a siatka konturująca ligandy jest koloru zielonego.
    7. Użyj opcji > orientacji/środka/powiększenia względem obiektów i dostosuj ręcznie, aby wyraźnie i wizualizować siatkę. Wybierz pobliskie pozostałości, które mogą wchodzić w interakcje z ligandem, na przykład Tyr64, Trp100 dla QUS, i w razie potrzeby wyświetl ich łańcuch boczny lub główny łańcuch lub oba jako reprezentację drążka.
    8. Ray trace do generowania obrazów w wysokiej rozdzielczości i zapisywania ich jako pliku png.
      UWAGA: Powyższe kroki są powtarzane dla mapy powiązanej z antagonistą EMD-31537 i odpowiadającego jej pliku współrzędnych PDB-7fd9.

3. Modelowanie cząsteczek inhibitora, deoksygalaktoonojirimycyny (DGN) i rozpuszczalnika w wysokiej rozdzielczości, zaostrzonej mapie β-galaktozydazy

  1. Identyfikacja liganda, DGN, przy użyciu półmap z cryoEM
    1. Opracowanie nieznanego słownika ligandów do modelowania [Deoksygalakto-nojirimycyna(DGN)]
      UWAGA: Plik słownika Deoxygalacto-nojirimycin jest zawarty w bibliotece monomerów CCP4 jako DGJ (3-literowy identyfikator liganda). Niemniej jednak tutaj jest uważany za nowy i nieznany ligand w celu zilustrowania procesu generowania plików słownikowych dla nieznanych ligandów, DGN jest używany jako 3-literowy kod.
      1. Otwórz podsumowanie związku deoksygalakto-nojirimycyny (DGN) na stronie internetowej PubChem i skopiuj ciąg uśmiechów dla związku deoksygalakto-nojirimycyny.
      2. Otwórz ligandy Phenix > > eLBOW.
      3. Określ ciąg uśmiechów jako dane wejściowe.
      4. Określ odpowiednią metodę optymalizacji budowy ligandów. Tutaj stosowana jest prosta optymalizacja.
      5. Wklej ciąg chemicznych uśmiechów w sekcji definicji liganda.
      6. Podaj odpowiednio nazwę stanowiska, prefiks pliku wyjściowego i identyfikator liganda, a następnie naciśnij run.
        UWAGA: Dane wyjściowe zadania zawierają plik współrzędnych DGN.pdb oraz plik słownika DGN.cif. Jligand29 może być również użyty do utworzenia pliku cif.
    2. Pobierz plik współrzędnych β-galaktozydazy (6tsh.pdb) z PDB i usuń współrzędne łańcuchów białkowych (B, C, D), liganda, DGN i innych cząsteczek rozpuszczalnika za pomocą edytora tekstu lub opcji usuwania łańcucha/strefy w Coot. Zapisz plik współrzędnych jako apo-betaGal_chainA.pdb.
      UWAGA: ChimeraX lub Pymol mogą być również używane do usuwania cząsteczki liganda/rozpuszczalnika.
    3. Pobierz połówki map (emd_10563_half_map_1.map i emd_10563_half_map_2.map) z dodatkowych danych wpisu EMD-10563 z EMDB.
    4. Otwórz CCPEM i użyj Relion, aby utworzyć maskę dla mapy na progu 0,01 (zgodnie z opisem w krokach 2.1.3.1.1-2.1.3.1.4).
    5. Uruchom program Servalcat (w pakiecie CCPEM zgodnie z opisem w kroku 2) z połówkami map uzyskanymi w kroku 3.1.3 oraz modelem apo w kroku 3.1.2 i symetrią D2.
      UWAGA: Model musi być wyrównany do jednej z połówek map lub pełnych map w celu zlokalizowania gęstości liganda. Można to zrobić, dopasowując model do mapy za pomocą ChimeraX, a następnie zapisując współrzędne względem połowy mapy. W tym przykładzie połówki map i mapa podstawowa w EMDB mają różne rozmiary pól/siatki, a model musi być umieszczony w połowie mapy.
    6. Otwórz łyskę.
      1. Otwórz plik DGN.cif dla słownika ligandów wygenerowanego w kroku 3.1.1 za pomocą Phenix eLBOW. W tym celu należy przejść do File > Import CIF dictionary i przejrzeć katalog zadań eLBOW.
      2. Otwórz pliki współrzędnych białka i liganda, apo-betaGal_chainA.pdb z kroku 3.1.2 i DGN.pdb z kroku 3.1.6.
      3. Automatycznie otwórz plik diffmap.mtz z zadania Servalcat (krok 3.1.5) i zwizualizuj mapę z etykietą DELFWT PHDELWT w Coot. Obrysuj mapę na progu wartości bezwzględnej ~ 4.
        UWAGA: Ważne jest, aby sprawdzić statystyki mapy, wpisując nagłówek map.mrc lub korzystając z narzędzi w Chimera. Można uzyskać wszystkie niezbędne informacje na temat rozmiaru piksela, rozmiaru pola, minimalnej, średniej i maksymalnej gęstości oraz odchylenia wartości skutecznej od średniej gęstości. Bardzo ważne jest, aby sprawdzić rozmiar piksela i rozmiar pudełka map krioEM. Mapa 3D przedstawia objętość mapy białko-ligand w siatce wokseli 3D. W każdym wokselu przechowywana jest wartość potencjału elektronu lub prawdopodobieństwo znalezienia elektronu w tym miejscu. Po wybraniu określonego progu woksele, które mają gęstość mniejszą niż określona wartość, są ustawiane na zero. Pomaga to zminimalizować eksperymentalny szum na mapie i lepiej wizualizować cechy mapy43. W związku z tym mapa powinna być obrysowana na progu, przy którym elementy mapy są dobrze widoczne, a szum na mapie jest minimalny.
      4. Przejdź do Ligand > Znajdź Ligandy. W nowym oknie, które zostanie wyświetlone, wybierz ligand, mapę różnic i model apo-betaGal_chainA.pdb. Pozostaw inne opcje w ustawieniach domyślnych i kliknij Znajdź ligandy, aby rozpocząć wyszukiwanie.
      5. Wyświetlana jest lista najważniejszych trafień pokazujących potencjalną gęstość ligandów z kopią umieszczoną w każdej z gęstości. Ręcznie sprawdź wszystkie trafienia, w których został umieszczony ligand. Zachowaj najbardziej prawdopodobne trafienia i usuń te niejednoznaczne.
        UWAGA: Różnica w gęstości mapy przy wysokim progu wyraźnie sugeruje obecność liganda w miejscu aktywnym.
  2. Modelowanie cząsteczek liganda, DGN i rozpuszczalnika
    1. Wykonaj rzeczywiste uściślenie przestrzeni w Coot, aby dopasować ligand (DGN.pdb) do mapy gęstości różnicowej, a następnie scal współrzędne liganda z apo-betaGal_chainA.pdb i zapisz go jako betaGal_chainA+ligand.pdb.
      UWAGA: Ligandy, które zostały umieszczone w regionach innych łańcuchów, można usunąć i nie są one łączone podczas zapisywania scalonego pliku współrzędnych. Ligandy w innych łańcuchach mogą być generowane przez ligandy NCS, jak pokazano w przykładzie 1, kroku 1.2.8, lub w Refmac/Servalcat przy użyciu rozszerzenia symetrii.
    2. Uruchom kolejne zadanie Servalcat, jak powyżej (krok 3.1.5) z betaGal_chainA+ligand.pdb jako modelem wejściowym i połówkami map (z kroku 3.1.3) z symetrią D2.
    3. Gęstość różnicowa (z zadania Servalcat w kroku 3.2.2) otaczająca modelowany ligand sugeruje obecność cząsteczek rozpuszczalnika koordynujących się z cząsteczką liganda. Gęstość środkowa w pobliżu liganda wydaje się być zbyt duża dla cząsteczek wody.
    4. Opierając się na wcześniejszych danych biochemicznych i strukturalnych wskazujących na obecność Mg2+ w tej pozycji, jon Mg2+ jest tutaj modelowany poprzez kliknięcie opcji umieść atom i określenie atomu jako MG.
    5. Modeluj cząsteczki wody w gęstości różnicowej w miejscu aktywnym, które wskazują na obecność cząsteczki rozpuszczalnika, klikając atom miejsca na wskaźniku i wybierając water.
      UWAGA: Coot ma również opcję automatycznego wybierania cząsteczek wody. Tutaj, ponieważ nacisk kładziony jest tylko na miejsce aktywne, cząsteczki wody są dodawane ręcznie.
    6. Połącz współrzędne Mg2+ i wody z plikiem betaGal+ligand.pdb i zapisz go jako betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb.
    7. Za pomocą betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb wykonaj uściślanie Refmac w Servalcat z symetrią D2.
      UWAGA: Mapa różnic wyjściowych z tego zadania może służyć jako środek do sprawdzenia, czy ligand został dokładnie zamodelowany, ponieważ mapa różnic powinna pokazywać minimalną resztkową gęstość dodatnią lub ujemną.
  3. Wizualizacja i generowanie figur za pomocą PyMOL
    UWAGA: Kroki opisane poniżej zawierają kilka przykładów tworzenia rysunków przy użyciu modeli i map, które można wykorzystać do zilustrowania obecności ligandów i rozpuszczalników.
    1. Otwórz plik refined_expanded.pdb z ostatniego zadania Servalcat (krok 3.2.6) z modelowanym ligandem i rozpuszczalnikiem.
    2. Wybierz różne łańcuchy osobno, aby pokolorować je na purpurowy, żółty, zielony i turkusowy, zgodnie z opisem w przykładzie 2.
    3. Przejdź do opcji Wyświetl sekwencję >, dokonaj oddzielnych wyborów dla cząsteczek wody, magnezu i DGN, a następnie zmień nazwy obiektów odpowiednio na woda, MG i DGN.
    4. Wyświetlaj MG i cząsteczki wody jako kule, zaznaczając obiekty, klikając prawym przyciskiem myszy i pokazując > sferę. Podobnie, wyświetl ligand w sztyfcie i odpowiednio pokoloruj ligandy i rozpuszczalniki. W tym przypadku ligand został zabarwiony na żółto przez heteroatom, jon magnezu jest koloru fioletowego, a cząsteczki wody są pokolorowane na czerwono.
    5. Wybierz DGN, MG i cząsteczki wody. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz akcje > skopiuj do obiektu i nazwij go jako ligandy.
    6. Otwórz plik diffmap_normalised_fo.mrc z zadania Servalcat w kroku 3.2.6 i zmień jego nazwę na ligand_fo.mrc. Wpisz następujące polecenie: isomesh mesh_ligands_fo, ligand_fo, 3, ligands, carve=2.
      UWAGA: Wokół atomów stosowana jest opcja rzeźbienia 2 A, a w zależności od rozdzielczości i jakości map można użyć wartości 3-5. Ponadto podczas otwierania map cryoEM w PyMOL zaleca się wyłączenie normalize_ccp4_maps.
    7. Użyj opcji > orientacji/powiększenia i dostosuj ręcznie, aby zobrazować ligandy i pobliskie oddziałujące reszty (w stosownych przypadkach), jak pokazano w kroku 2.3.7.
    8. Śledź te sceny, aby zapisać obrazy w wysokiej rozdzielczości za pomocą polecenia ray 3600, 3600.
    9. Zapisz scenę jako .png file.
      UWAGA: Poniższe kroki są opcjonalne i opisują proces wizualizacji (1) gęstości różnicowej (Fo-Fc) dla niemodelowanego liganda, DGN, (2) gęstości (Fo) modelowanego liganda, DGN, a także gęstości różnicowej (Fo-Fc) dla niemodelowanych rozpuszczalników i wreszcie dla (3) gęstości (Fo) dla modelowanego liganda, DGN i cząsteczek rozpuszczalnika w miejscu aktywnym.
    10. Aby zademonstrować obecność liganda, DGN i otaczających cząsteczek rozpuszczalnika przy użyciu mapy różnic, otwórz plik diffmap_normalised_fofc.mrc z zadania Servalcat w kroku 3.1.5. Zmień nazwę pliku mapy na unliganded_fofc.mrc, klikając kolejno opcje Akcje > zmień nazwę obok obiektu mapy. Wpisz następujące informacje w wierszu polecenia: isomesh mesh_ligands_fofc, unliganded_fofc, ligands, level=6, carve=2.
    11. Aby zademonstrować gęstość modelowanego liganda, DGN i otaczającej go niemodelowanej gęstości rozpuszczalnika, otwórz diffmap_normalised_fo.mrc oraz diffmap_normalised_fofc.mrc z zadania servalcat w kroku 3.2.2. Zmień nazwę pliku diffmap_normalised_fo.mrc na DGN_fo, a diffmap_normalised_fofc.mrc na DGN_unmodelled_solvents_fofc.
    12. Wybierz MG i wodę z opcji Wyświetl sekwencję >, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz działania > kopiowania do obiektu, a następnie nazwij je rozpuszczalnikami.
    13. Wpisz następujące polecenie w wierszu polecenia: isomesh mesh_DGN_fo, DGN_fo, DGN, level=3, carve=2; isomesh mesh_solvent_fofc, DGN_unmodelled_solvents_fofc, solvents, level=6, carve=2.
      UWAGA: mesh_DGN_fo pokaże gęstość liganda, a mesh_solvent_fofc pokaże gęstość pominięcia dla MG i wody.
    14. Na koniec, aby zobrazować modelowane ligandy, a także otaczające cząsteczki rozpuszczalnika w miejscu aktywnym, otwórz plik diffmap_normalised_fo.mrc z zadania Servalcat w kroku 3.2.6 i zmień jego nazwę na ligand_fo.mrc.
    15. Wpisz następujące polecenie w wierszu poleceń: isomesh mesh_ligand_fo, ligand_fo, selection=ligands, level=3, carve=2.
      UWAGA: Tutaj użyliśmy diffmap_normalised_fo.mrc, ale ostateczna zaostrzona mapa może być użyta do pokazania gęstości ligandów i otaczających reszt. Dobrą praktyką jest wspomnienie w legendzie rysunku o typie używanej mapy, wartościach wyostrzenia współczynnika B.
    16. Szerokość siatki i rozmiar sfery można ustawić, wpisując następujące polecenia: ustaw mesh_width=0,2 i ustaw sphere_scale=0,25, aby zmniejszyć rozmiar sfery.
    17. Pokoloruj siatkę fo na niebiesko, a siatkę fofc na zielono.
    18. Użyj opcji akcji> orientacji/powiększenia i dostosuj ręcznie, aby zobrazować ligandy i pobliskie oddziałujące reszty (w stosownych przypadkach), jak pokazano w kroku 2.3.7.
    19. Śledź te sceny, aby zapisać obrazy w wysokiej rozdzielczości za pomocą polecenia ray 3600, 3600.
    20. Zapisz poszczególne sceny jako pliki .png.

4. Wpływ rozdzielczości na modelowanie ligandów w β-galaktozydazie

  1. Otwórz Terminal i przejdź do katalogu zawierającego dwie połówki map.
  2. Otwórz dwie połówki map (krok 3.1.3) w formacie .map w ChimeraX, zwizualizuj je i zapisz jako emd10563_half1_1_unfil.mrc i emd10563_half2_1_unfil.mrc.
  3. Maska utworzona w kroku 3.1.4 może być użyta jako dane wejściowe.
  4. Uruchom zadanie PostProcessing w Relion, używając półmap i masek z kroków 4.2-4.3, z parametrami domyślnymi.
  5. Powtórz krok 4.4, teraz z włączonym ważeniem Skip FSC i określając ad hoc filtr dolnoprzepustowy o wartości 3 A.
  6. Powtórz krok 4.4 z filtrem dolnoprzepustowym ad hoc 3,5 A.
  7. Otwórz mapy (postprocess.mrc) z kroków 4.4-4.6, przefiltruj w różnych rozdzielczościach i współrzędnych modelu, plik 6tsh.pdb (wyrównany do półmap w ChimeraX) z kroku 3.1.2 w PyMOL. Zmień nazwy różnych map na 3.0, 3.5 i 2.3 zgodnie z ich rozdzielczościami.
    UWAGA: Filtrowanie dolnoprzepustowe map można potwierdzić, wizualizując je w ChimeraX lub Coot.
  8. Wizualizację wpływu rozdzielczości na gęstość cząsteczek ligandów i rozpuszczalników, tworząc siatkę 2 A wokół cząsteczek liganda i rozpuszczalnika przy progu 6σ, jak opisano w kroku 3.3.6, z mapami przefiltrowanymi do różnych rozdzielczości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przykład 1
Enzym enolaza z M. tuberculosis katalizuje przedostatni etap glikolizy i przekształca 2-fosfoglicerynian w fosfoenolopirogronian (PEP), który jest niezbędnym produktem pośrednim dla kilku szlaków metabolicznych44,45. Dane CryoEM dla próbek apo-enolazy oraz enolazy związanej z PEP zebrano przy tym samym rozmiarze piksela wynoszącym 1,07 Å, a przetwarzanie obrazów wykonano w programie Relion 3.146

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ulepszenia w sprzęcie i oprogramowaniu mikroskopowym spowodowały w ostatnich latach wzrost liczby struktur krioelektromagnetycznych. Chociaż najwyższa rozdzielczość osiągana w tej chwili w krioEM pojedynczych cząstek wynosi 1,2 A 57,58,59, większość struktur jest określana w okolicach rozdzielczości 3-4 A. Modelowanie ligandów na mapach o średniej i niskiej rozdzielczości może być trudne i często obarczone niejednoznacznością. B...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

SJ jest laureatem stypendium doktoranckiego od DAE-TIFR, a finansowanie jest potwierdzone. KRV przyjmuje do wiadomości grant DBT B-Life DBT/PR12422/MED/31/287/2014 oraz wsparcie Departamentu Energii Atomowej Rządu Indii pod numerem identyfikacyjnym projektu. RTI4006.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CCP4-8.0Konsorcjum kilku instytutówhttps://www.ccp4.ac.ukbezpłatne dla użytkowników akademickich i zawiera Coot oraz listę narzędzi opracowanych dla krystalografii rentgenowskiej
CCP-EMKonsorcjum kilku instytutówhttps://www.ccpem.ac.uk/download.phpBezpłatne dla użytkowników akademickich i obejmuje Coot, Relion i wiele innych
Coot Paul Emsley, LMB, Cambridgehttps://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/Ogólne oprogramowanie do budowania modeli, ale dostępne również z innymi pakietami opisanymi powyżej
DockinMap (Phenix)Konsorcjum kilku instytutówhttps://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.htmlOprogramowanie w pakiecie Phenix do dokowania modelu do map krioEM
Bank danych mikroskopii elektronowej Konsorcjum kilku instytutówhttps://www.ebi.ac.uk/emdb/Publiczne Repozytorium Map Mikroskopii Elektronowej
FalconThermo Fisher Scientific https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdfReklama, kamera firmy Thermo Fisher 
Phenix Konsorcjum kilku instytutówhttps://phenix-online.org/downloadbezpłatne dla użytkowników akademickich i obejmuje
Bank Danych BiałkaKonsorcjum kilku instytutówhttps://rcsb.orgPubliczna baza danych struktur makromolekularnych
PymolSchrödingerhttps://pymol.org/2/Narzędzie do wizalizacji molekularnej. Wersja edukacyjna jest bezpłatna, ale ma ograniczenia. Pełną wersję można uzyskać za niewielką opłatą.
RelionMRC-LMB, Cambridgehttps://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.htmlOprogramowanie do przetwarzania obrazów krioEM, dostępne również z CCP-EM
Titan KriosThermo Fisher Scientific https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c&
_source=1& gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA
AkZesWC4FYQSwIQRk
ZApkj08MfYG040DtiiuL8
RihoCebEQAvD_BwE		Komercyjny, cryoTEM firmy Thermo Fisher
UCSF ChimeraUCSF, USAhttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.htmlOprogramowanie ogólnego przeznaczenia do wyświetlania, analizy i nie tylko
UCSF Chimera XUCSF, USAhttps://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/Oprogramowanie ogólnego przeznaczenia do wyświetlania, analizy i nie tylko
Łyski

Bibliografia

  1. Steinbrecher, T., Labahn, A. Towards accurate free energy calculations in ligand protein-binding studies. Curr Med Chem. 17, 767-785 (2010).
  2. Fu, Y., Zhao, J., Chen, Z. Insights into the molecular mechanisms of protein-ligand interactions by molecular docking and molecular dynamics simulation: a case of oligopeptide binding protein. Comput Math Methods Med. 4, 3502514(2018).
  3. Grinter, S. Z., Zou, X. Challenges, applications, and recent advances of protein-ligand docking in structure-based drug design. Molecules. 19 (7), 10150-10176 (2014).
  4. Henderson, R., Hasnain, S. Cryo-EM': electron cryomicroscopy, cryo electron microscopy or something else. IUCrJ. 10 (5), 519-520 (2023).
  5. Rosenthal, P. B. A potential difference for single-particle cryo-EM. IUCrJ. 6, 988-989 (2019).
  6. Wang, J., Moore, P. B. On the interpretation of electron microscopic maps of biological macromolecules. Prot Sci. 26 (1), 122-129 (2017).
  7. Murshudov, G. N. Refinement of atomic structures against cryo-EM Maps. Meth Enzymol. 579, 277-305 (2016).
  8. Kulik, M., Chodkiewicz, M. L., Dominiak, P. M. Theoretical 3D electron diffraction electrostatic potential maps of proteins modeled with a multipolar pseudoatom data bank. Acta Crystallogr D Struct Biol. 78 (8), 1010-1020 (2022).
  9. Yonekura, K., Kato, K., Ogasawara, M., Tomita, M., Toyoshima, C. Electron crystallography of ultrathin 3D protein crystals: Atomic model with charges. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (11), 3368-3373 (2015).
  10. Mu, X., Gillman, C., Nguyen, C., Gonen, T. An overview of microcrystal electron diffraction (MicroED). Annu Rev Biochem. 90, 431-450 (2021).
  11. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  12. EMDB (the Electron Microscopy Data Bank. , Available from: www.ebi.ac.uk/emdb/ (2023).
  13. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Res. 44, 396-403 (2016).
  14. RCSB.org. , Available from: http://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em (2024).
  15. Lees, J. A., Dias, J. M., Han, S. Applications of Cryo-EM in small molecule and biologics drug design. Biochem Soc Trans. 49 (6), 2627-2638 (2021).
  16. Robertson, M. J., Meyerowitz, J. G., Skiniotis, G. Drug discovery in the era of cryo-electron microscopy. Trends Biochem Sci. 47 (2), 124-135 (2022).
  17. Muenks, A., Zepeda, S., Zhou, G., Veesler, D., DiMaio, F. Automatic and accurate ligand structure determination guided by cryo-electron microscopy maps. Nat Commun. 14, 1164(2023).
  18. Oldfield, T. J. X-ligand: An application for the automated addition of flexible ligands into electron density. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 57 (5), 696-705 (2001).
  19. Zwart, P. H., Langer, G. G., Lamzin, V. S. Modelling bound ligands in protein crystal structures. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2230-2239 (2004).
  20. Terwilliger, T. C., Klei, H., Adams, P. D., Moriarty, N. W., Cohn, J. D. Automated ligand fitting by core-fragment fitting and extension into density. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (8), 915-922 (2006).
  21. Casañal, A., Lohkamp, B., Emsley, P. Current developments in Coot for macromolecular model building of Electron Cryo-microscopy and Crystallographic Data. Prot Sci. 29 (4), 1069-1078 (2020).
  22. Yamashita, K., Palmer, C. M., Burnley, T., Murshudov, G. N. Cryo-EM single-particle structure refinement and map calculation using Servalcat. Acta Crystallogr D Struct Biol. 77 (10), 1282-1291 (2021).
  23. Wood, C. Collaborative computational project for electron cryo-microscopy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 71 (1), 123-126 (2015).
  24. Burnley, T., Palmer, C. M., Winn, M. Recent developments in the CCP-EM software suite. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (6), 469-477 (2017).
  25. Potterton, E., McNicholas, S., Krissinel, E., Cowtan, K., Noble, M. The CCP4 molecular-graphics project. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58 (11), 1955-1957 (2002).
  26. Agirre, J. The CCP4 suite: Integrative software for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr D Struct Biol. 79 (6), 449-461 (2023).
  27. Moriarty, N. W., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Electronic ligand builder and optimization workbench (eLBOW): A tool for ligand coordinate and restraint generation. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65 (10), 1074-1080 (2009).
  28. Adams, P. D. A comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (2), 213-221 (2010).
  29. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: Model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60 (12), 2126-2132 (2004).
  30. Debreczeni, J. É, Emsley, P. Handling ligands with Coot. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 68 (4), 425-430 (2012).
  31. Long, F., et al. AceDRG: A stereochemical description generator for ligands. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (2), 112-122 (2017).
  32. Schrödinger. LigPrep. Schrödinger Release 2022-1: Schrödinger, LLC. , Schrödinger, LLC. New York, NY. (2022).
  33. Brown, A. Tools for macromolecular model building and refinement into electron cryo-microscopy reconstructions. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 71 (1), 136-153 (2015).
  34. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 53, 240-255 (1997).
  35. Kovalevskiy, O., Nicholls, R. A., Long, F., Carlon, A., Murshudov, G. N. Overview of refinement procedures within REFMAC 5: Utilizing data from different sources. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (3), 215-227 (2018).
  36. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67 (4), 235-242 (2011).
  37. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera - A visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  38. Pettersen, E. F., et al. UCSF ChimeraX: Structure visualization for researchers, educators, and developers. Prot Sci. 30 (1), 70-82 (2021).
  39. Lamb, A. L., Kappock, T. J., Silvaggi, N. R. You are lost without a map: Navigating the sea of protein structures. Biochim Biophys Acta Proteins Proteom. 1854 (4), 256-268 (2015).
  40. Ehinger, S., Schubert, W. D., Bergmann, S., Hammerschmidt, S., Heinz, D. W. Plasmin(ogen)-binding α-Enolase from streptococcus pneumoniae: Crystal structure and evaluation of plasmin(ogen)-binding sites. J Mol Biol. 343 (4), 997-1005 (2004).
  41. Tjia-Fleck, S., Readnour, B. M., Ayinuola, Y. A., Castellino, F. J. High-Resolution single-particle cryo-EM hydrated structure of streptococcus pyogenes enolase offers insights into its function as a plasminogen receptor. Biochemistry. 62 (3), 735-746 (2023).
  42. DeLano, W. L. The PyMOL molecular graphics system. Schrödinger LLC wwwpymolorg. Version 1. , Available from: http://www.pymol.org (2002).
  43. Pfab, J., Si, D. Automated threshold selection for cryo-EM density maps. ACM-BCB 2019. Proceedings of the 10th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology and Health Informatics. , 161-166 (2019).
  44. Rahi, A., et al. Enolase of Mycobacterium tuberculosis is a surface exposed plasminogen binding protein. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 1861 (1), 3355-3364 (2017).
  45. Henderson, B., Martin, A. Bacterial virulence in the moonlight: Multitasking bacterial moonlighting proteins are virulence determinants in infectious disease. Infect Immun. 79 (9), 3476-3491 (2011).
  46. Scheres, S. H. W. A bayesian view on cryo-EM structure determination. J Mol Biol. 415 (2), 406-418 (2012).
  47. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166(2018).
  48. Mohammed, A., et al. Structural snapshots of Mycobacterium tuberculosis enolase reveal dual mode of 2PG binding and its implication in enzyme catalysis. IUCrJ. 10 (6), 738-753 (2023).
  49. RCSB Protein Data Bank (RCSB PDB). , Available from: http://www.rcsb.org (2023).
  50. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res. 28 (1), 3-21 (2000).
  51. Nasrallah, C. Agonists and allosteric modulators promote signaling from different metabotropic glutamate receptor 5 conformations. Cell Rep. 36 (9), 109648(2021).
  52. Doak, B. C., Norton, R. S., Scanlon, M. J. The ways and means of fragment-based drug design. Pharmacol Ther. 167, 28-37 (2016).
  53. Baker, M. Fragment-based lead discovery grows up. Nat Rev Drug Discov. 12 (1), 5-7 (2013).
  54. Kirsch, P., Hartman, A. M., Hirsch, A. K. H., Empting, M. Concepts and core principles of fragment-based drug design. Molecules. 24 (3), 4309(2019).
  55. Bartesaghi, A., et al. 2.2 Å resolution cryo-EM structure of β-galactosidase in complex with a cell-permeant inhibitor. Science. 348 (6239), 1147-1151 (2015).
  56. Saur, M. Fragment-based drug discovery using cryo-EM. Drug Discov Today. 25 (3), 485-490 (2020).
  57. Maki-Yonekura, S., Kawakami, K., Takaba, K., Hamaguchi, T., Yonekura, K. Measurement of charges and chemical bonding in a cryo-EM structure. Commun Chem. 6 (1), 98(2023).
  58. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  59. Nakane, T. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  60. Pintilie, G. Measurement of atom resolvability in cryo-EM maps with Q-scores. Nat Methods. 17 (3), 328-334 (2020).
  61. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  62. Koehl, A. Structural insights into the activation of metabotropic glutamate receptors. Nature. 566 (7742), 79-84 (2019).
  63. Scheres, S. H. W. Classification of structural heterogeneity by maximum-likelihood methods. Meth Enzymol. 482, 295-320 (2010).
  64. Carugo, O. Atomic displacement parameters in structural biology. Amino Acids. 50 (7), 775-786 (2018).
  65. Wlodawer, A., Li, M., Dauter, Z. High-resolution Cryo-EM maps and models: A crystallographer's perspective. Structure. 25 (10), 1589-1597 (2017).
  66. Masmaliyeva, R. C., Babai, K. H., Murshudov, G. N. Local and global analysis of macromolecular atomic displacement parameters. Acta Crystallogr D Struct Biol. 76 (10), 926-937 (2020).
  67. Merritt, E. A. To B or not to B: A question of resolution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 68 (4), 468-477 (2012).
  68. Afonine, P. V., et al. Real-space refinement in PHENIX for cryo-EM and crystallography. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (60), 531-544 (2018).
  69. Roberts on, M. J., van Zundert, G. C. P., Borrelli, K., Skiniotis, G. GemSpot: A pipeline for robust modeling of ligands into Cryo-EM maps. Structure. 28 (6), 707-716 (2020).
  70. Weis, F., Hagen, W. J. H. Combining high throughput and high quality for cryo-electron microscopy data collection. Acta Crystallogr D Struct Biol. 76 (8), 724-728 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mapy CryoEMmodelowanie ligandówoddziaływania białko-ligandkompleksy makromolekularnemapa różnicowadoprecyzowanie w przestrzeni rzeczywistejreszty centrum aktywnegowiązanie fosfoenolopirogronianukoordynacja magnezu
Modelowanie ligandów na mapach pochodzących z kriomikroskopii elektronowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.