Ocena uczenia się asocjacyjnego w chemotaksji nicienia Caenorhabditis elegans

Podsumowanie

Tu przedstawiamy protokół do testowania uczenia się skojarzeniowego poprzez przeprowadzenie klasycznego uwarunkowywania u organizmu modelowego C. elegans. Paradygmat opiera się na łączeniu stężenia soli w środowisku z obecnością lub brakiem pokarmu, co zmienia ich chemotaksję w kierunku soli lub w jej kierunku przeciwnym.

Streszczenie

Aby przystosować swoje zachowanie, zwierzęta przypisują wartość wrażeniom zmysłowym poprzez uczenie się skojarzeniowe i aktualizują tę skojarzeniową asocjację, gdy warunki środowiskowe się zmieniają. Zachowania Caenorhabditis elegans w odpowiedzi na chlorek sodu oferują dobrze zdefiniowany paradygmat do badania mechanizmów rządzących uczeniem się skojarzeniowym. Wystawianie dżdżownic na określone stężenia NaCl w powiązaniu z obecnością lub brakiem pokarmu wywołuje chemotaksję w kierunku lub wcześniej od tego stężenia NaCl, odpowiednio. Pamięć skojarzeniowa formuje się w ciągu kilku godzin i może być modyfikowana w tym samym czasie po wystawieniu zwierząt na inne stężenie NaCl.

Tutaj opisujemy, jak przeprowadzić test na plastyczność behawioralną i uczenie się na podstawie chemotaksji solowej u C. elegans. Szczepy testowe są hodowane w zsynchronizowanych kohortach aż osiągną dorosłość, a następnie kondycjonowane przez kilka godzin na płytkach z różnymi stężeniami NaCl, albo w obecności albo w braku pokarmu. Zwierzęta są następnie przenoszone na płytki testowe zawierające regiony o niskich, średnich lub wysokich stężeniach NaCl i pozwala się im pełzać przez 30 min przed zliczeniem liczby dżdżownic w każdym regionie. Następnie oblicza się indeks chemotaksji z dystrybucji dżdżownic na płytce. Test może być wykorzystany do sprawdzenia wpływu szerokiego zakresu czynników wpływających na uczenie się.

Wprowadzenie

Aby znacząco współdziałać ze swoim otoczeniem i wytwarzać adaptacyjne zachowania, zwierzęta muszą interpretować informacje zmysłowe, które otrzymują: czy dany bodźca zmysłowy jest korzystny czy szkodliwy dla ich przetrwania, prawie zawsze nie jest przeznaczony, ale zależy to od kontekstu. Kluczowym zadaniem układów sensorycznych i nerwowych jest zatem przypisywanie wartości informacjom z otoczeniem poprzez uczenie się skojarzeniowe. Niektóre bodźce są z natury apetyczne, takie jak jedzenie, a inne są z natury awersyjne, takie jak bodźce nocyceptywne. Takie bezwarunkowe bodźce (US) mogą zmienić reakcje na inne bodźce prezentowane razem z nimi; w rezultacie zwierzęta mogą rozwijać przyciąganie lub awersję do innego, uwarunkowanego bodźca (CS). Jest to interpretowane w taki sposób, że CS sygnalizuje lub przewiduje US^1,2,3. Badanie modeli uczenia się skojarzeniowego jest konieczne, aby wyjaśnić podstawowe mechanizmy genetyczne, komórkowe i fizjologiczne. Jednakże może to być wyzwaniem ze względu na konieczność stosowania modeli in vivo, zmienności zachowania, wymaganego licencjonowania obsługi zwierząt lub często długich czasów szkolenia zarówno badacza, jak i zwierząt, co zwykle wyklucza przeprowadzenie takich badań przez studentów na poziomie licencjackim w środowisku badawczym, a jeszcze bardziej w środowisku dydaktycznym.

Dlatego modele bezkręgowców oferują możliwość przeprowadzenia testów uczenia się skojarzeniowego z udziałem studentów na poziomie licencjackim lub magisterskim. Bezkręgowce nie wymagają licencji na zwierzęta do ich obsługi i mogą być opłacalne. Często stosowanym paradygmatem uczenia się skojarzeniowego jest uczenie się chemotaksji soli u C. elegans^4,5,6,7,8,9. C. elegans wyczuwają stężenie chlorku sodu (NaCl) w swoim środowisku i uczą się kojarzyć określone [NaCl] z obecnością lub brakiem jedzenia, odpowiednio. Ogólnie zwierzęta uczą się migrować w kierunku stężeń soli, które wcześniej były prezentowane z dużą ilością pokarmu bakteryjnego i uczą się migrować z tych, które były prezentowane w przypadku braku pokarmu bakteryjnego. Sól jest zatem bodźcem uwarunkowanym, a jedzenie lub głód jest bodźcem bezwarunkowym³. Ta asocjacja jest tworzona w ciągu mniej niż godziny i jest przykładem krótkotrwałej pamięci skojarzeniowej. Uczenie się skojarzeniowe chemotaksji NaCl jest modulowane, między innymi, przez sygnalizację zależną od wapnia/kalmoduliny (CaMK), dopaminergiczną i insulinową/fosfatydyloinozytolową (PI) 3-kinazę^5,9,10, co sugeruje, że wiąże się to z systemami motywacyjnymi oraz zależną od CaMK plastycznością synaptyczną i może działać w podobny sposób jak ścieżki sygnałowe rządzące uczeniem się skojarzeniowym u kręgowców.

W ugruntowanym protokołe uczenia się chemotaksji soli zwierzęta migarują w przestrzennym gradientzie soli na płytce agarowej stworzonym przez umieszczenie dwóch wkładek agarowych bez soli lub z dużą zawartością soli na płytce⁷. Te testy są trudne do przeprowadzenia w sposób ilościowy przez studentów z powodu dynamicznej zmiany stężenia NaCl na płytce do testu chemotaksji w czasie i przestrzeni, ponieważ NaCl z wkładek ciągle dyfunduje do płytki agarowej. Łatwiej do wykonania jest test z użyciem płytek czworobocznych, gdzie prezentowane są dwa różne stężenia soli (np. 25 mM NaCl i 0 mM NaCl) i oddzielone są one plastikowymi barierami¹¹. Jednakże ze względu na prezentację tylko dwóch różnych stężeń NaCl, nie może być on użyty jednocześnie do badania przyciągania lub/i uniknięcia obniżonego lub zwiększonego NaCl względem warunków wyjściowych. C. elegans jest zwykle hodowana na płytkach NGM (Nematode Growth Media) w obecności 50 mM NaCl i bakterii E. coli OP50¹², a zatem domyślnie tworzy pozytywne skojarzenie tego stężenia NaCl z pokarmem.

Przedstawiamy tutaj przystosowany protokół uczenia się chemotaksji soli, który może być wykonywany zarówno przez badaczy, jak i studentów. Zwierzęta są najpierw kondycjonowane na różne środowiska NaCl prezentowane w obecności lub braku pokarmu. Następnie są przenoszone na płytki testowe z wyborem niskiego, średniego i wysokiego stężenia soli w płytkach agarowych z komorami Y. Ich uczenie się chemotaksji w tym ustawieniu może być wykorzystane do badania wpływu różnych czynników na niego modulacyjnych, takich jak genotyp, konteksty środowiskowe lub wiek zwierząt.

Ten protokół jest dostosowany do zajęć praktycznych z laboratorium na poziomie licencjackim, podzielonych na osiem grup studentów, przy czym każda grupa studentów wykonuje zestaw sześciu pomiarów w każdym punkcie

Protokół

1. Przygotowanie płyt do wzrostu (GP) w celu synchronizacji C. elegans przed testem uczenia się asocjacyjnego i płyt do kondycjonowania (CP) w celu indukcji skojarzenia [NaCl]-pokarm w dniu testu

UWAGA: Naczynia Petriego do wzrostu i kondycjonowania są identyczne ze standardowymi płytami z pożywką do wzrostu nicieni (NGM)¹², z tą różnicą, że stężenie NaCl zmieniano na płytach 0 mM NaCl CP i 100 mM NaCl CP.

1. Przygotuj cztery czyste szklane butelki o pojemności 500 mL i dodaj następujące elementy:
   1. Dodaj 1,25 g peptonu, 8,5 g agaru, 487,5 mL wody destylowanej i mikser magnetyczny do jednej butelki (dla 0 mM NaCl CP);
   2. Dodaj 1,5 g NaCl, 1,25 g peptonu, 8,5 g agaru, 487,5 mL wody destylowanej i mikser magnetyczny do każdej z dwóch butelek (dla 50 mM NaCl CP i GP odpowiednio);
   3. Dodaj 3 g NaCl, 1,25 g peptonu, 8,5 g agaru, 487,5 mL wody destylowanej i mikser magnetyczny do jednej butelki (dla 100 mM NaCl CP).
2. Autoklawuj cztery butelki przez 15 min w 121 °C, a następnie pozwól im ostygnąć przez 30 min w 55 °C w kąpieli wodnej.
3. Umieść butelki (jedna po drugiej) na podgrzewanej mikserze magnetycznym. Dodaj do każdej butelki 12,5 mL 1 M KPO₄ (pH = 6,0 w temperaturze pokojowej [RT]). Mieszaj dokładnie przez 2 min, następnie dodaj 0,5 mL 1 M CaCl₂, 0,5 mL 5 mg/mL cholesterolu w etanolu i 0,5 mL 1 M MgSO₄ (wszystkie roztwory muszą być sterylne). Mieszaj za pomocą mieszania magnetycznego.
   UWAGA: Dokładne mieszanie po dodaniu KPO₄ zapobiega osadzaniu się fosforanu wapnia po dodaniu CaCl₂.
4. Dla każdego rodzaju płyty (0 mM CP, 50 mM CP, 100 mM CP, GP) dodaj 8 mL odpowiedniego medium do każdej 55 mm x 10 mm płyty Petriego w prawie sterylnych warunkach (w komorze przepływowej lub obok palnika Bunsena).
   UWAGA: Z tego kroku można wykonać około 62 płyt NGM każdego rodzaju.
5. Ostygnij płyty, pozostawiając je w RT przez około 3 godziny, a następnie przechowuj je w 4 °C do 2 tygodni przed użyciem.
6. Dodaj 200 μL zawiesiny E. coli OP50 do każdej NGM GP i pozostaw do wyschnięcia na noc w 20 °C w inkubatorze.
   UWAGA: Płyty można przechowywać w RT do 1 tygodnia przed użyciem.

2. Utrzymanie C. elegans i przygotowanie do testu uczenia się asocjacyjnego poprzez czasowe składanie jaj ¹³ (3 dni przed testem)

UWAGA: Jedna runda testu chemotaksji w sugerowanym formacie wymaga co najmniej 24 płyt do wzrostu (GP), 48 płyt do testu (Płyty testowe, AP) i 8 płyt na grupę kondycjonującą (Płyty kondycjonujące, CP). Dla klasy podzielonej na osiem grup studentów oznacza to, że każda grupa studentów otrzymuje 3 GP, 6 CP i 6 AP - czyli 1 CP i 1 AP na każdą warunkową wartość eksperymentalną.

1. Utrzymuj C. elegans N2 (var. Bristol) na płytach agarowych NGM z karmieniem żywym E. coli OP50 w 20 °C. Przechowuj płyty do góry nogami podczas utrzymania, aby zminimalizować utratę wilgoci.
2. Przenieś 30 młodych (dzień 2) dorosłych N2 na każdą GP.
3. Pozwól zwierzętom składać jaja przez około 8 godzin w 20 °C.
4. Usuń wszystkich dorosłych ze słoików i uprawiaj do góry nogami w 20 °C przez 3 dni.

3. Przygotowanie testu (1 dzień przed testem)

1. Przygotuj zasiane (+) i niezasiane (-) CP.
   1. Zasiej połowę partii każdej z 0 mM NaCl CP, 50 mM NaCl CP i 100 mM NaCl CP 200 μL OP50 na płytę (CP0+, CP50+ i CP100+ odpowiednio).
      UWAGA: Dodanie zawiesiny OP50 do CP0+ może prowadzić do przeniesienia niewielkiej ilości NaCl (<2 mM NaCl), co jest mało prawdopodobne, aby znacząco wpłynąć na zachowanie chemotaksji. W sytuacjach, gdy małe stężenia NaCl są istotne, można to uwzględnić, dodając 2 mM NaCl do płyt CP0- i "bez soli" na płytach testowych.
   2. Pozwól płytom wyschnąć na noc w 20 °C w inkubatorze obok niezasionych połowy CP (CP0-, CP50-, i CP100- odpowiednio)
2. Przygotuj płyty testowe (AP).
   1. Przygotuj trzy czyste szklane butelki o pojemności 1 L i dodaj następujące elementy:
      1. Dodaj 2,5 g peptonu, 17 g agaru, 975 mL wody destylowanej i mikser magnetyczny do jednej butel

Wyniki

Kondycjonowanie przez 4 godziny na płytkach z różnymi ilościami NaCl (0 mM, 50 mM, 100 mM), z jedzeniem lub bez, znacząco wpłynęło na zachowanie gatunku C. elegans typu dzikiego (N2). Po 30 min. na płytce badawczej, robaki kondycjonowane na płytkach z wysokimi stężeniami NaCl i jedzeniem (CP100+) oraz robaki kondycjonowane na płytkach bez NaCl i bez jedzenia (CP0-) miały dodatni CI, co wskazuje na preferencję wyższych stężeń NaCl (Rycina 2, Tabela 1, Tabela 2

Dyskusja

W tym artykule opisujemy ocenę uczenia się asocjacyjnego u nicienia C. elegans za pomocą chemotaksji jako paradygmatu eksperymentalnego. W naszym przykładzie zastosowaliśmy sześć warunków eksperymentalnych. Konkretnie, nicienie dzikiej populacji N2 C. elegans były warunkowane na płytkach z niską (0 mM), średnią (50 mM) lub wysoką (100 mM) stężeniem NaCl, które były albo zasiano standardowym pokarmem nicieni (E. coli szczep OP50) albo pozostawione bez zasiewu. Następnie nicienie C. elegans

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agar	Chemsolute	9972-2KG
Bacto-peptone	Gibco	211677
CaCl2 1M solution	Merck	2389
Caenorhabditis elegans strains	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Cholesterol	Roth	8866.1
E. coli OP50 liquid culture	N/A	N/A
Ethanol	Chemsolute	22731000
KH2PO4	Roth	P018.2
KPO4 (KH2PO4, K2HPO4) 1 M solution	Chemsolute	16341000
MgSO4 1 M solution	Roth	T888.2
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	Eppendorf	N/A
Na2HPO4	Roth	T877.1
NaCl	Chemsolute	13671000
Y-Petri dishes 90 x 10 mm	Moonlab	4-0033