Modelowanie ligandów na mapach pochodzących z kriomikroskopii elektronowej

Summary

Ten protokół wprowadza dostępne narzędzia do modelowania ligandów małocząsteczkowych na mapach krioEM makromolekuł.

Abstract

Rozszyfrowanie interakcji białko-ligand w kompleksie makromolekularnym jest kluczowe dla zrozumienia mechanizmu molekularnego, leżących u podstaw procesów biologicznych i rozwoju leków. W ostatnich latach mikroskopia elektronowa próbek kriogenicznych (cryoEM) stała się potężną techniką określania struktur makrocząsteczek i badania sposobu wiązania ligandów w rozdzielczości bliskiej atomowi. Identyfikacja i modelowanie cząsteczek niebiałkowych na mapach krioEM jest często trudne ze względu na anizotropową rozdzielczość w cząsteczce będącej przedmiotem zainteresowania i nieodłączny szum w danych. W tym artykule czytelnicy zapoznają się z różnymi programami i metodami stosowanymi obecnie do identyfikacji ligandów, budowy modeli i doprecyzowywania współrzędnych atomowych przy użyciu wybranych makrocząsteczek. Jednym z najprostszych sposobów identyfikacji obecności liganda, jak pokazano na przykładzie enzymu enolazy, jest odjęcie dwóch map uzyskanych z ligandem i bez niego. Dodatkowa gęstość liganda prawdopodobnie będzie wyróżniać się na mapie różnic nawet przy wyższym progu. Zdarzają się przypadki, jak pokazano w przypadku metabotropowego receptora glutaminianu mGluglu₅, kiedy takie proste mapy różnic nie mogą być wygenerowane. Niedawno wprowadzona metoda wyprowadzania mapy pominięć Fo-Fc może służyć jako narzędzie do walidacji i wykazywania obecności liganda. Wreszcie, na przykładzie dobrze przebadanej β-galaktozydazy, przeanalizowano wpływ rozdzielczości na modelowanie ligandów i cząsteczek rozpuszczalnika na mapach krioEM oraz przedstawiono perspektywę wykorzystania krioEM w odkrywaniu leków.

Introduction

Komórki spełniają swoje funkcje, przeprowadzając niezliczone reakcje chemiczne jednocześnie i niezależnie, a każda z nich jest skrupulatnie regulowana, aby zapewnić im przetrwanie i zdolność adaptacji w odpowiedzi na sygnały środowiskowe. Osiąga się to poprzez rozpoznawanie molekularne, które umożliwia biomolekułom, zwłaszcza białkom, tworzenie przejściowych lub stabilnych kompleksów z innymi makrocząsteczkami, a także małymi cząsteczkami lub ligandami¹. Tak więc interakcje białko-ligand mają fundamentalne znaczenie dla wszystkich procesów w biologii, które obejmują regulację ekspresji i aktywności białek, rozpoznawanie substratów i kofaktorów przez enzymy, a także sposób, w jaki komórki postrzegają i przekazują sygnały^1,2. Lepsze zrozumienie właściwości kinetycznych, termodynamicznych i strukturalnych kompleksu białko-ligand ujawnia molekularne podstawy interakcji ligandów, a także ułatwia racjonalne projektowanie leków poprzez optymalizację interakcji i swoistości leków. Ekonomicznym i szybszym podejściem do badania interakcji białko-ligand jest zastosowanie dokowania molekularnego, które jest metodą obliczeniową, która wirtualnie przesiewa różnorodny zakres małych cząsteczek i przewiduje tryb wiązania i powinowactwo tych ligandów do białek docelowych³. Jednak dowody eksperymentalne ze struktur o wysokiej rozdzielczości wyznaczonych za pomocą dyfrakcji rentgenowskiej (XRD), magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) lub kriomikroskopii elektronowej (cryoEM) dostarczają niezbędnego dowodu na takie przewidywania i pomagają w opracowaniu nowszych i skuteczniejszych aktywatorów lub inhibitorów dla danego celu. W tym artykule użyto skrótu "cryoEM", jak powszechnie określa się tę technikę. Trwa jednak debata na temat wyboru właściwej nomenklatury, a ostatnio zaproponowano termin cryogenic-sample Electron Microscopy (cryoEM), aby wskazać, że próbka znajduje się w temperaturze kriogenicznej i jest obrazowana za pomocą elektronów⁴. Podobnie, mapy wyprowadzone z cryoEM zostały nazwane potencjałem elektronowym, potencjałem elektrostatycznym lub potencjałem Coulomba, a dla uproszczenia używamy tutaj map cryoEM ^5,6,7,8,9,10.

Chociaż XRD był złotym standardem w wysokorozdzielczym określaniu struktury kompleksów białko-ligand, post resolution-revolution¹¹ cryoEM nabrał rozpędu, na co wskazuje gwałtowny wzrost liczby map potencjału Coulomba lub map krioEM zdeponowanych w Bazie Danych Mikroskopii Elektronowej (EMDB)^12,13 w ciągu ostatnich kilku lat¹⁴. Dzięki postępom w metodach przygotowywania, obrazowania i przetwarzania próbek, liczba depozycji Protein Data Bank (PDB)¹⁴ z wykorzystaniem cryoEM wzrosła z 0,7% do 17% w latach 2010-2020, przy czym około 50% zgłoszonych struktur w 2020 r. określono w rozdzielczości 3,5 A lub lepszej^15,16. CryoEM został szybko przyjęty przez społeczność biologów strukturalnych, w tym przemysł farmaceutyczny, ponieważ umożliwia badanie elastycznych i niekrystalicznych makrocząsteczek biologicznych, zwłaszcza białek błonowych i kompleksów wielobiałkowych, w rozdzielczości bliskiej atomowi, pokonując proces krystalizacji i uzyskując dobrze dyfrakcyjne kryształy wymagane do określenia struktury w wysokiej rozdzielczości za pomocą XRD.

Dokładne modelowanie liganda na mapie krioEM jest najważniejsze, ponieważ służy jako plan kompleksu białko-ligand na poziomie molekularnym. W krystalografii rentgenowskiej stosuje się kilka zautomatyzowanych narzędzi do budowania ligandów, które zależą od kształtu i topologii gęstości liganda w celu dopasowania lub wbudowania liganda w gęstość elektronów^17,18,19,20. Niemniej jednak, jeśli rozdzielczość jest niższa niż 3 A, podejścia te mają tendencję do uzyskiwania mniej pożądanych wyników, ponieważ cechy topologiczne, od których zależą w celu rozpoznania i budowania, stają się mniej zdefiniowane. W wielu przypadkach metody te okazały się nieskuteczne w dokładnym modelowaniu ligandów na mapach krioEM, ponieważ mapy te zostały określone w zakresie od niskiej do średniej rozdzielczości, zwykle między 3,5 A -5 A¹⁷.

Pierwszy krok w określaniu struktury 3D kompleksu białko-ligand za pomocą cryoEM polega na albo współoczyszczaniu liganda z białkiem (gdy ligand ma wysokie powinowactwo do wiązania z białkiem), albo na inkubacji roztworu białka z ligandem przez określony czas przed przygotowaniem siatki. Następnie niewielką objętość próbki umieszcza się na oczyszczonej plazmowo dziurawej siatce TEM, a następnie błyskawicznie zamraża się w ciekłym etanie i ostatecznie obrazuje za pomocą krio-TEM. Obrazy projekcyjne 2D od setek tysięcy do milionów pojedynczych cząstek są uśredniane w celu zrekonstruowania trójwymiarowej (3D) mapy potencjału kulombowskiego makrocząsteczki. Identyfikacja i modelowanie ligandów i cząsteczek rozpuszczalników na tych mapach stanowi w wielu przypadkach poważne wyzwania ze względu na rozdzielczość anizotropową na całej mapie (tj. rozdzielczość nie jest jednolita w całej makrocząsteczce), elastyczność w regionie, w którym związany jest ligand, oraz szum w danych. Wiele narzędzi do modelowania, udoskonalania i wizualizacji, które zostały opracowane dla XRD, jest obecnie dostosowywanych do użytku w cryoEM do tych samych celów^{18, 19, 20, 21}. W tym artykule przedstawiono przegląd różnych metod i oprogramowania stosowanych obecnie do identyfikacji ligandów, budowania modeli i doprecyzowywania współrzędnych wyznaczonych przez cryoEM. Opracowano protokół krok po kroku, aby zilustrować procesy związane z modelowaniem ligandów przy użyciu określonych kompleksów białko-ligand o różnej rozdzielczości i złożoności.

Pierwszy krok w modelowaniu ligandów na mapach cryoEM obejmuje identyfikację gęstości ligandów (niebiałkowych) na mapie. Jeśli wiązanie liganda nie indukuje żadnych zmian konformacyjnych w białku, wówczas obliczenie prostej mapy różnic między kompleksem białko-ligand a białkiem apo zasadniczo podkreśla regiony o dodatkowej gęstości, co sugeruje obecność liganda. Takie różnice można zaobserwować od razu, ponieważ wymagają one tylko dwóch map, a nawet mapy pośrednie podczas procesu udoskonalania 3D mogą być wykorzystane do sprawdzenia, czy ligand jest obecny. Dodatkowo, jeśli rozdzielczość jest wystarczająco wysoka (<3,0 A), mapa różnic może również dostarczyć informacji na temat lokalizacji cząsteczek wody, a także jonów oddziałujących z ligandem i resztą białkowym.

W przypadku braku mapy apo-protein, teraz można korzystać z Servalcat²², który jest dostępny jako samodzielne narzędzie i został również zintegrowany z pakietem oprogramowania CCP-EM^23,24 jako część udoskonalenia Refmac i w wydaniu CCP4 8.0^25,26. Servalcat umożliwia obliczenie mapy różnic ważonych FSC (Fo-Fc) przy użyciu niezaostrzonych półmap i modelu apoprotein jako danych wejściowych. Mapa pominięcia Fo-Fc reprezentuje rozbieżność między mapą eksperymentalną (Fo) a mapą uzyskaną na podstawie modelu (Fc). W przypadku braku liganda w modelu, dodatnia gęstość na mapie Fo-Fc, która pokrywa się z eksperymentalną mapą EM, zazwyczaj sugeruje obecność liganda. Założenie jest takie, że łańcuch białkowy jest dobrze dopasowany do mapy, a pozostała gęstość dodatnia wskazuje na lokalizację liganda. Ważne jest jednak, aby skrupulatnie zbadać, czy dodatnia gęstość nie wynika z niedokładności modelowania, takich jak niewłaściwy rotamer łańcucha bocznego białka.

Drugi krok polega na uzyskaniu lub stworzeniu pliku współrzędnych kartezjańskich liganda z dobrze zdefiniowaną geometrią na podstawie dostępnych informacji chemicznych. Standardowe ligandy (na przykład ATP i NADP⁺), które są już dostępne w bibliotece monomerów CCP4, można wykorzystać do udoskonalenia poprzez pobranie plików współrzędnych i geometrii za pomocą ich kodu dostępu do monomeru. Jednak w przypadku nieznanych lub niestandardowych ligandów dostępne są różne narzędzia do tworzenia plików geometrii. Niektóre z przykładów obejmują eLBOW²⁷ - (electronic ligand builder and optimization workbench) w Phenix²⁸, Lidia - wbudowane narzędzie w Coot²⁹, JLigand/ACEDRG^30,31, CCP-EM^23,24, Ligprep³²-moduł Glide w ramach pakietu Schrödinger. Plik współrzędnych liganda jest następnie dopasowywany do gęstości, prowadzony zarówno przez eksperymentalną mapę krioEM, jak i mapę różnic w Coot. Po tym następuje udoskonalenie w przestrzeni rzeczywistej w Phenix²⁸ lub wzajemne udoskonalenie w Refmac³³. Wymagana jest stacja robocza z systemem Linux lub laptop wyposażony w dobrą kartę graficzną i wyżej wymienione oprogramowanie. Większość z tych programów jest zawarta w różnych pakietach. CCP-EM²⁴ i Phenix²⁸ są swobodnie dostępne dla użytkowników akademickich i zawierają różne narzędzia używane w tym artykule, w tym Coot, Refmac5^33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine, itp. Podobnie, Chimera³⁷ i ChimeraX³⁸ udostępniają bezpłatne licencje użytkownikom akademickim.

Protocol

1. Modelowanie fosfoenolopirogronianu (PEP) w enolazie z Mycobacterium tuberculosis

1. Identyfikacja gęstości ligandów na mapie krioEM kompleksu PEP-enolaza
   1. Pobierz nieostrzone półmapy (emd_30988_additional_1.map i emd_30988_additional_2.map) apo-enolazy z dodatkowych danych w EMDB (patrz Spis materiałów).
   2. Otwórz ChimeraX (patrz Tabela Materiałów). Otwórz półmapy apo-enolase, klikając Otwórz na pasku narzędzi i wybierając nazwy plików. Wpisz vop add #1 #2 w wierszu poleceń, aby połączyć obie połówki map w celu uzyskania niezaostrzonej mapy apo-enolase.
      UWAGA: #1 i #2 oznaczają dwie połówki mapy enzymu apo-enolazy, jak wspomniano w kroku 1.1.1.
   3. Zmień nazwę połączonej mapy (ID mapy ChimeraX: #3), wpisując rename #3 Apo-enolase-unsharpened-map. Pokoloruj mapę na szaro z panelu modelu. Mapa wskazuje, że enolaza jest oktameryczna w roztworze o symetrii D4.
   4. Powtórz kroki 1.1.1-1.1.3, używając następujących połówek map emd_30989_additional_1.map (ID mapy: 4) i emd_30989_additional_2.map (ID mapy:5), aby uzyskać PEP-enolase-unsharpened-map (ID mapy: #6).
   5. Aby obliczyć mapę różnic, najpierw dopasuj dwie mapy (PEP-enolaza i niezaostrzone mapy apo-enolazy z kroku 1.1.3 i kroku 1.1.4) względem siebie, klikając Dopasuj (mapa na mapie) w panelu Mapa (pasek narzędzi) w ChimeraX.
      UWAGA: Normalizacja nie jest wykonywana między dwiema mapami. W niektórych przypadkach może być wymagana normalizacja w celu doprowadzenia map do tej samej skali.
   6. Odejmij mapę enolazy PEP od mapy enolazy apo, wpisując vop odejmij #6 #3 w wierszu poleceń.
      UWAGA: #6 = mapa niewyostrzona pep-enolaza, #3 = mapa niezaostrzona apo-enolaza.
   7. Pokoloruj odjętą mapę (ID mapy:7) na zielono, oznaczając gęstość dodatnią (zgodnie z konwencją krystalografii rentgenowskiej)³⁹.
   8. Pobierz współrzędne enolazy oktamerycznej M. tuberculosis (PDB: 7e4x) z Banku Danych o Białkach (PDB), kliknij Otwórz na pasku narzędzi i wybierz nazwę pliku.
   9. Zmień nazwę modelu na 7e4x.pdb, wpisując rename #8 Apo_enolase.pdb w wierszu poleceń. #8 oznacza Apo_enolase.pdb w ChimeraX.
   10. Wybierz model z panelu modelu. Kliknij prawym przyciskiem myszy na pasku narzędzi. Kliknij Przesuń cząsteczkę, aby umieścić model w pobliżu mapy PEP-enolazy (#7) i wyrównać model względem mapy. Dopasuj ten model do mapy PEP-enolase-unsharpened-map, wpisując fit #8 w #6 w wierszu poleceń. Tutaj mapa ma numer 6, a model jest oznaczony numerem 8.
       UWAGA: W niektórych przypadkach lokalne dopasowanie w ChimeraX może nie wystarczyć do wyrównania modelu. W takich przypadkach w Phenix można wykonać dodatkowy krok globalnego dopasowania (DockinMap, patrz Tabela materiałów).
   11. Zapisz dopasowany model, wpisując save Apo-enolase.pdb #8 w wierszu polecenia.
2. Modelowanie i udoskonalanie PEP w zaostrzonej mapie krioEM kompleksu PEP-enolaza ze współczynnikiem B
   1. Otwórz "coot" (patrz Spis materiałów) z terminala, wpisując ./Coot &.
   2. Wyświetl "Apo-enolase.pdb", klikając Plik, > Otwórz współrzędne Apo-enolase.pdb. Plik współrzędnych jest wyświetlany za pomocą wiązań (kolor według atomu).
   3. Pobierz zaostrzoną mapę Enolase związaną z PEP, tj. emd_30989.map z EMDB. Wyświetl to samo, klikając Plik > Otwórz mapę > emd_30989.map . Ustaw próg na 7,00 σ, przewijając środkowy przycisk myszy.
   4. Znajdź niemodelowane obiekty blob, klikając pozycję Weryfikuj > Niemodelowane obiekty blob > Znajdź obiekty blob.
   5. Zlokalizuj niemodelowaną gęstość liganda w pobliżu reszt miejsca aktywnego, Ser 42, Lys-386 i Arg-364 modelu enolazy.
   6. Pobierz plik modelu monomeru PEP z biblioteki monomerów Coot, klikając File > Get Monomer i wprowadzając PEP jako 3-literowy kod.
   7. Przenieś cząsteczkę PEP do gęstości za pomocą opcji Obróć/Przesuń- Strefa/Łańcuch/Cząsteczka w menu paska bocznego. Użyj udoskonalenia w przestrzeni rzeczywistej w Coot, aby dopasować cząsteczkę PEP do gęstości, klikając Strefa uszlachetniania w przestrzeni rzeczywistej w menu paska bocznego. Połącz dopasowany ligand z Apo-enolase.pdb za pomocą opcji scal cząsteczkę na karcie edycji. Zapisz model jako PEP-Enolase.pdb.
      UWAGA: Można również użyć liganda> opcji Jiggle-Fit Ligand, aby również dopasować ligand.
   8. Aby dodać ligandy do pozostałych monomerów w pliku współrzędnych, kliknij Obliczaj > Narzędzia NCS > Ligandy NCS. Pojawi się osobne okno o nazwie Znajdź ligandy związane z NCS. Dla opcji Białko z NCS wybierz plik współrzędnych Apo-enolase.pdb i Identyfikator łańcucha A jako Łańcuch główny NCS.
      1. Dla cząsteczki zawierającej ligand wybierz Apo-enolase.pdb jako plik współrzędnych i identyfikator łańcucha, J i numer reszty od 1 do 1. Kliknij Znajdź stanowiska kandydatów. Pojawi się okno o nazwie Dopasowane ligandy z listą pozycji kandydujących. Oceń dopasowanie, klikając na poszczególne kandydujące ligandy i przeanalizuj dopasowanie wizualnie.
         UWAGA: W Servalcat/Refmac można podać tylko model monomeru, a symetrię użytą do rekonstrukcji można podać w celu uzyskania modelu rozszerzonego.
   9. Dodatkową gęstość cząsteczek rozpuszczalnika zaobserwowano również w pobliżu liganda. Struktury krystaliczne enolazy o wysokiej rozdzielczości z różnych homologów sugerują obecność dwóch jonów Mg^{2+ 40,41}, co prawdopodobnie stabilizuje ujemny ładunek produktu pośredniego reakcji. Zamodeluj dwa jony Mg²⁺ w gęstości miejsca aktywnego, klikając umieść atom na wskaźniku i wybierając MG z listy typów atomów wskaźnika.
      UWAGA: Geometria i odległość wiązania mogą służyć jako wskazówka przy wyborze jonu metalu. W przypadku Mg²⁺ związanych z atomami tlenu w resztach białkowych odległość wiązania waha się w granicach 2,1 A -2,4 A, przy geometrii oktaedrycznej. Jednak w przypadku map o niskiej rozdzielczości sfera koordynacyjna jest często niekompletna, a odległość może się również różnić ze względu na ograniczenia rozdzielczości.
   10. Powtórzyć krok 1.2.8 w celu dodania jonów^Mg2+ do monomerów związanych z symetrią.
   11. Zapisz model, klikając Plik > Zapisz współrzędne > Wybierz > Nazwa pliku i wpisując Enolase+PEP+Mg.pdb.
   12. Otwórz graficzny interfejs użytkownika Phenix (patrz tabela materiałów). Uruchom zadanie uściślania rzeczywistej przestrzeni z plikami Enolase+PEP+Mg.pdb i emd_30989.map jako modelem wejściowym i mapą, odpowiednio, przy użyciu parametrów domyślnych. Ten krok jest wykonywany iteracyjnie z Coot, aby uzyskać dobre dopasowanie mapy do modelu i geometrię.
       UWAGA: Niewyostrzona mapa różnic służy do wykazania obecności liganda, na przykład na rysunku. Do celów modelowania użyto mapy wyostrzonej współczynnika B, która jest zalecana. Mapa wyostrzona współczynnikiem B może być również używana do obliczania mapy różnic w celach demonstracyjnych, w przeciwieństwie do mapy niewyostrzonej. Jeśli jednak rozdzielczość jest niższa w obszarze, w którym ligand jest związany, wówczas pojedynczy współczynnik B używany do wyostrzania całej mapy może nie ujawniać wyraźnie gęstości liganda.
3. Wizualizacja i generowanie figur modelowanego liganda
   1. Otwórz udoskonalony model Enolase+PEP+Mg z końcowego zadania uściślania Phenix w PyMOL⁴² (patrz Spis materiałów), klikając File > Open i wybierając nazwę pliku.
   2. Załaduj emd-30989.map (zaostrzona mapa związana z PEP), klikając File > Open i wybierając nazwę pliku.
   3. Zmień nazwę mapy na wyostrzoną PEP, klikając akcje > zmień nazwę względem obiektu emd_30989 i wpisując PEP-sharpened.
      UWAGA: W większości przypadków, na przykład enolaza, mapy po otwarciu w pymol są znormalizowane, ponieważ opcja normalizowania mapy jest domyślnie zaznaczona w pymol. Ponieważ mapy krioEM są wyśrodkowane na większym pudełku, normalizacja obejmie wszystko, co się w nim znajduje. W ten sposób normalizację można wyłączyć przed otwarciem w pymol.
   4. Wybierz ligandy, klikając wyświetl > sekwencji.
   5. Wpisz isomesh mesh_ligands, PEP-sharpened, 6.0, sele, carve=3.0 w wierszu poleceń i naciśnij enter.
   6. Pokoloruj mesh_ligand na niebiesko, klikając ostatnie pole, C, obok mesh_ligand obiektu.
   7. Wyświetl pozostałości w miejscu aktywnym, Ser-42, Asp-241, Glu-283, Asp-310, Arg-364 i Lys-386 oddziałujące z PEP i Mg²⁺ odpowiednio w reprezentacji pałeczki i sfery oraz enzym enolazy w reprezentacji kreskówki.
   8. Śledź promienie, wpisując ray 3600, 3600, aby wygenerować obrazy o jakości publikacji i zapisać jako plik png, klikając File > save i wybierając PEP.png jako nazwę pliku.

2. Modelowanie ligandów w metabotropowym receptorze glutaminianu mGluglu₅

1. Identyfikacja i modelowanie gęstości ligandów w krioEM mGlu₅ związanego z agonistą i antagonistą
   1. Pobierz dwie półmapy wraz z odpowiadającymi im plikami współrzędnych dla każdego z kompleksów mGlu₅ związanych z agonistą (EMD-31536, 7fd8.pdb) i antagonistą (EMD-31537,7fd9.pdb).
   2. Otwórz ChimeraX
      1. Otwórz plik współrzędnych 7fd8.pdb, klikając przycisk Otwórz i wybierając opcję 7fd8.pdb.
      2. Wpisz delete ligand w wierszu poleceń i naciśnij Enter.
      3. Podobnie użyj polecenia delete/B, aby usunąć łańcuch B.
         UWAGA: Ligandy i łańcuchy można usunąć za pomocą menu rozwijanego u góry, korzystając z opcji wyboru i akcji > atomy/wiązania > usunięcia.
      4. Zapisz niezligandowany plik pdb, wpisując następujące polecenie w wierszu polecenia: save 7fd8_noligand_chainA.pdb #1. #1 oznacza identyfikator modelu.
      5. Powtórz kroki 2.1.2.1-2.1.2.4 dla pliku 7fd9.pdb.
   3. Otwórz CCP-EM. Utwórz nowy projekt o nazwie mGlu₅ i określ katalog projektu oraz nazwę użytkownika.
      1. Otwórz Relion z opcji na lewym panelu.
         1. Przejdź do zakładki Tworzenie maski.
         2. Podaj jedną z połówek map dla EMD-31536 jako dane wejściowe.
            UWAGA: Relion akceptuje mapy z sufiksem .mrc, a mapy EMD mają sufiks .map. Pliki map można otworzyć w ChimeraX do wglądu i zapisać w formacie .mrc.
         3. Na karcie maski podaj rozmiar piksela jako 0,89 A i początkowy próg binaryzacji jako 0,007.
         4. Uruchom zadanie z aliasem 31536 (lub dowolną inną nazwą, która jest łatwa do naśladowania).
         5. Podobnie utwórz maskę dla połówki mapy EMD - 31537.
      2. Otwórz program Refmac Servalcat z opcji w lewym panelu w CCPEM.
         1. Podaj nazwę jako mGlu₅_agonist.
         2. Zaimportuj plik 7fd8_noligand_chainA .pdb zgodnie z opisem w sekcji 2.1.2.4 modelu. Podaj lokalizację dwóch połówek map i odpowiadającej im maski utworzonej w Relion.
         3. Określ rozdzielczość jako 3,8 A.
         4. Przejdź do ustawień zagęszczenia > opcji Ścisła symetria i wspomnij C2 jako symetrię grupy punktów relion.
         5. Uruchom program, naciskając przycisk start u góry.
   4. Po zakończeniu zadania otwórz wynik w Coot (opcja dostępna u góry w sekcji wyników). Spowoduje to domyślne wyświetlenie pliku diffmap.mtz w Coot, gdzie kolory czerwony i zielony oznaczają odpowiednio gęstości ujemne i dodatnie.
      1. Przejdź do Menedżera wyświetlania> właściwości mapy różnic o nazwie DELFWT PHDELWT i zmień poziom konturu na 4.0 (wartość bezwzględna).
         UWAGA: Wybór progu zależy od mapy i rozdzielczości.
      2. Ukryj mapę z etykietą FWT PHWT i cząsteczkę oznaczoną jako refined.pdb.
      3. Przesuwaj mapę za pomocą myszki, aby zwizualizować dodatnią gęstość (kolor zielony) i przesuń większą plamę na środek.
      4. Przejdź do File > Get monomer, wpisz QUS i naciśnij Enter.
      5. Przejdź do Calculate > Modeling > cząsteczki Rigid Body Fit i kliknij dwukrotnie monomer QUS, aby dostosować cząsteczkę do gęstości Fo-Fc.
      6. Użyj opcji scal cząsteczkę na karcie edycji, aby dodać cząsteczkę QUS do pliku współrzędnych refined.pdb.
      7. Powtórz kroki 2.1.4.3-2.1.4.6, aby dopasować ligand z kodem monomeru NAG i CHS odpowiednio w mniejszej plamie w domenie zewnątrzkomórkowej i na górze domeny transbłonowej.
      8. Zapisz współrzędną jako refined_ligands.pdb.
         UWAGA: Rozdzielczość domeny transbłonowej (TM) jest niższa, a zatem nie jest tutaj omawiana.
2. Udoskonalenie struktury ligandowej mGlu₅
   1. Otwórz CCPEM i sklonuj poprzednie zadanie uściślania (krok 2.1.3.2), a następnie uruchom je za pomocą pliku refined_ligands.pdb i zaostrzonej mapy (emd. 31536.mrc) jako dane wejściowe, przy użyciu parametrów domyślnych i symetrii C2.
      UWAGA: Jeśli program nie rozpoznaje liganda, należy dostarczyć pliki CIF. Te pliki CIF można pobrać z pliku PDB lub wygenerować za pomocą różnych programów (szczegółowe informacje można znaleźć w kroku 3.1.1).
3. Wizualizacja i generowanie figur w PyMOL
   1. Otwórz model refined_expanded.pdb z najnowszego zadania uściślania Refmac w PyMOL.
   2. Przejdź do File > Open i przejdź do katalogu zadań Refmac, aby załadować plik diffmap_normalised_fofc.mrc (mapa różnic w stosunku do zadania Servalcat w kroku 2.1.3.2) file.
      UWAGA: Jeśli pliki z rozszerzeniem .mrc nie są widoczne podczas przeglądania, zmień typ pliku na >wszystkie pliki i przeglądaj.
   3. Wybierz ligandy za pomocą sekwencji wyświetlania >
   .
   4. Przejdź do przycisku Akcje i zmień nazwę zaznaczenia na ligandy.
   5. Wpisz następujące polecenie w wierszu poleceń i naciśnij Enter: isomesh mesh_ligands, diffmap_normalised_fofc, 6.0, ligands, carve=2.5.
      UWAGA: Szerokość siatki można regulować. W tym przypadku używana jest szerokość siatki 0,2, którą ustawia się za pomocą następującego polecenia: set mesh_width=0,2.
   6. Kliknij prawym przyciskiem myszy jeden z monomerów i przejdź do koloru łańcucha >, aby określić kolor każdego monomeru. Pokoloruj ligand i siatkę, używając ostatniego pola oznaczonego literą c w ligandzie i mesh_ligands obiektach. Dimer receptora mGlu₅ jest pokazany w kreskówce, a monomery są zabarwione na turkusowy i pszenny. Ligandy są pokazane w sztyfcie, a siatka konturująca ligandy jest koloru zielonego.
   7. Użyj opcji > orientacji/środka/powiększenia względem obiektów i dostosuj ręcznie, aby wyraźnie i wizualizować siatkę. Wybierz pobliskie pozostałości, które mogą wchodzić w interakcje z ligandem, na przykład Tyr64, Trp100 dla QUS, i w razie potrzeby wyświetl ich łańcuch boczny lub główny łańcuch lub oba jako reprezentację drążka.
   8. Ray trace do generowania obrazów w wysokiej rozdzielczości i zapisywania ich jako pliku png.
      UWAGA: Powyższe kroki są powtarzane dla mapy powiązanej z antagonistą EMD-31537 i odpowiadającego jej pliku współrzędnych PDB-7fd9.

3. Modelowanie cząsteczek inhibitora, deoksygalaktoonojirimycyny (DGN) i rozpuszczalnika w wysokiej rozdzielczości, zaostrzonej mapie β-galaktozydazy

1. Identyfikacja liganda, DGN, przy użyciu półmap z cryoEM
   1. Opracowanie nieznanego słownika ligandów do modelowania [Deoksygalakto-nojirimycyna(DGN)]
      UWAGA: Plik słownika Deoxygalacto-nojirimycin jest zawarty w bibliotece monomerów CCP4 jako DGJ (3-literowy identyfikator liganda). Niemniej jednak tutaj jest uważany za nowy i nieznany ligand w celu zilustrowania procesu generowania plików słownikowych dla nieznanych ligandów, DGN jest używany jako 3-literowy kod.
      1. Otwórz podsumowanie związku deoksygalakto-nojirimycyny (DGN) na stronie internetowej PubChem i skopiuj ciąg uśmiechów dla związku deoksygalakto-nojirimycyny.
      2. Otwórz ligandy Phenix > > eLBOW.
      3. Określ ciąg uśmiechów jako dane wejściowe.
      4. Określ odpowiednią metodę optymalizacji budowy ligandów. Tutaj stosowana jest prosta optymalizacja.
      5. Wklej ciąg chemicznych uśmiechów w sekcji definicji liganda.
      6. Podaj odpowiednio nazwę stanowiska, prefiks pliku wyjściowego i identyfikator liganda, a następnie naciśnij run.
         UWAGA: Dane wyjściowe zadania zawierają plik współrzędnych DGN.pdb oraz plik słownika DGN.cif. Jligand²⁹ może być również użyty do utworzenia pliku cif.
   2. Pobierz plik współrzędnych β-galaktozydazy (6tsh.pdb) z PDB i usuń współrzędne łańcuchów białkowych (B, C, D), liganda, DGN i innych cząsteczek rozpuszczalnika za pomocą edytora tekstu lub opcji usuwania łańcucha/strefy w Coot. Zapisz plik współrzędnych jako apo-betaGal_chainA.pdb.
      UWAGA: ChimeraX lub Pymol mogą być również używane do usuwania cząsteczki liganda/rozpuszczalnika.
   3. Pobierz połówki map (emd_10563_half_map_1.map i emd_10563_half_map_2.map) z dodatkowych danych wpisu EMD-10563 z EMDB.
   4. Otwórz CCPEM i użyj Relion, aby utworzyć maskę dla mapy na progu 0,01 (zgodnie z opisem w krokach 2.1.3.1.1-2.1.3.1.4).
   5. Uruchom program Servalcat (w pakiecie CCPEM zgodnie z opisem w kroku 2) z połówkami map uzyskanymi w kroku 3.1.3 oraz modelem apo w kroku 3.1.2 i symetrią D2.
      UWAGA: Model musi być wyrównany do jednej z połówek map lub pełnych map w celu zlokalizowania gęstości liganda. Można to zrobić, dopasowując model do mapy za pomocą ChimeraX, a następnie zapisując współrzędne względem połowy mapy. W tym przykładzie połówki map i mapa podstawowa w EMDB mają różne rozmiary pól/siatki, a model musi być umieszczony w połowie mapy.
   6. Otwórz łyskę.
      1. Otwórz plik DGN.cif dla słownika ligandów wygenerowanego w kroku 3.1.1 za pomocą Phenix eLBOW. W tym celu należy przejść do File > Import CIF dictionary i przejrzeć katalog zadań eLBOW.
      2. Otwórz pliki współrzędnych białka i liganda, apo-betaGal_chainA.pdb z kroku 3.1.2 i DGN.pdb z kroku 3.1.6.
      3. Automatycznie otwórz plik diffmap.mtz z zadania Servalcat (krok 3.1.5) i zwizualizuj mapę z etykietą DELFWT PHDELWT w Coot. Obrysuj mapę na progu wartości bezwzględnej ~ 4.
         UWAGA: Ważne jest, aby sprawdzić statystyki mapy, wpisując nagłówek map.mrc lub korzystając z narzędzi w Chimera. Można uzyskać wszystkie niezbędne informacje na temat rozmiaru piksela, rozmiaru pola, minimalnej, średniej i maksymalnej gęstości oraz odchylenia wartości skutecznej od średniej gęstości. Bardzo ważne jest, aby sprawdzić rozmiar piksela i rozmiar pudełka map krioEM. Mapa 3D przedstawia objętość mapy białko-ligand w siatce wokseli 3D. W każdym wokselu przechowywana jest wartość potencjału elektronu lub prawdopodobieństwo znalezienia elektronu w tym miejscu. Po wybraniu określonego progu woksele, które mają gęstość mniejszą niż określona wartość, są ustawiane na zero. Pomaga to zminimalizować eksperymentalny szum na mapie i lepiej wizualizować cechy mapy⁴³. W związku z tym mapa powinna być obrysowana na progu, przy którym elementy mapy są dobrze widoczne, a szum na mapie jest minimalny.
      4. Przejdź do Ligand > Znajdź Ligandy. W nowym oknie, które zostanie wyświetlone, wybierz ligand, mapę różnic i model apo-betaGal_chainA.pdb. Pozostaw inne opcje w ustawieniach domyślnych i kliknij Znajdź ligandy, aby rozpocząć wyszukiwanie.
      5. Wyświetlana jest lista najważniejszych trafień pokazujących potencjalną gęstość ligandów z kopią umieszczoną w każdej z gęstości. Ręcznie sprawdź wszystkie trafienia, w których został umieszczony ligand. Zachowaj najbardziej prawdopodobne trafienia i usuń te niejednoznaczne.
         UWAGA: Różnica w gęstości mapy przy wysokim progu wyraźnie sugeruje obecność liganda w miejscu aktywnym.
2. Modelowanie cząsteczek liganda, DGN i rozpuszczalnika
   1. Wykonaj rzeczywiste uściślenie przestrzeni w Coot, aby dopasować ligand (DGN.pdb) do mapy gęstości różnicowej, a następnie scal współrzędne liganda z apo-betaGal_chainA.pdb i zapisz go jako betaGal_chainA+ligand.pdb.
      UWAGA: Ligandy, które zostały umieszczone w regionach innych łańcuchów, można usunąć i nie są one łączone podczas zapisywania scalonego pliku współrzędnych. Ligandy w innych łańcuchach mogą być generowane przez ligandy NCS, jak pokazano w przykładzie 1, kroku 1.2.8, lub w Refmac/Servalcat przy użyciu rozszerzenia symetrii.
   2. Uruchom kolejne zadanie Servalcat, jak powyżej (krok 3.1.5) z betaGal_chainA+ligand.pdb jako modelem wejściowym i połówkami map (z kroku 3.1.3) z symetrią D2.
   3. Gęstość różnicowa (z zadania Servalcat w kroku 3.2.2) otaczająca modelowany ligand sugeruje obecność cząsteczek rozpuszczalnika koordynujących się z cząsteczką liganda. Gęstość środkowa w pobliżu liganda wydaje się być zbyt duża dla cząsteczek wody.
   4. Opierając się na wcześniejszych danych biochemicznych i strukturalnych wskazujących na obecność Mg²⁺ w tej pozycji, jon Mg²⁺ jest tutaj modelowany poprzez kliknięcie opcji umieść atom i określenie atomu jako MG.
   5. Modeluj cząsteczki wody w gęstości różnicowej w miejscu aktywnym, które wskazują na obecność cząsteczki rozpuszczalnika, klikając atom miejsca na wskaźniku i wybierając water.
      UWAGA: Coot ma również opcję automatycznego wybierania cząsteczek wody. Tutaj, ponieważ nacisk kładziony jest tylko na miejsce aktywne, cząsteczki wody są dodawane ręcznie.
   6. Połącz współrzędne Mg²⁺ i wody z plikiem betaGal+ligand.pdb i zapisz go jako betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb.
   7. Za pomocą betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb wykonaj uściślanie Refmac w Servalcat z symetrią D2.
      UWAGA: Mapa różnic wyjściowych z tego zadania może służyć jako środek do sprawdzenia, czy ligand został dokładnie zamodelowany, ponieważ mapa różnic powinna pokazywać minimalną resztkową gęstość dodatnią lub ujemną.
3. Wizualizacja i generowanie figur za pomocą PyMOL
   UWAGA: Kroki opisane poniżej zawierają kilka przykładów tworzenia rysunków przy użyciu modeli i map, które można wykorzystać do zilustrowania obecności ligandów i rozpuszczalników.
   1. Otwórz plik refined_expanded.pdb z ostatniego zadania Servalcat (krok 3.2.6) z modelowanym ligandem i rozpuszczalnikiem.
   2. Wybierz różne łańcuchy osobno, aby pokolorować je na purpurowy, żółty, zielony i turkusowy, zgodnie z opisem w przykładzie 2.
   3. Przejdź do opcji Wyświetl sekwencję >, dokonaj oddzielnych wyborów dla cząsteczek wody, magnezu i DGN, a następnie zmień nazwy obiektów odpowiednio na woda, MG i DGN.
   4. Wyświetlaj MG i cząsteczki wody jako kule, zaznaczając obiekty, klikając prawym przyciskiem myszy i pokazując > sferę. Podobnie, wyświetl ligand w sztyfcie i odpowiednio pokoloruj ligandy i rozpuszczalniki. W tym przypadku ligand został zabarwiony na żółto przez heteroatom, jon magnezu jest koloru fioletowego, a cząsteczki wody są pokolorowane na czerwono.
   5. Wybierz DGN, MG i cząsteczki wody. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz akcje > skopiuj do obiektu i nazwij go jako ligandy.
   6. Otwórz plik diffmap_normalised_fo.mrc z zadania Servalcat w kroku 3.2.6 i zmień jego nazwę na ligand_fo.mrc. Wpisz następujące polecenie: isomesh mesh_ligands_fo, ligand_fo, 3, ligands, carve=2.
      UWAGA: Wokół atomów stosowana jest opcja rzeźbienia 2 A, a w zależności od rozdzielczości i jakości map można użyć wartości 3-5. Ponadto podczas otwierania map cryoEM w PyMOL zaleca się wyłączenie normalize_ccp4_maps.
   7. Użyj opcji > orientacji/powiększenia i dostosuj ręcznie, aby zobrazować ligandy i pobliskie oddziałujące reszty (w stosownych przypadkach), jak pokazano w kroku 2.3.7.
   8. Śledź te sceny, aby zapisać obrazy w wysokiej rozdzielczości za pomocą polecenia ray 3600, 3600.
   9. Zapisz scenę jako .png file.
      UWAGA: Poniższe kroki są opcjonalne i opisują proces wizualizacji (1) gęstości różnicowej (Fo-Fc) dla niemodelowanego liganda, DGN, (2) gęstości (Fo) modelowanego liganda, DGN, a także gęstości różnicowej (Fo-Fc) dla niemodelowanych rozpuszczalników i wreszcie dla (3) gęstości (Fo) dla modelowanego liganda, DGN i cząsteczek rozpuszczalnika w miejscu aktywnym.
   10. Aby zademonstrować obecność liganda, DGN i otaczających cząsteczek rozpuszczalnika przy użyciu mapy różnic, otwórz plik diffmap_normalised_fofc.mrc z zadania Servalcat w kroku 3.1.5. Zmień nazwę pliku mapy na unliganded_fofc.mrc, klikając kolejno opcje Akcje > zmień nazwę obok obiektu mapy. Wpisz następujące informacje w wierszu polecenia: isomesh mesh_ligands_fofc, unliganded_fofc, ligands, level=6, carve=2.
   11. Aby zademonstrować gęstość modelowanego liganda, DGN i otaczającej go niemodelowanej gęstości rozpuszczalnika, otwórz diffmap_normalised_fo.mrc oraz diffmap_normalised_fofc.mrc z zadania servalcat w kroku 3.2.2. Zmień nazwę pliku diffmap_normalised_fo.mrc na DGN_fo, a diffmap_normalised_fofc.mrc na DGN_unmodelled_solvents_fofc.
   12. Wybierz MG i wodę z opcji Wyświetl sekwencję >, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz działania > kopiowania do obiektu, a następnie nazwij je rozpuszczalnikami.
   13. Wpisz następujące polecenie w wierszu polecenia: isomesh mesh_DGN_fo, DGN_fo, DGN, level=3, carve=2; isomesh mesh_solvent_fofc, DGN_unmodelled_solvents_fofc, solvents, level=6, carve=2.
       UWAGA: mesh_DGN_fo pokaże gęstość liganda, a mesh_solvent_fofc pokaże gęstość pominięcia dla MG i wody.
   14. Na koniec, aby zobrazować modelowane ligandy, a także otaczające cząsteczki rozpuszczalnika w miejscu aktywnym, otwórz plik diffmap_normalised_fo.mrc z zadania Servalcat w kroku 3.2.6 i zmień jego nazwę na ligand_fo.mrc.
   15. Wpisz następujące polecenie w wierszu poleceń: isomesh mesh_ligand_fo, ligand_fo, selection=ligands, level=3, carve=2.
       UWAGA: Tutaj użyliśmy diffmap_normalised_fo.mrc, ale ostateczna zaostrzona mapa może być użyta do pokazania gęstości ligandów i otaczających reszt. Dobrą praktyką jest wspomnienie w legendzie rysunku o typie używanej mapy, wartościach wyostrzenia współczynnika B.
   16. Szerokość siatki i rozmiar sfery można ustawić, wpisując następujące polecenia: ustaw mesh_width=0,2 i ustaw sphere_scale=0,25, aby zmniejszyć rozmiar sfery.
   17. Pokoloruj siatkę fo na niebiesko, a siatkę fofc na zielono.
   18. Użyj opcji akcji> orientacji/powiększenia i dostosuj ręcznie, aby zobrazować ligandy i pobliskie oddziałujące reszty (w stosownych przypadkach), jak pokazano w kroku 2.3.7.
   19. Śledź te sceny, aby zapisać obrazy w wysokiej rozdzielczości za pomocą polecenia ray 3600, 3600.
   20. Zapisz poszczególne sceny jako pliki .png.

4. Wpływ rozdzielczości na modelowanie ligandów w β-galaktozydazie

1. Otwórz Terminal i przejdź do katalogu zawierającego dwie połówki map.
2. Otwórz dwie połówki map (krok 3.1.3) w formacie .map w ChimeraX, zwizualizuj je i zapisz jako emd10563_half1_1_unfil.mrc i emd10563_half2_1_unfil.mrc.
3. Maska utworzona w kroku 3.1.4 może być użyta jako dane wejściowe.
4. Uruchom zadanie PostProcessing w Relion, używając półmap i masek z kroków 4.2-4.3, z parametrami domyślnymi.
5. Powtórz krok 4.4, teraz z włączonym ważeniem Skip FSC i określając ad hoc filtr dolnoprzepustowy o wartości 3 A.
6. Powtórz krok 4.4 z filtrem dolnoprzepustowym ad hoc 3,5 A.
7. Otwórz mapy (postprocess.mrc) z kroków 4.4-4.6, przefiltruj w różnych rozdzielczościach i współrzędnych modelu, plik 6tsh.pdb (wyrównany do półmap w ChimeraX) z kroku 3.1.2 w PyMOL. Zmień nazwy różnych map na 3.0, 3.5 i 2.3 zgodnie z ich rozdzielczościami.
   UWAGA: Filtrowanie dolnoprzepustowe map można potwierdzić, wizualizując je w ChimeraX lub Coot.
8. Wizualizację wpływu rozdzielczości na gęstość cząsteczek ligandów i rozpuszczalników, tworząc siatkę 2 A wokół cząsteczek liganda i rozpuszczalnika przy progu 6σ, jak opisano w kroku 3.3.6, z mapami przefiltrowanymi do różnych rozdzielczości.

Results

Przykład 1
Enzym enolaza z M. tuberculosis katalizuje przedostatni etap glikolizy i przekształca 2-fosfoglicerynian w fosfoenolopirogronian (PEP), który jest niezbędnym produktem pośrednim dla kilku szlaków metabolicznych^44,45. Dane CryoEM dla próbek enolazy apo-enolazy i enolazy związanej z PEP zebrano przy tym samym rozmiarze piksela 1,07 A, a przetwarzanie obrazu przeprowadzono za pomocą Relion 3.1^46,47. Struktury apo-enolazy i PEP-enolazy określono odpowiednio na poziomie 3,1 A i 3,2 A⁴⁸. Mapy i modele zostały zdeponowane w EMDB i PDB^49,50 (EMD-30988, EMD-30989, PDB-7e4x i PDB-7e51). Mapa krioEM enzymu pokazuje, że jest to oktamer w roztworze (Rysunek 1A). W celu zidentyfikowania gęstości ligandów na mapie PEP-enolazy wybrano niezaostrzone mapy apoenzymu i enzymu związanego z PEP, a następnie obliczono mapę różnic w ChimeraX, odejmując mapę PEP-enolazy od mapy apoenzymu. Zaobserwowano wyraźną gęstość (zieloną) na wysokim progu, co sugerowało obecność liganda (Rysunek 1B). Modelowanie łańcucha białkowego na niezaostrzonej mapie wyraźnie wykazało, że dodatkowa gęstość jest obecna w miejscu aktywnym białka (Rysunek 1C). Ligand, PEP, został następnie zamodelowany na wyostrzonej mapie czynnika B przy użyciu Coot, a model białko+ligand został udoskonalony w przestrzeni rzeczywistej za pomocą Phenix. Dwa jony Mg²⁺ modelowano w gęstości obserwowanej w pobliżu liganda (Rysunek 1D). Ligand, PEP, przyjmuje podobną orientację, jak obserwowano w innych homologach enolazy, a kilka reszt w miejscu aktywnym, takich jak Lys-386, Arg-364, tworzy interakcje wiązań wodorowych z ligandem PEP. Jony Mg²⁺ tworzą metalowe wiązania koordynacyjne z Asp-241, Glu-283, Asp-310 i fosforanem PEP (Rysunek 1D).

Przykład 2
W przypadku braku dostępnej struktury białka apo lub jeśli białko ulega dużej zmianie konformacyjnej, obliczenie map różnic w sposób opisany powyżej nie jest możliwe. W 2021 r. grupa Gariba Murshunova z Laboratorium Biologii Molekularnej w Cambridge wprowadziła Servalcat²², który implementuje przepływ pracy uściślania za pomocą Refmac, a także oblicza mapę różnic Fo-Fc po udoskonaleniu. Dodatnia gęstość różnicowa Fo-Fc sugeruje obecność cząsteczek/ligandów, które nie zostały uwzględnione w modelu podczas udoskonalania, co zasadniczo jest mapą pominięć. Zaleca się jednak, aby najpierw ocenić ogólne dopasowanie modelu do mapy, a następnie ocenić mapę gęstości różnicowej.

Aby zilustrować użycie Servalcat/Refmac, wybrano mGlu₅, dimerycznego receptora sprzężonego z białkiem G, który wiąże się z neuroprzekaźnikiem, L-Glutaminianem. Po związaniu agonisty, L-quiskwalanu, domena zewnątrzkomórkowa zmienia orientację, co wyzwala rotację 7TM, zbliżając je do stabilizacji stanu aktywowanego. W związku z tym obserwuje się dużą zmianę konformacyjną między apo/antagonistą a antagonistą. stany związane z agonistą⁵¹ (Rysunek 2A i Rysunek 2E). Dwie półmapy zarówno dla kompleksów związanych z agonistą (EMD-31536), jak i antagonistą (EMD-31537) uzyskano z EMDB, a mapy krioEM wykazują zróżnicowaną rozdzielczość w cząsteczce i lepiej rozdzieloną domenę zewnątrzkomórkową. Następnie zostały one wykorzystane jako dane wejściowe w Servalcat wraz z białkiem apo jako modelem do obliczenia różnicy lub mapy Fo-Fc dla każdego zestawu danych. Mapa ta wyraźnie pokazała obecność różnych cząsteczek ligandów (niebiałkowych). Rozdzielczość oszacowana za pomocą FSC (korelacja powłoki Fouriera) dla kompleksów związanych z agonistą i antagonistą wynosiła odpowiednio 3,8 A i 4,0 A. W przypadku mGlu₅ związanego z agonistą, mapa różnic Servalcat Fo-Fc wykazała obecność zarówno agonisty (L-quisqualate) (Figura 2B), jak i N-acetyloglukozaminy (NAG) (Figura 2C) w ECD receptora (ze względu na niższą rozdzielczość TMD, tutaj skupiamy się tylko na ECD i górnej części TMD). Reszty białkowe, w tym Tyr-64, Trp-100, Ser-151 i Thr-175, oddziałują z agonistą. Gęstość w pobliżu reszty Asn-210 sugerowała obecność N-acetyloglukozaminy (Rysunek 2C). Gęstość zgodną z hemibursztynianem cholesterolu, który został dodany podczas oczyszczania mGlu_5, zaobserwowano w pobliżu szczytu transbłonowej helisy 1 (Rysunek 2D). Ponieważ rozdzielczość jest umiarkowana, a ligand, L-quiskwalan, może być umieszczony w różnych orientacjach, wcześniejsza struktura domeny zewnątrzkomórkowej z ligandem (PDB-6N50) została wykorzystana jako przewodnik do modelowania liganda. Wiązanie antagonisty stabilizuje stan otwarty lub spoczynkowy receptora (Rysunek 2E). Gęstość zgodną z antagonistą LY341495 zaobserwowano na zawiasach płata I i płata II domeny muchonki w ECD. Antagonista oddziałuje z resztami podobnymi do reszt agonisty. Interakcja układania się między Tyr-223 w płacie II a antagonistą stabilizuje receptor w stanie otwartym (Rysunek 2F). Podobnie jak w przypadku struktury agonistycznej, glikozylację lub obecność ugrupowania N-acetyloglukozaminy zaobserwowano w pobliżu Asn-210 (Rysunek 2G).

Przykład 3
Trzeci przykład wyjaśnia protokół modelowania ligandów i cząsteczek rozpuszczalników o rozmiarach fragmentów lub małych rozmiarach na mapach CryoEM o wysokiej rozdzielczości. Odkrywanie leków w oparciu o fragmenty (FBDD) stało się potężną i innowacyjną metodą opracowywania nowatorskich terapii opartych na celach w różnych obszarach chorobowych, co czyni ją obiecującą ścieżką w badaniach i rozwoju w branży farmaceutycznej^52,53. FBDD rozpoczyna się od badań przesiewowych i starannej selekcji małych, dobrze rozpuszczalnych fragmentów cząsteczek o niskiej masie cząsteczkowej, które wiążą się z określonymi białkami docelowymi lub biomolekułami będącymi przedmiotem zainteresowania. Określenie struktur tych kompleksów białko-fragment ujawnia sposób wiązania tych fragmentów, który służy jako przewodnik do projektowania większych i bardziej złożonych cząsteczek podobnych do leków o rosnącym powinowactwie i swoistości do docelowego białka⁵⁴. Jednak ta metoda wymaga gęstości ligandów o wysokiej rozdzielczości, aby dokładnie określić pozycję i poprawnie umieścić grupy funkcyjne ligand¹⁵.

β-galaktozydaza, jedna z pierwszych struktur o wysokiej rozdzielczości, które zostały określone dzięki postępom w technologii cryoEM, jest dobrze zbadanym enzymem homotetramerycznym o mocy 450 kDa, który katalizuje hydrolizę laktozy do glukozy i galaktozy⁵⁵. Aby zaprezentować zastosowanie cryoEM w FBDD, Astex w Wielkiej Brytanii określił strukturę β-galaktozydazy z inhibitorem wielkości fragmentu, deoksygalaktoonojirimycyną (DGN) związaną w miejscu aktywnym (EMDB-10563, PDB:6tsh)⁵⁶. Ten zestaw danych służy do zilustrowania protokołu do jednoznacznego modelowania ligandów i rozpuszczalników na mapach o wysokiej rozdzielczości. Aby pokazać wpływ rozdzielczości na modelowanie i wizualizację ligandów, mapy przefiltrowano do 3,0 A i 3,5 A na etapie przetwarzania końcowego w Relion. Podkreśla to jakość gęstości mapy przy różnych rozdzielczościach i podkreśla potrzebę wyższej rozdzielczości do modelowania ligandów i rozpuszczalników.

Enzym jest tetramerem o symetrii D2 w roztworze (Rysunek 3A). Mapa różnic (między mapą a modelem), obliczona przez Servalcat, sugerowała obecność DGN i kilku cząsteczek rozpuszczalnika w miejscu aktywnym enzymu (Rysunek 3B). Przy szacowanej rozdzielczości 2,3 A gęstość wykazywała cechy o wysokiej rozdzielczości, co pomogło w dokładnym modelowaniu inhibitora w miejscu aktywnym białka. Zaobserwowano interakcje między DGN a Tyr-503 i His-540 (Rysunek 3C). Gęstość różnicowa sugerowała również obecność cząsteczek rozpuszczalnika, które oddziałują z DGN, a także reszt białkowych. Mg²⁺ i kilka cząsteczek wody modelowano w gęstości (Rysunek 3D). Obserwuje się wiązania koordynacyjne metali między Mg²⁺ a Glu-416, Glu-461 i kilkoma cząsteczkami wody (Rysunek 3D). Zaobserwowano, że Mg²⁺ oddziałuje z DGN za pośrednictwem cząsteczki wody.

Przy niższej rozdzielczości 3,5 A i 3,0 A, gęstość liganda przypomina plamę i brakuje jej cech o wysokiej rozdzielczości kluczowych dla dokładnego modelowania liganda (Rysunek 4A,B). Gęstość cząsteczek wody prawie nie istniała przy tych rozdzielczościach. Podsumowując, wraz ze wzrostem rozdzielczości, zwłaszcza wyższej niż 3,0 A, gęstość umożliwiła modelowanie większej liczby cząsteczek wody (Rysunek 4C,D). Prawidłowe umiejscowienie chiralnego centrum liganda stało się osiągalne przy ~2,3 A (Rysunek 4C,D) ze względu na obecność wyraźnych cech na mapie, które kierowały rozmieszczeniem, a także modelowaniem cząsteczek wody i Mg²⁺. Dla porównania, gęstość dla Mg²⁺ pozostała zauważalna w całym zakresie rozdzielczości (Rysunek 4A-C).

Rysunek 1: Modelowanie ligandu fosfoenolopirogronianu w enolazie M. tuberculosis. (A) pokazuje wyostrzoną mapę enzymu enolazy związanego z PEP przez współczynnik B. Mapa sugeruje, że enolaza jest oktameryczna w roztworze, a każdy monomer na mapie jest inaczej zabarwiony. (B) wyświetla nienaostrzoną mapę krioEM enzymu apo-enolazy w kolorze szarym z mapą różnic (między mapami związanymi z PEP i niezaostrzonymi mapami apo-enolazy) nałożoną na kolor zielony, co sugeruje obecność liganda, PEP. Jest to mapa demonstracyjna pokazująca obecność ligandów. (C) wyświetla dopasowanie modelu enolazy do niezaostrzonej mapy krioEM, podkreślając położenie gęstości różnicowej w stosunku do białka. Model białka jest pokazany w reprezentacji kreskówki i pokolorowany w Chainbow. Ten rysunek pokazuje, że dodatkowa gęstość (zielona) jest obecna w miejscu aktywnym każdego monomeru. (D) pokazuje ligand, PEP, zamknięty w zaostrzonej mapie współczynnika B, w kolorze niebieskim. Dodatkowo zaobserwowano również gęstość dla dwóch jonów Mg²⁺, które tworzą wiązania koordynacyjne metalu z kilkoma resztami w miejscu aktywnym, w tym Ser-42, Asp 241, Glu-283, Asp-310 i atomami liganda. Ligand tworzy oddziaływania wiązań wodorowych z Lys-386, Lys-335 i Arg-364. Reszty białkowe są pokazane w postaci pałeczek, a jony Mg²⁺ są pokazane jako fioletowe kulki. Figury w panelach (A-D) zostały wygenerowane za pomocą Pymol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Identyfikacja, modelowanie i wizualizacja różnych ligandów w receptorze mGlu₅. Mapy pominięcia Fo-Fc uzyskano przy użyciu Servalcat. (A) pokazuje strukturę dimerów receptora mGlu₅ (PDB-7fd8) w reprezentacji kreskówki, przy czym każdy monomer jest zabarwiony odpowiednio na turkusowy i pszeniczny i związany z agonistą L-quisqualate. Wszystkie ligandy, które zostały zidentyfikowane w przestrzeni zewnątrzkomórkowej i na górze domeny transbłonowej receptora, są otoczone mapą pominięcia Fo-Fc, pokolorowaną na zielono i wyprofilowaną na 6σ. (B) podkreśla dopasowanie agonisty, L-quisqualate zamkniętego w mapie różnic. L-quiskwalan oddziałuje z kilkoma resztami mGlu₅, w tym Tyr-64, Trp-100, Ser-151, Thr-175 i Gly-280. Oddziaływania wiązania H są reprezentowane przez czerwone kreski. W (C) dodatkowa gęstość jest widoczna w pobliżu Asn-210, który jest obecny w domenie zewnątrzkomórkowej receptora, a cząsteczka N-acetyloglukozaminy (NAG) była modelowana w tej gęstości. Dla jasności, NAG nie jest powiązany z Asn na bieżącym rysunku. (D) pokazuje różnicę w gęstości hemibursztynianu cholesterolu (CHS) na zielono w pobliżu powierzchni receptora wystawionej na działanie lipidów. Cząsteczka CHS, reprezentowana w pałeczkach, była modelowana w tej gęstości. (E) pokazuje strukturę receptora mGlu₅ (PDB-7fd9) związanego z LY341495 antagonistycznym w reprezentacji kreskówkowej. W (F) dodatkowa gęstość na mapie różnic Fo-Fc znajdująca się na zawiasie między płatem I a płatem II domeny zewnątrzkomórkowej wskazuje na obecność antagonisty. Kluczowe reszty (Tyr-64, Trp-100, Ser-152, Ser-173, Thr-175 i Tyr-223) wokół antagonisty są pokazane w reprezentacjach drążków, a potencjalne interakcje wiązań wodorowych z antagonistą są pokazane czerwonymi kreskami. (G) pokazuje różnicę w gęstości sugerującą obecność cząsteczki NAG w pobliżu Asn-210 w strukturze związanej z antagonistą (zauważ, że NAG nie jest powiązany z Asn dla jasności). Dane zostały wygenerowane za pomocą Pymol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Identyfikacja, modelowanie i udoskonalanie małych cząsteczek inhibitora i rozpuszczalnika na mapie β-galaktozydazy o wysokiej rozdzielczości (EMD-10563). (A) pokazuje model β-galaktozydazy o rozdzielczości 2,3 A (PDB: 6tsh) w reprezentacji kreskówkowej, gdzie każdy monomer jest wyraźnie zabarwiony. Szare pole podświetla miejsce wiązania liganda. (B) wyświetla gęstość różnicową Fo-Fc (z Servalcat) w zielonej siatce w miejscu aktywnym enzymu. Różnica w gęstości sugeruje obecność inhibitora (DGN) i kilku cząsteczek rozpuszczalnika w miejscu aktywnym. (C) wykazuje, że na podstawie mapy Fo-Fc inhibitor deoksygalakto-nojirimycyna (DGN) jest modelowany w miejscu aktywnym. Ten modelowany ligand jest przedstawiony w formacie pałeczki i zamknięty w gęstości Fo (przez Servalcat), która jest pokolorowana na blue_mesh. Obserwuje się interakcje wiązań wodorowych między DGN a kilkoma resztami białkowymi, w tym Tyr-503 i His-540. Dodatkowa gęstość różnicowa Fo-Fc wokół liganda (zielona) wskazuje na cząsteczki rozpuszczalnika. (D) Mapa pokazuje, że kilka cząsteczek rozpuszczalnika, w tym woda i Mg²⁺, reprezentowanych odpowiednio jako czerwone i fioletowe kule, jest modelowanych w miejscu aktywnym po upewnieniu się, że każda cząsteczka rozpuszczalnika jest związana z białkiem (Glu-416, His-418 i Glu-461) lub resztą liganda. Cząsteczki wody i Mg²⁺ są zamknięte w gęstości Fo (niebieska siatka). Obserwuje się, że Mg²⁺ oddziałuje z ligandem, DGN za pośrednictwem cząsteczki wody. Mapa Fo-Fc (zielona siatka) w panelach (B,C) jest wyprofilowana na poziomie 6σ, natomiast gęstość Fo - niebieska siatka w C i D (z udoskonalenia Servalcat po modelowaniu) jest wyprofilowana na poziomie 3σ. Figury w panelach (A-D) zostały wygenerowane za pomocą Pymol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Wpływ rozdzielczości na modelowanie ligandów w β-galaktozydazie. Mapy połówkowe z EMD-10563 zostały użyte jako dane wejściowe w kroku post-process Relion, a połączone mapy post-process zostały przefiltrowane do rozdzielczości 2,3 A, 3,0 A i 3,5 A z różnymi współczynnikami B. Mapa pokazana na wszystkich panelach jest wyprofilowana na 6σ. Dla jasności, pokazano tylko szkielet białkowy bez łańcuchów bocznych, ligandów lub cząsteczek rozpuszczalnika w panelach A, B i C. (A) Mapa jest filtrowana do 3,5 A i pokazane jest miejsce aktywne β-galaktozydazy. W tej rozdzielczości widoczna jest plama przypominająca ligand, DGN, której towarzyszy kilka mniejszych plam w pobliżu. Modelowanie liganda we właściwej orientacji okazuje się trudne ze względu na brak wyraźnych obiektów na mapie. (B) Pokazana jest mapa przefiltrowana do rozdzielczości 3,0 A. W tym przypadku plama liganda staje się nieco bardziej zdefiniowana, ale nadal brakuje jej ogólnych funkcji. Zaobserwowano również kilka innych małych plamek sugerujących cząsteczki rozpuszczalnika. (C) Mapa przefiltrowana do rozdzielczości 2,3 A ujawnia gęstość liganda z wyraźnymi cechami, w szczególności ujawniając konformację krzesła iminocukru. W tej rozdzielczości obserwuje się znaczną liczbę małych kropel odpowiadających cząsteczkom wody. Automatyczne oszacowanie/wyostrzenie współczynnika B w procesie końcowym Relion daje wartość -18 Ų dla map filtrowanych do 3 A i 3,5 A, podczas gdy wartość ta wynosi -52 A² dla mapy przefiltrowanej do 2,3 A. Różne współczynniki B wyostrzania map EM mogą być również wykonywane za pomocą Coot i przydatne w budowaniu modeli. (D) Panel ilustruje, że ligand DGN (reprezentacja pałeczki), Mg²⁺ i cząsteczki wody (jako kule) modelowane w miejscu aktywnym i zaostrzonej mapie pod kątem 2,3 A, pokazanej w niebieskiej siatce otaczającej te atomy. Figury w panelach (A-D) zostały wygenerowane za pomocą Pymol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Ulepszenia w sprzęcie i oprogramowaniu mikroskopowym spowodowały w ostatnich latach wzrost liczby struktur krioelektromagnetycznych. Chociaż najwyższa rozdzielczość osiągana w tej chwili w krioEM pojedynczych cząstek wynosi 1,2 A 57,58,59, większość struktur jest określana w okolicach rozdzielczości 3-4 A. Modelowanie ligandów na mapach o średniej i niskiej rozdzielczości może być trudne i często obarczone niejednoznacznością. Biorąc pod uwagę powszechne zastosowanie cryoEM zarówno w środowisku akademickim, jak i w przemyśle farmaceutycznym do badań translacyjnych i odkrywania leków, niezbędne jest zapewnienie prawidłowego i niejednoznacznego modelowania ligandów. W związku z tym rozsądne jest ilościowe określenie rozdzielczości atomów ligandów poprzez obliczenie wyników Q⁶⁰, które są obecnie dostępne w EMDB jako metryka do oceny jakości map i dopasowania modelu, a także w Chimera.

W pierwszym przykładzie ChimeraX został użyty do obliczenia mapy różnic w przestrzeni rzeczywistej między mapami apo i związanymi z ligandem w enzymie enolazy M. tuberculosis. Dodatkowa gęstość przy wysokim progu sugeruje obecność ligandu, fosfoenolopirogronianu, w miejscu aktywnym i Mg²⁺ związanego z ligandem. Należy zauważyć, że w tym przypadku mapa ma średnią rozdzielczość (3,2 A), a cząsteczki wody nie mogą być modelowane z pewnością (rysunek 1). Ograniczeniem związanym z tą metodą jest to, że można ją stosować tylko wtedy, gdy wiązanie liganda nie wywołuje znaczących zmian konformacyjnych w białku. Normalizacja mapy nie została wykonana w tym przypadku, ponieważ zarówno zestawy danych apo, jak i ligandów zostały pozyskane w tym samym rozmiarze piksela i przetworzone z identycznymi parametrami w Relion. Warto jednak zauważyć, że przy porównywaniu map wygenerowanych przez różne programy do rekonstrukcji, takich jak Relion ^46,47 i CryoSparc⁶¹, lub o różnej jakości, normalizacja map staje się niezbędna, zanim będzie można dokonać miarodajnych porównań.

Następnym przykładem jest mGlu₅, który ulega dużej reorganizacji molekularnej po związaniu agonistycznym, jak wynika ze struktur krioEM^51,62 (Figura 2). W tym scenariuszu nie jest możliwe obliczenie prostej mapy różnic między receptorami niezwiązanymi (apo) i związanymi z ligandem ze względu na znaczne różnice między mapami. W tym przypadku wykorzystano Servalcat, który wykorzystuje niewyostrzone i nieważone półmapy jako dane wejściowe do uściślania w przestrzeni odwrotnej, a następnie oblicza mapę różnicy między mapą eksperymentalną a mapą uzyskaną z modelu. Przy wysokim progu można zwizualizować różnice i pełnić rolę przewodnika do korekty i ulepszenia modelu. Zaobserwowano kilka niemodelowanych pęcherzyków w domenie zewnątrzkomórkowej i w pobliżu domeny transbłonowej mGlu₅ i wykorzystano je jako przewodnik do modelowania ligandów (ryc. 2).

Trzeci przykład pokazuje, w jaki sposób rozdzielczość (2,3 A) odgrywa kluczową rolę w interpretacji map i modelowaniu inhibitora wielkości fragmentu w β-galaktozydazie. W tym przypadku wyzwanie polegało na zidentyfikowaniu bardzo małego liganda (<200 Da) na mapie różnic Servalcat wśród nieodłącznego szumu w danych i dokładnym jego modelowaniu. Oprócz wysokiej rozdzielczości globalnej wyznaczonej za pomocą korelacji powłoki Fouriera (FSC), rozdzielczość lokalna specyficzna dla liganda była również wystarczająco wysoka, aby zapewnić dokładne rozmieszczenie centrów chiralnych ligandów (ryc. 3). Gęstość cząsteczek rozpuszczalnika zaobserwowano na mapie różnic w całym enzymie, a zwłaszcza wokół liganda. Wykazano również wpływ rozdzielczości na modelowanie ligandów i atomów rozpuszczalnika (ryc. 4). Ważne jest, aby zachować ostrożność podczas modelowania cząsteczek wody lub rozpuszczalnika, ponieważ czasami hałas na niskim progu może przypominać cząsteczki wody lub rozpuszczalnika, co prowadzi do potencjalnych błędnych interpretacji.

Inną ważną kwestią jest to, że same mapy krioEM mogą nie wystarczyć do dokładnej identyfikacji jonu metalu na własną rękę. Dodatkowe metody biofizyczne, takie jak rozszerzona absorpcja promieniowania rentgenowskiego o drobnej strukturze (EXAFS) lub spektroskopia rentgenowska z dyspersją energii (EDX), są często konieczne do potwierdzenia obecności i tożsamości jonu metalu. Zarówno w enzymach enolazy, jak i β-galaktozydazy, Mg²⁺ modelowano ze względu na bogactwo już dostępnych informacji na temat tych białek, potwierdzających tożsamość jonu metalu. Również koordynacja jonów metali w tych przypadkach, której przykładem jest klasyczna geometria oktaedryczna i bliskie ideału odległości koordynacyjne Mg²⁺, dostarczyła istotnego dowodu na ich tożsamość.

Ogólnie rzecz biorąc, podczas modelowania ligandów na mapach krioEM należy wziąć pod uwagę kilka ważnych kwestii. Na początek ważny jest wybór odpowiedniej mapy do identyfikacji i modelowania ligandów. We wszystkich przypadkach niewyostrzona i nieważona mapa lub półmapa jest zalecana zamiast mapy zaostrzonej i ważonej, aby uwidocznić gęstość liganda, ponieważ wyostrzanie i ważenie może spowodować niedoostrzenie lub nadmierne zaostrzenie (szum spowodowany zakończeniem serii) obszarów na mapie. Może to skutkować nieoptymalną gęstością liganda, a zastosowanie różnych współczynników B może być wykorzystane do oceny gęstości podczas budowania modelu w Coot. Chociaż istnieje ryzyko związane z używaniem zaostrzonej mapy do identyfikacji ligandów na mapie krioEM, niewyostrzona mapa może nie pokazywać pełnych szczegółów gęstości ligandów, ale może być wykorzystana do celów demonstracyjnych, jak pokazano na rysunku 1B, C.

Pozycja modelowanego liganda powinna zostać zweryfikowana, zwłaszcza w przypadkach, gdy dane są słabe. Jak pokazano tutaj dla mGlu₅, lokalna rozdzielczość różni się na mapie cryoEM, a bezstronne modelowanie liganda może być trudne. Servalcat może być używany jako cenne narzędzie do wykrywania potencjalnych niedokładności w modelowaniu białek i ligandów²².

Niejednorodność składu może występować w kompleksie białko-ligand, w którym ligand może być obecny tylko w określonej populacji (jeśli ligand ma niską masę cząsteczkową, etap klasyfikacji może nie usunąć niejednorodności). Niemniej jednak ważne jest, aby podczas przetwarzania obrazu przed modelowaniem liganda wykonać krok^{63 klasyfikacji 3D} iteracyjnie i sprawdzić, czy gęstość liganda ulega poprawie. Jeśli obecnych jest wiele kopii białka, należy zachować ostrożność przy stosowaniu symetrii w poprzek mapy podczas początkowego generowania i udoskonalania modelu, ponieważ może to uśrednić gęstość ligandów we wszystkich cząsteczkach związanych z symetrią. Symetria powinna być narzucona dopiero po dokładnym sprawdzeniu mapy w celu potwierdzenia obecności gęstości ligandów we wszystkich łańcuchach białkowych.

W zależności od stanu (kryształ lub roztwór) i lokalizacji (zakopane lub powierzchnia), atomy mogą być dynamiczne, a w udoskonaleniu modelu nazywa się to parametrem przemieszczenia atomowego (ADP). Wraz z mapą różnic, która dostarcza wizualnych wskazówek dotyczących możliwych niedokładności w modelu, wartości ADP mogą być wykorzystane do oceny dokładności ligandów po udoskonaleniu 64,65,66,67. Zazwyczaj ligand powinien mieć podobne wartości ADP jak otaczające go pozostałości, tj. jeśli są stabilnie związane i dokładnie modelowane. Jednak ligandy na obrzeżach lub atomy liganda (takie jak lipidy), które są dalekie od makrocząsteczek, mogą mieć wyższe wartości ADP. Oprócz doprecyzowania współrzędnych, zarówno Refmac^33,34, jak i Phenix pozwalają na doprecyzowanie wartości ADP^{28, 68}. W Refmac aproksymacja Motta-Bethe'a służy do obliczania współczynnika rozpraszania elektronów poszczególnych atomów podczas obliczania mapy. W najnowszej wersji Phenixu wprowadzono indywidualne udoskonalanie czynnika B, podobne do krystalografii, w celu wyjaśnienia nieporządku atomowego. Bardzo często w udoskonalonych modelach wyprowadzonych z cryoEM, obserwuje się szeroki zakres wartości ADP (czasami wartości bliskie zeru), a nawet Q-score, który jest używany w EMDB do oceny dopasowania modelu do mapy, zależy od zdeponowanej mapy pierwotnej i charakteru wyostrzenia współczynnika B⁶⁰. W budowaniu modeli krioEM często stosuje się wiele map, a co za tym idzie, mapy używane w modelowaniu i udoskonalaniu powinny być wyraźnie wymienione w metodach, ponieważ ze względu na rozdzielczość anizotropową w wielu makrocząsteczkach, jedna mapa może nie wystarczyć do wyjaśnienia wszystkich szczegółów.

W modelowaniu ligandów w makrocząsteczkach jednym z głównych ograniczeń map krioEM (podobnie jak w krystalografii) jest to, że jeśli miejsce wiązania liganda ma niską rozdzielczość lub jeśli związany ligand jest dynamiczny, ustalenie prawidłowej konformacji może okazać się trudne. Ponadto większość struktur krioEM ma rozdzielczość poniżej 3 A, a reprezentacja cząsteczek wody na mapach jest ograniczona, co utrudnia ocenę roli hydratacji w wiązaniu ligandów lub leków (jak pokazano tutaj na przykładach enolazy i mGluR). Metody obliczeniowe mogą być stosowane w połączeniu z danymi krioelektromagnetycznymi w celu wyeliminowania tych ograniczeń⁶⁹. W przeciwieństwie do krystalografii, tylko model jest poddawany udoskonalaniu, a nie mapa. Obecnie jedyną metodą wskazania obecności liganda lub zapewnienia dokładnego modelowania jest generowanie map pominięć (przy użyciu narzędzi takich jak Servalcat). W związku z tym istnieje szereg narzędzi, które mogą pomóc naukowcom w budowaniu i ocenie modelu, ale istnieje kilka obszarów w zakresie udoskonalania modelu, w których w najbliższej przyszłości można spodziewać się nowszych podejść lub modyfikacji obecnych podejść.

W tym artykule skupiliśmy się na aktualnych podejściach do modelowania ligandów, które obejmują ręczną kontrolę gęstości liganda, generowanie pliku geometrii liganda, a następnie modelowanie liganda na mapie cryoEM. Jest to ekscytujący okres w biologii strukturalnej i odkrywaniu leków, ponieważ bezpośrednie detektory elektronów z większą liczbą klatek na sekundę i wykorzystaniem szybszego pozyskiwania danych⁷⁰ zaowocowały uzyskaniem map o wysokiej rozdzielczości (<2,8 A) kilku makrocząsteczek często związanych ligandami drobnocząsteczkowymi w stosunkowo krótkim czasie. Niedawne wprowadzenie zautomatyzowanych narzędzi do modelowania ligandów, takich jak GEMspot⁶⁹ w pakiecie Schrödinger i EMERALD¹⁷ w pakiecie Rosetta, które próbują znaleźć najbardziej prawdopodobną pozycję związaną liganda przy jednoczesnym uwzględnieniu eksperymentalnych danych krioEM, daje nadzieję na usprawnienie i automatyzację tego procesu. Podobnie jak w przypadku krystalografii rentgenowskiej, przewiduje się, że identyfikacja sposobów wiązania ligandów małocząsteczkowych za pomocą cryoEM, być może dwóch lub więcej w ciągu jednego dnia, stanie się realną możliwością.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCP4-8.0	Konsorcjum kilku instytutów	https://www.ccp4.ac.uk	bezpłatne dla użytkowników akademickich i zawiera Coot oraz listę narzędzi opracowanych dla krystalografii rentgenowskiej
CCP-EM	Konsorcjum kilku instytutów	https://www.ccpem.ac.uk/download.php	Bezpłatne dla użytkowników akademickich i obejmuje Coot, Relion i wiele innych
Coot	Paul Emsley, LMB, Cambridge	https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/	Ogólne oprogramowanie do budowania modeli, ale dostępne również z innymi pakietami opisanymi powyżej
DockinMap (Phenix)	Konsorcjum kilku instytutów	https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html	Oprogramowanie w pakiecie Phenix do dokowania modelu do map krioEM
Bank danych mikroskopii elektronowej	Konsorcjum kilku instytutów	https://www.ebi.ac.uk/emdb/	Publiczne Repozytorium Map Mikroskopii Elektronowej
Falcon	Thermo Fisher Scientific	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf	Reklama, kamera firmy Thermo Fisher
Phenix	Konsorcjum kilku instytutów	https://phenix-online.org/download	bezpłatne dla użytkowników akademickich i obejmuje
Bank Danych Białka	Konsorcjum kilku instytutów	https://rcsb.org	Publiczna baza danych struktur makromolekularnych
Pymol	Schrödinger	https://pymol.org/2/	Narzędzie do wizalizacji molekularnej. Wersja edukacyjna jest bezpłatna, ale ma ograniczenia. Pełną wersję można uzyskać za niewielką opłatą.
Relion	MRC-LMB, Cambridge	https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html	Oprogramowanie do przetwarzania obrazów krioEM, dostępne również z CCP-EM
Titan Krios	Thermo Fisher Scientific	https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c& _source=1& gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE	Komercyjny, cryoTEM firmy Thermo Fisher
UCSF Chimera	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html	Oprogramowanie ogólnego przeznaczenia do wyświetlania, analizy i nie tylko
UCSF Chimera X	UCSF, USA		https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/Oprogramowanie ogólnego przeznaczenia do wyświetlania, analizy i nie tylko